Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM)
Mục lục Lời nói đầu 14 Ch-ơng I Tổng quan tài liệu 24 1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 24 1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 24 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 24 1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 25 1.1.2. Tóm l-ợc về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng 26 1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 27 1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida 27 1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn 27 1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn. 28 1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida 28 1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida 31 1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 32 1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida 32 1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 33 1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). 33 1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen. 34 1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida. 35 1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp gây ra ở gia cầm. 37 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. 37 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong n-ớc. 39 1.2.3. Đặc điểm của Salmonella. 41 1.2.4. Tình trạng ngộ độc thức ăn do Salmonella. 41 1.2.5. Biện pháp phòng bệnh. 42 1.2.6. vắc-xin chống Salmonella cho gà 43 1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella 43 1.2.6.2. Sơ l-ợc về kháng nguyên roi của S. typhimurium 44 1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella. 45 1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin 46 1.3. Bệnh Lở mồm Long móng 47 1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình nghiên cứu về bệnh trong, ngoài n-ớc. 47 1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh trên thế giới và ở Việt Nam. 47 1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới. 49 1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong n-ớc. 51 1.3.2. Vi rút gây bệnh LMLM. 52 1.3.2.1. Hình thái học. 52 1.3.2.2. Sức đề kháng của vi rút. 52 1.3.2.3. Đặc tính nuôi cấy. 52 1.3.3. Các ph-ơng pháp chẩn đoán. 53 1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng. 53 1.3.3.2. Đại c-ơng về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. 53 1.3.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học. 54 1.3.3.3.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 54 1.3.3.3.2. Phản ứng trung hoà vi rút. 55 1.3.3.3.3. Phản ứng ELISA. 55 1.3.3.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác 56 1.3.3.4. Chẩn đoán vi rút học. 56 1.3.3.5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR. 56 Ch-ơng II: Nguyên liệu và ph-ơng pháp nghiên cứu 58 A. Nguyên liệu 58 2.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l-ợng cao. 58 2.1.1. Động vật thí nghiệm. 58 2.1.2. Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng. 58 2.1.3. Dụng cụ máy móc thí nghiệm. 58 2.1.4. Môi tr-ờng, hoá chất 58 2.2. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 59 2.2.1. Động vật và sản phẩm động vật. 59 2.2.2. Các loại môi tr-ờng thông th-ờng. 59 2.2.3. Các loại môi tr-ờng chuyên biết. 60 2.2.4. Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác. 62 2.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 62 2.3.1. Chủng vi sinh vật. 62 2.3.2. Động vật. 62 2.3.3. Plasmid. 62 2.3.4. Môi tr-ờng nuôi cấy. 63 2.3.5 Các dung dịch. 63 2.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. 64 2.4.1. Bệnh phẩm. 64 2.4.2. Nguồn bệnh phẩm. 64 2.4.3. Dung dịch bảo quản bệnh phẩm. 64 2.4.4. Tế bào BHK- 21 và môi tr-ờng nuôi cấy tế bào. 65 2.4.5. Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RT-PCR. 65 2.4.5.1. Mẫu ARN chuẩn. 65 2.4.5.2. Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RT- PCR. 65 2.4.5.3. Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng (cloning). 65 2.4.5.4. Thiết bị, máy móc. 66 2.4.5.5. Các cặp mồi đặc hiệu với vi rút LMLM type O, A , C hoặc Asia-1. 66 B. Ph-ơng pháp nghiên cứu 66 3.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l-ợng cao. 66 3.1.1. Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất vacxin. 66 3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR. 67 3.1.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn đối với chuột nhắt trắng. 69 3.1.4. Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn – Saponin. 71 3.1.5. Kiểm nghiệm vắc xin 72 3.1.5.1. Kiểm tra vô trùng vắc xin. 72 3.1.5.2 Kiểm tra an toàn vacxin 72 3.1.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin. 72 3.1.5.3.1. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm. 72 3.1.5.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò. 72 3.1.6. Ph-ơng pháp xử lý số liệu. 76 3.1.6.1. Ph-ơng pháp tính chỉ số miễn dịch. 76 3.1.6.2. Ph-ơng pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê. 76 3.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 77 3.2.1. Các ph-ơng pháp vi sinh vật học thông th-ờng. 77 3.2.2. Các ph-ơng pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin. 77 3.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 78 3.3.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn. 78 3.3.2. Ph-ơng pháp tổng hợp chuỗi (PCR). 78 3.3.3. Xử lý ADN bằng enzym hạn chế. 78 3.3.4. Phản ứng nối ghép gen. 79 3.3.5. Biến nạp vào E. coli. 79 3.3.6. Tách chiết ADN plasmid từ E. coli. 80 3.3.7. Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp. 81 3.3.8. Biến nạp plasmid vào nấm men P. pastoris bằng xung điện. 82 3.3.9. Western Blot, ELISA. 83 3.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. 84 3.4.1. Các ph-ơng pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế. 84 3.4.2. Ph-ơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm. 84 3.4.3. Ph-ơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM. 86 3.4.3.1. Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô. 86 3.4.3.2. Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ng-ợc. 86 3.4.3.3. Phản ứng PCR. 86 3.4.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR. 87 3.4.4. Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam. 88 3.4.4.1. Lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRR2.1 và biến nạp vào tế bào khả biến (competent E. coli cells). 88 3.4.4.2. Tách chiết Plasmid. 89 3.4.4.3. Cắt bằng enzym giới hạn. 89 3.4.5. Ph-ơng pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM. 90 3.4.5.1. Ph-ơng pháp nuôi tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney - 21). 90 3.4.5.2. Ph-ơng pháp tách tế bào bám dính. 90 3.4.5.3. Ph-ơng pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHK-21. 90 Ch-ơng III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 92 4.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l-ợng cao. 92 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết của các địa ph-ơng. 92 4.1.2. Tính t-ơng đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P. multocida chủng IR với đại diện các chủng P. multocida phân lập đ-ợc. 95 4.1.3. Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò. 96 4.1.4. Kết quả xác định công thức bổ trợ thích hợp và theo dõi độ dài miễn dịch của vắc xin keo phèn-saponin. 97 4.1.5. Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn- saponin chủng IR. 98 4.1.6. Tính t-ơng đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida chủng IR với các chủng P. multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT trâu bò tại Việt Nam. 99 4.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 99 4.2.1. Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn nuôi gà giống. 99 4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. 100 4.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella phân lập đ-ợc. 102 4.2.4. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đ-ợc trên chuột nhắt trắng. 104 4.2.5. Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên các loại môi tr-ờng dinh d-ỡng khác nhau. 105 4.2.6. Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 106 4.2.7. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đ-ợc 106 4.2.8. Kết quả xác định LD 50 của các chủng Salmonella phân lập đ-ợc 107 4.2.9. Sản xuất thử nghiệm vacxin S. enteritidis và S. Typhimurium vô hoạt keo phèn 108 4.2.10. Kết quả thử thuần khiết vacxin 108 4.2.11. Kết quả thử vô trùng của vacxin 108 4.2.12. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng 109 4.2.13. Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị 110 4.2.14. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 110 4.2.15. Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà 111 4.2.16. Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin 111 4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp 113 4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 113 4.3.1.1. Đ-a gen vào vectơ pCR2.1 113 4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 113 4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S. typhimurium, S. enteritidis 114 4.3.1.1.3. Đ-a sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 115 4.3.1.2. Đ-a gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) 119 4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 120 4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong nấm men P. pastoris 122 4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR 122 4.3.2.2. Đ-a gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 123 4.3.2.3. Đ-a gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 123 4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris 125 4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 126 4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC 126 4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng nguyên toàn phần trên gà hậu bị 127 4.3.3.3. Western blot và ELISA 127 4.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3 131 4.3.5. Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3 132 4.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR 134 4.4.1. Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây 134 4.4.2. Diễn biến lâm sàng của bệnh trên bò và lợn 136 4.4.3. Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh 138 4.4.3.1. Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 138 4.4.3.2. Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.3.3. Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.4. Thiết lập ph-ơng pháp RT–PCR để phát hiện vi rút gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết 140 4.4.5. Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập tại tỉnh Qủang Trị 143 4.4.6. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM. 145 4.4.7. Kết quả ứng dụng ph-ơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa 147 4.4.8. Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị 149 4.4.8.1. Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các type O, A, C, và asia-1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O 149 4.4.8.2. Kết quả giải trình trình tự nuclêotide 151 4.4.9. Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHK-21 153 4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 153 4.4.9.2. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21 153 4.4.9.3. Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút LMLM lên tế bào BHK-21 155 4.4.9.4. So sánh chẩn đoán vi rút LMLM bằng RT-PCR từ bệnh phẩm biểu mô và từ bệnh phẩm biểu mô đã cấy chuyển trên tế bào 156 4.4.10. So sánh ph-ơng pháp ELISA và RT-PCR để chẩn đoán-định typ virut LMLM 158 4.4.11. Nhận xét tổng quan về ph-ơng pháp RT-PCR trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 160 Ch-ơng IVKết luận và đề nghị 163 Kết luận 163 I. Các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm 163 II. Về nội dung và ph-ơng pháp sử dụng 163 III. Về giải pháp khoa học công nghệ 164 IV. Các sản phẩm cụ thể 165 Đề nghị 165 Lời cảm ơn 166 Tài liệu tham khảo 167
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
(H×nh 3.7). Sau ®ã c¸c ®o¹n gen
®−îc nèi víi pET22b(+) ®· më vßng nhê
enzym ADN ligaza. S¶n phÈm lai ®−îc
biÕn n¹p vµo tÕ bµo vi khuÈn E. coli BL21,
cÊy tr¶i trªn m«i tr−êng LB cã bæ sung
ampixilin ë 37oC. Sau 12 giê, sè l−îng
khuÈn l¹c mäc lªn lµ kh¸ nhiÒu vµ cã kÝch
th−íc ®ång ®Òu. TiÕp theo chóng t«i tiÕn
hµnh kiÓm tra plasmit tr−íc khi ®−a vµo
H×nh 3.7: Ph©n tÝch plasmit trªn gel agarose 0.8%
§−êng ch¹y 2, 4, 7: pET22b(+)
§−êng ch¹y 1, 3: pET22b(+) mang gen fliC3
§−êng ch¹y 5, 6: pET22b(+) mang gen gm3
§−êng ch¹y 5, 6: pET22b(+) mang gen sef14
biÓu hiÖn.
C¸c dßng plasmid ®−îc t¸ch tõ c¸c thÓ biÕn n¹p ®Òu cao h¬n dßng plasmid
pET22b(+) (H×nh 3.8). §iÒu ®ã chøng tá c¸c dßng plasmid ®ã ®· cã ®o¹n gen ®−îc
chÌn vµo. §Ó ch¾c ch¾n chóng t«i ®· c¾t kiÓm tra c¸c dßng plasmid nµy b»ng enzyme
giíi h¹n NcoI vµ XhoI.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
fliC3
1,5 kb
gm3
1,5 kb
sef14
0,5 kb
H×nh 3.8: Ph©n tÝch s¶n phÈm c¾t c¸c dßng plasmid pET22b(+) mang ®o¹n gen ngo¹i
lai trªn gel agarose 0.8%
§−êng ch¹y 1-3: pET22b(+) mang gen fliC3 c¾t b»ng NcoI+XhoI
§−êng ch¹y 4, 5, 11: Thang ADN chuÈn (1Kb, Gibco)
§−êng ch¹y 6, 7: pET22b(+) mang gen gm3 c¾t b»ng NcoI+XhoI
§−êng ch¹y 8: pET22b(+) c¾t b»ng NcoI+XhoI
§−êng ch¹y 9, 10: pET22b(+) mang gen sef14 c¾t b»ng NcoI+XhoI
42
H×nh 3.8 cho thÊy c¸c ®o¹n gen ®−îc t¹o ra sau khi c¾t cã kÝch th−íc ®óng nh−
tÝnh to¸n. §iÒu nµy kh¼ng ®Þnh r»ng chóng t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng vect¬ biÓu hiÖn
pET22b(+) mang c¸c gen fliC3, gm3, sef14. Vect¬ pET22b(+) mang gen fliC3, gm3,
sef14 ®−îc ®Æt tªn theo thø tù lµ pETfliC3, pETgm3, pETsef14. C¸c gen nµy sÏ ®−îc
kiÓm tra kh¶ n¨ng biÓu hiÖn trong tÕ bµo E. coli BL21.
4.3.1.3. BiÓu hiÖn gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21
Sau khi thiÕt kÕ thµnh c«ng vect¬ biÓu hiÖn pETfliC3, pETgm3, pETsef14,
chóng t«i tiÕn hµnh c¶m øng c¸c dßng tÕ bµo E. coli BL21 mang plasmit t¸i tæ hîp ë hai
nhiÖt ®é lµ 28 oC vµ 37oC víi nång ®é chÊt c¶m øng IPTG lµ 1mM. IPTG lµ hîp chÊt
cã kh¶ n¨ng t−¬ng t¸c víi chÊt øc chÕ operon Lac Z, gi¶i phãng operon nµy trë l¹i ho¹t
®éng phiªn m· b×nh th−êng. Nhê ®ã, ®o¹n gen ngo¹i lai n»m trong operon Lac Z ®−îc
biÓu hiÖn d−íi sù ®iÒu khiÓn cña promot¬
T7 n»m phÝa tr−íc nã. §Ó biÓu hiÖn
protein tèt nhÊt trong ®iÒu kiÖn cã chÊt
c¶m øng, tÕ bµo ph¶i ë trong giai ®o¹n
®ang t¨ng tr−ëng. V× vËy, tr−íc khi bæ
sung chÊt c¶m øng chóng t«i ®· nu«i cÊy
lµm t−¬i 1 thÓ tÝch dÞch huyÒn phï trong
50 thÓ tÝch m«i tr−êng LB láng cã bæ sung
ampixilin ®Õn OD600 ®¹t kho¶ng 0,8. Quy
tr×nh c¶m øng ®−îc thùc hiÖn nh− phÇn
ph−¬ng ph¸p ®· tr×nh bµy. MÉu tÕ bµo E.
coli mang plasmit t¸i tæ hîp pETfliC3
pETgm3, pETsef14 ®−îc thu l¹i sau 3h
nu«i cÊy c¶m øng b»ng c¸ch li t©m vµ
®−îc hßa l¹i vµo l−îng n−íc võa ®ñ chøa
1µg/ml PMSF vµ ®Ó trong -750C trong 1
giê hoÆc ®Ó qua ®ªm. Sau ®ã tÕ bµo ®−îc
ph¸ b»ng ph−¬ng ph¸p sèc nhiÖt kÕt hîp
H×nh 3.9: Ph©n tÝch protein tæng sè cña c¸c
chñng E. coliBL21 mang gen fliC3, gm3,
sef14 trªn gel acrylamit 12,6%
§−êng ch¹y 1: Protein tõ chñng E. coli
BL21 mang pETfliC3
§−êng ch¹y 2, 5: Thang protein chuÈn
§−êng ch¹y 3, 4: Protein tõ chñng E. coli
BL21 mang pET22b(+)
§−êng ch¹y 6: Protein tõ chñng E. coli
BL21 mang pETgm3
víi lyzozym. Theo c¸ch nµy, protein t¸i tæ hîp n»m trong khoang chu chÊt sÏ ®−îc gi¶i
phãng vµ ®−îc thu l¹i b»ng c¸ch li t©m tèc ®é cao.
Protein t¸ch chiÕt ®−îc kiÓm tra b»ng c¸ch ch¹y ®iÖn di trªn gel polyacrylamit
12,6% (H×nh 3.9). Chóng t«i ®· lµm thÝ nghiÖm c¶m øng ë hai nhiÖt ®é kh¸c nhau lµ
43
28oC vµ 37oC. Tuy nhiªn, c¸c kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp fliC3, gm3, sef14 chØ ®−îc tæng
hîp tèt ë nhiÖt ®é 28oC.
Theo tÝnh to¸n b¨ng protein t¸i tæ hîp cña gen fliC3 cã kÝch th−íc 1410 bps sÏ
quy ®Þnh cho chuçi polypeptit cã träng l−îng ph©n tö kho¶ng 52 kDa. Trong thÝ nghiÖm
cña chóng t«i, b¨ng protein t¸i tæ hîp cã kÝch th−íc n»m ë kho¶ng gi÷a b¨ng 66,2 kDa
vµ b¨ng 45 kDa cña protein chuÈn. V× vËy, chóng t«i nhËn ®Þnh protein t¸i tæ hîp thu
®−îc cã kÝch th−íc xÊp xØ víi protein fliC3 cña vi khuÈn S. typhimurium. Còng theo
tÝnh to¸n, gen gm3 sÏ m· ho¸ cho protein cã kÝch th−íc kho¶ng 55 kDa. Trong thÝ
nghiÖm cña chóng t«i, protein ®−îc t¹o ra khi c¶m øng chØ cã kÝch th−íc trªn 40kDa
nhá h¬n kÝch th−íc dù ®o¸n. MÆc dï vËy gen gm3 ®· ®−îc kiÓm tra kh«ng bÞ lçi vµ
khung ®äc lµ ®óng. Nguyªn nh©n protein ®−îc tæng hîp ra cã kÝch th−íc nhá h¬n cã
thÓ do trong qu¸ tr×nh tæng hîp, protein l¹ ®· bÞ c¾t bá mét phÇn. §©y chØ lµ pháng
®o¸n v× nguyªn nh©n chÝnh x¸c th× vÉn cßn lµ mét Èn sè. Gen sef14 còng kh«ng ®−îc
biÓu hiÖn trong E. coli mÆc dï viÖc kiÓm tra tr×nh tù gen cho thÊy gen sef14 ®−îc ®−a
vµo pET22b(+) kh«ng bÞ lçi. Nguyªn nh©n cña rñi ro nµy cã thÓ do trong E. coli còng
cã l«ng vµ roi nh− Salmonella. V× vËy, trong E. coli còng cã c¬ chÕ cho viÖc ®iÒu khiÓn
t¹o protein cho l«ng vµ roi riªng. ViÖc cã thªm gen t¹o roi vµ l«ng cã thÓ ¶nh h−ëng tíi
sù ph¸t triÓn b×nh th−êng cña chñng vµ v× vËy ®Ó b¶o vÖ sù ph¸t triÓn b×nh th−êng,
chñng E. coli ®· lµm øc chÕ kh«ng tæng hîp kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp nµy n÷a. V× vËy,
®Ó t¹o ®−îc nguån kh¸ng nguyªn cho thö nghiÖm v¨c-xin, chóng t«i ®· ®−a c¸c gen nµy
vµo thö biÓu hiÖn trong nÊm men víi mong muèn sÏ cã ®−îc nguån kh¸ng nguyªn tèt
h¬n.
4.3.2. BiÓu hiÖn gen fliC3, gm3, sef14 trong nÊm men P. pastoris
Víi môc ®Ých thu ®−îc nguån kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp kh¸c tõ nÊm men ®Ó
nghiªn cøu so s¸nh kh¶ n¨ng biÓu hiÖn vµ b¶o vÖ gµ chóng t«i ®· biÓu hiÖn c¸c gen m·
ho¸ kh¸ng nguyªn l«ng vµ roi trong nÊm men P. pastoris. Dù ®Þnh gen ®−a vµo nÊm
men sÏ chøa c¶ tr×nh tù m· ho¸ cho ®u«i histidin dïng cho tinh s¹ch protein t¸i tæ hîp,
chóng t«i ®· thiÕt kÕ c¸c ®o¹n måi nh©n c¸c gen tõ ®Çu 5’ cña gen ®Õn hÕt vïng histag
trong pETfliC3, pETgm3, pETsef14. Gen sau khi ®−îc nh©n lªn b»ng pCR sÏ ®−îc giíi
h¹n bëi SnaBI, NotI vµ ®−îc ®−a vµo vect¬ pCR2.1 ®Ó t¸ch dßng. Sau ®ã, c¸c ®o¹n gen
®−îc ®−a vµo pPIC9 t¹i ®iÓm c¾t SnaBI vµ NotI. Vect¬ pPIC9 mang c¸c gen sau khi ®·
44
®−îc kiÓm tra sÏ ®−îc c¾t më vßng t¹i vïng HIS4 ®Ó tÝch hîp vµo hÖ gen nÊm men P.
pastoris.
4.3.2.1. Nh©n c¸c gen b»ng PCR
Qua ®iÖn di ®å trªn h×nh 3.10 cho thÊy c¸c gen ®−îc nh©n lªn ®Æc hiÖu thÓ hiÖn
lµ mét b¨ng s¸ng, râ cã kÝch th−íc t−¬ng øng víi kÝch th−íc cña c¸c gen nh− mong
muèn. §iÒu nµy t¹o ®iÒu kiÖn cho viÖc t¸ch dßng gen ®−îc chÝnh x¸c.
4.3.2.2. §−a gen vµo vect¬ t¸ch dßng pCR2.1
S¶n phÈm pCR sau ®ã ®−îc nèi víi vect¬ pCR2.1 b»ng enzyme DNA ligase vµ
®−îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli DH5α ®Ó t¸ch dßng. T−¬ng tù nh− khi ®−a gen vµo
vect¬ pCR2.1 ë phÇn trªn, c¸c khuÈn l¹c cã mµu tr¾ng lµ dßng tÕ bµo cã chøa plasmid
®· mang gen ngo¹i lai ®−îc nu«i cÊy ®Ó t¸ch plasmid kiÓm tra. Nh− trªn ®iÖn di ®å cho
thÊy c¸c dßng plasmit ®−îc t¸ch ra tõ khuÈn l¹c mµu tr¾ng cã kÝch th−íc cao h¬n dßng
®èi chøng lµ pCR2.1. Plasmid mang gen fliC3, gm3, sef14 ®−îc ®Æt tªn t−¬ng øng lµ
pCRfliC-his, pCRgm-his, pCRsef-his.
4.3.2.3. §−a gen vµo vect¬ biÓu hiÖn pPIC9
C¸c gen tõ vect¬ pCRfliC-his, pCRgm-his, pCRsef-his ®−îc c¾t ra b»ng SnaBI,
NotI, tinh s¹ch vµ ®−a vµo vect¬ pPIC9 ®· ®−îc c¾t b»ng enzyme t−¬ng øng. S¶n phÈm
cña ph¶n øng nèi ghÐp gen ®−îc biÕn n¹p vµo E. coli DH5α. S¶n phÈm biÕn n¹p ®−îc
1 2 3 4 5
H×nh 3.10: Ph©n tÝch s¶n phÈm PCR trªn gel agarose 0,8%
§−êng ch¹y 1, 4: Thang ADN chuÈn (1Kb)
§−êng ch¹y 2, 3, 5: t−¬ng øng víi s¶n phÈm PCR gen gm3, fliC3, sef14
45
tr¶i trªn m«i tr−êng cã chøa Amp chän läc. Chóng t«i ®· ngÉu nhiªn chän mét sè
khuÈn l¹c ®Ó t¸ch plasmit kiÓm tra. KÕt qu¶ cho thÊy, hÇu hÕt c¸c plasmit ®· chøa ®o¹n
gen chÌn vµo (H×nh 3.11).
H×nh 3.11: Ph©n tÝch plasmit t¸i tæ hîp trªn gel agarose 0,8%
§−êng ch¹y 1, 5, 14: pCR2.1 §−êng ch¹y 6-9: pCRgm-his
§−êng ch¹y 2-4: pCRsef-his §−êng ch¹y 210-13: pCRfliC-his
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
H×nh 3.12: Ph©n tÝch plasmit pPIC9 mang gen fliC3, gm3, sef14 trªn gel
agarose 0,8%1-3: pICSef-his
§−êng ch¹y 1-3: pPICsef-his §−êng ch¹y 4, 7, 10: pPIC9
§−êng ch¹y 5, 6: pPICfliC-his §−êng ch¹y 1-3: pPICsef-his
46
§Ó ch¾c ch¾n c¸c dßng gen n»m trong pPIC9, chóng t«i ®· tiÕn hµnh c¾t kiÓm
tra gen b»ng enzym h¹n chÕ NcoI + XhoI. KÕt qu¶ cho thÊy c¸c ®o¹n gen ®−îc t¹o ra
cã kÝch th−íc ®óng nh− tÝnh to¸n (H×nh 3.12 vµ 3.13).
Nh− vËy chóng t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng vect¬ pPICsef14, pPICgm3, pPICfliC
®Ó biÓu hiÖn gen trong nÊm men P. pastoris.
4.3.2.4. BiÓu hiÖn gen trong nÊm men P. pastoris
C¸c plasmit pPICsef14, pPICgm3, pPICfliC ®−îc c¾t më vßng t¹i vïng HIS4 ®Ó
t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho plasmid t×m vµ b¾t cÆp víi vïng t−¬ng ®ång trªn hÖ gen nÊm
men vµ trao ®æi chÐo, tÝch hîp ®−a ®o¹n gen ngo¹i lai vµo hÖ gen. §©y lµ hÖ biÓu hiÖn
rÊt m¹nh ®−îc nghiªn cøu vµ øng dông rÊt réng r·i ®Ó t¹o nhiÒu protein t¸i tæ hîp ®Æc
biÖt lµ c¸c protein cña Eukaryot ®Ó sö dông trong y, d−îc häc. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i
tÊt c¶ c¸c protein ®Òu ®−îc biÓu hiÖn tèt trong hÖ nµy mµ mét sè protein ®Æc biÖt lµ
protein cña vi khuÈn ®−îc t¹o ra yÕu vµ kh«ng ®−îc tiÕt ra ngo¹i bµo. V× vËy trong thÝ
nghiÖm cña m×nh, chóng t«i chØ thö biÓu hiÖn víi hy väng cã thÓ thu ®−îc nguån kh¸ng
nguyªn t¸i tæ hîp trong nÊm men ®Ó nghiªn cøu.
NÊm men P. pastoris ®−îc chän läc theo ®ét biÕn khuyÕt d−ìng. Nh÷ng dßng tÕ
bµo chøa ®o¹n gen tÝch hîp vµo vïng HIS4 th× míi cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng trªn m«i
1 2 3 4 5 6 7 8 9
H×nh 3.13: Ph©n tÝch s¶n phÈm c¾t trªn gel agarose 0,8%
§−êng ch¹y 1: pICflic-his c¾t b»ng SnaB I/Not I
§−êng ch¹y 2, 3, 6: pPIC9 c¾t b»ng SnaBI/NotI
§−êng ch¹y 5:pPICgm c¾t b»ng SnaBI/NotI
47
tr−êng kh«ng cã histidin cßn nh÷ng dßng kh«ng mang gen tÝch hîp th× kh«ng sinh
tr−ëng ®−îc. B»ng c¸ch nµy chóng t«i ®· chän ra ®−îc c¸c dßng nÊm men cã chøa gen
ngo¹i lai ®Ó biÓu hiÖn.
C¸c dßng tÕ bµo chøa gen fliC3, gm3, sef14 ®−îc nu«i cÊy trong m«i tr−êng
YPG sau ®ã ®−îc c¶m øng b»ng methanol ®Ó t¹o protein t¸i tæ hîp. Sau khi c¶m øng 3
ngµy, m«i tr−êng nu«i cÊy ®−îc ®iÖn di trªn gel acrylamit ®Ó xem sù biÓu hiÖn cña
protein ngo¹i lai. Kh«ng nh− mong muèn, protein ngo¹i lai ®· kh«ng ®−îc tæng hîp
trong tÕ bµo nÊm men. Nguyªn nh©n t¹i sao c¸c protein nµy kh«ng ®−îc biÓu hiÖn lµ
ch−a râ nh−ng cã thÓ protein roi vµ l«ng ®· g©y ¶nh h−ëng ®Õn tÕ bµo nÊm men.
Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®−îc ë trªn, chóng t«i ®· biÓu hiÖn ®−îc fliC3, gm3 m· ho¸
cho kh¸ng nguyªn roi H:i, H:g,m cña vi khuÈn S. typhimurium vµ S. enteritidis trong tÕ
bµo E. coli BL21. C¸c kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp nµy ®−îc sö dông ®Ó thö ®¸p øng miÔn
dÞch vµ kh¶ n¨ng b¶o vÖ gµ chèng l¹i Salmonella.
4.3.3. Thö ®¸p øng miÔn dÞch cña gµ víi kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp Flic3
4.3.3.1. Tinh s¹ch kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC
V× protein Gm3 ®−îc t¹o ra kh«ng cßn nguyªn vÑn vµ bÞ mÊt ®o¹n ë phÇn cuèi
gen v× vËy viÖc tinh s¹ch gÆp nhiÒu khã kh¨n. V× vËy, trong qu¸ tr×nh x¸c ®Þnh l¹i ®iÒu
kiÖn ®Ó biÓu hiÖn vµ tinh s¹ch protein Gm3 tèt nhÊt, chóng t«i tinh s¹ch FliC3 ®Ó kiÓm
tra kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch. Riªng víi Gm3, chóng t«i sÏ tiÕn hµnh ngay sau khi
x¸c ®Þnh ®−îc c¸c ®iÒu kiÖn cho FliC3.
E. coliBL21 mang gen fliC3 ®−îc nu«i cÊy c¶m øng ®Ó t¹o protein t¸i tæ hîp nh−
®· ®−îc tr×nh bµy ë phÇn ph−¬ng ph¸p. Sau khi xö lý mÉu nh− ®· nªu trªn phÇn ph−¬ng
ph¸p, protein tæng sè ®−îc cho qua cét ¸i lùc His-tag ®Ó tiÕn hµnh tinh s¹ch protein
FliC. §iÓm thuËn lîi cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC so víi kh¸ng nguyªn tù nhiªn lµ
®· mang thªm ®−¬c ®u«i gåm 6 axit amin histidin. D−íi ®iÒu kiÖn pH thÝch hîp (pH
=7), Ion Co2+ g¾n trªn h¹t Sepharose t¹o liªn kÕt tÜnh ®iÖn víi ®u«i histidine. Khi ®ã,
protein t¸i tæ hîp sÏ ®−îc gi÷ l¹i trªn cét. Sau khi ®· röa s¹ch nh÷ng protein kh«ng
mong muèn, protein t¸i tæ hîp ®−îc thu l¹i nhê dÞch thu cã pH = 5. D−íi ®iÒu kiÖn pH
thÊp, liªn kÕt tÜnh ®iÖn gi÷a Ion Co vµ ®u«i His-tag ®−îc ph¸ vì, v× vËy, protein t¸i tæ
hîp theo dÞch thu ra ngoµi cét. S¶n phÈm protein t¸i tæ hîp ®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di
SDS-PAGE 12% (h×nh 3.14).
48
66
1 2
FliC
97
14
45
30
21
kDa
H×nh 3.14: Ph©n tÝch protein tinh s¹ch trªn gel polyacrylamide 12%
§−êng ch¹y 1: Thang protein chuÈn (Gibco)
§−êng ch¹y 2: S¶n phÈm protein tinh s¹ch
KÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 9 cho thÊy, b¨ng protein râ nÐt ë ®−êng ch¹y 2 víi kÝch
th−íc kho¶ng 51 kDa, ®óng nh− tÝnh to¸n. S¶n phÈm protein tinh s¹ch ®−îc sö dông
lµm kh¸ng nguyªn ®Ó g©y miÔn dÞch trªn gµ.
4.3.3.2. G©y miÔn dÞch kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC vµ kh¸ng nguyªn toµn
phÇn trªn gµ hËu bÞ
Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC vµ kh¸ng nguyªn toµn phÇn ®−îc tiÕn hµnh tiªm
vµo l« gµ (4 con ®èi chøng, 4 con thÝ nghiÖm). Sau khi g©y miÔn dÞch ®−îc 14 ngµy,
tiÕn hµnh tiªm tiÕp kh¸ng nguyªn lÇn 2 ®Ó c¬ thÓ gµ ®¸p øng miÔn dÞch thø cÊp. Thu
huyÕt thanh gµ sau 21 ngµy g©y miÔn dÞch. Sau ®ã, huyÕt thanh gµ ®−îc sö dông nh−
kh¸ng thÓ 1 trong kü thuËt Western blot vµ ELISA.
4.3.3.3. Western blot vµ ELISA
Tr−íc tiªn, ®Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ
hîp, kh¸ng nguyªn FliC ®−îc chuyÓn qua mµng PVDF (Polyvinylidene difluoride). Phñ
tiÕp kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC (gäi lµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu) ®Ó t¹o sù
kÕt cÆp ®Æc hiÖu víi kh¸ng nguyªn. KÕt qu¶ Western blot ®−îc thÓ hiÖn trªn h×nh 3.15.
Trong thÝ nghiÖm nµy, gµ ®èi chøng lµ gµ ®−îc nu«i cïng ®iÒu kiÖn víi gµ thÝ
nghiÖm nh−ng kh«ng ®−îc tiªm kh¸ng nguyªn. V× vËy, gµ ®èi chøng kh«ng t¹o kh¸ng
thÓ kh¸ng l¹i FliC. Ng−îc l¹i, gµ thÝ nghiÖm cã kh¶ n¨ng t¹o ra IgG rÊt m¹nh do ®−îc
49
1 2 3 4
66
30
21
14
KDa
Kh¸ng
nguyªn t¸i
tæ hîp
~51KDa
H×nh 3.15: KÕt qu¶ Western blot cña kh¸ng nguyªn FliC víi kh¸ng thÓ tõ c¸c lo¹i gµ
§−êng ch¹y 1, 3: Thang protein chuÈn (Gibco)
§−êng ch¹y 2: FliC phñ víi kh¸ng thÓ tõ gµ ®èi chøng
§−êng ch¹y 4: FliC phñ víi kh¸ng thÓ tõ gµ thÝ nghiÖm
45
g©y miÔn dÞch thø cÊp. KÕt qu¶ (H×nh 3.15) kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC cã kh¶ n¨ng
®¸p øng miÔn dÞch cao trong gµ, biÓu hiÖn lµ mét v¹ch ®Ëm, víi kÝch th−íc kho¶ng 51
kDa nh− tÝnh to¸n.
Trong thÝ nghiÖm trªn gµ chØ ®−îc g©y ®¸p øng miÔn dÞch víi kh¸ng nguyªn tinh
s¹ch FliC, v× vËy, chØ cã thÓ t¹m kÕt luËn lµ cã kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña FliC
trong gµ. Trong khi ®ã yªu cÇu ®èi víi v¾c-xin lµ kh¶ n¨ng t¹o ®¸p øng miÔn dÞch nh−
kh¸ng nguyªn tù nhiªn. §Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng nµy, kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC ph¶i
cã kh¶ n¨ng ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng ®−îc kh¸ng nguyªn tù nhiªn, hoÆc
ng−îc l¹i kh¸ng thÓ tù nhiªn cã kh¶ n¨ng ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng ®−îc
kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp. §Ó kh¼ng ®Þnh ®iÒu nµy, kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC ®−îc
kiÓm tra kh¶ n¨ng ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng víi kh¸ng nguyªn tù nhiªn.
Theo nh− m« t¶ ë phÇn ph−¬ng ph¸p, kh¸ng nguyªn tù nhiªn lµ kh¸ng nguyªn
toµn phÇn thu trùc tiÕp tõ chñng S. typhimurium nªn sÏ chøa kh¸ng nguyªn FliC tù
nhiªn. Kh¸ng thÓ kh¸ng víi kh¸ng nguyªn toµn phÇn ®−îc gäi lµ kh¸ng thÓ ®a dßng.
Kh¸ng thÓ ®a dßng ®−îc sö dông ®Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng kÕt cÆp víi kh¸ng nguyªn t¸i tæ
hîp FliC b»ng kü thuËt Western blot (H×nh 3.16). Trªn ®−êng ch¹y 3 cho thÊy, do cã
nhiÒu lo¹i kh¸ng nguyªn chøa trong kh¸ng nguyªn toµn phÇn nªn trªn ®−êng ch¹y cã
xuÊt hiÖn nhiÒu b¨ng kh¸ng nguyªn ®¸p øng miÔn dÞch kh¸c nhau. Trong khi ®ã, trong
50
tr−êng hîp víi kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp (®−êng ch¹y 2) xuÊt hiÖn b¨ng víi kÝch th−íc
kho¶ng 51KDa. KÕt qu¶ nµy ®· chøng tá kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC ®· cã kh¶ n¨ng
kÕt cÆp víi kh¸ng thÓ ®a dßng.
H×nh 3.17: KÕt qu¶ ELISA so s¸nh kh¶ n¨ng kÕt cÆp cña kh¸ng nguyªn tù nhiªn (NP) vµ
kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp (RP) víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu pha lo·ng c¬ sè 10 (tõ AÆH)
Cét 1, 7: Kh¸ng nguyªn ®−îc phñ kh¸ng thÓ 1 thu tõ gµ ®èi chøng)
Cét 2 –5 vµ 8-11: Kh¸ng thÓ 1 lµ huyÕt thanh gµ sè 1, 2, 3, 4
Cét 6, 12: GiÕng ®èi chøng (Kh«ng phñ kh¸ng thÓ 1)
1 2 3
KDa
116
45
25
66,2
35
18,4
14,4
H×nh 3.16: KÕt qu¶ Western blot cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC vµ tù nhiªn víi
kh¸ng thÓ kh¸ng víi kh¸ng nguyªn tù nhiªn
§−êng ch¹y 1: Thang protein chuÈn (Fermentas)
§−êng ch¹y 2: Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC
§−êng ch¹y 3: Kh¸ng nguyªn tù nhiªn (toµn phÇn)
51KDa
51
§Ó t¹o c¬ së ch¾c ch¾n h¬n cho viÖc sö dông FliC vµo chÕ t¹o v¾c-xin t¸i tæ hîp,
kh¶ n¨ng kÕt cÆp cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp vµ kh¸ng nguyªn toµn phÇn víi kh¸ng
thÓ ®Æc hiÖu ®−îc so s¸nh víi nhau b»ng kü thuËt ELISA. B»ng viÖc pha lo·ng nång ®é
kh¸ng nguyªn theo c¬ sè 10 vµ vÉn gi÷ nång ®é kh¸ng thÓ, ELISA cho phÐp so s¸nh
kh¶ n¨ng b¾t cÆp víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu cña 2 lo¹i kh¸ng nguyªn (H×nh 3.17).
KÕt qu¶ ELISA cho thÊy, ë nång ®é pha lo·ng huyÕt thanh gµ ®Õn 104, vÉn cßn
cã thÓ ph¸t hiÖn ®−îc sù kÕt cÆp cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ. §iÒu ®ã ®·
thÓ hiÖn kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp còng cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu
t−¬ng ®−¬ng víi kh¸ng nguyªn tù nhiªn. 104 lµ mét gi¸ trÞ kh¸ lín vµ chøng tá kh¸ng
nguyªn t¸i tæ hîp cã hiÖu qu¶ cao trong viÖc t¹o ®¸p øng miÔn dÞch ë gµ.
Víi nh÷ng kÕt qu¶ ®¹t ®−îc trªn cho thÊy kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC cã
nguån gèc tõ S. typhimurium ®· ®−îc biÓu hiÖn thµnh c«ng. Kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn
dÞch cña kh¸ng nguyªn nµy ®· ®−îc thö trªn gµ. Møc ®¸p øng miÔn dÞch cña kh¸ng
nguyªn t¸i tæ hîp ®−îc kiÓm tra b»ng c¸c kü thuËt Western blot vµ ELISA. KÕt qu¶
kiÓm tra ®· kh¼ng ®Þnh møc ®¸p øng miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp t−¬ng
®−¬ng víi kh¸ng nguyªn tù nhiªn. Víi kÕt qu¶ nµy, chóng t«i sÏ tiÕp tôc nghiªn cøu
kh¶ n¨ng b¶o hé cña kh¸ng nguyªn FliC ®Ó sö dông vµo môc ®Ých t¹o v¾c-xin t¸i tæ hîp
phßng chèng S. typhimurium ë gµ.
4.3.4. Tinh s¹ch protein t¸i tæ hîp GM3
Còng t−¬ng tù nh− qu¸ tr×nh tinh s¹ch Flic3, chóng t«i còng tiÕn hµnh tinh s¹ch
protein t¸i tæ hîp Gm3. Do trong néi bµo cña chñng E. coli BL21 mang gen gm3 cã
proteaza t−¬ng thÝch víi tr×nh tù protein Gm3 nªn chóng t«i ph¶i tiÕn hµnh øc chÕ
proteaza b»ng PMSF. Víi l−îng PMSF ®−îc bæ sung ngay trong qu¸ tr×nh ph¸ tÕ bµo,
protein Gm3 h¹n chÕ ®−îc l−îng bÞ c¾t. V× vËy, trong qu¸ tr×nh tinh s¹ch qua cét s¾c ký
¸i lùc, chung t«i ®· thu ®−îc protein Gm3. KÕt qu¶ tinh s¹ch ®−îc miªu t¶ trªn h×nh
3.18.
KÕt qu¶ tinh s¹ch cho thÊy, protein tinh s¹ch lµ b¨ng râ nÐt víi kÝch th−íc
kho¶ng 52Kda ®óng nh− tÝnh to¸n cña chóng t«i. H¬n n÷a, c¸c ph©n ®o¹n protein tinh
s¹ch ®· cho thÊy, ph©n ®o¹n tinh s¹ch tèt nhÊt lµ 3-5. C¸c ph©n ®o¹n protein nµy ®−îc
thu l¹i ®Ó tiÕn hµnh c¸c b−íc nghiªn cøu tiÕp theo.
52
4.3.5. Nghiªn cøu kh¶ n¨ng b¶o hé cña protein t¸i tæ hîp Flic3 vµ Gm3
§Ó nghiªn cøu kh¶ n¨ng b¶o hé cña protein t¸i tæ hîp chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¹o
vacxin t¸i tæ hîp tõ protein nµy. B»ng viÖc bæ sung t¸ chÊt theo tû lÖ 1:1, protein t¸i tæ
hîp vµ t¸ chÊt t¹o nªn vacxin t¸i tæ hîp. Sau ®ã, vacxin t¸i tæ hîp ®−îc tiªm vµo gµ 4
tuÇn tuæi ®Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng b¶o hé.
ViÖc nghiªn cøu kh¶ n¨ng b¶o hé cña vacxin t¸i tæ hîp ®−îc tiÕn hµnh trªn 100
con gµ 4 tu©n tuæi. Sè gµ ®−îc chia lµm 6 l«. Sau khi tiªm vacxin t¸i tæ hîp vµ vacxin
bÊt ho¹t, c¸c l« gµ ®−îc tiÕn hµnh l©y nhiÔm chñng ®éc víi liÒu ®ñ ®Ó cã kh¶ n¨ng g©y
chÕt. KÕt qu¶ qu¸ tr×nh kiÓm nghiÖm ®−îc nªu ë b¶ng 1
KÕt qu¶ sau khi thèng kª cho thÊy, ë l« 6 lµ gµ kh«ng ®−îc tiªm khi bÞ l©y
nhiÔm kh¶ sèng sãt kho¶ng 15% (10/12 con), trong khi kh¶ n¨ng sèng cña l« 4+5 tiªm
vacxin b©t ho¹t lµ 17/29 con (tøc 58%), vµ kh¶ n¨ng sèng cña l« 1+2+3 khi tiªm vacxin
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
H×nh 3.18: Ph©n tÝch protein Gm3 tinh s¹ch trªn gel polyacrylamide 12%
§−êng ch¹y 1: Protein ch−a tinh s¹ch
§−¬ng ch¹y 2: Protein ë dÞch röa
§−êng ch¹y 3: Thang protein chuÈn Fermentas
§−êng ch¹y 4 – 10: Protein thu ®−îc ë c¸c ph©n ®o¹n 1-7
Gm3
53
B¶ng 1. Kh¶ n¨ng b¶o hé cña v¾c xin t¸i tæ hîp
L«
gµ
Sè
l−îng
gµ
(Con)
Sè gµ chÕt
tr−íc khi
g©y nhiÔm
Lo¹i vacxin
tiªm
Lo¹i vi khuÈn g©y
nhiÔm
Sè gµ chÕt
sau khi
g©y nhiÔm
(con)
Sè gµ
cßn
sèng
(con)
Ghi
chó
1 15 3
T¸i tæ hîp
Flic3
S. enteritidis,
S. typhimurium 3 9
2 15 3
T¸i tæ hîp
Flic3+Gm3
S. enteritidis, S.
typhimurium 1 11
3 15 2
T¸i tæ hîp
Gm3
S. enteritidis, S.
typhimurium 3 10
4 15 2
BÊt ho¹t S.
enteritidis
S. enteritidis, S.
typhimurium 6 7
5 14 1
BÊt ho¹t S.
typhimurium
S. enteritidis, S.
typhimurium 3 10
14 7 Kh«ng tiªm vacxin
S. enteritidis, S.
typhimurium 5 2 6
12 2 Kh«ng tiªm vacxin Kh«ng nhiÔm 0 10
H×nh 3.19: KiÓm tra kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña vacxin t¸i tæ hîp b»ng kü thuËt
Western blot
B¶n A: Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp Gm3, B¶n B: Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp Flic3
§−êng ch¹y 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: Thang Protein chuÈn (fermentas)
§−êng ch¹y 2, 10: HuyÕt thanh gµ kh«ng tiªm vacxin
§−êng ch¹y 6, 14: HuyÕt thanh gµ tiªm hçn hîp Gm3 vµ Flic#
§−êng ch¹y 4: HuyÕt thanh gµ tiªm Gm3
§−êng ch¹y 14: HuyÕt thanh gµ tiªm Flic3
§−êng ch¹y 8: HuyÕt thanh gµ tiªm S. enteritidis
§−êng ch¹y 12: HuyÕt thanh gµ tiªm S. typhimurium
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
A
B
54
t¸i tæ hîp lµ 30/37 con ( tøc 81%). Nh− vËy, chóng t«i kh¼ng ®Þnh vacxin t¸i tæ hîp cã
kh¶ n¨ng b¶o hé gµ chèng Salmonella.
§Ó kiÓm tra vÒ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch vµ kh¶ n¨ng b¶o hé cña v¨cxin t¸i tæ
hîp chóng t«i tiÕn hµnh chän ngÉu nhiªn gµ ë c¸c l« kh¸c nhau ®Ó thu huyÕt thanh. Sau
®ã, b»ng ph−¬ng ph¸p lai Western blot víi kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp (Flic3 vµ Gm3),
c¸c mÉu huyÕt thanh nµy sÏ kh¼ng ®Þnh ®−îc kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña vacxin
t¸i tæ hîp (kÕt qu¶ ®−îc thÓ hiÖn trªn h×nh 3.19).
KÕt qu¶ cña kü thuËt Western blot cho thÊy, kh¸ng ngyªn t¸i tæ hîp Gm3 vµ
Flic3 cã kh¶ n¨ng b¾t ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp vµ kh¸ng
thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn tù nhiªn. KÕt qu¶ ®−îc kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n khi ë gµ ®èi
chóng kh«ng thÊy xuÊt hiÖn sù ®¸p øng miÔn dÞch ®Æc hiÖu víi kh¸ng nguyªn t¸i tæ
hîp. Víi kÕt qu¶ trªn, chóng t«i kh¼ng ®Þnh ®· t¹o thµnh c«ng vacxin t¸i tæ hîp chèng
salmonella ë gµ.
4.4. §Þnh type vi rót LMLM b»ng kü thuËt RT-PCR
4.4.1. Kh¸i qu¸t t×nh h×nh dÞch bÖnh LMLM t¹i ViÖt Nam trong vßng 5 n¨m trë
l¹i ®©y thêi gian gÇn ®©y (B¶ng 4.1).
B¶ng 4.1. T×nh h×nh bÖnh Lë måm Long Mãng giai ®o¹n 1999 – 10/2004
Tr©u bß Lîn
N¨m Sè
tØnh
Sè
huyÖn
Sè æ
dÞch
Sè
m¾c
Sè chÕt,
xö lý
Sè
tØnh
Sè
huyÖn
Sè æ
dÞch
Sè
m¾c
Sè chÕt,
xö lý
1999 55 347 1912 112579 1.309 52 217 958 25820 3270
2000 48 126 1708 351284 15136 51 266 1148 42999 14986
2001 16 29 47 3976 112 17 47 95 6428 1534
2002 26 71 183 10287 194 28 75 208 6933 2229
2003 28 88 266 20303 116 28 67 123 3533 712
2004* 28 77 250 9861 149 18 24 55 1065 528
*2004: Sè liÖu tÝnh ®Õn th¸ng 10.
VÒ c¸c chñng vi rót LMLM ë ViÖt Nam. Tõ n¨m 1995, Côc Thó y ®· x¸c ®Þnh vi
rót g©y bÖnh LMLM ë ViÖt Nam chØ cã typ O vµ hµng n¨m ®Òu göi mÉu sang WRL,
Pirbright ®Ó x¸c ®Þnh l¹i chñng vi rót g©y bÖnh ngoµi thùc ®Þa.
55
4.4.2. DiÔn biÕn l©m sµng cña bÖnh trªn bß vµ lîn
TriÖu chøng l©m sµng cña tr©u bß thay ®æi tuú theo thêi gian m¾c bÖnh. Khi m¾c
bÖnh, tr©u bß sèt cao (400C- 41,50C). Con vËt lê ®ê, uÓ o¶i, kÐm ¨n, l«ng dùng, bøt røt,
khã chÞu vµ run rÈy c¬. Khi ®· t¹o môn n−íc ë miÖng, l−ìi, bê vµ kÏ mãng, con vËt cã
biÓu hiÖn l©m sµng ®Æc tr−ng: Nhai nhãp nhÐp, run m«i, ch¶y n−íc d·i, run ch©n vµ ®i
khËp khiÔng, ®øng lªn n»m xuèng khã kh¨n. Khi c¸c môn n−íc vì ra cã dÞch mµu vµng
nh¹t, th©n nhiÖt h¹ xuèng b×nh th−êng. Quan s¸t thÊy môn n−íc vµ sau nµy lµ c¸c vÕt
loÐt ë mâm, l−ìi, xoang miÖng, nóm vó vµ trªn da gi÷a mãng trªn vµ mãng d−íi cña
bµn ch©n.
ë mét sè ®Þa ph−¬ng kh¸c nh− L¹ng S¬n, Phó Thä…chóng t«i ®· quan s¸t
nh÷ng lîn nghi bÞ bÖnh LMLM. Lîn cã môn n−íc ë bê mãng vµ kÏ mãng vµ ë mâm,
mòi. C¸c môn nøoc ë lîn khi vì ra dÔ bÞ nhiÔm khuÈn kÕ ph¸t.
Th«ng qua nh÷ng triÖu chøng l©m sµng ®−îc miªu t¶ nh− trªn céng víi sù so
s¸nh, tham kh¶o víi c¸c tµi liÖu cña c¸c t¸c gi¶ vÒ triÖu chøng cña gia sóc m¾c bÖnh
LMLM, vÒ mÆt chÈn ®o¸n l©m sµng, chóng t«i cho r»ng c¸c ®µn gia sóc mµ chóng t«i
tiÕn hµnh lÊy bÖnh phÈm nghi bÞ m¾c bÖnh LMLM. PhÇn lín c¸c bÖnh phÈm ®Òu ®−îc
thu thËp tõ nh÷ng gia sóc cã triÖu chøng l©m sµng nghi lµ bÞ bÖnh LMLM.
4.4.3. Thu thËp, vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n bÖnh phÈm tõ gia sóc nghi m¾c bÖnh
Thu thËp bÖnh phÈm tõ gia sóc nghi m¾c bÖnh LMLM. Nh− ®· nãi ë phÇn
Nguyªn LiÖu, chóng t«i cã hai nguån bÖnh phÈm tõ gia sóc nghi bÞ bÖnh LMLM: bÖnh
phÈm do Bé m«n HS-MD-BL trùc tiÕp lÊy vµ bÖnh phÈm do Chi côc Thó y cña mét sè
tØnh vµ cña Trung t©m Thó y vïng Thµnh phè Hå ChÝ Minh göi ®Õn. Tæng sè mÉu tõ hai
nguån kÓ trªn mµ chóng t«i ®· tiÕn hµnh chÈn ®o¸n vµ l−u gi÷ lµ 250 mÉu bÖnh phÈm
biÓu m«.
VËn chuyÓn bÖnh phÈm tõ gia sóc nghi m¾c bÖnh LMLM. §èi víi c¸c bÖnh
phÈm trùc tiÕp thu thËp tõ thùc ®Þa, lä ®ùng bÖnh phÈm ®−îc ®Æt vµo hép nhùa cã s½n
®¸ vµ ®−îc vËn chuyÓn vÒ ngay phßng thÝ nghiÖm. §èi víi bÖnh phÈm do c¸c Chi côc
Thó y thu thËp, lä ®ùng bÖnh phÈm còng ®−îc ®Æt trong c¸c hép xèp cã c¸c tói lµm
l¹nh chÌn xung quanh vµ ®−îc göi ph¸t chuyÓn nhanh tíi ViÖn Thó y.
B¶o qu¶n mÉu bÖnh phÈm tõ gia sóc nghi m¾c bÖnh LMLM. Sau khi mÉu bÖnh
phÈm ®Õn n¬i, bÖnh phÈm ®−îc b¶o qu¶n ë - 800C.
4.4.4. ThiÕt lËp ph−¬ng ph¸p RT–PCR ®Ó ph¸t hiÖn vi rót g©y bÖnh LMLM b»ng
mÉu ARN ®· biÕt
56
§Ó thiÕt lËp ph−¬ng ph¸p RT - PCR, chóng t«i ®· sö dông mÉu chuÈn lµ mÉu
ARN chiÕt t¸ch tõ bÖnh phÈm nghi LMLM cña ViÖt Nam, ®· ®−îc x¸c ®Þnh lµ chøa vi
H×nh 4.1: PCR víi cÆp måi 1F/1R ®Æc hiÖu cho c¸c typ O, A, C vµ Asia 1 cña vi rut LMLM
víi s¶n phÈm cã ®é dµi 328 cÆp baz¬. Tõ 1-14 lµ c¸c mÉu ARN chuÈn ®Æc hiÖu cho typ O
nhËn tõ Phßng thÝ nghiÖm chuÈn quèc tÕ vÒ LMLM (WRL) Pirbright. M lµ chØ thÞ ph©n tö.
rót LMLM type O, nhËn tõ phßng thÝ nghiÖm chuÈn Quèc tÕ Pirbright, Anh
Quèc.
Chóng t«i ®· dïng cÆp måi 1F/1R ®−îc c«ng bè lµ ®Æc hiÖu víi c¸c typ O, A, C
vµ Asial cña vi rót LMLM ®Ó thiÕt lËp ph−¬ng ph¸p RT - PCR t¹i ViÖt Nam. KÕt qu¶
®−îc nªu trªn h×nh 4.1 cho thÊy: víi cÆp måi 1F/1R, c¶ 14 mÉu ARN ®Òu cho kÕt qu¶
PCR d−¬ng tÝnh víi s¶n phÈm cã ®é dµi 328 bp (mòi tªn), hoµn toµn trïng hîp víi c¸c
H×nh 4.2. PCR víi cÆp måi P33/P38 ®Æc hiÖu cho typ O cña vi rót LMLM víi s¶n phÈm cã ®é
dµi 405 bp. Tõ 1-14 lµ c¸c chñng chuÈn ®Æc hiÖu cho typ O nhËn tõ phßng thÝ nghiÖm chuÈn
quèc tÕ vÒ LMLM (WRL), Pirbright, Anh Quèc. M lµ chØ thÞ ph©n tö.
kÕt qu¶ ®· c«ng bè vÒ cÆp måi nµy. Víi kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh 100%, chøng tá ®é
nh¹y cao, cÆp måi nµy hoµn toµn thÝch hîp ®Ó sö dông chÈn ®o¸n ph¸t hiÖn sù cã mÆt
cña vi rót g©y bÖnh LMLM ë ViÖt Nam.
57
Bªn c¹nh cÆp måi 1F/1R chóng t«i cßn tiÕn hµnh ph¶n øng RT-PCR sö dông cÆp
måi P33/P38 ®Æc hiÖu cho typ O víi kÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë H×nh 4.2 cho thÊy s¶n
phÈm PCR cã ®é dµi 405 cÆp baz¬ (mòi tªn). KÕt qu¶ nµy hoµn toµn trïng hîp víi kÕt
qu¶ mµ Phßng thÝ nghiÖm Pirbright ®· tiÕn hµnh.
4.4.5. ChÈn ®o¸n ®Þnh type c¸c mÉu bÖnh phÈm thu thËp t¹i tØnh Qñang TrÞ
Vµo th¸ng 2 n¨m 2003, t¹i tØnh Qu¶ng TrÞ (QT), cã dÞch ë bß vµ lîn víi triÖu
chøng l©m sµng nghi lµ bÖnh LMLM (H×nh 4.3). Chóng t«i ®· tiÕn hµnh kh¸m vµ lÊy
H×nh 4.3. ¶nh chôp bß cã triÖu
chøng l©m sµng nghi lµ m¾c bÖnh
LMLM. §· tiÕn hµnh lÊy mÉu
biÓu m« cña 3 bß. BÖnh phÈm
®−îc b¶o qu¶n ë 4oC trong dung
®Þch ®Öm phèt ph¸t-glycerine cã
bæ sung kh¸ng sinh. Sau khi ®−îc
vËn chuyÓn ®Õn phßng thÝ nghiÖm,
bÖnh phÈm ®−îc b¶o qu¶n ë -
80oC cho ®Õn khi dïng.
mÉu bÖnh phÈm biÓu m« cña 3 bß m¾c bÖnh trong giai ®o¹n ®Çu. KÕt qu¶ RT-PCR ®èi
víi 3 bÖnh phÈm tõ QT ®−îc tr×nh bµy ë H×nh 4.4. KÕt qu¶ cña H×nh 4.4A cho thÊy, 2
trong sè mÉu bÖnh phÈm thu thËp tõ QT cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh víi cÆp måi 1F/1R lµ
cÆp måi ®Æc hiÖu chung. KÕt qu¶ 4.4B cho thÊy 2 trong sè 3 bÖnh phÈm cho ph¶n øng
d−¬ng tÝnh víi cÆp måi P33/P38, lµ cÆp måi ®Æc hiÖu cho type O. §−îc dïng nh− ®èi
chóng d−¬ng (type O) trong ph¶n øng, mÉu chuÈn (d¶i P, H×nh 4.4B) lµ ARN mµ WRL,
Pirbright göi cho chóng t«i còng cho kÕt qu¶ t−¬ng tù.
QT1 QT2 QT3 M
P QT1 QT2 QT3 M
H×nh 4.4. H×nh A. KÕt qu¶ RT-PCR
dïng cÆp måi 1F/1R ®Æc hiÖu chung
®Ó nhËn biÕt c¸c type O,A,C, vµ Asia-1
cña vi rót LMLM. S¶n phÈm PCR ®Æc
hiÖu cã ®é dµi 328 cÆp baz¬ (mòi tªn).
H×nh B. KÕt qu¶ cña ph−¬ng ph¸p RT-
PCR víi cÆp måi P33/P38 ®Æc hiÖu
cho type O cña virus LMLM. S¶n
phÈm PCR ®Æc hiÖu cã ®é dµi 405 cÆp
baz¬ (mòi tªn). Tõ QT1- QT3 lµ c¸c
mÉu bÖnh phÈm bÓu m« thu thËp QT.
P lµ mÉu chuÈn nhËn tõ Phßng ThÝ
nghiÖm ChuÈn Quèc tÕ vÒ LMLM,
WRL-Pirbright. M lµ chØ thÞ ph©n tö. A B
4.4.6. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña c¸c cÆp måi dïng trong chÈn ®o¸n
®Þnh type vi rót g©y bÖnh LMLM.
58
TÝnh ®Æc hiÖu cña c¸c cÆp måi P33/P38 (typ O), P33/P37 (type A), P33/P40
(type C) vµ P33/P74 (typ Asia-1) ®−îc kiÓm tra víi ARN chuÈn nhËn tõ WRL,
Pirbright vµ mÉu ARN chiÕt t¸ch tõ bÖnh phÈm mµ chóng t«i thu thËp ®−îc tõ QT.
H×nh 4.5. KÕt qu¶ kiÓm tra ®é ®Æc hiÖu cña
c¸c cÆp måi: 1F/1R, P33/P38, P33/P87,
P33/P40, P33/P74 víi mÉu chuÈn nhËn tõ
WRL, Pirbright ®· ®−îc x¸c ®Þnh lµ typ O vµ
mÉu ARN chiÕt t¸ch tõ bÖnh phÈm biÓu m«
thu thËp t¹i QT. P1, P2, P4, P7, P9, P11 lµ
c¸c mÉu chuÈn nhËn tõ phßng thÝ nghiÖm
chuÈn quèc tÕ vÒ LMLM (WRL), Pirbright,
Anh Quèc. QT3, QT5, QT8, QT10, QT12 lµ
c¸c mÉu bÖnh phÈm biÓu m« thu thËp tõ thùc
®Þa. M lµ chØ thÞ ph©n tö.
KÕt qu¶ tr×nh bµy trªn h×nh 4.5 cho thÊy víi c¸c cÆp måi 1F/1R vµ P33/P38,
ph¶n øng PCR cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh víi mÉu chuÈn nhËn tõ Phßng ThÝ nghiÖm
WRL/FMD cña Pirbright – ký hiÖu lµ P (giÕng 2, 4) vµ víi mÉu bÖnh phÈm thu thËp tõ
QT – Ký hiÖu lµ QT (giÕng 3, 5). S¶n phÈm PCR ®Æc hiÖu víi cÆp måi 1F/1R cã ®é dµi
lµ 328 cÆp baz¬ vµ ®èi víi cÆp måi P33/P38 s¶n phÈm PCR cã ®é dµi lµ 420 cÆp baz¬.
KÕt qu¶ nµy trïng hîp víi c¸c kÕt qu¶ kh¸c ®· ®−îc c«ng bè vÒ c¸c cÆp måi nµy.
KÕt qu¶ trªn h×nh 4.5 còng cho thÊy: ®èi víi 3 cÆp måi ®Æc hiÖu type cßn l¹i
(P33/P40, P33/P74, P33/P87), ph¶n øng RT-PCR cho kÕt qu¶ ©m tÝnh. §iÒu ®ã còng
chøng tá r»ng c¸c cÆp måi nµy hoµn toµn ®Æc hiÖu v× chóng kh«ng b¾t cÆp víi chuçi
ADN khu«n t¹o thµnh tõ mÉu ARN chuÈn (giÕng 7, 9, 11) còng nh− mÉu ARN t¸ch
chiÕt tõ mÉu bÖnh phÈm thùc ®Þa (giÕng 8, 10 vµ 12).
Tõ kÕt qu¶ trªn, cã thÓ cho r»ng c¸c bÖnh phÈm mµ chóng t«i thu thËp ®−îc cã
chøa vi rót g©y bÖnh LMLM type O v× chóng cã ph¶n øng RT-PCR d−¬ng tÝnh víi cÆp
måi 1F/1R (giÕng 3), vµ cÆp måi P33/P38 (giÕng 5) nh−ng ©m tÝnh víi c¸c cÆp måi ®Æc
hiÖu type cßn l¹i (giÕng 8, 10 vµ 12).
4.4.7. KÕt qu¶ øng dông ph−¬ng ph¸p RT-PCR ®Ó chÈn ®o¸n ®Þnh typ vi rót g©y
bÖnh LMLM tõ c¸c bÖnh phÈm thu thËp tõ thùc ®Þa
Tæng sè mÉu bÖnh phÈm biÓu m« mµ chóng t«i trùc tiÕp thu thËp tõ c¸c æ dÞch
vµ nhËn tõ c¸c Chi côc Thó y, Trung t©m Thó y vïng Thµnh phè Hå ChÝ Minh göi ®Õn
lµ 251 mÉu. Nh− nhËn xÐt ë phÇn trªn, trong thêi gian chóng tèi tiÕn hµnh nghiªn cøu,
kh«ng cã mÉu bÖnh phÈm nµo ®−îc x¸c ®Þnh mang vi rut LMLM thuéc typ A, C hay
Asia-1. KÕt qu¶ nµy còng trïng hîp víi nh÷ng th«ng b¸o cña Côc Thó y cho ®Õn th¸ng
8 n¨m 2004 r»ng cho ®Õn thêi ®iÓm ®ã vi rót g©y bÖnh LMLM ë ViÖt Nam chØ lµ typ O
dùa trªn kÕt qu¶ cña ph−¬ng ph¸p ELISA phat hiÖn vµ ®Þnh type vi rót.
59
B¶ng 4.2. ChÈn ®o¸n ®Þnh typ vi rót LMLM tõ bÖnh phÈm thùc ®Þa
1F/1R P33/P38 P33/P74 P33/P87 P33/P40 Lo¹i mÉu
vµ sè
l−îng
K
Õt
q
u¶
Sè
l−îng
% Sè
l−îng
% Sè
l−îng
% Sè
l−îng
% Sè
l−îng
%
- 30 100 30 100 30 100 30 100 30 100A 30
+ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
- 33 13 83 33 30* 100 30* 100 30* 100B 251
+ 218 87 168 67 0 0 0 0 0 0
Chó thÝch: A: BÖnh phÈm "©m": tÕ bµo BHK-21 kh«ng ®−îc g©y nhiÔm vµ bÖnh phÈm da hoÆc
m« bµo ®éng vËt thu thËp t¹i lß mæ. B: BÖnh phÈm biÓu m« cña ®éng vËt nghi bÞ bÖnh LMLM
thu thËp tõ thùc ®Þa. * 30 mÉu bÖnh phÈm thùc ®Þa trong ®ã lÊy 15 mÉu ©m tÝnh víi cÆp måi
1F/1R vµ 15 mÉu d−¬ng tÝnh víi cÆp måi 1F/1R. 1F/1R: cÆp måi ®Æc hiÖu chung (universal
primers), P33/P38: cÆp måi ®Æc hiÖu cho vi rót type O, P33/P74: cÆp måi ®Æc hiÖu cho type
Asia-1, P33/P87: cÆp måi ®Æc hiÖu cho type typ A vµ P33/P40: cÆp måi ®Æc hiÖu cho type C.
Trong qu¸ tr×nh øng dông ph−¬ng ph¸p RT-PCR vµo viÖc chÈn ®o¸n mÉu bÖnh
phÈm tõ thùc ®Þa, chóng t«i nhËn thÊy ë mét sè thÝ nghiÖm tuy cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh
víi cÆp måi 1F/1R (®Æc hiÖu chung cho c¸c type O, A, C vµ Asia-1) nh−ng ©m tÝnh víi
tÊt c¶ c¸c cÆp måi ®Æc hiÖu cho tõng type riªng biÖt. Nh÷ng tr−êng hîp nµy ®Òu r¬i vµo
mÉu bÖnh phÈm cña lîn. Chóng t«i ®· göi c¸c mÉu nµy sang ViÖn C«ng nghÖ sinh häc
®Ó tiÕn hµnh gi¶i m· gen. KÕt qu¶ so s¸nh víi ng©n hµng gen cho thÊy c¸c mÉu bÖnh
phÈm cã chøa vi rót LMLM thuéc typ O. Nguyªn nh©n cña hiÖn t−îng trªn cã thÓ lµ do
®é nh¹y cña cÆp måi P33/P38 ch−a cao víi mÉu dÞch phÈm tõ lîn cña ViÖt Nam thuéc
type O Cathay. Do ®ã, cÇn ph¶i tiÕn hµnh thªm c¸c thÝ nghiÖm ®Ó t×m cho ®−îc cÆp måi
nµo thÝch hîp nhÊt cho mÉu bÖnh phÈm cña lîn type O Cathay.
4.4.8. T¸ch dßng vµ gi¶i tr×nh tr×nh tù ®o¹n gene m· ho¸ cho serotype O cña vi
rut g©y bÖnh Lë måm long mãng thu thËp t¹i tØnh Qñang TrÞ
TiÕn hµnh t¸ch dßng b»ng c¸ch g¾n trùc tiÕp s¶n phÈm PCR vµo vector t¸ch
dßng pCRTM2.1 víi bé Kit cña H·ng Invitrogen råi biÕn n¹p vµo vi khuÈn E.coli
chñng DH-5α. C¸c khuÈn l¹c cña E.coli cã chøa ®o¹n ADN ngo¹i lai ®−îc t¸ch tõ
khuÈn l¹c riªng rÏ mµu tr¾ng b»ng ph−¬ng ph¸p miniprep vµ sau ®ã ®−îc tuyÓn chän
60
b»ng c¸ch ch¹y ®iÖn di trªn gel agarose 1 %. Chän c¸c plasmid cã kÝch th−íc lín h¬n
plasmid gèc (t¸ch tõ khuÈn l¹c mµu xanh). KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy trªn h×nh 4.6.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
A B
H×nh 4.6: (A) §iÖn di trªn gel agarose 1% ®Ó chän c¸c plasmid mang gene ®Æc hiÖu cho
typ O. Kªnh tõ 1-6 vµ tõ 8-12 lµ plasmit t¸ch tõ khuÈn l¹c mµu tr¾ng. Kªnh 7 lµ plasmit
t¸ch tõ khuÈn l¹c mµu xanh. (B) §iÖn di ®Ó chän c¸c plasmit mang gene ®Æc hiÖu chung
®Ó nhËn biÕt c¸c typ O, A, C, vµ Asia-1. Kªnh tõ 1-8 vµ tõ 10-17 lµ plasmit t¸ch tõ
khuÈn l¹c mµu tr¾ng. Kªnh 9 lµ plasmit t¸ch tõ khuÈn l¹c mµu xanh.
Trong sè c¸c plasmid kÓ trªn, chóng t«i ®· chän 8 plasmid cã kh¶ n¨ng mang
gene ®Æc hiÖu cho typ O (H×nh 4.6A) vµ 10 plasmid cã kh¶ n¨ng mang gene ®Æc hiÖu
chung ®Ó nhËn biÕt c¸c type O, A, C, vµ Asia-1 (H×nh 4.6B) råi c¾t b»ng enzym giíi
h¹n EcoRI. Sau khi ®−îc c¾t b»ng enzym nµy, ®o¹n ADN ngo¹i lai ®−îc t¸ch ra khái
vect¬ pCRTM2.1. KÕt qu¶ thùc nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 4.7.
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11
A B
H×nh 4.7. §iÖn di trªn gel agarose 1% ®Ó kiÓm tra c¸c plasmid cã kh¶ n¨ng mang ®o¹n
ADN ngo¹i lai sau khi ®−îc c¾t b»ng enzym giíi h¹n EcoRI. M lµ chØ thÞ ph©n tö. (A).
C¸c plasmit cã kh¶ n¨ng mang ®o¹n gene ®Æc hiÖu cho typ O. Kªnh tõ 1-5 vµ 7-9 lµ c¸c
dßng plasmit ®−îc c¾t b»ng EcoRI, kªnh 6 lµ s¶n phÈm PCR tr−íc khi g¾n vµo vect¬ t¸ch
dßng. (B). C¸c plasmid cã kh¶ n¨ng mang ®o¹n gene ®Æc hiÖu chung ®Ó nhËn biÕt c¸c typ
O, A, C, vµ Asia-1. Kªnh tõ 1-7 vµ 9-11 lµ c¸c plasmid ®−îc c¾t b»ng EcoRI. Kªnh 8 lµ
s¶n phÈm PCR tr−íc khi g¾n vµo vect¬ t¸ch dßng.
KÕt qu¶ thùc nghiÖm tr×nh bµy ë h×nh 4.7A vµ 4.7B cho thÊy sau khi c¾t b»ng
enzym EcoRI ®o¹n ADN ngo¹i lai ®−îc t¸ch ra khái vect¬ pCRTM2.1 vµ cã ®é dµi
t−¬ng øng víi ®o¹n ADN tr−íc khi g¾n vµo vect¬. Dùa vµo kÕt qu¶ trªn, chóng t«i ®·
61
thu ®−îc 6 dßng plasmid mang ®o¹n ADN ngo¹i lai ®Æc hiÖu cho type O vµ 5 dßng
plasmid mang ®o¹n ADN ngo¹i lai ®Æc hiÖu chung ®Ó nhËn biÕt c¸c type O, A, C, vµ
Asia-1.
C¸c dßng plasmit mang ®o¹n ADN ngo¹i lai ®−îc tinh chÕ b»ng c¸ch kÕt tña víi
PEG-6000 (H×nh 4.8) vµ tr×nh tù nucleotid ®−îc x¸c ®inh b»ng m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù
ADN tù ®éng. Tõ s¶n phÈm PCR víi cÆp måi 1F/1R, t¸ch dßng 2 ®o¹n gene ký hiÖu P1
vµ P2 ®¹i diÖn cho mÉu ARN chuÈn nhËn tõ Phßng ThÝ nghiÖm chuÈn WRL, Pirbright
vµ mét ®o¹n gen P54 ®¹i diÖn cho mÉu bÖnh phÈm cña QT. Víi cÆp måi P33/P38, còng
®· t¸ch dßng 2 ®o¹n gene kh¸c lµ P9 ®¹i diÖn cho mÉu ARN nhËn tõ Phßng ThÝ nghiÖm
chuÈn WRL, Pirbright vµ P55 ®¹i diÖn cho mÉu bÖnh phÈm tõ QT.
P1 P2 P54 P9 P55
H×nh 4.8. KÕt qu¶ tinh s¹ch c¸c dßng plasmid
mang ®o¹n ADN ngo¹i lai b»ng PEG 6000
KÕt qu¶ gi¶i tr×nh tr×nh tù nuclªotide. Tr×nh tù c¸c ®o¹n gene kÓ trªn ®−îc so
s¸nh víi tr×nh tù c¸c ®o¹n gene cña c¸c vi rót LMLM ®· ®¨ng ký trong ng©n hµng d÷
liÖu gene b»ng ch−¬ng tr×nh FASTA t¹i ®Þa chØ: KÕt qu¶ cho
thÊy: P1 cã ®é t−¬ng ®ång cao nhÊt lµ 97.256 %; P2: 97.866 %; P54: 95.427 %; P9:
99.005 %, vµ P55: 96.766 % so víi c¸c tr×nh tù ®· ®−îc c«ng bè trªn Ng©n hµng d÷
liÖu gene. §iÒu nµy chøng tá mÉu ARN nhËn tõ Phßng ThÝ nghiÖm WRL, Pirbright
®−îc chiÕt t¸ch tõ bÖnh phÈm cã chøa vi rót LMLM type O vµ mÉu bÖnh phÈm tõ QT
mµ chóng t«i thu thËp ®−îc còng chøa vi rót type O.
4.4.9. KÕt qu¶ ph©n lËp vi rót trªn tÕ bµo dßng BHK-21
62
Nu«i cÊy vµ duy tr× tÕ bµo BHK-21. Sau khi nu«i cÊy tÕ bµo BHK-21, nhËn thÊy
®Æc ®iÓm, h×nh th¸i, tÝnh chÊt cña tÕ bµo BHK-21 vÉn kh«ng thay ®æi so víi tÕ bµo gèc
®−îc nhËn tõ Ph¸p. C¸c kÕt qu¶ nu«i cÊy, duy tr×, b¶o qu¶n vµ håi phôc tÕ bµo ®Òu phï
hîp víi c¸c tÝnh chÊt cña dßng tÕ bµo mµ c¸c t¸c gi¶ ngoµi n−íc ®· m« t¶.
Mét giê sau khi tiÕn hµnh nu«i cÊy, quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn vi quang häc thÊy tÕ
bµo b¾t dÇu b¸m dÝnh xuèng bÒ mÆt cña ®¸y chai. Sau kho¶ng 6-9 giê tÕ bµo ph¸t triÓn
dµi ë 2 ®Çu vµ b¸m dÝnh víi nhau. Sau tõ 24- 48 giê tÕ bµo b¸m thµnh mét líp xuèng bÒ
mÆt cña ®¸y chai vµ kÕt nèi víi nhau thµnh h×nh m¹ng, thØnh tho¶ng cã nh÷ng côm tÕ
bµo mäc chång lªn nhau. KÕt qu¶ nu«i cÊy tÕ bµo ®−îc ghi l¹i ë H×nh 4.9.
H×nh 4.9A. 24 giê sau khi nu«i cÊy H×nh 4.9B. 48 giê sau khi nu«i cÊy
KÕt qu¶ duy tr×, b¶o qu¶n, håi phôc vµ sö dông tÕ bµo BHK-21 trong nghiªn cøu
vi rót g©y bÖnh LMLM ®· ®−îc ®¨ng trong Ký yÕu 35 n¨m nghiªn cøu vµ ph¸t triÓn cña
ViÖn Thó y (1969-2004) vµ sÏ ®−îc ®¨ng trong T¹p chÝ Khoa häc Kü thuËt Thó y trong
sè 5 n¨m 2005 (TrÇn ThÞ Thanh Hµ vµ cs, 2005).
G©y nhiÔm bÖnh phÈm nghi vi rót LMLM lªn tÕ bµo BHK-21. KÕt qu¶ g©y nhiÔm
®−îc chôp l¹i t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau víi c¸c CPE ®iÓn h×nh (xem h×nh 4.10).
H×nh 4.10A. 48 h sau g©y nhiÔm H×nh 4.10B. 72 h sau g©y nhiÔm
63
TiÕn hµnh ph−¬ng ph¸p RT-PCR víi cÆp måi ®Æc hiÖu cho vi rót LMLM type O
víi kÕt qu¶ thu ®−îc d−¬ng tÝnh, chóng t«i kÕt luËn ®· g©y nhiÔm vµ ph©n lËp thµnh
c«ng vi rót g©y bÖnh LMLM tõ bÖnh phÈm cña gia sóc m¾c bÖnh t¹i QT lªn tÕ bµo. KÕt
qu¶ chi tiÕt ®−îc tr×nh bµy trong mét Ên phÈm ®¨ng trªn T¹p ChÝ Khoa häc Kü thuËt
Thó y víi tiªu ®Ò “Ph©n lËp vi rót Lë måm long mãng tõ æ dÞch t¹i tØnh QT” (Xem phÇn
Phô Lôc).
So s¸nh chÈn ®o¸n vi rót g©y bÖnh LMLM b»ng RT-PCR tõ bÖnh phÈm biÓu m«
vµ tõ bÖnh phÈm biÓu m« ®· cÊy chuyÓn trªn tÕ bµo. BÖnh phÈm biÓu m« lÊy tõ gia sóc
cã triÖu chøng l©m sµng nghi m¾c bÖnh LMLM tõ thùc ®Þa sau khi kiÓm tra b»ng ph¶n
øng RT- PCR cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh, ®· ®−îc Bé M«n HS-MD-BL ViÖn Thó- y g©y
nhiÔm thµnh c«ng trªn tÕ bµo dßng BHK-21. Khi tÕ bµo xuÊt hiÖn CPE (bÖnh tÝch tÕ
bµo) nghi lµ do vi rót LMLM g©y ra víi biÓu hiÖn: tÕ bµo co trßn l¹i vµ bong trãc ra
khái bÒ mÆt cña ®¸y chai, råi næi lªn trªn, chóng t«i chiÕt t¸ch ARN tõ mét phÇn tÕ bµo
bÞ nhiÔm vµ tiÕn hµnh lµm ph¶n øng RT- PCR víi mÉu ARN ®ã (H×nh 4.11).
H×nh 4.11A. KÕt qu¶ RT-PCR víi mÉu
bÖnh phÈm tr−íc khi nu«i cÊy trªn TB
H×nh 4.11B. KÕt qu¶ RT-PCR víi mÉu
bÖnh phÈm sau khi nu«i cÊy trªn TB
Chóng t«i nhËn thÊy: C¸c mÉu ARN chiÕt t¸ch tõ tÕ bµo ®−îc g©y nhiÔm b»ng
bÖnh phÈm thu thËp tõ thùc ®Þa cho s¶n phÈm PCR lµ nh÷ng b¨ng ADN s¸ng h¬n, gän
vµ s¾c nÐt h¬n so víi c¸c mÉu ARN chiÕt t¸ch tõ bÖnh phÈm thùc ®Þa ch−a g©y nhiÔm
lªn tÕ bµo. Tõ kÕt qu¶ ®ã, cã thÓ cho lµ mÉu ARN chiÕt t¸ch tõ tÕ bµo ®−îc g©y nhiÔm
b»ng bÖnh phÈm thùc ®Þa cã ®é tinh khiÕt cao h¬n so víi mÉu ARN chiÕt t¸ch tõ bÖnh
phÈm thùc ®Þa.
§iÒu nµy còng hoµn toµn phï hîp víi ph−¬ng diÖn lý thuyÕt: sau khi nu«i cÊy vi
rót LMLM trªn m«i tr−êng tÕ bµo víi c¸c ®iÒu kiÖn ®Æc biÖt th× mÉu ARN chiÕt t¸ch
64
®−îc tinh läc h¬n, kh«ng bÞ t¹p lÉn bëi c¸c thµnh phÇn kh¸c cña m« bµo, ®ång thêi
còng ®óng víi kÕt qu¶ øng dông ph−¬ng ph¸p RT-PCR ®Ó chÈn ®o¸n bÖnh phÈm nghi
tõ thùc ®Þa cña chóng t«i nh− ®· tr×nh bµy ë c¸c phÇn trªn.
4.4.10. KÕt qu¶ so s¸nh 2 ph−¬ng ph¸p ELISA vµ RT-PCR ®Ó chÈn ®o¸n-®Þnh
typ virut LMLM
§Ó s¸nh ®é nh¹y cña ph−¬ng ph¸p ELISA vµ ph−¬ng ph¸p RT-PCR, chóng t«i
®· phèi hîp víi TTTYVTPHCM tiÕn hµnh thùc nghiÖm nµy. TTTYVTPHCM ®· göi
cho chóng t«i 17 bÖnh phÈm (B¶ng 4.3) ®−îc ®¸nh sè thø tù nh−ng kh«ng ghi kÕt qu¶
ELISA. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh ph−¬ng ph¸p RT-PCR ®èi víi nh÷ng bÖnh phÈm nµy vµ
göi kÕt qu¶ cña ph−¬ng ph¸p RT-
PCR l¹i cho TTTYVTPHCM
(H×nh 4.12). Sau khi nhËn ®−îc
kÕt qu¶ RT-PCR, TTTYV
TPHCM göi l¹i cho chóng t«i kÕt
qu¶ cña ph−¬ng ph¸p ELISA ®ãi
víi tõng bÖnh phÈm ®· ®−îc ®¸nh
sè kÓ trªn. Trong sè 17 bÖnh
phÈm, cã 15 bÖnh phÈm lµ biÓu
m« môn n−íc cña gia sóc nghi lµ
m¾c bÖnh LMLM vµ 2 bÖnh
phÈm lµ tÕ bµo ®−îc g©y nhiÔm
H×nh 4.12.. KÕt qu¶ RT-PCR ®èi víi 17 bÖnh phÈm
cña TTTYVTPHCM. GiÕng 12 lµ chØ thÞ ph©n tö,
giÕng 17 lµ ®èi chøng ©m (tÕ bµo BHK-21 kh«ng
®−îc g©y nhiÔm) vµ giÕng 20 lµ ®èi chøng d−¬ng
(virut LMLM typ O ph©n lËp t¹i QT) cßn l¹i lµ bÖnh
phÈm trong ®ã giÕng 18 vµ 19 lµ bÖnh phÈm tÕ bµo
®−îc g©y nhiÔm virut LMLM typ O.
víi bÖnh phÈm ®−îc x¸c ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p ELISA lµ cã chøa virut LMLM typ O.
Tõ hai kÕt qu¶ nµy, chóng t«i s¬ bé so s¸nh ®é nh¹y cña hai ph−¬ng ph¸p (B¶ng 4.3).
KÕt qu¶ cña ph−¬ng ph¸p RT-PCR cho thÊy, trong sè 17 bÖnh phÈm , cã 15 bÖnh
phÈm cho kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh víi cÆp måi 1F/1R vµ 1 bªnh phÈm cho kÕt qu¶ ©m tÝnh
còng víi cÆp måi nµy (bÖnh phÈm sè 6). Trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i ®· sö dông
cÆp måi 1F/1R lµ cÆp måi ®Æc hiÖu chung cho tÊt c¶ c¸c virut LMLM (7 typ). TiÕp theo
®ã, chóng t«i ®· dïng cÆp måi P33/P38 ®Æc hiÖu víi typ O cña virut LMLM ®èi víi
nh÷ng bÖnh phÈm nµy vµ kÕt qu¶ cho thÊy c¸c mÉu d−¬ng tÝnh víi cÆp måi 1F/1R ®Òu
lµ virut typ O (kÕt qu¶ kh«ng tr×nh bµy).
65
B¶ng 4.3. So s¸nh ph−¬ng ph¸p ELISA vµ RT-PCR
trªn bÖnh phÈm cña TTTYVTP HCM
KÕt qu¶ Ghi chó S
T
T
Ký hiÖu mÉu Lo¹i
bÖnh
phÈm
ELISA RT-PCR
Primers 1F/1R
Chi tiÕt ph−¬ng
ph¸p RT-PCR
Sè thø tù
trªn Gel
1 13-06-03-01 BM* - + 1
2 13-06-03-02 BM + + 2
3 13-06-03-03 BM - + 3
4 13-06-03-04 BM + + 4
5 13-06-03-05 BM + + 5
6 13-06-03-06 BM - - 6
7 13-06-03-07 BM - + 7
8 13-06-03-08 BM + + 8
9 13-06-03-09 BM + + 9
10 13-06-03-10 BM + + 10
11 13-06-03-11 BM + + 11
ChØ thÞ ph©n tö 12
12 13-06-03-12 BM + + 13
13 13-06-03-13 BM - + 14
14 13-06-03-14 BM + + 15
15 13-06-03-15 BM + + 16
§èi chøng ©m 17
16 99- 174 TB TB** + + Sö lý 56o/60p 18
17 03-030 TB TB + + Sö lý 56o/60p 19
*** + BÖnh phÈm QT 20
Ghi chó: *BiÓu m« môn n−íc, ** TÕ bµo ®−îc g©y nhiÔm, *** Kh«ng lµm.
KÕt qu¶ cña ph−¬ng ph¸p ELISA (B¶ng 4.3) cho thÊy trong sè 17 bÖnh phÈm, cã
12 bÖnh phÈm cho ph¶n øng d−¬ng tÝnh vµ 5 bÖnh phÈm cho kÕt qu¶ ©m tÝnh (bÖnh
phÈm 1, 3, 6, 7 vµ 13). Cã thÓ thÊy râ r»ng bÖnh phÈm 6 ©m tÝnh víi c¶ hai ph−¬ng ph¸p
vµ 4 bÖnh phÈm (1, 3, 7, 13) d−¬ng tÝnh víi ph−¬ng ph¸p RT-PCR.
Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn, cã thÓ b−íc ®Çu kÕt luËn r»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR nhËy
h¬n ph−¬ng ph¸p ELISA trong viÖc chÈn ®o¸n-®Þnh typ virut g©y bÖnh LMLM. §Ó cã
kÕt luËn chÝnh x¸c, cÇn tiÕn hµnh hai ph−¬ng ph¸p víi sè l−îng mÉu lín h¬n n÷a.
66
Ch−¬ng IV
KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ
KÕt luËn
Trong thêi gian ba n¨m thùc hiÖn ®Ò tµi, víi nh÷ng nç lùc rÊt lín - mÆc dï cã
nh÷ng lý do kh¸ch quan trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi, ®Æc biÖt lµ bÖnh Cóm gia cÇm
xtõ cuèi n¨m 2003 cho ®Õn nay, tËp thÓ c¸c c¸n bé chñ tr× ®Ò tµi vµ c¸c thµnh viªn tham
gia trong tõng ®Ò tµi nh¸nh ®· rÊt tÝch cùc hoµn thµnh c¸c néi dung nghiªn cøu ®· ®Ò ra.
Nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu mµ ®Ò tµi ®· thu ®−îc, nh− ®· nªu trong b¶n tù ®¸nh
gi¸ vµ biÓu hiÖn qua c¸c ®ît kiÓm tra ®Þnh kú §Ò tµi, võa cã ý nghÜa vÒ mÆt khoa häc
võa cã ý nghÜa vÒ mÆt thùc tÕ vµ ®−îc tãm t¾t l¹i nh− sau:
I. C¸c chØ tiªu c¬ b¶n cña c¸c s¶n phÈm
Sè l−îng v¾c xin s¶n xuÊt vµ thö nghiÖm ®óng vµ v−ît yªu cÇu (yªu cÇu lµ 3000
liÒu v¾c xin mçi lo¹i) ®èi víi v¾c xin s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ vi khuÈn. §èi víi v¾c
xin t¸i tæ hîp, Chñ tr× ®Ò tµi nh¸nh ®· cã b¶n thuyÕt tr×nh vÒ c«ng nghÖ kh«ng thÓ s¶n
xuÊt v¾c xin t¸i tæ hîp víi sè l−îng lín nh− vËy do ®iÒu kiÖn trang thiÕt bÞ chØ phï hîp
víi nghiªn cøu vµ s¶n xuÊt ë qui m« nhá d−íi 1000 liÒu.
Ph−¬ng ph¸p RT-PCR øng dông ®Ó chÈn ®o¸n ®Þnh type vi rót g©y bÖnh LMLM
lµ ph−¬ng ph¸p cã ®é nh¹y vµ ®é ®Æc hiÖu cao h¬n so víi ph−¬ng ph¸p ELISA lµ
ph−¬ng ph¸p hiÖn ®ang ®−îc sö dông trong thùc tÕ chÈn ®o¸n t¹i ViÖt Nam.
II. VÒ néi dung vµ ph−¬ng ph¸p sö dông
Nh÷ng néi dung nghiªn cøu cña §Ò tµi lµ hoµn toµn míi víi nh÷ng c¨n cø sau
®©y.
- T×m ra mét c«ng thøc v¾c xin chèng bÖnh tô huyÕt trïng tr©u bß cã hiÖu lùc
phßng hé cao so víi nh÷ng v¾c xin hiÖn cã.
- V¾c xin v« ho¹t phßng chèng vi khuÈn Salmonella enteritidis vµ Salmonella
typhimurium lÇn ®Çu tiªn ®−îc nghiªn cøu vµ chÕ t¹o t¹i ViÖt Nam.
67
- V¾c xin biÕn n¹p chèng bÖnh Salmonella enteritidis vµ Salmonella
typhimurium lÇn ®Çu tiªn ®−îc nghiªn cøu vµ chÕ t¹o t¹i ViÖt Nam.
- ChÈn ®o¸n, ®Þnh type vi rut g©y bÖnh LMLM b»ng kü thuËt sinh häc ph©n tö
(RT-PCR) lÇn ®Çu tiªn ®−îc ¸p dông t¹i ViÖt Nam. VÒ c¸c néi dung “t¸ch dßng vµ gi¶i
tr×nh tù ®o¹n gen m· hãa ®Æc hiÖu cho type O cña vi rót LMLM tõ bÖnh phÈm thùc ®Þa”
vµ “ph©n lËp vi rót g©y bÖnh LMLM t¹i mét æ dÞch cña tØnh Qu¶ng TrÞ” lµ c¸c néi dung
hoµn toµn míi, v−ît h¬n yªu cÇu cña §Ò tµi ®· ®Æt ra vµ lµm tiÒn ®Ò cho viÖc ®Þnh
subtype cña vi rót LMLM vµ nghiªn cøu vÒ vi rót g©y bÖnh LMLM t¹i ViÖt Nam.
ChÝnh v× thÕ, trong sè c¸c ph−¬ng ph¸p ®· sö dông ®Ó thùc hiÖn c¸c néi dung
cña §Ò tµi cã c¸c kü thuËt hoµn toµn míi, vÝ dô nh− ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p, ph−¬ng
ph¸p PCR, ph−¬ng ph¸p RT-PCR, ph−¬ng ph¸p t¸ch dßng …
III. VÒ gi¶i ph¸p khoa häc c«ng nghÖ
Trªn c¬ së so s¸nh víi nh÷ng th«ng tin ®· ®−îc c«ng bè trªn c¸c Ên phÈm trong
vµ ngoµi n−íc ®Õn thêi ®iÓm kÕt thóc ®Ò tµi, §Ò tµi cã nh÷ng ®iÓm míi sau ®©y:
1. Nghiªn cøu hoµn thiÖn c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy vµ b¶o qu¶n c¸c chñng vi khuÈn
ph©n lËp ®−îc tõ c¸c æ dÞch. Nghiªn cøu hoµn thiÖn ®iÒu kiÖn nu«i cÊy vµ b¶o qu¶n c¸c
tÕ bµo tiªn ph¸t, hoÆc tÕ bµo dßng nhËn tõ n−íc ngoµi vÒ vµ c¸c lo¹i m«i tr−êng thÝch
hîp ®Ó duy tr× vµ s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn vi sinh vËt t−¬ng øng cã hiÖu gi¸ cao víi môc
®Ých s¶n xuÊt v¾c xin.
2. X¸c ®Þnh tÝnh chÊt sinh häc vµ tÝnh kh¸ng nguyªn cña c¸c chñng vi sinh vËt
ph©n lËp ®−îc, so s¸nh víi c¸c chñng ®ang ®−îc sö dông s¶n xuÊt v¾c xin ®Ó chän
chñng s¶n xuÊt v¾c xin phï hîp nhÊt.
3. Dïng c«ng thøc bæ trî míi (saponin + keo phÌn) ®Ó s¶n xuÊt v¾c xin phßng
bÖnh tô huyÕt trïng tr©u bß cã hiÖu lùc cao.
4. C«ng nghÖ s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn toµn khuÈn vµ v¾c xin c«ng nghÖ gen víi vi
khuÈn biÕn n¹p ®Ó phßng chèng Salmonella enteritidis vµ Salmonella typhimurium.
5. ChÈn ®o¸n ®Þnh type vi rót g©y bÖnh LMLM b»ng kü thuËt sinh häc ph©n tö
(RT-PCR).
68
IV. C¸c s¶n phÈm cô thÓ
1. §· chÕ t¹o thµnh c«ng v¾c xin tô huyÕt trïng tr©u bß keo phÌn –saponin, ®Æt
tªn lµ v¾c xin tô huyÕt trïng tr©u bß K-S. V¾c xin ®· ®¹t c¸c yªu cÇu vÒ v« trïng, an
toµn vµ hiÖu lùc cÊp ngµnh. §é dµi miÔn dÞch cña v¾c xin Ýt nhÊt 8 th¸ng sau khi tiªm.
2. §· s¶n xuÊt thö nghiÖm thµnh c«ng 2 lo¹i vacxin v« ho¹t keo phÌn S.
enteritidis (E17) vµ S. typhimurium (T6), víi kÕt qu¶ b¶o hé tèt trªn chuét nh¾t tr¾ng vµ
an toµn trªn gµ thÝ nghiÖm.
3. §· t¹o thµnh c«ng vacxin t¸i tæ hîp chèng Salmonella ë gµ Kh¶ n¨ng sinh
®¸p øng miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp FliC3 vµ Gm3 t−¬ng tù nh− kh¸ng
nguyªn tù nhiªn.
4. §· ¸p dông thµnh c«ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR ®èi víi bÖnh phÈm biÓu m«
thu thËp tõ gia sóc nghi m¾c bÖnh LMLM víi kÕt qu¶ cña ph−¬ng ph¸p ®¹t ®é ®Æc hiÖu
cao.
5. §· tham gia ®µo t¹o ®−îc: 11 sinh viªn tèt nghiÖp ®¹i häc, 3 Th¹c sü.
6. §· xuÊt b¶n ®−îc 9 bµi b¸o trong c¸c T¹p chÝ Khoa häc.
§Ò nghÞ
1. Cho phÐp kh¶o nghiÖm c¸c s¶n phÈm v¾c xin cña §Ò tµi trong thùc tÕ s¶n xuÊt
®Ó cã kÕt qu¶ trªn diÖn réng h¬n nh»m cã c¬ së ®Ó sö dông c¸c lo¹i v¾c xin nµy trong
thùc tÕ phßng chèng bÖnh.
2. Cho phÐp øng dông ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n ®Þnh typ vi rót g©y bÖnh LMLM
b»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR t¹i c¸c c¬ së chÈn ®o¸n cña Côc Thó y.
3. Tæ chøc tËp huÊn phæ biÕn c¸c c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾c xin míi vµ chuyÓn
giao c«ng nghÖ cho c¸c c¬ së s¶n xuÊt v¾c xin trong n−íc.
4. TiÕp tôc ®−îc nghiªn cøu vÒ vi rót g©y bÖnh LMLM dùa vµo c¸c chñng ®·
ph©n lËp ®−îc.
69
Lêi c¶m ¬n
Thay mÆt tËp thÓ phô tr¸ch vµ tham gia thùc hiÖn §Ò tµi Khoa häc
C«ng nghÖ cÊp Nhµ n−íc KC.04.06, chóng t«i xin göi lêi c¶m ¬n ch©n
thµnh tíi:
1. Bé Khoa häc C«ng nghÖ vÒ viÖc ®Ò xuÊt vµ tæ chøc ch−¬ng tr×nh
nghiªn cøu Khoa häc C«ng nghÖ cÊp Nhµ n−íc giai ®o¹n 2001 – 2005 ®Ó
c¸c c¸n bé khoa häc cã ®iÒu kiÖn ph¸t huy n¨ng lùc nghiªn cøu nh»m
mang l¹i lîi Ých cho x· héi.
2. Ban Chñ nhiÖm Ch−¬ng tr×nh KC.04 vÒ sù h−íng dÉn, qu¶n lý vµ
gióp ®ì tËn t×nh vÒ mäi mÆt trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi.
3. ViÖn Thó y, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc vÒ qu¶n lý vèn ng©n s¸ch,
t¹o ®iÒu kiÖn vÒ c¬ së vËt chÊt, trang thiÕt bÞ vµ c¸c vÊn ®Ò cÇn thiÕt trong
qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi.
4. Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n vÒ sù qu¶n lý trùc tiÕp,
t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi trong qu¸ tr×nh triÓn khai.
5. TÊt c¶ c¸c chñ tr× §Ò tµi nh¸nh, c¸c ®ång nghiÖp tham gia thùc
hiÖn ®Ò tµi b»ng tÊt c¶ c¸c kh¶ n¨ng, trÝ tuÖ vµ t©m huyÕt cña m×nh.
6. Phßng Khoa häc §µo t¹o, Phßng KÕ ho¹ch VËt t−, Phßng KÕ to¸n
Tµi chÝnh, Phßng Tæ chøc C¸n bé, Phßng Hµnh chÝnh Qu¶n trÞ ®· gióp ®ì
chóng t«i trong viÖc hoµn tÊt c¸c c«ng viÖc nghiÖm thu.
Hµ néi, ngµy 25 th¸ng 6 n¨m 2005
Chñ nhiÖm §Ò tµi
TS. T« Long Thµnh
Các file đính kèm theo tài liệu này:
6102.pdf
