Đề tài Nghiên cứu hoàn thiện và thử nghiệm công nghệ điều chế vindolin, catharanthin và vinblastin từ lá Dừa cạn Việt nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc chống ung thư

LỜI MỞ ĐẦU VÀ NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI Trên thế giới, đi tiên phong và thành công trong việc triển khai sản xuất thuốc chống ung thư từ các ancaloid Dừa cạn và phải kể đến các công ty như: công ty Eli Lilly - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VELBANÒ đi từ vinblastin sunfat chỉ định điều trị các bệnh Hodgkin, ung thư máu, ung thư biểu mô tinh hoàn, u Kaposi, ung thư dạ con; công ty Pharmacia Corporation Kalamazoo - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VINCASAR PSF đi từ vinblastin sunfat và vincristin sunfat chỉ định đặc hiệu điều trị bệnh bạch cầu ác tính; công ty Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với sản phẩm thuốc tiêm và viên nén NAVELBINEÒ đi từ vinorelbin tartrat được bán tổng hợp từ vindolin và catharanthin, được chỉ định đặc hiệu điều trị ung thư vú và ung thư phổi, có thể sử dụng độc lập hoặc phối hợp điều trị với cisplatin; .v.v... Ngày nay các quốc gia và vùng lãnh thổ có thể trồng được Dừa cạn đều đã chủ động nghiên cứu và triển khai sản xuất vinblastin và các dẫn xuất như Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước Trung Á, Bắc Phi, .v.v... Có thể nêu một vài con số theo thống kê vào năm 2002 của FAO làm ví dụ: Madagasca xuất khẩu 1000 tấn (khô) lá và hoa Dừa cạn hàng năm; Ở Hungari, năng suất lá và hoa Dừa cạn đạt tới 1,5 - 2 tấn lá khô/ha/năm; Ở Ấn Độ, riêng tập đoàn Cipla hàng năm sản xuất khoảng 15 - 25 kg vinblastin sunfat và vincristin sunfat; Chúng ta đều biết, do độc tính cao, nên vincristin được sử dụng trong điều trị ung thư máu ít hơn nhiều so với vinblastin, vậy mà ở khu vực Bắc Mỹ và châu Âu, chỉ tính riêng lượng tiêu thụ vincristin sunfat đã đạt tới 40 triệu USD hàng năm. Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng được trồng làm cảnh vì cho hoa đẹp. Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và có thời gian canh tác ngắn. Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn Catharanthus roseus L. có thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn ven biển các tỉnh miền Trung, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng ancaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Từ những năm 1980, đã có nhiều đề tài nghiên cứu về các ancaloid từ Dừa cạn được thực hiện, nhưng việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ chiết xuất và bán tổng hợp vinblastin và vincristin vẫn còn chưa được tổ chức triển khai nghiêm túc để có thể đưa vào sản xuất tại Việt Nam. Với một nguồn nguyên liệu Dừa cạn đạt và vượt tiêu chuẩn của châu Âu đã được tổ chức canh tác rất quy mô, sản lượng xuất khẩu sang thị trường Pháp và châu Âu đạt hàng trăm tấn một năm, mà các bệnh nhân ung thư máu vẫn phải sử dụng vinblastin sunfat nhập khẩu từ các hãng Eli Lilly - Mỹ, Geoden Richer - Hungari, Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với giá 240.000 VND 1 lọ 10 mg. Theo số liệu của Vimedimex II và BV Pharma, hàng năm các công ty này nhập khẩu khoảng 2 triệu USD các thuốc tiêm vinblastin sunfat, vincristin sunfat để cung cấp cho thị trường các tỉnh phía Nam. Từ kết quả của các khảo sát sơ bộ trong quá trình nghiên cứu tại Viện Hóa học công nghiệp, kết hợp so sánh và tham khảo các công nghệ nước ngoài, chúng tôi nhận thấy rằng với công nghệ chiết xuất hiện đại, trên giống Dừa cạn tốt nhất (có hàm lượng Vinblastin 0,01 % trên lá khô - tương đương với Madagasca), chi phí tối thiểu để phân lập 1 g vinblastin vẫn còn lớn hơn 250 USD, trong khi đó, giá xuất xưởng của Eli Lilly, Geoden Richer và của Cipla chỉ dao động trong khoảng 120 - 135 USD/1 g vinblastin (FAO/UNDP - 2002). Như vậy, nếu thuần túy chỉ dựa vào chiết tách, các thuốc chống ung thư máu từ lá và hoa Dừa cạn của Việt Nam sẽ không cạnh tranh được ngay ở thị trường trong nước. Trong khi đó lại không tận dụng được các tiền chất có sẵn trong Dừa cạn để bán tổng hợp các thuốc này. Xuất phát từ những thực tế nêu trên, được sự hỗ trợ của Tổng Công ty Hóa chất Việt Nam, chúng tôi đã đề xuất và thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện và thử nghiệm công nghệ điều chế vindolin, catharanthin và vinblastin từ lá Dừa cạn Việt nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc chống ung thư” nhằm đạt được các mục tiêu: 1. Có được quy trình công nghệ chiết tách các ancaloid Vindolin và Catharanthin từ lá Dừa cạn Việt Nam làm nguyên liệu tổng hợp Vinblastin 2. Đề xuất được quy trình công nghệ bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin phù hợp điều kiện Việt Nam. Chương I TỔNG THUẬT TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 1.1 Các nghiên cứu công nghệ chiết xuất và bán tổng hợp trên thế giới 1.1.1 Vài nét về cây Dừa cạn và các Vinca ancaloid Cây Dừa cạn Vinca rosea L. (Catharanthus roseus (L.) G. Donn.) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) phân bố rộng rãi trên nhiều nước nhiệt đới, đặc biệt ở Việt Nam và Madagasca, ở các nước phương Tây cây này thường được biết đến dưới tên gọi là Madagascan periwinkle. Trong dân gian, cao sắc nước của lá và hoa Dừa cạn được sử dụng để chữa mắt, tiêu viêm, cầm máu và làm dịu vết đốt của côn trùng. Đặc biệt, theo y học cổ truyền ở Ấn Độ, Madagasca và Việt Nam, các thầy lang còn dùng lá Dừa cạn để trị bệnh tiểu đường [1, 2]. Năm 1952, khi nghiên cứu tác dụng của các ancaloid từ lá Dừa cạn lên chuột , R. Noble và C. Noble đã phát hiện ra các hợp chất này có khả năng làm giảm số lượng bạch huyết cầu trong máu chuột. Từ đó, theo định hướng nghiên cứu các chất gây độc tế bào hoặc gây ức chế phân bào bạch cầu ác tính, các Vinca ancaloid có hoạt tính như vinblastin, vincristin, vindesin và vinorelbin đã được phát hiện hoặc bán tổng hợp để ứng dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là các bệnh Hodgkin và các bệnh ung thư máu. Năm 1958, lần đầu tiên Noble và Beer đã phân lập được vinblastin - còn gọi là vincaleukoblastin từ lá cây Dừa cạn; trong các năm 1959 đến 1962, Johnson và Svoboda đã tìm ra vincristin - một ancaloid hàm lượng thấp trong cây Dừa cạn. Hợp chất muối sunfat của vinblastin và vincristin đã được áp dụng rộng rãi trong các trị liệu hóa học chữa ung thư máu, ung thư mô bào bạch huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư vú [3, 4]. Các nghiên cứu tổng hợp vinblastin và chuyển hóa thành các dẫn xuất áp dụng trong hóa trị liệu ung thư cũng được đẩy mạnh: Năm 1978, Barnett và cộng sự bằng các phản ứng hidrazin hóa và hidro hóa đã chuyển hóa vinblastin thành vindesin, ngay lập tức chất này đã được áp dụng trong hóa trị liệu các bệnh ung thư vú và ung thư phổi dưới tên biệt dược là Eldisine®; nhưng dấu mốc quan trọng nhất mở ra hướng mới cho việc sản xuất vinblastin và các dẫn xuất từ cây Dừa cạn là thành công của Mangeney và cộng sự vào năm 1979, khi cải tiến phản ứng Polonovski để tổng hợp vinblastin và vincristin từ các ancaloid chủ yếu của Vinca rosea L. là vindolin và catharanthin [1, 2, 4, 5]. Dưới đây là cấu trúc của một số Vinca ancaloid đã được ứng dụng để điều chế thuốc chống ung thư và một số bệnh khác trong y học . Cho đến nay, vinblastin và các dẫn xuất sử dụng làm thuốc chống ung thư trên thế giới đã được sản xuất chủ yếu theo hai con đường: 1 - Chiết xuất từ lá Dừa cạn,2 - Bán tổng hợp từ vindolin và catharanthin theo phương pháp hóa học hoặc theo phương pháp sử dụng xúc tác enzym (Mc Lauchlan và cộng sự) [6]. Với các kết quả nghiên cứu về cơ chế gây bệnh ung thư và điều trị trong y học lâm sàng hiện đại và trong lĩnh vực sinh học phân tử, vinblastin, vincristin và các dẫn xuất lại đã được khẳng định một lần nữa là các hoạt chất có tác dụng chống ung thư thực thụ, không chỉ với vai trò là các tác nhân gây độc tế bào (cytotoxicity) như đã biết, mà còn đóng vai trò là các chất ức chế hoạt tính của các tác nhân nhân (nuclear factor), đặc biệt là ức chế hoạt tính của NF-kB (nuclear factor kB) - tác nhân nhân chủ yếu trong quá trình gây ra các bệnh viêm và phát sinh tế bào ung thư [4, 7 - 14]. 1.1.2 Một số nét tiêu biểu của các công nghệ phân lập Vinca ancaloid Vinblastin và vincristin là các ancaloid dimeric indol-indolin, tích tụ trong lá và hoa của cây Dừa cạn với hàm lượng thấp (10-5 - 10-4 %), do đó việc phân lập tinh khiết các chất này thường rất phức tạp và đòi hỏi kỹ thuật chiết tách ở trình độ cao. Mặc dầu vậy, hiện nay các quy trình công nghệ chiết Dừa cạn vẫn được xây dựng dựa theo phương pháp chung chiết xuất ancaloid, sử dụng kỹ thuật chiết phân bố bằng các dung môi hữu cơ khác nhau cùng với việc thay đổi pH phù hợp với từng giai đoạn cụ thể. Hình 1.1 nêu sơ đồ tóm tắt một số phương pháp chiết tách truyền thống và hiện đại đang được áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất các Vinca ancaloid [4, 5, 11 - 17]: Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt các quy trình chiết và phân lập ancaloid Theo Noble và cộng sự, lá Vinca rosea L. được chiết bằng hỗn hợp etanol với axít axetic theo tỷ lệ thích hợp. Cao dịch chiết thu được sau khi cất loại dung môi được hòa vào dung dịch HCl 2 % và lọc loại sạch tạp chất không tan. Dịch lọc được điều chỉnh tới pH 4 và chiết rửa bằng benzen để loại bỏ các tạp chất màu và các chất ít phân cực không có tính kiềm. Dịch nước axít còn lại được trung hòa bằng NH4OH rồi đem chiết lấy hỗn hợp “ancaloid tổng số” (Total alkaloids) bằng benzen và clorofoc [3]. “Ancaloid tổng số” được phân tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ là nhôm ôxit hoạt độ 4 - 5 (Woehlem Al2O3 grade IV-V) với hệ dung môi benzen - diclometan rửa giải theo cách gradient. Các phân đoạn sắc ký được sàng lọc bằng cách kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào và được xác định thành phần vinblastin bằng sắc ký lớp mỏng. Các phân đoạn sắc ký chứa vinblastin được cô kiệt, sau đó hòa vào dung dịch axít sunfuric/etanol để kết tinh vinblastin sunfat [3, 4, 5]. Svoboda và cộng sự (1959) đã đóng góp vào quy trình của Noble một số cải tiến có ý nghĩa. Ở giai đoạn đầu, nguyên liệu thực vật được chiết trực tiếp với dung môi ít phân cực như n-hexan để rửa các chất màu và ancol béo mạch dài trước khi chiết với dung môi axít tartric/etanol. Ở giai đoạn sau, các dung môi độc hại như benzen đã được thay thế bằng clorofoc, dicloetan và diclometan. “Ancaloid tổng số” vẫn được phân tách bằng sắc ký cột trên ôxit nhôm. Phương pháp này đã được áp dụng từ những năm 1960 để sản xuất vinblastin sunfat và vincristin sunfat tại công ty Eli Lylli, Mỹ [4, 5, 13]. Trong dung môi ancol/nước phối hợp với đệm axít, các Vinca ancaloid có các giá trị pKa khác nhau, đây chính là gợi ý để phân tách các hợp chất này bằng sắc ký phân bố lỏng - lỏng với các pha dung môi có pH khác nhau. Năm 1999, tại CNRS - Cộng hòa Pháp, Renault và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu phân lập các Vinca ancaloid bằng sắc ký phân bố ly tâm (CPC) với hai pha dung môi có pH biến đổi dần dần (gradient). “Ancaloid tổng số” của lá Dừa cạn được phân tách trên cột tách HPCPC Sanki series 1000 với pH của một pha gradient từ 2 - 9; pha còn lại có pH gradient từ 10 - 4. Độ tinh khiết của các ancaloid vindolin, catharanthin, vinblastin và vindolinin phân tách được từ hỗn hợp đạt tới 80 - 90 %. Tuy nhiên, do năng suất phân tách thấp hơn so với các phương pháp sắc ký khác nên kỹ thuật CPC chỉ được áp dụng hạn chế ở các nghiên cứu thí nghiệm [14]. Cũng dựa vào sự khác biệt hằng số pKa của các Vinca ancaloid trong dung dịch nước/axít, Guanasekera và cộng sự đã phát triển phương pháp chiết phân bố bằng các dung môi dẫn xuất clo ở các pH khác nhau. Theo đó, dịch chiết nước/axít của lá Dừa cạn được điều chỉnh môi trường bằng NH4OH tới từng giá trị pH xác định rồi chiết với diclometan, dicloetan hoặc clorofoc để thu nhận từng phần chiết ancaloid tương ứng. Với phương pháp chiết này, tuy tổng cộng lượng ancaloid trong các phần chiết thu được thấp hơn so với các phương pháp truyền thống; nhưng có thể tập trung từng nhóm Vinca ancaloid vào những phần chiết xác định và từ đó tiết kiệm được chi phí phân lập tinh khiết những ancaloid mong muốn [15, 16, 17]. Nhìn chung, các phương pháp chiết xuất và phân tách ancaloid đang được áp dụng để nghiên cứu phân lập các ancaloid từ cây Dừa cạn đều có thể thực hiện được trong các pilot và các phòng thí nghiệm Hóa Dược, Hóa Hữu cơ và Hóa Hợp chất thiên nhiên. Nhưng các phương pháp này đều có nhược điểm chung là phân chia thành nhiều giai đoạn thực hiện phức tạp, khó kiểm soát, dễ gây thất thoát sản phẩm, điều này mang ý nghĩa tiêu cực đối với việc triển khai ở quy mô công nghiệp chiết xuất các hoạt chất có hàm lượng thấp như các Vinca ancaloid [4 - 17]. Do vậy, để có thể đưa công nghệ ra sản xuất, các quy trình chiết và phân tách nên được xây dựng thành các chu trình công nghệ hoàn chỉnh khép kín; thay thế các dung môi độc hại như benzen bằng các dung môi tương đương ít độc và ít ảnh hưởng môi trường; tối ưu hóa và hiện đại hóa các phép đo kiểm soát quá trình chiết và tách sắc ký. 1.1.3 Bán tổng hợp Vinblastin và các dẫn xuất Vinblastin và các dẫn xuất là các ancaloid dimeric có hàm lượng thấp (~ 0,01 % trong lá Dừa cạn khô), trong khi ancaloid chủ yếu của Dừa cạn là vindolin - một trong hai phần monomer cấu thành vinblastin - có hàm lượng trong lá Dừa cạn lớn hơn 4 đến 5 lần so với vinblastin. Trong quá trình phân tách “ancaloid tổng số” của Dừa cạn bằng sắc ký hấp phụ, thông thường vindolin và catharanthin được rửa giải ra trước so với vinblastin. Để hạ giá thành thuốc, tận dụng phụ phẩm vindolin, catharanthin cũng như các Vinca ancaloid khác, các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất từ vindolin và catharanthin đã được phát triển mạnh mẽ và đưa vào áp dụng trên thế giới từ cuối những năm 1970 [18 - 25]. Năm 1978, Barnett và cộng sự bằng các phản ứng hidrazin hóa và hidro hóa đã chuyển hóa vinblastin thành vindesin, ngay lập tức chất này đã được áp dụng trong hóa trị liệu các bệnh ung thư vú và ung thư phổi dưới tên biệt dược là Eldisine® [13]; nhưng dấu mốc quan trọng nhất mở ra hướng mới cho việc sản xuất vinblastin và các dẫn xuất từ cây Dừa cạn là thành công của Mangeney và cộng sự vào năm 1979, khi cải tiến phản ứng Potier-Polonovski để bán tổng hợp vinblastin và vincristin từ các ancaloid chủ yếu của C. roseus là vindolin và catharanthin [18, 19, 21]. Năm 1974, tại CNRS - Pháp, Potier cùng các cộng sự đã nghiên cứu điều chế các dimeric ancaloid kiểu vinblastin dựa trên cơ sở ôxy hóa catharanthin thành Nb-oxid-catharanthin và ghép đôi với vindolin theo phản ứng Potier-Polonovski. Theo hướng này, Mageney cùng với nhóm nghiên cứu của Potier đã điều chế thành công 5’-nor-anhydovinblastin (vinorelbin), vinblastin, leurosidin, leurosin và vincristin [18, 19, 21]. Các chất này đều có hoạt tính tốt và các quy trình bán tổng hợp được áp dụng tại công ty Pierre Fabre để sản xuất thuốc chống ung thư vào năm 1979. Theo quy trình sử dụng vào thời kỳ đó, hiệu suất tạo thành vinblastin và đồng phân 20’-epimer của nó là leurosidin khá thấp (~ 2 %), chi phí các chất phản ứng cao, do đó công ty Pierre Fabre chỉ điều chế đến 5’-nor-anhydrovinblastin để sản xuất vinorelbin tartrat và đăng ký độc quyền sản phẩm này làm thuốc tiêm và viên nén NAVELBINEÒ [21]. Từ phát kiến của Potier và Mageney, các nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất điều chế vinblastin, tổng hợp chọn lọc lập thể vinblastin và các dẫn xuất được đẩy mạnh ở CNRS cũng như các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới (Xem Sơ đồ 1). Năm 1979, Langlois và cộng sự đã nghiên cứu các phản ứng sử dụng ôxy không khí làm tác nhân ôxy hóa. Dạng enamin được khử bằng hydro với xúc tác Pd/C hoặc bằng NaBH4. Sau này, Kutney (1981) đã công bố quy trình one-pot điều chế vinblastin và leurosidin với phản ứng ôxy hóa sử dụng peroxid, ôxy không khí hoặc FeCl3; tác nhân khử là các dẫn xuất dihydronicotinamid. Với tỷ lệ nồng độ các chất phản ứng phù hợp, hiệu suất vinblastin có thể đạt tới hơn 40 % (Sơ đồ 1) [20]. Sơ đồ 1: Tóm tắt các phương pháp điều chế Vinblastin tiừ Vindolin và Catharanthin 3’,4’-Anhydrovinblastin (AVLB) được tạo ra 18 % trong quá trình one-pot tổng hợp vinblastin từ catharanthin và vindolin. Trong khi đó, nếu chọn lọc thực hiện phản ứng khử - 1,2 hợp chất trung gian hoạt động iminium bằng tác nhân NaBH4, hiệu suất tạo thành 3’,4’-anhydrovinblastin đạt tới trên 80 % (Sơ đồ 1). Do đó các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin từ AVLB cũng được đẩy mạnh nhằm tận dụng sản phẩm này và nâng cao năng suất VLB [23]. Sakamoto và các cộng sự (1990) đã phát triển phương pháp ôxy hóa AVLB bằng FeCl3/amoni oxalat và phương pháp này đã được áp dụng tại Công ty Công nghệ Hóa dầu Mitsui để sản xuất vinblastin. Hiệu suất chuyển hóa AVLB ~ 90 %, hiệu suất tạo thành vinblastin đạt tới hơn 40 % [23]. Theo hướng sử dụng xúc tác nguồn gốc sinh học làm tác nhân chiral, năm 2006, Tatsuya và các cộng sự đã công bố kết quả sử dụng kháng thể monoclon anti-vinblastin MAb-10-A9 làm xúc tác, oxy không khí và NaBH3CN được sử dụng làm các tác nhân oxy hóa - khử hóa; sau 24 giờ, hiệu suất chuyển hóa 3’,4’-anhydrovinblastin tạo thành vinblastin đạt tới 82,2 %, trong sản phẩm hoàn toàn không có mặt 20’-epi-vinblastin (leurosidin). Tuy nhiên, việc tổ hợp MAb-10-A9 trên động vật hiện vẫn còn đang ở trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển cho tương lai [6]. 1.2 Tình hình nghiên cứu và triển khai trong nước Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng được trồng làm cảnh vì cho hoa đẹp. Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và có thời gian canh tác ngắn. Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu giống và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn Vinca rosea L. có thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng ancaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Công ty Vimedimex II kết hợp với Trung tâm Nghiên cứu giống và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã thử nghiệm canh tác cây Dừa cạn trên các vùng đất cát ven biển các tỉnh miền Trung để thu hoạch rễ và lá phục vụ xuất khẩu với sản lượng hàng trăm tấn một năm. Từ những năm 1980 - 1990, Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu và Xí nghiệp Dược phẩm Trung Ương II thuộc Bộ Y tế đã thực hiện các đề tài nghiên cứu chiết xuất vinblastin và các ancaloid khác từ Dừa cạn Việt Nam để phục vụ sản xuất thuốc chống ung thư và thuốc hỗ trợ tuần hoàn não. Các tác giả đã nghiên cứu chiết ancaloid mô phỏng theo các quy trình của Noble và Svoboda. Cụ thể như sau: Nguyên liệu được chiết bằng cồn 90o, cao dịch chiết sau khi loại dung môi được chuyển sang dạng muối ancaloid bằng cách hòa vào dung dịch axít sunfuric 2 % cho tan tối đa, pH được điều chỉnh giữ ở khoảng pH 2, sau đó lọc loại sạch cặn không tan. Dịch lọc được chiết rửa nhiều lần với tricloetylen để loại các chất lipophin. Dịch axít còn lại được kiềm hóa bằng NH4OH tới khoảng pH 9,5 - 10, sau đó chiết lấy “ancaloid tổng số” từ dung dịch kiềm này bằng tricloetylen. “Ancaloid tổng số” được phân tách trên cột sắc ký nhôm ôxit với hệ dung môi rửa giải là benzen và một số dung môi hữu cơ khác. Các phân đoạn sắc ký được kiểm tra định tính bằng sắc ký lớp mỏng. Sản phẩm được kết tinh trực tiếp từ các phân đoạn sắc ký dưới dạng muối sunfat sau khi đã cô loại bớt dung môi. Ngoài vinblastin sunfat, các tác giả cũng thu được các ancaloid chủ yếu của Dừa cạn như vindolin, catharanthin và ajmalicin Nhược điểm của phương pháp này là các vinca ancaloid sẽ không được trích ly một cách triệt để ra khỏi các mô thực vật do chúng khá khó tan trong dung môi cồn nước. Một nét cải tiến trong quá trình chiết so với Noble là sử dụng axít sunfuric để đẩy các vinca ancaloid trong cao dịch chiết thành dạng muối sunfat tan trong nước. Đây là dạng muối khá bền và không tan ngay cả trong cồn tuyệt đối, do đó có thể dễ dàng chiết rửa loại tạp chất lipophin trong dịch chiết bằng tricloetylen. Nhưng ở đây bộc lộ một nhược điểm là các muối này cũng không hoàn nguyên trở lại ancaloid hoàn toàn khi sử dụng amoniac để kiềm hóa dịch axít, nên hỗn hợp “ancaloid tổng số” được chiết từ đây cũng sẽ có mặt cả các muối phân ly trong nước của ancaloid. Các thành phần này nếu không được loại bỏ trước bằng sắc ký trao đổi ion sẽ ảnh hưởng mạnh tới độ chọn lọc của quá trình tách sắc ký “ancaloid tổng số” trên cột nhôm ôxit. Từ đó sản phẩm vinblastin và vinblastin sunfat sẽ không được làm giàu tới mức độ cần thiết để có thể tinh chế bằng cách kết tinh mà buộc phải điều chế ở dạng đông khô, rất dễ hút ẩm và bị phân hủy. Trong nỗ lực tổng hợp toàn phần các Vinca ancaloid, năm 1990, các tác giả Phan Đình Châu (Đại học Dược Hà Nội), Csaba Szántay (Đại học kỹ thuật Budapest - Hungary) và các cộng sự đã điều chế thành công các dẫn xuất Vinca ancaloid monomeric như vincadifformin, (+/-)-3-oxominovine và tabersonin. Tuy nhiên, ngoài tabersonin thể hiện hoạt tính làm giảm nhẹ huyết áp (khoảng 25 % khi so sánh với reserpin), các chất này đều chưa tìm được ứng dụng trong điều trị lâm sàng. Cũng trong những năm 1990, các tác giả Mai Ngọc Tâm (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Bogomil Pyuskyulev (Viện Hàn lâm khoa học Bungari) và các cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu lực cao phân tích xác định sự biến đổi hàm lượng vindolin, catharanthin và vinblastin trong lá Dừa cạn vào các thời kỳ sinh trưởng khác nhau. Đóng góp vào các hiểu biết về bán tổng hợp, chuyển hóa và cấu trúc của các Vinca ancaloid kiểu vinblastin, tác giả Mai Ngọc Tâm cùng các cộng sự cũng đã thực hiện những biến cải hóa học ở các vị trí C-16, C-17 và C-20’ của vinblastin tạo ra dẫn xuất mới D15(16)-17-deaxetoxy-20’-deoxy-vinblastin và dẫn xuất tri-O-axetylguanosin ở C-17 của hợp chất này. Cho tới nay, việc tiếp thu các kỹ thuật phân lập hiện đại và nghiên cứu hoàn thiện công nghệ điều chế vinblastin từ Dừa cạn Vinca rosea L. ở Việt Nam còn chưa được quan tâm đúng mức và chưa được tổ chức triển khai nghiêm túc. Với một nguồn nguyên liệu Dừa cạn đạt và vượt tiêu chuẩn của châu Âu đã được tổ chức canh tác rất quy mô, sản lượng xuất khẩu sang thị trường Pháp và châu Âu đạt hàng trăm tấn một năm, mà chúng ta vẫn phải nhập khẩu vinblastin sunfat từ các hãng Eli Lilly - Mỹ, Geoden Richer - Hungary, Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với giá khoảng 15,5 USD/10 mg. 1.3 Lựa chọn phương án công nghệ Xuất phát từ tổng quan các công nghệ hiện có trên thế giới và kết quả trước đây của các nghiên cứu trong nước về điều chế các Vinca ancaloid, chúng tôi tập trung nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ chiết tách vindolin, catharanthin và bán tổng hợp vinblastin theo các phương pháp sau đây: 1.3.1 Chiết, tách các Vinca ancaloid a/ Chiết xuất “Ancaloid tổng số” từ lá Dừa cạn Công nghệ chiết Lá Dừa cạn được nghiên cứu hoàn thiện từ quy trình của Noble và các cộng sự [3] cải tiến theo Doepke và các cộng sự [36]. - Trong quy trình này, axít axetic có tác dụng tạo muối với các ancaloid - làm tăng khả năng tan của các hợp chất này trong dung môi ancol - nước. Thêm vào đó, axít axetic khi phân ly tạo anion axetat, đồng dạng với các nhóm thế este của các Vinca ancaloid, nên sẽ không làm thủy phân các hợp chất này khi đun nóng để cô dịch chiết. - Cồn 90o là dung môi chiết có khả năng hòa tan tốt các hoạt chất cần quan tâm từ nguyên liệu thực vật. Đồng thời, sau quá trình chiết, lượng nước tan trong cồn (10 % theo thể tích) sẽ chiếm chỗ trong mô thực vật, nằm lại hoàn toàn trong bã nguyên liệu và tạo điều kiện để thu hồi cồn dễ dàng hơn. b/ Phân tách các Vinca ancaloid Vindolin, catharanthin và vinblastin được phân tách từ ancaloid tổng số theo phương pháp sắc ký hấp phụ trên silica gel với hệ dung môi CHCl3/CH3OH thích hợp, đây là phương pháp có độ chọn lọc cao nhất khi phân tách các Vinca ancaloid. Ancaloid là các bazơ, bị lưu giữ mạnh trên pha tĩnh silica gel (có tính axít yếu). Do đó, để giảm thời gian phân tách và tăng tuổi thọ sử dụng của cột tách - giảm tiêu hao vật tư sắc ký, theo các phương pháp mới hiện nay [13, 16, 17, 24], chúng tôi khử hoạt tính silica gel bằng NH4OH/CH2Cl2/CH3OH (pH ~ 8 - 8,5). Với cột tách được nạp loại silica gel này, cân bằng tách sắc ký sẽ được thiết lập hoàn toàn theo cơ chế hấp phụ/giải hấp, có thời gian tách nhanh và dễ điều khiển hơn. 1.3.2 Bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin Công nghệ bán tổng hợp vinblastin được nghiên cứu dựa trên quy trình của Sakamoto [23] đã hiệu chỉnh rút ngắn lại theo Verma và các cộng sự [26]. Mặc dù đây không phải là quy trình cho hiệu suất cao nhất (~ 30 %, trong khi phương pháp Sakamoto đạt hiệu suất hơn 40 %), nhưng dễ triển khai trong điều kiện Việt Nam. Từ hai giai đoạn, quá trình tổng hợp được rút ngắn thành phản ứng một nồi (one-pot), các tác nhân Ôxy hóa - H2O2, FeCl3 và NaOCl, Khử hóa - NaBH4 và xúc tác Axít citric đều là các hóa chất cơ bản thông dụng trên thị trường. Thêm vào đó, quy trình này có thể thực hiện được với hỗn hợp các chất đầu, không cần tinh khiết, đây là yếu tố rất quan trọng trong công nghệ để giảm chi phí tinh chế tiền chất và hợp chất trung gian.