Đề tài Nghiên cứu khả năng tăng trưởng ở một số vi sinh vật trên bề mặt giá đỡ cellulose vi khuẩn (bc – bacterial cellulose)

TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của vi sinh vật. Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ. Các vi khuẩn sản sinh BC BC đuợc tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn. Trong đó Acetobacter xylinum sinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của BC được tổng hợp khác nhau ở các loài vi khuẩn khác nhau. Bảng 2.1 : Cấu trúc cellulose của một số vi sinh vật [7] Giống Cấu trúc cellulose Acetobacter Achromobacter Aerobacter Agrobacterium Alcaligen Pseudomonas Rhizobium Sarcina Zoogloea Lớp màng ngoại bào tạo thành các dãi Sợi Sợi Sợi ngắn Sợi Các sợi không tách biệt Sợi ngắn Cellulose dị hình Chưa xác định rõ cấu trúc Trong đó chủng Acetobacter đặc biệt là Acetobacter xylinum (A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus) là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất và được sử dụng phổ biến nhất trong việc sản xuất thạch dừa vì năng suất tạo BC cao, cấu trúc BC phù hợp cho nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau [7]. Vi khuẩn Acetobacter xylinum Phân loại: Theo khóa phân loại Bergey, A. xylinum thuộc: Lớp : Schizomycetes Bộ : Pseudomonadales Bộ phụ : Pseudomonadieae Họ : Pseudomonadaceae Giống : Acetobacter Loài : Acetobacter xylinum Gần đây, A. xylinum đã được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius [7]. Đặc điểm hình thái A. xylinum: A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do môi trường. Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [7]. Hình 2.1: Tế bào Acetobacter xylinum Trên môi trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A. xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau một tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần. Trên môi trường lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày [11]. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A. xylinum Phản ứng catalase dương tính. Oxi hóa ethanol thành CO2 và H2O. Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer. Không tạo sắc tố nâu. Vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn. Chuyển hóa glucose thành acid. Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton. Tổng hợp cellulose. A. xylinum sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 - 2 đơn vị. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C và pH từ 5,4 – 6,3. A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 - 35°C và nồng độ ethanol có thể tới 10% [7]. Các đặc điểm của BC Cấu trúc của BC Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β-1,4-glucan. Các nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000 – 75.000nm trong khi những dải vi sợi cellulose có chiều dài từ 1 - 9μm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen. BC khác với PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. Hình 2.2: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [44] Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế. Cellulose I và II đều được tổng hợp trong tự nhiên trong đó celulose I phổ biến hơn. Cellulose I có thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I. Rất ít tế bào Eukaryote tổng hợp cellulose II. A. xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại cellulose I và II. Cellulose I: được tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở môi trường tĩnh. Các chuỗi β-1,4-glucan được sắp xếp song song với nhau theo một trục. Năm 1984 Atalla và Vander Hart đã xác định được cấu trúc cellulose Iα và cellulose Iβ. Cellulose II: thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc. Các chuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như không song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt [7][24]. Hình 2.3: Sự hình thành vi sợi bởi A. xylinum [Iguchi và cộng sự, 2000]Vi sôïi Cellulose Microfibril Tieàn sôïi Loã xuaát cellulose Cellulose II LPS envelope Cellulose Synthase Cellulose I Cytoplasmic Membrane Chức năng sinh lý của cellulose đối với Acetobacter xylinum Tế bào A. xylinum được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose còn có vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase. Nhờ tính dẻo và tính thấm nước của màng cellulose mà vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện chất độc và vi sinh vật gây bệnh. Cellulose bao quanh bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào A. xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống chỉ còn 3% [7]. Tính chất độc đáo của BC Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất đuợc tổng hợp không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh. Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể. Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể, lực ẩm cao. Màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 – 700 lần trọng lượng của nó. Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bước trung gian. Màng cellulose được định hướng trong quá trình tổng hợp: có khả năng hình thành các sợi biến động, tạo các màng bền theo một trục. Theo Brown và White (1989) có thể hình thành một găng tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống bên trong môi trường lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn. Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp BC thì có thể làm thay đổi những thuộc tính của BC. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá trình tổng hợp. Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động lên gen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng cellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose [11][31]. Sinh tổng hợp BC Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc tác và các protein điều hòa. Cellulose được tổng hợp từ A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose. Sự thủy phân glucose không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì chúng không tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đó là phosphofructose kinase. Ở A.xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với quá trình dị hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từ những phản ứng dị hóa. Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trình đồng hóa khác, bao gồm sự tổng hợp protein. A.xylinum biến đổi nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, pyruvate, dihydroxyacetone và các dicarboxylic acid thành cellulose với hiệu suất 50%. Ngày nay con đường tổng hợp cellulose ở A.xylinum đã được hiểu rất rõ. Đó là một quá trình tổng hợp gồm nhiều bước liên tiếp nhau, gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa, giai đoạn kết tinh. Giai đoạn polymer hóa: trong đó có sự tham gia của enzyme tổng hợp cellulose xúc tác. Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Tiếp theo Glc-6-P bị isomer hóa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzyme phosphoglucosemutase (PGM). Sau đó enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) xúc tác chuyển Glc-1-P thành UDPGlc, trong đó có sự hiện diện của UTP. Cuối cùng cellulose được tạo thành từ UDPGlc nhờ enzyme cellulose synthase và cyclic-di-GMP là yếu tố giúp hoạt hóa enzyme này. Giai đoạn kết tinh: các chuỗi bắt đầu được tổng hợp nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết hợp với nhau bằng liên kết Van der Waals tạo nên lớp các chuỗi glucan. Lớp này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó các lớp này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đó tạo thành các bó và thành các sợi. Kích thước, hình dạng, độ trong suốt, tỷ lệ các dạng của cellulose tùy thuộc vào vị trí xúc tác của phức chất enzyme. Hình 2.4: Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài [43] 1PFK Fru-bi-P FBP Con đường sinh glucose Chu trình Pentose phosphate Chu trình Krebs PGI FK Fru-6-P Fructose PTS Fru-1-P ATP ADP PGA G6PDH (NAD, NADP) Glucose Glc-6-P GK ADP ATP Cellulose CS UDP-Glc UGP Glc-1-P PGM Hình 2.5: Con đường sinh tổng hợp BC ở Acetobacter xylinum [44] UDPGlc pyrophosphorylase là enzyme quyết định sự tổng hợp cellulose vì vài kiểu hình đột biến không tổng hợp cellulose thiếu enzyme này (Valla et al.,1989). Hơn nữa, hoạt tính pyrophosphorylase khác nhau giữa những loài A. xylinum khác nhau và hoạt tính cao nhất thì được phát hiện trong những loài sản xuất cellulose hiệu quả nhất như là A. xylinum ssp. sucrofermentans BPR2001. Ngoài ra có vài loài thích sử dụng fructose như là nguồn cacbon và thể hiện hoạt tính phosphoglucoisomerase cao và có hệ enzyme trao đổi phosphor và phụ thuộc vào phosphoenolpyruvate. Hệ này xúc tác biến đổi fructose thành fructose-1-phosphate và thành fructose-1,6-biphosphate [7][6]. Nguyên liệu để nuôi Acetobacter xylinum nhằm thu BC Nước dừa già Nước dừa già là môi trường cổ điển để thu nhận BC từ A. xylinum. Đây là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích sinh trưởng: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản từ 3 ngày rồi đem sử dụng làm môi trường lên men. Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm, chất lượng dinh dưỡng của nước dừa cũng không đảm bảo. Môi trường nước dừa cần cung cấp thêm nguồn cacbon (sucrose, glucose hoặc nguồn cacbon khác), nguồn nitơ (SA, DAP). Rỉ đường Là phần nước đường không thể kết tinh hết cũng như còn lẫn các tạp chất sau khi ly tâm nhiều lần nước mía để tách lấy đường kết tinh. Rỉ đường là một hỗn hợp khá phức tạp. Ngoài lượng đường khá cao, rỉ đường còn chứa các hợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ khác. Thành phần của rỉ đường có chứa 15 – 20% nước, 80 – 85% chất khô hòa tan và nhiều loại vitamin như: thiamine, riboflavin, acid nicotinic, acid folic, biotin Chất khô hòa tan trong rỉ đường gồm: Đường tổng số chiếm hơn 50%, trong đó saccharose chiếm 30 – 35%, đường khử chiếm 15 – 20% (gồm glucose, fructose). Chất khử không lên men thường chiếm 1,7%. Thành phần chất khô còn lại chiếm dưới 50%, trong đó có 30 – 32% chất hữu cơ và chất vô cơ 18 – 20%. Khi được bảo quản lâu ngày, chất lượng rỉ đường thường giảm. Vì vậy cần có chế độ bảo quản hợp ý để quá trình lên men đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, còn sử dụng nước mía và các nguyên liệu khác từ công nghiệp thực phẩm để lên men thu BC [7]. Các phương pháp sản xuất BC Nhân giống Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được giữa trong ống thạch nghiêng trong điều kiện lạnh sâu. Khi cần nuôi cấy thì tiến hành hoạt hóa chúng. Khi lấy giống ra sử dụng cần cấy chuyền qua môi trường rắn. Cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã hấp khử trùng, hoạt hóa ở nhiệt độ 28°C trong 18 – 24 giờ được giống cấp 1. Giống cấp 1 có thể tiếp tục được nhân giống cấp 2, 3 Tỉ lệ giống so với môi trường từ 1 – 10%. Lên men Lên men tĩnh: môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30°C. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulos nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 – 10 ngày có thể thu BC. Hình 2.6: Miếng BC được hình thành từ lên men tĩnh [24] Lên men động: vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 28 - 30°C, 180 – 200 vòng/phút. BC được tạo từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men. Hình 2.7: Hạt BC được hình thành từ nuôi cấy lắc [24] Ứng dụng của BC Với những ưu điểm nổi bật, BC ngày càng được nghiên cứu nhiều và có nhiều ứng dụng rộng rãi. Bảng 2.2: Một số sản phẩm từ màng BC của Acetobacter xylinum [6] [21][15] Lĩnh vực ứng dụng Sản phẩm Thực phẩm Tráng miệng (thạch dừa) Ăn kiêng (kem, salad) Thịt nhân tạo Vỏ bao xúc xích Nước uống siro không có cholesterol Trà Kobucha hay manchurian Y dược Lớp màng trị bỏng Tác nhân vận chuyển thuốc Da nhân tạo Chất làm co mạch Mỹ phẩm Móng nhân tạo Đánh móng dày và mỏng hơn Môi trường Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn Hấp thu chất độc Quần áo, giày dép tự phân hủy Dầu mỏ Thu hồi dầu Trang phục Sản xuất sợi nhân tạo Y phục quân đội Thể thao Lều lắp ráp Sản phẩm rừng Gỗ nhân tạo Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ Thùng hàng có độ bền cao Lĩnh vực khác Làm màng lọc Tả lót có thể tái chế Màng rung động âm thanh Môi trường nuôi cấy mô thực vật Hình 2.8: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC[7]. Hình 2.9: Ứng dụng BC làm giá thể nuôi cấy cụm chồi thuốc lá[7]. Hình 2.10: Ứng dụng BC trong vật liệu mới làm tấm xốp [7]. Ứng dụng BC làm giá đỡ nuôi cấy tế bào vi sinh vật BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của giá đỡ trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào vi sinh vật. Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học: hình dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra hình dạng mong muốn. Đây là ưu điểm của BC so với các giá đỡ khác. BC có tính cơ lý bền và ổn định: độ chịu lực của BC khá cao. Tính chất cơ lý bền và ổn định của BC giúp cho BC chịu được sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực. BC không tan trong môi trường phản ứng. Giá đỡ BC có độ trương nở tốt: độ trương nở cao giúp cho sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm. Môi trường trong và ngoài giá đỡ không có sự khác biệt giúp cho tế bào vi sinh vật giữ nguyên được các đặc điểm sinh hóa của tế bào tự do. BC đã qua xử lý không gây tác động kìm hãm đến hoạt động sống của vi sinh vật vì sau giai đoạn xủ lý, BC chỉ là giá đỡ trơ về mặt hóa học và có độ trương nở tốt. Giá thành BC: so với các vật liệu khác thì BC thấp hơn rất nhiều. BC có khả năng tái sử dụng. BC an toàn cho môi trường sống. Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men là: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, giá thành rẻ. Tuy nhiên điểm hạn chế của nó là không thể nuôi cấy những vi sinh vật tạo ra cellulase vì bản chất của BC là cellulose [12]. Giới thiệu về Saccharomyces cerevisiae Đặc điểm của S. cerevisiae S. cerevisiae là tế bào nhân chuẩn đơn bào, được dùng làm đối tượng mô hình cho nghiên cứu sinh vật nhân chuẩn. Ứng dụng sớm trong lên men rượu và làm bánh mì. Hiện nay ứng dụng trong công nghiệp lên men rượu với quy mô lớn. Đối tượng sinh vật nhân chuẩn đơn bào dùng để sản xuất protein tái tổ hợp. Cấu tạo và sinh sản của S. cerevisiae Phân loại: Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Saccharomyces Loài: Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào, tế bào giống như ở động và thực vật [9]. S. cerevisiae thường có dạng hình tròn hay bầu dục. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Kích thước thay đổi trong khoảng (3 – 10)μm x (4,5 – 15)μm. Hình 2.11: Tế bào nấm men S. cerevisiae [40][42] Hình 2.12: Khuẩn lạc S. cerevisiae trên môi trường Hansen Nhân của tế bào S. cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. Ngoài nhiễm sắc thể, trong nhân tế bào S. serevisiae còn có thể có plasmid có cấu tạo là 1 phân tử DNA vòng chứa 6300 đôi base và có kích thước 2μm, có khả năng sao chép độc lập, mang thông tin di truyền, có vai trò quan trọng trong thao tác chuyển gen của kĩ thuật di truyền[3]. Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần chủ yếu của tế bào nấm men là nước (chiếm khoảng 75% khối lượng chung). Thành phần sinh khối khô của nấm men : Chất vô cơ 5 – 10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4,8 – 12 Protein (N x 6,25) 30 – 75 Lipid 2 – 5 Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% là chất tro. Chất hữu cơ gồm: protein 13 – 14%, glycogen 6 – 8%, cellulose 1,8 – 2%, chất béo 0,5 – 2%. Protein: nấm men có hàm lượng protein trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô) và khoảng 45% chất khô protein hoàn chỉnh. Các dẫn xuất của acid nucleic như base, purin, pyrimidin, các acid amin tự do đều được coi là nguyên liệu. Glycogen: là chất dự trữ nguồn cacbon. Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hóa của nấm men và giải phóng ra nước, CO2. Chất béo: gồm acid oleic, linoelic, palmitic. Trong chất béo có 30 – 40% phosphatide. Tro: gồm các oxide sau: P2O5 khoảng 25 – 60%, CaO 1 – 8%, MgO 4 – 6%, Na2O 0,5 – 2%, SO2 0,5 – 6%, SiO2 1 – 2%, Fe2O3 0,05 – 0,7%. Nấm men S. cerevisiae có nhiều phương thức sinh sản khác nhau: Sinh sản vô tính: Tế bào nảy chồi đa cực, đôi khi có khuẩn ty giả. Sinh sản hữu tính: Bào tử túi. Túi khá bền và hình thành trực tiếp từ một tế bào lưỡng bội. Mỗi túi có chứa 1-4 (ít khi nhiều hơn). Bào tử túi hình ô van, tròn nhẵn. Chu kì sống của nấm men S. cerevisiae: có 2 giai đoạn đơn bội và lưỡng bội. Đầu tiên tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) sinh sôi nảy nở theo kiểu nảy chồi. Sau đó hai tế bào đơn bội tiếp hợp với nhau, có sự trao đổi của tế bào chất và nhân, tạo ra tế bào lưỡng bội (2n). Tế bào lưỡng bội lại nảy chồi thành nhiều tế bào lưỡng bội khác, cuối cùng hình thành hợp tử. Sau quá trình giảm phân nhân của hợp tử thành bốn nhân đơn bội. Mỗi nhân đơn bội được bao bọc tế bào chất, hình thành màng, tạo thành bốn bào tử nằm trong một túi gọi là bào tử túi. Khi túi vỡ, bào tử ra ngoài phát triển thành tế bào dinh dưỡng và lại phân chia theo lối này rồi tiếp tục chu trình sống. Trong vòng đời của nấm men có sự luân phiên sinh sản vô tính và hữu tính với các giai đoạn đơn bội và lưỡng bội khác nhau[9]. Sự hình thành nang bào tử trong điều kiện thiếu CO2 ở Saccharomyces cerevisiae được kích thích khi nồng độ oxy 12% và nồng độ oxy 41,1% thì giảm cũng không đáng kể. Tuy nhiên khi oxy đạt nồng độ 68,8% và 100% thì khả năng hình thành nang bào tử sẽ giảm rất rõ. CO2 kiềm hãm sự hình thành nang bào tử và rất ít nang bào tử được hình thành ở nồng độ CO2 25% hoặc cao hơn. Hơi nước từ dung dịch ethanol 5% ức chế đáng kể sự hình thành bào tử (Adams và Miller - 1954) [26]. S. cerevisiae phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 30°C, thời gian nhân đôi khoảng 1,5 – 2 giờ. Nấm men Saccharomyces cerevisiae phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước, trong không khí, trong trái cây, nước ngọt, nước nho ép trước khi lên men thành rượu, rượu táo, rượu vang, rượu sake, bia, quả ôliu, salads, bột mì, bánh mì, kefir, yogurt, phô mai, kem [23]. Nhu cầu dinh dưỡng Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên các nguồn cacbon khác nhau, glucose được sử dụng phổ biến nhất. Ngoài ra fructose, maltose, saccharose, galactose và các dextrin đơn giản cũng được sử dụng. Nhưng S. cerevisiae không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulose vì vậy nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicelulose. Còn lactose, pentose cũng hoàn toàn không sử dụng được. Với raffinose chỉ sử dụng được một phần ba. S. cerevisiae cũng có thể tồn tại trên nguồn cacbon không lên men như glycerol, ethanol và acetate (3% glycerol, 3% ethanol, 3% acetate). Tùy từng ứng dụng, có thể phối trộn nhiều cacbon vào môi trường nuôi cấy. Nấm men S. cerevisiae không đồng hóa được nitrate. Nguồn nitơ vô cơ được sử dụng tốt là các muối ammonium của acid vô cơ cũng như hữu cơ, đó là ammonium sulphate, phosphate, muối acetate, lactate, succinate. Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptide, các nucleotide Trong thực tế thường dùng cao nấm men, cao ngô, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc) làm nguồn nitơ hữu cơ. Đối với các nguyên tố vô cơ thì phospho được quan tâm trước hết. S. cerevisiae sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphate, thường dùng muối K2HPO4 và KH2PO4 làm nguồn P và K. Kế đến là nguyên tố lưu huỳnh vì là thành phần của một vài acid amin trong phân tử protein. Trong nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn N và S. Vài ion kim loại như kali, magie, canxi, sắt, kẽm cũng cần có trong môi trường nuôi cấy S. cerevisiae. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men S. cerevisiae là 6 vitamin nhóm B: B8, biotin, B3, B1, B6 và PP. Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám (cám gạo, cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp biotin). Saccharomyces cerevisiae khác với các loài nấm men khác nhờ vào đặc tính sinh trưởng và các đặc điểm sinh lý: phần lớn loài này có khả năng lên men đường. Đặc tính cơ bản nhất của nấm men được phân loại dựa vào khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau[17][35]. Ứng dụng của Saccharomyces cerevisiae Nấm men có nhiều ứng dụng trong sản xuất công nghiệp như công nghiệp sản xuất cồn, sinh khối (thực phẩm, men bánh mì, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi) và các sản phẩm trao đổi chất khác. Trong những năm gần đây, nấm men còn được sử dụng để sản xuất enzyme, vitamin, polysaccharide, carotenoid, ethanol, CO2, glycerin, acid hữu cơ và các hợp chất được tổng hợp bằng cách tái tổ hợp DNA vào nấm men. Trong các sản phẩm nói trên có nhiều sản phẩm được sản xuất ở quy mô thương mại. S. cerevisiae và các chủng nấm men khác từ hạt ngũ cốc được dùng để sản xuất rượu chưng cất. Ngày nay nấm men dùng trong sản xuất ethanol được cải tiến bằng cách biến đổi gen và hợp nhất với tế bào trần để tăng năng suất cho quá trình sản xuất. Trước đây, việc sản xuất ethanol chủ yếu bằng phương pháp tổng hợp hóa học từ dầu. Nhưng hiện nay, phần lớn lượng ethanol được sản xuất bằng nấm men (cao hơn 87% so với phương pháp hóa học). Enzyme invertase của nấm men S. cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo và mứt. S. cerevisiae được dùng làm tế bào chủ để sản xuất DNA tái tổ hợp. Một số sản phẩm được tiết ra bởi nấm men S. cerevisiae chứa gen tái tổ hợp: α-amylase của lúa mì, nhân tố phát triển biểu bì ở người, nhân tố giải phóng hormone tăng trưởng ở người, albumin huyết thanh người, nhân tố tăng trưởng insulin của người, prochymosin, insulin và somatostation. Interferon-γ của người được tạo ra 5 – 10% tổng lượng protein của tế bào hemoglobin người, kế tiếp là hemendogenous chiếm 2 – 3% tổng số protein. Superoxide dismutase của người được tạo ra trong pha ổn định của tế bào[12][1]. Giới thiệu về Rhodotorula Đặc điểm của tế bào Rhodotorula Phân loại Giới: Nấm Ngành: Basidiomycota Lớp: Urediniomycetes Bộ: Sporidiales Họ: Sporidiobolaceae Giống: Rhodotorula Theo Kurtzman và Fell (2000) giống men Rhodotorula gồm 45 loài, theo mô tả các tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa trước đó có tên gọi là Rh. rubra, loài này sinh enzyme urease, không đồng hóa nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc ở nhiệt độ 40°C và loài Rh. rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. rubra ở một số tài liệu hiện nay không còn nữa và đã được thay bằng tên mới là Rh. mucilaginosa. Cho đến ngày nay, người ta đã phân lập được 34 loài, trong đó có 2 loài Rhodotorula glutinis và Rhodotorula gracilis đang được quan tâm nhiều nhất. Cấu tạo và sinh sản của Rhodotorula Tế bào nấm men Rhodotorula ở dạng đơn bào, hình tròn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc gậy. Kích thước tế bào (2,5 – 5)x(5 – 10)μm. Khuẩn lạc Rhodotorula có bề mặt trơn nhẵn, bong, đôi khi gồ ghề, mịn. Mép khuẩn lạc không có răng cưa. Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng có khi màu vàng hoặc đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tùy môi trường, có thể đạt từ 1 – 10mm. Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử đốt. Hình 2.13: Khuẩn lạc Rhodotorula trên môi trường Hansen Rhodotorula thuộc nhóm nấm men không sinh bào tử, thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ dao động từ 20 - 40°C. Giống như các loài nấm men khác, tế bào Rhodotorula cũng được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản như: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân và các bào quan khác. Vài acid amin tham gia vào thành phần cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula: arginine, histidine, isoleucine, leucine, tryptophan, phenylalanine, methionine Nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nảy chồi đa cực, trừ một số loài như: Rh. pilimanae, Rh. pilatii, Rh .javaniti, Rh. ingniosa, Rh. difuens và Rh.bogoriensis là nảy chồi có cực. Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu phân đôi. Tốc độ sinh sản nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi là từ 2 - 6 giờ. Đầu tiên hạch dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Một phần hạch chuyển động vào chồi, một phần ở tế bào mẹ. Đồng thời một phần tế bào chất cũng sang chồi con. Chồi con lớn dần, khi chồi con bằng chồi mẹ nó được tách ra sống riêng lẻ. Một tế bào mẹ tạo một lần được một hoặc nhiều chồi con. Các chồi con sắp xếp trên tế bào không nhất thiết cùng một vị trí. Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula trong khoảng 24 - 48 giờ nếu môi trường cung cấp đủ các chất cần thiết. Nấm men Rhodotorula phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong trái cây, nước nho ép trước khi lên men thành rượu, rượu vang, bia, bột mì, thịt bò, thịt gia cầm, cá, hải sản, động vật có vỏ, xúc xích, thịt giăm bông [23]. Đặc điểm sinh hóa Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hóa sau: Không lên men được các loại đường: glucose, galactose, sucrose, maltose, lactose, raffinose nhưng chúng lại sử dụng được các loại đường này (trừ lactose) để cung cấp nguồn cacbon cho việc xây dựng tế bào. Sử dụng được ethanol như là nguồn cacbon và không đồng hóa KNO3. Tạo enzyme urease. Đồng hóa DBB (Diazonium Blue B). Có khả năng tổng hợp sắc tố carotenoid. Không đồng hóa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula khác với giống nấm men Candida, Cryptococcus. Không tạo thành hợp chất loại tinh bột[5]. Sắc tố của nấm men Rhodotorula Nhiều sắc tố đã được phân lập từ nấm men, đặc biệt là từ Rhodotorula và có nhiều phương pháp hiện đại đã chứng minh sự hiện diện của sắc tố với lượng tương đối cao trong vài loài nấm men. Nakayama, Mackinney và Phaff (1954) đã tìm thấy “nấm men vàng” của Rhodotorula và Cryptococcus có chứa β-carotene như là sắc tố chính. Sắc tố chủ yếu có trong Rhodotorula là torularhodin, torulene, β-carotene và γ-carotene. Hình 2.14: Các sắc tố của nấm men Rhodotorula [20] Carotene là một trong hai nhóm của carotenoid. Nhóm 1- carotene: những hợp chất hydrocacbon carotenoid, nhóm 2- xanthophyll: những dẫn xuất của carotene với nhóm chức chứa oxy. β-carotene là một trong những chất thuộc nhóm carotene, là màu tím đỏ trong bảng màu tự nhiên và được biết như là tiền vitamin A. β-carotene xuất hiện trong tự nhiên trong cà rốt, khoai lang, bơ, lòng đỏ trứng gà, dầu cá β-carotene được sản xuất bởi Rh. flava, Rh. gracilis, Rh. pallid đã được nghiên cứu bởi Deufel và Clark (1958). Hóa tính và hóa sinh chung của các caroteniod được nhiều tác giả đề cập (Goodwin, 1965; Davies, 1965; Porter và Anderson, 1967). Carotenoid của vi khuẩn (Jensen, 1965), của nấm (Goodwin, 1952; Valadon, 1966). Nhiệt độ nóng chảy cao khoảng 130-220°C. Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi. Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong dung môi như cloroform, dichlorothane. Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không phân cực. Dễ bị oxy hóa bởi không khí và nhiệt độ, ion kim loại. Sản lượng β-carotene đạt từ 5,2 – 120,8 μg/g tế bào khô khi nuôi cấy trên môi trường bán tổng hợp. Những nhà nghiên cứu đã tìm thấy sắc tố carotenoid của loại sắc tố đỏ và vàng được tách chiết trực tiếp từ tế bào Rhodotorula với acetone lạnh bằng môi trường tổng hợp Wickerham trong 72 giờ trên máy lắc. Sắc tố được chuyển từ acetone sang ether dầu hỏa và được mô tả bởi phương pháp sắc kí và quang phổ. Sắc tố sẽ thay đổi hoặc bị phá hủy bởi việc xử lý sơ bộ tế bào nấm men bằng HCl và nhiệt[14][26][33]. Ứng dụng của Rhodotorula trong sản xuất chất béo Mặc dù chất béo được sản xuất bởi nhiều loài vi sinh vật trong những điều kiện nuôi cấy đặc biệt . Tuy nhiên trong tự nhiên có một số loài nấm men, điển hình là Rh. glutinis có khả năng sản xuất một số lượng lớn chất béo và đã được nghiên cứu một cách rộng rãi. Rhodotorula glutinis là nấm men được quan tâm một cách đặc biệt bởi vì nó có chứa lượng chất béo cao (63% /100g nấm men khô), hệ số béo cao (hệ số béo đuợc tính là g béo/100g đường ), có khả năng phát triển dễ dàng trong môi trường nuôi cấy chìm, hình thành chất béo một cách nhanh chóng và không bị ràng buộc bởi sự hồi phục từ môi trường nhân giống. Mặc dù Rh. glutinis có thể sử dụng nhiều loại đường như là nguồn cacbon nhưng đường tốt nhất cho quá trình sản xuất chất béo là glucose, fructose, mannose, sucrose và mật rỉ đường (Pan et al., 1949). Xylose là đường kém thích hợp nhất nhưng nó được nấm men này sử dụng một cách hoàn hảo nhất sau khi đã thích nghi (Nielsen và Nilsson, 1950). Nồng độ đường tốt nhất cho việc tạo ra chất béo là 4 – 8%. Khi tăng nồng độ lên khoảng 20% trong môi trường nuôi cấy cũng không làm ảnh hưởng đến lượng chất béo được tạo ra, nhưng nếu tăng cao hơn nữa thì sẽ làm giảm lượng chất béo (Steinberg và Ordal, 1954). Pan và cộng sự (1949) đã nhận thấy rằng việc cung cấp thiếu (NH4)2SO4 và KH2PO4 trong môi trường mật rỉ đường sẽ ảnh hưởng đến khả năng sử dụng đường của Rh. glutinis. Khi 2 thành phần này được cung cấp với lượng 0,5g/l thì khả năng sử dụng đường của nấm men và hệ số chất béo là tốt nhất. Sự thiếu hụt lưu huỳnh hay sắt trong môi trường cũng làm giảm khả năng hình thành chất béo (Nielsen và Rojowski, 1950). Với pH 3 – 8,5 thì tốc độ tạo thành chất béo tăng từ 2,1 – 3,1g chất béo/ 100g nấm men không béo/ 1 giờ (Steinberg và Ordal, 1954). pH của môi trường mật rỉ đường để sản xuất chất béo khoảng 4,6 – 4,8 và nhiệt độ tối ưu khoảng 28°C[26]. Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula Lu, Chun (1993) nghiên cứu các thông số phát triển của nấm men Rhodotorula rubra và sự tạo thành carotenoid của chúng. C.T Shih và Y.D. Hang (1996) nghiên cứu khả năng sinh ra sắc tố carotenoid của Rhodotoruala rubra từ môi trường nước muối dưa cải bắp của Đức. Pietro Buzzini, Alessandro Martini (1999) nghiên cứu sự tạo thành caroteneoid của nấm men Rhodotorula glutisis được nuôi cấy trên môi trường nguyên liệu thô có nguồn gốc từ sản xuất nông nghiệp (nước nho, táo chưa lên men, mật đường glucose, ). Kết quả thu được lượng carotenoid cao nhất khi nuôi cấy Rhodotorula glutisis trên môi trường nước nho đặc chưa lên men: 915,4 µg β-carotene/g nấm men khô, trong đó có 9,2% β-carotene, 9,3% torulene và 78,8% torularhodin[5]. Giới thiệu về vi khuẩn Azotobacter Đặc điểm của vi khuẩn Azotobacter Phân loại Phân loại Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Azotobacter Năm 1901 nhà khoa học người Hà Lan M.W.Beijerinck lần đầu tiên phân lập được Azotobacter. Ông đặt tên cho loài vi khuẩn này là Azotobacter chroococcum. Chúng giữ vai trò làm cho đất thêm phì nhiêu bằng việc cố định nitơ từ khí quyển, thường gặp chúng trong tự nhiên và có nhiều loài khác nhau. Vi khuẩn Azotobacter là vi khuẩn gram âm, tế bào có dạng hình cầu đến hình que. Tế bào có kích thước (2-10) x (1-2) µm. Tế bào sinh sôi nảy nở theo lối phân cắt đơn giản. Di động nhờ tiên mao mọc xung quanh cơ thể. Lượng DNA trong tế bào thường thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác (khoảng 0,7 – 0,81%). Hình 2.15: Khuẩn lạc Azotobacter trên môi trường Ashby (hình trái) và tế bào Azotobacter dưới kính hiển vi (hình phải) [36] Khi tế bào già sẽ mất khả năng di động và tế bào có dạng giống hình cầu. Quan sát dưới kính hiển vi tế bào Azotobacter già được bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày. Một số loài Azotobacter có khả năng hình thành bào xác, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ hình thành tế bào mới. Hình 2.16: Nang Azotobacter [43][37] Trên môi trường không chứa nitơ, khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi khi nhăn nheo. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc, khuẩn lạc có màu vàng lục, hồng hay nâu đen. Màu sắc khuẩn lạc là một trong những tiêu chí để phân loại các loài Azotobacter [11] [32][37]. Nhu cầu dinh dưỡng Phần lớn các loài Azotobacter phân lập từ thiên nhiên có khả năng cố định được trên 10mg N2 khi tiêu thụ hết 1g hợp chất cacbon. Một chủng Azotobacter trong điều kiện thuận lợi có thể đồng hóa được 30mg N2/1g hợp chất cacbon. Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi sinh vật khác thì Azotobacter sẽ cố định nitơ cao hơn khi nuôi cấy riêng lẽ. Azotobacter có khả năng đồng hóa muối ammonium và urê, một số loài còn sử dụng được nitrate và nitrite. Hai loại acid amin thích hợp nhất là acid glutamic và acid asparaginic. Sự có mặt của muối ammonium hay nitrate trong môi trường sẽ làm hạn chế sự cố định nitơ của Azotobacter. Azotobacter đồng hóa nhiều loại monosaccharide, disaccharide, trisaccharide, polysaccharide, glycerin, mannit, sorbit, inozit, các oxit acid, các diacid, các hợp chất thơm. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon ở trên tùy theo từng chủng. Azotobacter không có khả năng đồng hóa chất mùn. Chúng chỉ có khả năng phát triển mạnh mẽ trong đất có nhiều chất hữu cơ dễ đồng hóa. Đất có bón phân xanh, phân chuồng có tác dụng tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển nhanh chóng của Azotobacter. Ngoài ra nó còn đồng hóa tốt các sản phẩm phân giải cellulose. Các hợp chất chứa phospho có ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát triển và khả năng cố định nitơ của Azotobacter. Chúng cũng có khả năng đồng hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa phosphor. Calci cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát triển của Azotobacter. Các nguyên tố vi lượng (B, Mo, Fe, Mn) cũng rất cần thiết đối với Azotobacter. Chúng giúp cho quá trình cố định nitơ tiến hành được thuận lợi. Fe và Mo là cofactor của enzyme nitrogenase, là enzyme quan trọng trong quá trình cố định nitơ (Brock và cộng sự, 1994). Các nguyên tố phóng xạ (Radi, Tori, Urani) có khả năng kích thích sự phát triển của Azotobacter và quá trình cố định nitơ của chúng. Theo nghiên cứu của Vemani và cộng sự (1997), mặc dù Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ nhưng khi thêm nitơ vào môi trường nuôi cấy sẽ làm giảm thời gian pha lag và thời gian thế hệ. Khi thêm NaNO3 (0,5g/l) sẽ đẩy nhanh quá trình tăng trưởng nhưng nồng độ NaNO3 có tăng thêm thì kết quả cũng không thay đổi. Tương tự với KNO3. Kết quả tốt nhất là với NH4Cl 0,1g/l [4][11]. Đặc điểm sinh lý Azotobacter rất mẫm cảm với pH của môi trường, chúng có thể phát triển ở pH = 4,5 – 9 nhưng thích hợp nhất là khoảng 7,2 – 8,2. Tuy nhiên pH thích hợp cho quá trình cố định nitơ là khoảng 5,5 – 7,2 (đôi khi đến 7,7). Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6 vì vậy không gặp chúng trong đất chua. Các điều tra ở Việt Nam (Nguyễn Lân Dũng, 1960, 1964, 1969) cho biết khi pH đất thấp hơn 5,5 sự phát triển của Azotobacter bị hạn chế một cách rõ rệt. Trong khi đó ở đất có pH trung tính Azotobacter luôn luôn có từ hàng nghìn đến hàng vạn tế bào trong mỗi gram đất khô. Azotobacter là loại vi khuẩn ưa ẩm. Tuy vậy bào xác của Azotobacter vẫn có thể chịu đựng được rất lâu khi đất khô hạn. Azotobacter phát triển ở khoảng nhiệt độ 25 - 30°C. Ở nhiệt độ cao 45 - 48°C chúng sẽ thoái hóa và chết. Ngoài ra, chúng cũng có khả năng chống chịu tốt đối với nhiệt độ thấp. Azotobacter là vi sinh vật hiếu khí. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng không khí có ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của Azotobacter. Điều kiện tốt nhất cho quá trình hình thành sinh khối là áp suất O2 từ 2 – 3% không khí bão hòa và quá trình này sẽ giảm nếu tăng áp suất O2(SWabra và cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu khác (Pena và công sự, 2000), khi tăng cả áp lực oxy hòa tan lẫn tốc độ khuấy trộn trong nuôi cấy thì mật độ tế bào Azotobacter sẽ tăng. Sự phát triển và cố định nitơ của Azotobacter trong đất chịu ảnh hưởng mật thiết với các hệ vi sinh vật. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng tốt đối với sự phát triển của chúng (tổng hợp các chất hoạt động sinh học, phân giải các chất hữu cơ bền vững) còn có nhiều nhóm vi sinh vật ức chế (cạnh tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh) [4]. Đã có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ của Azotobacter với cây trồng. Chúng có mặt trong vùng rễ cây trồng với số lượng cao hơn nhiều so với vùng ngoài rễ. Số lượng của chúng còn biến đổi tùy thuộc từng loại cây, từng giai đoạn phát triển của cây và những yếu tố sinh thái địa lý khác. Người ta chứng minh được Azotobacter không phát triển trên bề mặt rễ mà phát triển trong đất xung quanh rễ [2]. Ảnh hưởng của Azotobacter đối với cây trồng Azotobacter có khả năng tích lũy trong dịch nuôi cấy nhiều chất hoạt động sinh học (vitamin B1, B6, biotin, auxin) và có khả năng tổng hợp chất kháng sinh chống mốc thuộc nhóm anxomixin. Azotobacter có tác dụng tăng cường nitơ cung cấp cho cây trồng. Trung bình khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lựơng, Azotobacter có thể đồng hóa được 10 – 15mg nitơ phân tử. Nhìn chung, hiện nay người ta đều cho rằng Azotobacter có khả năng tạo ra các chất sinh trưởng như vitamin B1, B2, B6, hetero auxin, giberrelin và khả năng ức chế nấm của loại vi khuẩn này. Có rất nhiều thí nghiệm cho thấy Azotobacter tác động tốt lên cây trồng theo hướng này là chính [4] Ứng dụng của Azotobacter trong sản xuất phân vi sinh Nhiều nước trên thế giới đã sử dụng Azotobacter để sản xuất phân vi sinh với tên gọi Azotobacterin, loại phân bón này có tác dụng nâng cao sản lượng cây trồng. Phân bón vi sinh Azotobacterin chứa 108 CFU/g vi khuẩn Azotobacter và chất mang, giúp tăng khả năng cố định N2 trong đất, tăng độ xốp của đất, tăng năng suất và kích thích tăng trưởng của cây. Ngoài ra nó còn giúp phòng chống một số bệnh cho cây trồng như bệnh héo xanh ở khoai cây, bệnh khô vằn trên ngô, giảm các loại sâu như sâu cuốn lá, sâu đục than trên lúa , nhờ vậy giảm chi phí thuốc trừ sâu hóa học, giảm ô nhiễm môi trường. Phân Azotobacterin có tác dụng làm giảm đáng kể lượng nitrate độc hại trong rau, tăng giá trị dinh dưỡng của rau màu vì thế rất phù hợp dùng cho các cây hoa màu, cây có củ tạo ra các sản phẩm rau và quả sạch. Quy trình sản xuất phân vi sinh Azotobacterin: tác nhân chính của loại phân này là các chủng vi khuẩn Azotobacter, chủ yếu là Azotobacter chroococcum. Vi khuẩn Azotobacter được thu nhận từ phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường Ashby (hoặc bằng phương pháp lên men sục khí) được trộn với một nửa lượng chất mang cần thiết đã bổ sung thêm các chất dinh dưỡng. Hỗn hợp được trộn đều và trải thành một lớp dày khoảng 20 – 40cm trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25°C trong khoảng 3 ngày. Sau đó trộn khối vật chất này với phần chất mang và các chất dinh dưỡng còn lại và cũng trải đều tất cả thành lớp mỏng trong các điều kiện như trên. Mỗi ngày đảo trộn một lần để làm tăng độ thông khí cho quá trình phát triển của vi khuẩn. Sau 3 – 5 ngày có thể đóng gói sản phẩm để bảo quản và đưa đi sử dụng. Lượng giống cần thiết cho quá trình này vào khoảng 2 – 3% khối lượng chất mang. Chất mang dùng là than bùn được khơi khô, đập nhỏ, trung hòa đến độ pH trung tính hoặc kiềm yếu rồi bổ sung thêm 1% đường, 0,1 – 0,2% superphotphat. Ở cuối quá trình sản xuất mật độ vi khuẩn Azotobacter trong phân phải đạt ở mức 108 tế bào/g [4]. Hình 2.17: Chế phẩm phân Azotobacterin ở Ấn Độ Yêu cầu đối với phân vi sinh: Các chủng vi sinh vật trong phân bón phải có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trường chúng được áp dụng. Các chủng vi sinh vật phải có ảnh hưởng tốt đến các đối tượng áp dụng. Phân vi sinh không ảnh hưởng xấu tới môi trường, con người và vật nuôi. Phân vi sinh có giá thành rẻ, thuận tiện trong sử dụng và phải mang lại hiệu quả cho người sản xuất. Ý nghĩa của việc sử dụng phân vi sinh: Giảm các loại phân bón vô cơ và thuốc bảo vệ thực vật, tạo điều kiện chuyển nền nông nghiệp hóa học sang nông nghiệp hữu cơ. Nâng cao chất lượng môi trường và bảo vệ các nguồn lợi tự nhiên của hệ sinh thái. Tăng khả năng sử dụng các nguồn lợi có sẵn của tự nhiên. Bảo đảm chất lượng và độ an toàn của các loại nông sản [4].