Đề tài Nghiên cứu một số phản ứng chuyển hóa với hợp chất ent-Kauran diterpenoid phân lập

ung thư cổ tử cung Hela. Các hợp chất 16αH-17,19-ent-kauranediol (134), 13-hydroxy-16-ent-kauren-19-al (135), 16-ent-kauren-19-ol (136) chống lại hai dòng tế bào ung thư K562 và L-929. Hợp chất 16-ent-kauren-19-ol (136) chọn lọc nhất cho hoạt tính này IC50 = 6,8 µg/ml [23]. Các loài Rabdosia ở Trung Quốc được sử dụng trong y học cổ truyền như tác nhân chống ung thư và chống viêm nhiễm. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của lá và thân cùng các hoạt tính sinh học đối với các loài Rabdosia khác nhau, đặc biệt là Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara. Các kauran diterpen như oridonin (137) và ponicidin (138) là những chất độc tế bào chính trong các loài Rabdosia [32]. 137 138 Các hợp chất 139, 140, 144, 145 và 146 tách ra từ ngọn của Isodon enanderianus gây độc tế bào mạnh lên dòng tế bào K562 với IC50 lần lượt là 0,67; 0,16; 0,59; 0,13; 0,87 µg/ml. Các hợp chất 141 và 142 không gây độc tế bào đối với dòng tế bào K562 [38]. R1 R2 R3 R4 R5 139 OH OAc OH H =O 140 OAc H OH H =O 143 OAc H OH H β-OH 144 145 146 OAc OAc OH H H OAc H H H OH OH H β-OH =O =O Hình 15: Các ent-kauran từ Isodon enanderianus Năm ent-kauran diterpenoid mới, các ludongnin F-J (147-151) cùng với 10 hợp chất đã biết, các guidongnin A-C (152-154), angustifolin (155), 6-epiangustifolin (156), sculponeatin J (157) và gardenin D đã được tách ra từ lá của Isodon rubescens var. lushiensis. Tất cả các hợp chất 147-159 đã được đánh giá ảnh hưởng ức chế lên tế bào ung thư K562. Hợp chất 151-152, 155-158 gây ảnh hưởng ức chế mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 0,18; 0,30; 0,23; 0,87; 0,83; 0,25 µg/ml. Trong khi các hợp chất còn lại 147-150, 153-154 không có hoạt tính (IC50 > 50 µg/ml). Điều này xác nhận rằng cấu hình cyclopentanon với một nhóm exomethylen là trung tâm hoạt động gây hoạt tính. Hợp chất 151 gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư gan CA và dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50 lần lượt là 0,09 và 0,70 µg/ml [24]. R1 R2 R3 R4 147 α-OCH3 H =O β-CH3 148 α-OCH3 H =O α-CH3 149 β-OCH3 H =O α-CH3 150 β-OCH3 H =O β-CH3 151 α-OCH3 H =O =CH2 152 =O OH α -OH =CH2 153 =O H =O β-CH3 154 =O OH =O β-CH3 155 β-OCH3 OH =O =CH2 156 α-OCH3 OH =O =CH2 157 =O OH =O =CH2 158 =O H =O α-CH3 Hình 16: Các ent-kauran tách ra từ lá Isodon rubescens var. lushiensis Năm 2006, lần đầu tiên trên thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococus aureus kháng methicillin đã được Phan Minh Giang và cộng sự thực hiện trên các ent-kauran diterpenoid được phân lập từ Croton tonkinensis [22]. Các diterpenoid hoạt động nhất là ent-18-acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (MIC 32 µg/ml), ent-18-acetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one 32 (500 µg/ml) và ent-18-acetoxy-7β, 14α-dihydroxykaur-16-en-15-one 32 (125 µg/ml). Chương 2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu thực vật Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, hong khô nơi thoáng mát và sấy khô ở 50oC. Sau đó, xay mẫu khô thành dạng bột mịn. Bột nguyên liệu thực vật được ngâm chiết với các dung môi như metanol, rồi phân bố chọn lọc trong các dung môi thích hợp (n-hexan, diclometan) để thu được các phần chiết. 2.1.2 Các phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây khổ sâm Bắc Bộ cũng như phân lập các chất đã sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và các phương pháp kết tinh phân đoạn. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, dày 0,2 mm (Merck). Hiện màu các vệt bằng thuốc thử dung dịch vanilin/H2SO4 1%, Dragendoff-Munier và soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Sắc ký cột (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi dưới áp suất khí quyển. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel Merck các cỡ hạt, được nhồi theo phương pháp nhồi ướt. 2.1.3 Các phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất Cấu trúc của hợp chất phân lập được đã được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ khối lượng (EI-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) là 1H NMR, 13C NMR, DEPT. 2.1.4 Điều chế các phần chiết từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ Bột khô lá cây khổ sâm Bắc Bộ được ngâm chiết 2 lần với metanol khan ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết metanol được cất loại dung môi xuống còn 1/10 thể tích rồi pha loãng bằng nước cất theo một tỷ lệ thích hợp. Dịch metanol-nước được chiết lần lượt với dung môi không hoặc ít phân cực như n-hexan, diclometan. Sau khi được làm khô, cất loại dung môi các dịch chiết cho các phần chiết tương ứng n-hexan, diclometan (D). Sơ đồ 1: Qui trình chiết lá cây khổ sâm Bắc Bộ Bột lá cây khổ sâm Bắc Bộ 1. Chiết với metanol 2.Gộp cô dung môi Phần chiết MeOH Phần bã 1.Chiết với n-hexan 2. Làm khô dịch chiết bằng Na2SO4 3. Cất loại dung môi Dịch nước Phần chiết n-hexan (H) 1.Chiết với diclometan 2. Làm khô dịch chiết bằng Na2SO4 3. Cất loại dung môi Dịch nước Phần chiết diclometan (D) 2.2 Qui trình phân lập các ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Để phân lập các ent-kauran diterpenoid, ta đi từ phần chiết D (xem 3.3.2). 15 gam phần chiết D được tẩm với 10 gam silica gel (Merck, 0,063-0,100mm) thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu sẫm. Phân tách hỗn hợp này bằng sắc ký cột (CC) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton thu được 8 phân đoạn từ D1 đến D8. Nhóm phân đoạn D2 sau đó được phân tách lại bằng sắc ký cột thường (CC) trên chất hấp phụ silica gel (Merck, 0,063–0,200mm) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton, ta thu được 3 nhóm phân đoạn D2.1, D2.2, D2.3. Nhóm phân đoạn D2.2 thấy có tinh thể hình kim màu trắng kết tinh, lấy ra kết tinh lại trong axeton thu được một chất tinh khiết CH1 (1). Nhóm phân đoạn D2.3 thu được một hỗn hợp hai tinh thể đồng kết tinh rất khó tách ký hiệu là hỗn hợp 2 chất CH2 (7) và CH3 (8). 1 7 8 Sơ đồ 2: Qui trình phân tách phần chiết diclometan (D) D (15 g) CC, silica gel (0,063 – 0,100 mm), 80 pđ (150 ml/ pđ) D2 26 – 39 0,5 g D1 1 – 25 0,6 g D3 40 – 80 1,4 g CC, silica gel (0,063 – 0,100 mm), 35 pđ (15 ml/ pđ) D2.2 10–15 0,5 g D2.1 Pđ 1- 9 0,3 g D2.3 26–35 0,2 g Rửa, n-hexan - axeton Kết tinh lại, axeton 7 + 8 1 2.3 Chuyển hoá các ent-kauran diterpenoid Các chất ent-kauran diterpenoid được phân lập từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) có hoạt tính khá phong phú. Các chất này có hoạt tính kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum in vitro. Đồng thời chúng cũng có tác dụng ức chế rõ rệt đối với một số dòng tế bào ung thư (Hep-G2, RD, FI, VR) và có tác dụng ức chế đối với một số vi sinh vật như vi khuẩn. Với mục đích thực hiện chuyển hoá ở một số nhóm chức của các chất này để nhận được các hợp chất mới có hoạt tính tốt hơn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu một số phản ứng chuyển hoá của chúng. Hình 17: Sơ đồ các phản ứng chuyển hóa chất 1 Hình 18: Sơ đồ các phản ứng chuyển hóa hỗn hợp chất 7 và 8 2.3.1 Phản ứng epoxi hóa Cân 0,5 g chất đầu vào bình cầu phản ứng có dung tích 50 ml. Hòa tan hết chất đầu trong 16 ml CH2Cl2. Cho 0,4 g MCPBA vào bình, hòa tan hoàn toàn trong 16 ml CH2Cl2. Làm lạnh bình phản ứng đến -10oC. Làm lạnh dung dịch peaxit đến -5oC. Nhỏ giọt dung dịch peaxit vào bình phản ứng, khuấy đều trong thời gian 40’. Khuấy tiếp hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, rồi để yên trong 3 ngày. Cho hỗn hợp sau phản ứng lên phễu chiết, lắc hỗn hợp với dung dịch NaHCO3 bão hòa (3 lần, mỗi lần 30 ml), chiết giữ lại lớp dưới CH2Cl2. Cuối cùng rửa bằng nước 4 lần đến pH trung tính. Làm khan dung dịch nhận được bằng Na2SO4. Cất loại dung môi cho sản phẩm thô có màu trắng ngà. Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc kí cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 -0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton 8:1 thu 10 ml/ phân đoạn cho các sản phẩm epoxit tương ứng. Từ chất đầu là chất (1) thu được sản phẩm chính là A3 (159). Từ chất đầu là hỗn hợp 2 chất (7) và (8) thu được sản phẩm chính là F (160 và 161). Phản ứng này có mục đích oxi hóa nối đôi ở C-16 và C-17 thành oxit. Phương trình phản ứng: 159 Tinh thể màu trắng, đnc 176 – 178oC. Rf = 0,35 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 1:1), vệt chất có màu tím hồng khi phun với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. Vệt có màu vàng sẫm khi phun thuốc thử Dragendoff-Munier. Phổ 1H NMR của 159 cho thấy sự có mặt của một nhóm cacbonyl [δC 170,4 (s)] một nhóm metin được oxy hóa [δC 76,9 (d), C-7], một nhóm metylen mang oxi ở C-18 [δC 72,1 (t); δH 3,65 (d, J=11,5 Hz) và 3,89 (d, J=11,5 Hz)] và một nhóm axetat [δC 121,1 (q); δH 2,07 (s)]. Một vòng epoxit đã hình thành ở vị trí cũ của nối đôi C-16/C-17 [δC 51,4 (t); δH 2,59 (d, J=6,0 Hz)], vòng này được liên kết với một vòng lacton [δC 170,4 (t)] bằng một cầu axetat [δC 91,1 (s)]. 160: Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của hai nhóm axetat ở vị trí số 1 và 14 [δH 1,98 (s); 1,99 (s)] và một nhóm OH ở vị trí số 7 [δH 4,17 (brs)] đồng thời có một vòng epoxit được hình thành ở vị trí cũ của nối đôi [δH, 3,26 (d, J=10,5 Hz)]. 161: Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của hai nhóm axetat ở vị trí số 1 và 7 [δH 2,01 (s); 2,02 (s)] và một nhóm OH ở vị trí số 14 [δH 5,04 (s)] đồng thời có một vòng epoxit được hình thành ở vị trí cũ của nối đôi [δH, 3,18 (d, J=11,0 Hz)]. 2.3.2 Phản ứng mở vòng epoxit A3 bằng thủy phân kiềm Cân 100 mg chất A3 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng với dung dịch NaOH 2,5% trong MeOH (10 ml) trên nồi nước nóng trong 2h. Sau phản ứng thêm nước cất vào bình phản ứng. Chiết hỗn hợp phản ứng 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 6 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng nước cất đến môi trường trung tính. Làm khan dung dịch nhận được bằng Na2SO4, lọc và cất loại diclometan, thu được cặn thô. Cặn thô được tinh chế bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 -0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v) thu 8 ml/ phân đoạn cho tinh thể L (162). Phản ứng này có mục đích thủy phân epoxit thành diol. Phương trình phản ứng: 159 162 162 Tinh thể màu trắng hình kim. Rf = 0,65 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (1:2, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. Phổ 13C NMR và DEPT chỉ ra sự có mặt của 22 nguyên tử C, có một nhóm cacbonyl [δC 180,3 (s)], có bốn nguyên tử C bậc 4 [δC 36,9; 38,2; 82,7; 87,9], một nhóm metylen mang oxi ở C-18 [δC 70,0; δH 3,76 (d, J=10,5 Hz) và 3,95 (d, J=10,5 Hz). Một vòng epoxit ở vị trí C-16/C-17 [δC 62,4; δH 3,0 (d, J = 11,0 Hz)], vòng này được liên kết với một vòng lacton [δC 180,3 ] bằng một cầu axetat [δC 87,9 (s)] 2.3.3 Phản ứng thủy phân hỗn hợp epoxit F bằng phức BF3.Et2O Cho 20 mg epoxit A1 được hòa tan trong CHCl3 khan vào bình cầu phản ứng được khuấy từ trong điều kiện được làm lạnh bằng đá. Thêm 5 giọt BF3.Et2O vào bình phản ứng. Sau 5 phút, hỗn hợp phản ứng được rửa bằng dung dịch NaHCO3, được làm khan trên Na2SO4, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn thô. Cặn thô được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 -0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (10:1, v/v) thu 5 ml/ phân đoạn cho tinh thể F2 (163). 161 160 163 163 Tinh thể màu trắng dạng bột. Rf = 0,32 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. Phổ13C NMR chỉ ra sự có mặt của một nhóm cacbonyl [δC 217,1], có năm nguyên tử C bậc 4 [δC 21,5; 32,9; 42,8; 61,9; 62,4], phổ 1H NMR chỉ ra sự có mặt của một nhóm axetat [δH 2,01 (s)], một vòng epoxit ở vị trí C-16/C-17 [δC 62,4; 48,3 δH 2,91 (d, J = 11,0 Hz)]. 2.3.4 Phản ứng thủy phân Cân 200 mg chất đầu cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 5 ml metanol chứa 15% KOH vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu ở nhiệt độ khoảng 70 – 80oC trong 12 giờ. Sau khi phản ứng, thêm 30 ml nước cất vào hỗn hợp trên và cất loại metanol. Chiết dung dịch này 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 5ml). Rửa bằng nước đến pH = 7, gộp các dịch chiết diclometan lại, làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm), hệ dung môi là gradient n-hexan-axeton thu 5 ml/ phân đoạn cho các sản phẩm thủy phân tương ứng. Từ chất đầu là chất 1 thu được sản phẩm chính là 164. Từ chất đầu là hỗn hợp 2 chất 7 và 8 thu được sản phẩm chính là K2 (165). Phản ứng này có mục đích thủy phân các nhóm axetat thành nhóm hydroxyl. Phương trình phản ứng: 1 164 7 8 165 165 Tinh thể màu trắng hình kim. Rf = 0,53 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. Phổ13C NMR chỉ ra có năm nguyên tử C bậc 4 [δC 72,7; 32,9; 43; 61,6; 146,0], nối đôi ngoại vòng giữa C-16 và C-17 [δC 146,0; 117,7], phổ 1H NMR cũng chỉ ra không có nhóm axetat trong phân tử. 2.3.5 Phản ứng axetyl hóa chất 1 Cân 50 mg chất 1 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 0,2 ml anhidrit axetic, sau đó cho 0,5 ml pyridin (đã được làm khan kỹ bằng KOH rắn và chưng cất trước khi dùng) vào bình phản ứng. Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau phản ứng, thêm nước cất và dung dịch HCl 7M vào bình phản ứng. Chiết hỗn hợp phản ứng khoảng 7 lần bằng diclometan (mỗi lần 6 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng nước đến môi trường trung tính. Làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể 166. 2.3.6 Phản ứng oxi hoá chất 1 Cân 50 mg chất 1 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 1 ml clorofoc vào trong bình để hoà tan chất. Sau đó cho vào bình dung dịch A (40mg K2Cr2O7 trong 2,5 ml nước cất) và nhỏ giọt từ từ 0,1 ml axit sunfuric đặc vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy và đun hồi lưu ở nhiệt độ 50 – 60oC trong 3 ngày. Sau phản ứng chiết dung dịch thu được 5 lần bằng clorofoc (mỗi lần 7 ml). Rửa bằng nước cất đến pH = 7, gộp các dịch chiết clorofoc lại, làm khan và cất loại clorofoc, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm), hệ dung môi là gradient n-hexan-axeton thu 5 ml/ phân đoạn cho tinh thể 167. 2.3.7 Phản ứng oxi hoá hỗn hợp 7 và 8 bằng tác nhân Jones Cân 10 mg chất đầu vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 10 ml axeton (được làm lạnh đến -20oC) vào bình để hoà tan chất. Sau đó thêm từ từ vào bình dung dịch 1 ml tác nhân Jones (tác nhân Jones được điều chế từ 27g CrO3 và 23 ml H2SO4 đặc sau đó thêm 20 ml nước cất) sao cho nhiệt độ phản ứng không vượt quá -5oC. Sau 5phút phản ứng kết thúc, thêm isopropanol để phá hủy lượng dư tác nhân. Sau phản ứng đổ hỗn hợp phản ứng vào nước, chiết dung dịch thu được khoảng 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH = 7. Làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể hình kim màu trắng O1 (168). Phản ứng này có mục đích oxy hoá nhóm ancol bậc hai ở C-7 thành xeton. 7 8 168 168 Tinh thể màu trắng hình kim. Rf = 0,41 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan - axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. Phổ 13C NMR chỉ ra nối đôi ngoại vòng giữa C-16 và C-17 [δC 145,5; 118,7], có hai nhóm cacbonyl ở vị trí số 7 và 15 [δC 201,5; 205,1], phổ 1H NMR cũng chỉ ra sự có mặt của 2 nhóm axetat ở vị trí số 1 và 14 [δH 1,96; 1,99]. 2.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các dẫn xuất ent-kauran diterpenoid Chủng vi khuẩn Escherichia coli (E. Coli) đứng hàng đầu trong những căn nguyên gây bệnh ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, gây nhiễm khuẩn huyết, ngoài ra còn là nguyên nhân của những bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, gây nhiễm trùng vết thương. Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus (còn gọi là tụ cầu) gây nhiễm độc thức ăn, gây viêm ruột cấp, gây ra những nhiễm trùng các bệnh ngoài da. Pseudomonas aeruginosa cũng là chủng vi khuẩn gây bệnh có điều kiện, khi cơ thể người suy giảm miễn dịch vi khuẩn này gây viêm mủ điển hình, viêm phủ tạng (xương, đường tiết niệu...), nhiễm trùng bệnh viện khá phổ biến. Một số loại nấm sợi khi nhiễm vào thức ăn có khả năng gây độc tố, trong đó có chủng nấm mốc Aspergillus niger và Fusarium oxysporum. Các chủng nấm men, ngoài tác dụng lên men khi được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như chủng Saccharomyces cerevisiae, còn có thể gây ra nhiễm trùng nội tạng, nhiễm trùng đường tiết niệu như chủng Candida albicans [10, 11]. Như vậy, việc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các phần chiết và các hợp chất được phân lập là rất cần thiết và hữu ích. Hoạt tính kháng sinh của các ent-kauran diterpenoid thiên nhiên ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl axetat (1), ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one (7), ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (8), ent-18-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (CT2), và các dẫn xuất bán tổng hợp: sản phẩm epoxi hóa chất 1 là A3 (159), sản phẩm epoxi hóa hỗn hợp chất (7+8) là F (160 và 161), sản phẩm mở vòng epoxit A3 (159) là L (162), sản phẩm thủy phân hỗn hợp epoxit F (160 và 161) là F2 (163), sản phẩm thủy phân chất 1 là 164, sản phẩm thủy phân hỗn hợp chất (7+8) là K2 (165), sản phẩm axetyl hóa chất 1 là 166, sản phẩm oxi hóa chất 1 là 167, sản phẩm oxi hóa hỗn hợp chất (7+8) là 168 đã được thử nghiệm trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Berghe và Vlietlinck (1991) [35]. Các chủng vi sinh vật được thử nghiệm bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (-), Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+), Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus, hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Fusarium oxysporum, và hai chủng nấm men Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae. Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định nói trên đã xác định các tác nhân kháng khuẩn và kháng nấm mới thuộc dãy ent-kauran diterpenoid. Các hoạt tính tập trung vào các chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus với các giá trị MIC tương ứng là 25 và 50 µg/ml O1(168). Dẫn xuất 167 (MIC 12,5 µg/ml), 166, CT2, 7 (MIC 50 µg/ml) kháng S. aureus. Các hoạt tính kháng nấm A. niger đã được phát hiện cho 166 (MIC 25 µg/ml); 167 (50 µg/ml), 1 (50 µg/ml) và kháng nấm S. cerevisiae cho 1 (50 µg/ml). Chương 3 PHẦN THỰC NGHIỆM 3.1 Đối tượng và kỹ thuật thực nghiệm 3.1.1 Nguyên liệu thực vật Nguyên liệu thực vật là toàn bộ phần lá của cây khổ sâm Bắc Bộ. Cây được thu hái ở Hà Nội vào tháng 9 năm 2004. Mẫu cây được rửa sạch, hong trong bóng râm, sau đó tuốt lá, nhặt bỏ cành và đem sấy ở nhiệt độ 40oC. Khi mẫu lá cây đã khô hoàn toàn, đem xay thành bột mịn. Bột nguyên liệu thực vật được ngâm chiết với metanol, rồi phân bố chọn lọc trong các dung môi thích hợp n-hexan, diclometan và etyl axetat để thu được các phần chiết. 3.1.2 Dung môi Các dung môi (n-hexan, axeton, cloroform, diclometan, metanol và etyl axetat) đều được làm khan và chưng cất lại. Sau đó pha hệ dung môi theo tỷ lệ phù hợp với yêu cầu sử dụng trong sắc ký. Lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi mới cho vào bình khai triển đáy bằng có nắp nhám kín. Để yên dung môi đến khi bão hòa mới sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng. 3.1.3 Các thuốc thử phát hiện các lớp chất Dùng ánh sáng đèn UV (l 254 nm) và các thuốc thử vanilin/axit sunfuric 1%, thuốc thử Dragendoff – Munier và thuốc thử FeCl3 - Điều chế thuốc thử vanilin/axit sunfuric: Hoà tan hoàn toàn 1,86 g vanilin trong 100 ml axít sunfuric đặc thu được dung dịch thuốc thử vanilin/axit sunfuric - Điều chế thuốc thử Dragendoff – Munier Pha chế dung dịch gốc từ các dung dịch sau: Dung dịch A Dung dịch B Bi(NO3)5 17g Axit tactric 200g Nước 800ml KI 160g Nước 400ml Trộn lẫn hai dung dịch A và B với nhau thu được dung dịch gốc có màu da cam. Dung dịch gốc này cần được bảo quản trong chai màu nâu, tránh ánh sáng và để lạnh. Khi cần sử dụng ta pha dung dịch gốc thành dung dịch thuốc thử như sau: Dung dịch gốc 50ml Axit tactric 200g Nước 400ml 3.1.4 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254, dày 0,2 mm (Merck). Cách đưa chất lên lớp mỏng: lấy một lượng nhỏ cặn chiết hoà tan bằng 2 – 3 giọt dung môi thích hợp, sau đó dùng capilla chấm chất lên lớp mỏng. Dung môi: Các dung môi (n-hexan, axeton, clorofoc, benzen, và metanol) đều được làm khan và chưng cất lại. Sau đó pha các hệ dung môi theo tỉ lệ phù hợp. Lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi cho vào bình triển khai đáy bằng có nắp nhám kín. Để yên dung môi đến khi bão hoà mới sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột (FC và CC) Trong sắc ký cột nhanh (FC) đã áp dụng không khí nén với áp lực từ 0,2 – 0,3 bar để đẩy dung môi chạy qua cột sắc ký. Chất hấp phụ dùng ở đây là silica gel 60 Merck ( cỡ hạt 0,015 – 0,040 mm hoặc 0,040 –0,063 mm ). Cột tách sắc ký là một ống thuỷ tinh hình trụ, phía dưới có khoá. Cột có đường kính tuỳ theo yêu cầu sử dụng. Tốc độ rửa giải là 1 – 1,5 ml/phút. Sắc ký cột thường (CC) được dùng với chất hấp phụ silica gel 60 Merck (cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, 0,063 – 0,100 mm, hoặc 0,063 – 0,200 mm). Quá trình chạy cột được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Dung môi sử dụng trong sắc ký cột là n-hexan, etyl axetat (EtOAc), toluen, axeton, clorofoc, metanol... Các dung môi đều được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong chai kín. Chất cần phân tách bằng sắc ký cột được hoà tan trong dung môi, thêm một lượng nhỏ chất hấp phụ. Trộn đều hỗn hợp và làm bay hơi hết dung môi, thu được một hỗn hợp ở dạng bột tơi. Khi đưa chất lên cột chất hấp phụ phải dàn đều và dùng bông thuỷ tinh hoặc cát phủ lên bề mặt chất. Nhồi cột sắc ký theo phương pháp nhồi khô hay nhồi ướt. Trong quá trình nhồi cột phải loại bỏ triệt để các bọt khí bằng cách cho dung môi chảy qua cột nhiều lần và gõ nhẹ vào thân cột để cột được nén đều sau đó để yên qua đêm cho cột ổn định. 3.1.5 Các phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất *Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên thiết bị Impact 410 – Nicolet FT–IR. *Phổ khối lượng (EI-MS và HR-EI-MS) thiết bị Hewlett Packard 5989 B MS và Varian MAT 44S. *Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1H NMR được ghi trên máy Brucker Avance 500. 13C NMR (với chương trình DEPT) được ghi trên máy Brucker Advance 500. TMS (tetrametyl silan) (1H NMR) hoặc tín hiệu của dung môi (13C NMR) là chất chuẩn nội. Độ chuyển dịch hoá học được biểu thị bằng ppm. Điểm nóng chảy được đo trên bộ dụng cụ Boetius (Đức). 3.2 Điều chế các phần chiết từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) 1 kg bột lá khô của cây khổ sâm Bắc Bộ được ngâm chiết 2 lần với metanol khan ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 3-4 lít metanol, cách nhau 3 ngày. Tiến hành lọc trên phễu Buchne, mỗi lần tráng bã lá bằng 100ml metanol. Dịch lọc sau 2 lần chiết, được gom lại rồi tiến hành cô quay dưới áp suất thấp để còn lại 650ml dịch chiết metanol. Lấy 100 g bã lá sau khi lọc lần hai để ngâm tiếp với một lượng vừa đủ metanol, sau 3 ngày lấy dịch lọc kiểm tra trên sắc ký bản mỏng. Hiện màu các vệt bằng soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và phun với các thuốc thử vanillin/H2SO4 1%, Dragendoff – Munier, so sánh với chất chuẩn thấy không còn vệt chất chuẩn nên coi quá trình ngâm chiết đã hoàn thành. Pha loãng dịch metanol bằng nước cất theo một tỉ lệ thích hợp (metanol/ nước: 1/1) và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan và diclometan. Dịch n-hexan thu được là 1l và dịch diclometan là 1l. Dịch diclometan được làm khan bằng Na2SO4 và loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm để thu được phần chiết diclometan (D). 3.3 Phân tách ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ 3.3.1 Khảo sát phần chiết diclometan D bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sử dụng bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 v/v. Phát hiện vệt chất trên lớp mỏng bằng ánh sáng tử ngoại, phun thuốc thử vanilin/H2SO4 1% và thuốc thử Dragendorff-Munier. Bảng 1: Kết quả khảo sát TLC phần chiết diclometan (D) (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (2:1, v/v) STT Rf Đèn UV (l 254 nm) Thuốc thử vanilin/ axit sunfuric 1 0,86 phát quang hồng tím 2 0,69 xanh tím hồng 3 0,47 hồng tím 4 0,36 vàng xanh 5 0,32 - tím sẫm 6 0,27 nâu tím nhạt 7 0,24 nâu nhạt xanh Ghi chú: Vệt (-) là không có màu 3.3.2 Qui trình phân tách phần chiết diclometan D bằng phương pháp sắc ký cột 15 gam phần chiết D được tẩm với 10 gam silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,100mm) thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu sẫm. Phân tách hỗn hợp này bằng sắc ký cột (CC) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton thu được 8 phân đoạn từ D1 đến D8. Nhóm phân đoạn D2 sau đó được phân tách lại bằng sắc ký cột thường (CC) trên chất hấp phụ silica gel (Merck, 0,063–0,200 mm) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton, ta thu được 3 nhóm phân đoạn D2.1, D2.2, D2.3. Nhóm phân đoạn D2.2 có tinh thể hình kim màu trắng kết tinh, lấy phần tinh thể ra kết tinh lại trong axeton thu được một chất tinh khiết, ký hiệu là chất 1. Từ nhóm phân đoạn D2.3 thu được một hỗn hợp hai tinh thể đồng kết tinh không phân tách được bằng phương pháp sắc ký cột là 7 và 8. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất 1: Tinh thể màu trắng hình kim, đnc. 135 – 138oC; Rf = 0,46 (TLC, silica gel, hệ dung môi axeton-diclometan (10:1, v/v), vệt chất có màu tím hồng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3, δ, ppm): δ (ppm) 0,74 (1H, tdq, J = 13Hz, 40 Hz, 0,9 Hz, Hβ-1), 0,84 (3H, s, 3H-19), 1,14(3H, d, 3H-20), 1,23 (1H, brd, J = 8,5 Hz, Hβ-9), 1,28 (1H, dd, J = 1,26 Hz, 1,8 Hz, Hβ -5), 1,35 (1H, m, Hβ-3), 1,38 (1H, brd, J = 4,2 Hz, Hα-3), 1,45 (1H, q, J = 12,0 Hz, Hα-6), 1,47 (1H, m, Hβ-11), 1,50 (1H, m, Hβ-2), 1,63 (1H, s, OH), 1,65 (1H, m, Hα-2), 1,70 (1H, ddd, J = 12,0 Hz, 4,4 Hz, 1,6 Hz, Hβ-6), 1,70 (1H, m, Hβ-12), 1,79 (1H, ddd, J = 3,5 Hz, 3,5 Hz, 13 Hz, Hα-1), 1,96 (1H, tdd, J = 13,0 Hz, 6,2 Hz, 2,7 Hz, Hα-12), 2,07 (1H, brd, H-14), 2,10 (3H, s, OCOCH3), 3,10 (1H, m, H-13), 3,66 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-18A), 3,87 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-18B), 4,05 (1H, dd, J = 4,4 Hz, 12,0 Hz, Hβ-7), 5,29 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17A), 5,97 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17B). 13C-NMR (CDCl3, δ, ppm): δ (ppm) 17,5 (t, C-2), 17,5 (q, C-19), 18,0 (t, C-11), 18,2 (q, C-20), 21,1 (q, OCOCH3), 27,7 (t, C-6), 27,9 (t, C-14), 32,8 (t, C-12), 35,4 (t, C-3), 36,4 (s, C-4), 37,6 (d, C-13), 38,9 (t, C-1), 39,6 (s, C-10), 46,3 (d, C-5), 51,8 (d, C-9), 58,3 (s, C-8), 70,8 (d, C-7), 72,3 (t, C-18), 115,0 (t, C-17), 149,2 (s, C-16), 171,2 (s, OCOCH3), 209,7 (s, C-15). 3.4 Các phản ứng chuyển hóa các ent-kauran 3.4.1 Phản ứng epoxi hóa Cân 0,5 g chất đầu vào bình cầu phản ứng có dung tích 50 ml. Hòa tan hết chất đầu trong 16 ml CH2Cl2. Cho 0,4 g MCPBA vào bình, hòa tan hoàn toàn trong 16 ml CH2Cl2. Làm lạnh bình phản ứng đến -10oC. Làm lạnh dung dịch peaxit đến -5oC. Nhỏ giọt dung dịch peaxit vào bình phản ứng, khuấy đều trong thời gian 40’. Khuấy tiếp hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, rồi để yên trong 3 ngày. Cho hỗn hợp sau phản ứng lên phễu chiết, lắc hỗn hợp với dung dịch NaHCO3 bão hòa (3 lần, mỗi lần 30 ml), chiết giữ lại lớp dưới CH2Cl2. Cuối cùng rửa bằng nước 4 lần đến pH trung tính. Làm khan dung dịch nhận được bằng Na2SO4. Cất loại dung môi cho sản phẩm thô có màu trắng ngà. Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc kí cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton 8:1 thu 10 ml/ phân đoạn cho các sản phẩm epoxit tương ứng. Từ chất đầu là chất 1 thu được sản phẩm chính là A3 (159) (0,41 g). Hiệu suất phản ứng là 73%. Từ chất đầu là hỗn hợp 2 chất 7 và 8 thu được sản phẩm chính là F (hỗn hợp 160 và 161) (0,42 g). Hiệu suất phản ứng là 81,5%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất A3: Tinh thể màu trắng, đnc 176 – 178oC. Rf = 0,35 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 1:1 (v/v), vệt chất có màu tím hồng khi phun với thuốc thử vanilin/H2SO4 1%. Vệt có màu vàng sẫm khi phun thuốc thử Dragendorff-Munier. 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 0,86 (3H, s, Me-19), 0,92 (H, dt, J = 13,2 Hz, 3,6 Hz, H-1a), 1,12 (3H, s, Me-20), 1,36(2H, m, 2H-3), 1,40 (1H, m, H-5), 1,48 (1H, q, J = 12,5 Hz, H-6a), 1,58 (1H, m, H-2a), 1,59 (1H, brs, H-9), 1,63 (1H, m, H-2b), 1,65 (1H, m, H-12a), 1,80 (1H, dd, J = 12,5 Hz, H-6b), 1,87 (1H, m, H-1b), 1,92 (2H, m, 2H-11), 1,96 (1H, m, H-12b), 2,0 (1H, brs, H-13), 2,07 (3H, s, OCOCH3), 2,42 (1H, brs, H-13), 2,52 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-17a), 2,80 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-17b), 3,65 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-18a), 3,83 (1H, dt, J = 12,0 Hz, 4,0 Hz, H-7), 3,89 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-18b). 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm): 17,5 (t, C-2), 17,8 (t, C-11), 17,84 (q, C-19), 18,4 (q, C-20), 21,0 (q, -OCOCH3), 24,8 (t, C-14), 26,8 (t, C-6), 26,9 (t, C-12), 33,1 (d, C-13), 35,2 (t, C-3), 36,3 (s, C-4), 39,7 (t, C-1), 40,0 (s, C-10), 46,2 (d, C-5), 51,38 (d, C-9), 51,4 (t, C-17), 55,9 (s, C-8), 72,1 (t, C-18), 76,9 (d, C-7), 91,1 (s, C-16), 170,4 (s, C-15), 171,1 (s, - OCOCH3). Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất F: Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,59 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 2:1 (v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 160: 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 0,91 (3H, s, CH3-19), 0,95 (3H, s, CH3-18), 1,29 (3H, s, CH3-20), 1,98 (3H, s, 14-OAc), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 2,91 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-17a), 3,26 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-17b), 4,17 (1H, brs, H-7), 4,89 (1H, s, H-1), 6,16 (1H, s, H-14). 161: 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 0,88 (3H, s, CH3-19), 0,97 (3H, s, CH3-18), 1,18 (3H, s, CH3-20), 2,01 (3H, s, 1-OAc), 2,02 (3H, s, 7-OAc), 2,94 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17a), 3,18 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17b), 4,89 (1H, s, H-1), 5,04 (1H, s, H-14), 5,46 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 4,0 Hz, H-7). 3.4.2 Phản ứng mở vòng epoxit A3 bằng thủy phân kiềm Cân 100 mg chất A3 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng với dung dịch NaOH 2,5% trong MeOH (10 ml) trên nồi nước nóng trong 2h. Sau phản ứng thêm nước cất vào bình phản ứng. Chiết hỗn hợp phản ứng 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 6 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng nước cất đến môi trường trung tính. Làm khan dung dịch nhận được bằng Na2SO4, lọc và cất loại diclometan, thu được cặn thô. Cặn thô được tinh chế bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 -0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v) thu 8 ml/ phân đoạn cho tinh thể L (162) (60 mg). Hiệu suất phản ứng đạt 42,4%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất L (162): Tinh thể màu trắng hình kim. Rf = 0,65 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (1:2, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, δ, ppm): 0,73 (3H, brs, CH3-19), 1,0 (3H, brs, CH3-20), 2,54 (1H, brs, H-13), 3,0 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17a), 3,38 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17b), 3,76 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18a), 3,77 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 5,4 Hz, H-7), 3,95 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18b). 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD, δ, ppm): 17,4 (C-19), 17,5 (C-18), 17,6 (C-2), 17,9 (C-11), 26,3 (C-6), 27,3 (C-12), 28,4 (C-14), 34,9 (C-3), 36,9 (C-4), 38,2 (C-10), 39,6 (C-1), 34,8 (C-13), 44,8 (C-5), 54,9 (C-9), 62,4 (C-17), 70,0 (C-18), 73,9 (C-7), 82,7 (C-8), 87,9 (C-16), 180,3 (C-15). 3.4.3 Phản ứng thủy phân hỗn hợp epoxit F bằng phức BF3.Et2O Cho 20 mg epoxit F được hòa tan trong CHCl3 khan vào bình cầu phản ứng được khuấy từ trong điều kiện được làm lạnh bằng đá. Thêm 5 giọt BF3.Et2O vào bình phản ứng. Sau 5 phút, hỗn hợp phản ứng được rửa bằng dung dịch NaHCO3, được làm khô trên Na2SO4, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn thô. Cặn thô được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 -0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (10:1, v/v), thu 5 ml/ phân đoạn cho tinh thể F2 (163) (7 mg). Hiệu suất phản ứng là 27%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất F2 (163): Bột màu trắng vô định hình. Rf = 0,32 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 (v/v), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,91 (3H, s, CH3-19), 0,97 (3H, s, CH3-18), 1,17 (3H, s, CH3-20), 2,01 (3H, s, 1-OAc), 2,29 (1H, brs, H-13), 2,91 (1H, d, J=11,0 Hz, H-17a), 3,18 (1H, d, J=11,0 Hz, H-17b), 4,34 (1H, dd, J=12,5 Hz, 4,0 Hz, H-7), 4,88 (1H, brs, H-14), 5,04 (1H, J=1,5 Hz, H-1). 13C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 18,2 (C-11), 18,6 (C-20), 21,3 (C-19), 21,5 (1-OAc), 22,7 (C-2), 27,6 (C-6), 28,0 (C-12), 32,9 (C-4), 33,3 (C-20), 34,9 (C-3), 42,8 (C-10), 42,9 (C-13), 45,5 (C-9), 47,2 (C-5), 48,3 (C-17), 61,9 (C-8), 62,4 (C-16), 72,8 (C-1), 74,2 (C-7), 75,4 (C-14), 170,1 (1-OAc), 217,1 (C-15). 3.4.4 Phản ứng thủy phân Cân 200 mg chất đầu cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 5 ml metanol chứa 15% KOH vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu ở nhiệt độ khoảng 70 – 80oC trong 12 giờ. Sau khi phản ứng, thêm 30 ml nước cất vào hỗn hợp trên và cất loại metanol. Chiết dung dịch này 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 5 ml). Rửa bằng nước đến pH = 7, gộp các dịch chiết diclometan lại, làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm), hệ dung môi là gradient n-hexan-axeton thu 5 ml/ phân đoạn cho các sản phẩm thủy phân tương ứng. Từ chất đầu là chất 1 thu được sản phẩm chính là 164 (90 mg). Hiệu suất phản ứng là 75%. Từ chất đầu là hỗn hợp 2 chất 7 và 8 thu được sản phẩm chính là K2 (165) (83 mg). Hiệu suất phản ứng là 74%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất K2 (165): Tinh thể màu trắng hình kim. Rf = 0,53 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,89 (3H, s, CH3-19), 0,96 (3H, S, CH3-18), 1,09 (3H, s, CH3-20), 3,08 (1H, s, H-13), 3,69 (1H, brs, OH), 4,37 (1H, dt, J = 12,5 Hz, 4,0Hz, H-7), 4,91 (1H, s, H-1), 5,29 (1H, s, H-14), 5,41 (1H, s, H-17a), 6,18 (1H, s, H-17b), 13C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 18,6 (C-20), 21,4 (C-19), 33,2 (C-18), 117,7 (C-17), 146,0 (C-16), 206,5 (C-15), 76,1 (C-14), 44,2 (C-13), 32,3 (C-12), 16,6 (C-11), 43,0 (C-10), 48,1 (C-9), 61,6 (C-8), 72,9 (C-7), 27,3 (C-6), 47,6 (C-5), 32,9 (C-4), 35,0 (C-3), 22,7 (C-2), 72,7 (C-1). 3.4.5 Phản ứng axetyl hóa chất 1 Cân 50 mg chất 1 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 0,2 ml anhidrit axetic, sau đó cho 0,5 ml pyridin (làm khan kỹ bằng KOH rắn và chưng cất trước khi dùng) vào bình phản ứng. Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau phản ứng, thêm nước cất và dung dịch HCl 7M vào bình phản ứng. Chiết hỗn hợp phản ứng khoảng 7 lần bằng diclometan (mỗi lần 6 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng nước đến môi trường trung tính. Làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể 166 (47mg). Hiệu suất phản ứng là 89,5%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất 166: Tinh thể hình kim, màu trắng. Rf = 0,63 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat (2:1, v/v), vệt chất có màu tím hồng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,82 (3H, s, Me-19), 1,15 (3H, s, Me-20), 1,91 (3H, s, 7-OAc), 2,13 (3H, s, 18-OAc), 3,10 (1H, sbr, H-13), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18A), 3,85 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-18B), 5,10 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz, H-3), 5,29 (1H, s, H-17A), 5,96 (1H, s, H-17B). 13C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 17,6 (t, C-2), 17,7 (q, C-19), 17,9 (t, C-11), 18,2 (q, C-20), 21,0 và 21,0 (q, 7-OAc, 18-OAc), 24,4 (t. C-6), 29,2 (t, C-14), 32,6 (t, C-12), 35,7 (t, C-3), 36,4 (s, C-4), 35,7 (d, C-13), 39,0 (t, C-1), 39,7 (s, C-10), 45,9 (d, C-5), 51,9 (d, C-9), 56,2 (s, C-8), 72,0 (d, C-7), 73,1 (t, C-18), 115,2 (t, C-17), 148,8 (s, C-16), 169,5 (s, 7-OAc), 171,4 (s, 18-OAc), 207,4 (s, C-15). 3.4.6 Phản ứng oxi hoá chất 1 Cân 50 mg chất 1 cho vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 1 ml clorofoc vào trong bình để hoà tan chất. Sau đó cho vào bình dung dịch A (40mg K2Cr2O7 trong 2,5 ml nước cất) và nhỏ giọt từ từ 0,1 ml axit sunfuric đặc vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy và đun hồi lưu ở nhiệt độ 50 – 60oC trong 3 ngày. Sau phản ứng chiết dung dịch thu được 5 lần bằng clorofoc (mỗi lần 7 ml). Rửa bằng nước cất đến pH = 7, gộp các dịch chiết clorofoc lại, làm khan và cất loại clorofoc, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm), hệ dung môi là gradient n-hexan-axeton thu 5 ml/ phân đoạn cho tinh thể 167 (42 mg). Hiệu suất phản ứng đạt 82,5%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất 167: Bột màu trắng vô định hình. Rf = 0,69 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat (2:1, v/v), vệt chất có màu vàng da cam khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,85 (3H, s, Me-19), 0,94 (3H, s, Me-20), 2,11 (3H, s, 18-OAc), 2,40 (1H, dd, J = 18,5 Hz, 11,5 Hz, H-6A), 2,71 (1H, dd, J = 18,5 Hz, 8,0 Hz, H-6B), 3,02 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 4,5 Hz, H-13), 3,64 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18A), 3,82 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18B), 5,39 (1H, s, H-17A), 5,92 (1H, s, H-17B). 13C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 14,8 (q, C-20), 17,2 (q, C-19). 17.5 (t, C-2), 17,7 (t, C-11), 21,0 (q, 18-OAc), 27,7 (t, C-6), 30,2 (t, C-14), 35,1 (d, C-13), 35,8 (t, C-3), 36,8 (s, C-4), 38,2 (s, C-10), 38,4 (t, C-12), 39,2 (t, C-1), 44,0 (d, C-5), 54,9 (d, C-9), 63,8 (s, C-8), 72,2 (t, C-18), 116,9 (t, C-17), 151,2 (s, C-16), 171,5 (s, 18-OAc), 203,2 (s, C-7), 210,7 (s, C-15). 3.4.7 Phản ứng oxi hoá hỗn hợp 7 và 8 bằng tác nhân Jones Cân 20 mg chất đầu vào bình cầu phản ứng có dung tích 25 ml. Thêm 10 ml axeton (được làm lạnh đến -20oC) vào bình để hoà tan chất. Sau đó thêm từ từ vào bình dung dịch 1 ml tác nhân Jones (tác nhân Jones được điều chế từ 27g CrO3 và 23 ml H2SO4 đặc sau đó thêm 20 ml nước cất) sao cho nhiệt độ phản ứng không vượt quá -5oC. Sau 5 phút phản ứng kết thúc, thêm isopropanol để phá hủy lượng dư tác nhân. Sau phản ứng đổ hỗn hợp phản ứng vào nước, chiết dung dịch thu được khoảng 3 lần bằng diclometan (mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết diclometan lại, rửa bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH = 7. Làm khan và cất loại diclometan, thu được một cặn thô. Cặn thô này được phân tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063–0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-axeton (6:1, v/v) thu 5ml/ phân đoạn cho tinh thể hình kim màu trắng O1 (168) (16 mg). Hiệu suất phản ứng đạt 78,5%. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của chất O1: Tinh thể màu trắng hình kim. Rf = 0,41 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v)), vệt chất có màu vàng khi phun với thuốc thử vanilin/ H2SO4. 1H-NMR (CDCl3, δ, ppm): 0,90 (3H, s, CH3-19), 0,91 (3H, s, CH3-18), 1,41 (3H, s, CH3-20), 1,96 (3H, s, 14-OAc), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 3,12 (1H, brs, H-13), 4,97 (1H, s, H-1), 5,43 (1H, s, H-17a), 5,76 (1H, s, H-14), 6,19 (1H, s, H-17b). 13C-NMR (CDCl3, δ, ppm): 16,1 (C-11), 17,2 (C-20), 20,8 (1-OAc), 20,9 (14-OAc), 21,1 (C-19), 22,5 (C-2), 31,9 (C-12), 32,3 (C-18), 33,2 (C-4), 34,8 (C-3), 38,1 (C-6), 42,2 (C-10), 43,1 (C-13), 46,6 (C-5), 48,6 (C-9), 68,7 (C-8), 72,9 (C-1), 76,2 (C-14), 118,7 (C-17), 145,5 (C-16), 170,0 (1-OAc), 171,0 (1H-OAc), 201,5 (C-7), 205,1 (C-15). 3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các dẫn xuất. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và MCKane, L., & Kandel (1996). Các chủng vi sinh vật kiểm định: Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum. Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Chứng dương tính: + Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-) + Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men Thuốc tháng sinh được pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin: 50 mM; Tetracylin: 10 mM; Nystatin: 0,04 mM. Chứng âm tính: Vi sinh vật kiểm định không trộn lẫn kháng sinh và chất thử Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma. Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm. Tiến hành thí nghiệm: Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm. Đọc kết quả: Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU< 5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) của chất có hoạt tính: Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn. Mẫu thô có MIC ≤ 200µg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50µg/ml là có hoạt tính. Kết quả thử hoạt tính được nêu ở phần 2.4.KẾT LUẬN Thực hiện nội dung nghiên cứu phân lập và chuyển hoá ent-kauran diterpenoid từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) và khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận được, luận văn đã thu được các kết quả như sau: Đã phân lập được các ent-kauran diterpenoid 1 và hỗn hợp 7 + 8 làm các chất đầu cho chuyển hóa. Các chất đầu này được chuyển hóa ở vị trí của các nối đôi và các nhóm chức hidroxy và cacbonyl để tạo thành các dẫn xuất mới. Đã thực hiện thành công phản ứng epoxi hóa ở nối đôi của các ent-kauran diterpenoid và mở vòng epoxit tạo thành nhờ thủy phân hoặc botriflorua eterat; đã thực hiện các phản ứng thủy phân, axetyl hóa và oxi hóa các ent-kauran diterpenoid thành các dẫn xuất dihydroxy, diaxetyl và dixeton tương ứng. Cấu trúc của các sản phẩm chuyển hóa đã được xác định bằng các phương pháp phổ. Đã thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật với các sản phẩm nhận được. Sản phẩm oxi hóa ent-kauran diterpenoid cho kết quả ức chế tốt đối với một số vi khuẩn và nấm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. Phan Tống Sơn (1986), Hoá học các terpen và terpenoid, ĐHTH Hà Nội - ĐHTH Amsterdam, Amsterdam. Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh (1976, 1977), Thực hành hoá học hữu cơ (Organikum, dịch từ tiếng Đức), Tập 1, 2, Nhà xuât bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Taylor Water C. (1999), “Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hoá học, 37 (4), tr. 57 – 59. Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1976, 1980), Cơ sở Hoá học hữu cơ, tập 1, 2, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. Phan Tống Sơn, Lê Huyền Trâm, Phan Minh Giang (2002), “Đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)”, Tạp chí Hoá học, 40, tr. 53 – 57. Bế Thị Thuần, Trương Văn Như, Nguyễn Duy Khang (1991), “Góp phần nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá khổ sâm đối với một số vi khuẩn”, Tạp chí Dược học, 1, tr. 16 – 17. Bế Thị Thuần, Trương Văn Như (1991), “Nghiên cứu thành phần hoá học của cây khổ sâm và thăm dò tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 5, tr. 11 – 12. Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức (2007), Vi sinh vật thực phẩm, NXB Y học, Hà Nội. Trường Đại học Y Hà Nội – Bộ môn vi sinh vật (2003), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội. Viện dược liệu (1990), Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Tiếng Anh Batista R., Braga F. C., Oliveira A. B. (1999), “Synthesis and trypanocidal activity of ent-kaurane glycosides”, Bioorganic & Medicinal Chemistry. 17, pp 381-391. Block S., Stevigny C., Gillet M. C. D. P., Hoffmann E. D., Uabres G., Adjakidje V., Leclercq J. Q. (2002), “Ent-trachylabdan-3β-ol, a new cytotocic diterpene from Croton zambesicus”, Planta Med. 68, pp. 647 – 649. Bruno M., Rosselli S., Pibiri I., Kilgore N., Lee K. H. (2002), “Anti-HIV agents derived from the ent-kaurane diterpenoids lineanol”, J. Nat. Prod. 65, pp.1594 – 1597. Erazo S., Zaldivar M., Delporte C., Backhouse N., Tapia P., Belmonte E., Monache F. D., Negrete R. (2002), “Antibacterial diterpenoids from Fabiana densa var. ramulosa”, Planta Med. 68, pp. 361 – 363. Phan M. G., Jin H. E., Phan T. S., Lee J. H., Hong Y. S., Lee J. J. (2003), “ent-Kaurane Diterpenoids from Croton tonkinensis Inhibit LPS-Induced NF-κB Activation and NO Production”, J. Nat. Prod. 66, pp. 1217 – 1220. Phan M. G., Otsuka H., Phan T. S. (2005), “Three minor ent-kaur-16-ene-type diterpene from Croton tonkinensis Gagnep”, Viet nam J. Chem. 43 (2), pp. 263 – 264. Phan M. G., Phan T. S., Lee J. J., Otsuka H., Wat C. Taylor (2003), “Chemical constituents and therapeutic potential of the Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis GAGNEP. (Euphorbiaceae)”, Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and Other Natural Products (ASOMPS XI), October 2003, Kunming, China. Phan M. G., Phan T. S., Lee J. J., Otsuka H. (2004), “Four ent-kaurane – Type Diterpenoids from Croton tonkinensis GAGNEP”, Chem. Pharm. Bull. 52 (7), pp. 879 – 882. Phan M. G., Phan T. S., Hamada Y., Otsuka H. (2005), “Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis GAGNEP”, Chem. Pharm. Bull. 53 (3), pp. 296 – 300. Phan M. G., Phan T. S., Matsunami K., Otsuka H. (2006), “ Anti-staphylococcal activity of ent-kaurane-type diterpenoids from Croton tonkinensis”, J. Nat. Med. 60, pp. 93-95. Han L., Huang X., Sattler E., Dahse H. M., Lin W., Grabley S. (2004), “New Diterpenoids from the Marine Mangrove Bruguiera gymnorrhiza”, J. Nat. Prod. 67, pp. 1620 – 1623. Han Q. B., Zhao A. H., Zhang J. X., Lu Y., Zhang L. L., Zheng Q. T ., Sun H. D. (2003), “Cytotoxic Constituents of Isodon rubescens var. lushiensis”, J. Nat. Prod. 66, pp. 1391 – 1394. Hanson J. R. (1999), Nat. Prod. Rep. 16, pp. 209 – 219. Jiang B., Hou A. J., Li M. L., Li S. H., Han Q. B., Wang S. H., Lin Z. W., Sun H. D. (2002), “Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon sculponeata”, Planta Med. 68, pp. 921 – 925. Jiang B., Yang H., Li M. L., Hou A. J., Han Q. B., Wang S. J ., Sun H. D. (2002), “Diterpenoids from Isodon adenantha”, J. Nat. Prod. 65, pp. 1111 – 1116. Li S. H., Niu X. M., Peng L. Y., Zhang H. T., Yao P., Sun H. D. (2002), “ent-Kaurane Diterpenoids from the Leaves of Isodon xerophilus”, Planta Med. 68, pp. 946 - 948. Marquina S., Parra J. L., González M., Zamilpa A., Escalante J., María R., Laura Álvarez L. (2009), “Hydroxylation of the diterpenes ent-kaur-16-en-19-oic and ent-beyer-15-en-19-oic acids by the fungus Aspergillus niger” , Phytochemistry. 70, pp. 2017–2022. Minh P. T., Ngoc P. H., Walter C. T., Cuong N. M. (2004), “A new ent-kaurane diterpenoid from Croton tonkinensis leaves”, Fitoterapia. 75, pp. 552 – 556. Niu X. M., Li S. H., Li M. L., Zhao Q. S., Med S. X., Na Z., Wang S. J., Lin Z. W., Sun H. D. (2001), “Antiviral, Haemolytic and Molluscicidal Activities of Triterpenoid Saponins from Maesa lanceolata: Establishment of Structure-Activity Relationships”, Planta Med. 68, pp. 528 – 533. Perry N. B., Burgess E. J., Back S. H., Weavers R. T., Geis W., Mauger A. B. (1999), “11-Oxygenated cytotoxic 8,9-secokauranes from a New Zealand liverwort, Lepidolaena taylorii”, Phytochemistry. 50, pp. 423 – 433. Phan T. S., Phan M. G., Taylor W. C. (2000), “An ent-Kaurane Diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep”,  Aust. J. Chem. 53, pp. 1003 – 1005. Tang W., Hemm I., Bertram B. (2003), “Recent Development of Antitumor Agents from Chinese Herbal Medicines; Part I. Low Molecular Compounds”, Planta Med. 69, pp. 97 – 108. Vanden Berghe D. A., Vlietlinck A. J. (1991), Method in plant biochemsitry, ed. Hosttetman K., Academic Press, London. Wu Y. C., Hung Y. C., Chang F. R., Cosentino M., Wang H. K., Lee K. H. (1996), “Identification of ent-16β,17-Dihydroxykauran-19-oic Acid as an Anti-HIV Principle and Isolation of the New Diterpenoids Annosquamosins A and B from Annona squamosa”, J. Nat. Prod. 59, pp. 635 – 637. Wikens M., Alarcon C., Urzua A., Mendoza L. (2002), “Characterization of the Bactericidal Activity of the Natural Diterpene Kaurenoic Acid”, Planta Med. 68, pp. 452 – 454. Xiang W., Na Z., Li S. H., Li M. L., Li R. T., Tian Q. E., Sun H. D. (2003), “Cytotoxic Diterpenoids from Isodon enanderianus”, Planta Med. 69, pp. 1031 – 1035. Xu L., Wang F. P., (2005), “Exhaustive degradation of the ring D of 3,20-epoxy ent-kaurane-type diterpene maoecrystal A”, Tetrahedron. 61, pp. 4467-4474. Zamilpa A., Tortoriello J., Navarro V., Delgado G., Alvarez L. (2002), “Antispasmodic and Antimicrobial Diterpenic Acids from Viguiera hypargyrea Roots”, Planta Med. 68, pp. 281 – 283. Zhang H., Fan Z., Tan G. T., Chai H. B., Pezzuto J. M.., Sun H., Fong H. H. S. (2002), “Pseudoirroratin A, a New Cytotoxic ent-Kaurene Diterpene from Isodon pseudo-irrorata”, J. Nat. Prod. 65, pp. 215 – 217. Zhao Y., Niu X. M., Qian L. P., Liu Z. Y., Zhao Q. S, Sun H. D. (2007), “Synthesis and cytotoxicity of some new eriocalyxin B derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry. 42, pp. 494-502.