Đề tài Nghiên cứu nấm Fusarium spp. gây hại trên cây hồ tiêu ở Quảng Trị

ng năm qua tình hình bệnh hại xuất hiện hầu như khắp các vùng trồng tiêu trên thế giới gây thiệt hại đáng kể và trở thành yếu tố quan trọng hạn chế diện tích và sản lượng tiêu. Vì vậy diễn biến bệnh hại trên cây hồ tiêu đã được nghiên cứu tại các nước sản xuất tiêu trên thế giới như sau: Ở Ấn Độ, các báo cáo đầu tiên về bệnh hại rễ tiêu là do Barber công bố năm 1902, 1903, 1905. Butler (1906) đẫ tiến hành điều tra bệnh hại ở vùng Wynad (Tây Nam Ấn Độ). Ông dẫ phát hiện ra tuyến trùng hại rễ là do nấm Fusarium oxysporium. Later (1918) đã bác bỏ kết quả của Buler và cho rằng nguyên nhân gây bệnh là chưa rõ ràng. Venkara Rau (1929) đã phân lập được Phytophthora sp. từ các mẫu tiêu bị chết héo chủ yếu ở vùng mới khai hoang. Nhưng tiến sĩ Ramaskishen (1957) đã cho rằng không có loài phytophthora nào được phân lập từ cây tiêu bị bệnh trong nước. Ở Indonesia, tài liệu xuất bản về tình hình bệnh chết tiêu đã có từ năm 1885 ở phía Nam đảo sumatra. Đến năm 1899, Zimmerman tường trình về một loại bệnh ở rễ có thể làm chêt cả cây tiêu. Bệnh đã xuất hiện thành dịch ở Teluk Betong thuộc đảo sumatra. Đến năm 1901 Zimmerman cũng thấy dạng bệnh tương tự xuât hiên ở Đông Java. Ông tìm Được loài tuyến trùng Meloidogyne sp. Gây ra hiện tượng bệnh lý trên. Một số tác giả nghiên cứu bệnh tiêu ở Java sau đó cũng cho rằng tuyến trùng gây bướu ở rễ là nguyên nhân chính gây bệnh. Một số tác giả khác lưu ý rằng các điều kiên canh tác kém cũng có thể gây ra bệnh cho tiêu. Tình hình bệnh tương tự cũng thấy ở Lampong, phía Nam đảo Sumatra. Còn ở đảo Bangka, giáp bờ phía đông Sumatra ngay từ năm 1916, Rutger đã phát hiện thấy hiện tượng suy thoái dần trên cây tiêu, sau này được gọi là bênh vàng cây tiêu, do tuyến trùng Radôphlus similis gây ra. Bệnh này phát triển rất mạnh năm 1937. Năm 1936, Muller cho rằng hiện tượng chết rũ cây tiêu ở Java và sumatra nói trên có liên quan đến bệnh thối gốc tiêu mà ông đã tìm thấy nấm gây bệnh là Phytophthora palmivora var.piperis. Vào những năm 1962-1964, sản lượng tiêu hàng năm ở Indonesia đạt khoảng 50.000 tấn. Nhưng tình hình dịch bệnh phát triển rất mạnh mấy năm sau đó làm tiêu chết hàng loạt, sản lượng tiêu tụt xuống chỉ còn trên dưới 15.000 tấn. Chỉ sau khi có những nghiên cứu về giống, phân bón và phòng trừ sâu bệnh cho tiêu cùng với việc tổ chức một số hợp tác xã trồng tiêu và các biên pháp hỗ trợ tích cực của nhà nước, sản lượng tiêu ở đây mới dần dần được phục hồi và đạt mỗi năm khoảng 30.000 tấn trong những năm gần đây. Ở Malaysia, bệnh chết tiêu được phat hiện ở Sarawak từ những năm 1952-1953 Holiday và Mowat đã xác định nguyên nhân gây bệnh là do nấm Phytophthora palmivora. Hiên tượng bệnh cũng tương tự như đã phát hiện ở Sumatranawm 1952 mà Muller gọi là bênh thối gốc. Bệnh này phát triển mạnh trong những năm 1953-1956 gây thiệt hại khoảng 7.000 tấn tiêu, trị giá 1,7 triệu bảng Anh theo thời giá lúc đó. Blacklock (1954) cũng đã ghi nhận một số loại sâu bệnh khác phát hiện được ở Sarawak như các nấm gây thối gốc, rễ Fomes lignosus, Ganoderma lucidum; bệnh rỉ lá do tảo Cephaleuros parasiticus, tuyến trùng rễ heterodera sp.... Các nước khác, ngoài các vùng Tây Nam Ấn Độ, Sumatra và Banka còn có một số vùng trồng tiêu khác cũng nổi tiếng như ở Brazil và các nước bán đảo Đông Dương. Barat (1952) là người đầu tiên nghiên cứu về bệnh thối rễ hồ tiêu ở các vùng này. Ông cũng giống như Muller, các nghiên cứu của ông là nghiên cứu về tuyến trùng Meloidogyne sp. Barat cũng đã phân lập được nấm Phytophthora sp. từ cây tiêu bị bệnh nhưng ông không xem đây là nguyên nhân gây bệnh chính. Ở Sarawak có rất ít báo cáo về bệnh thối rễ trước khi có các điều tra được tiến hành ở Newman (1941), mẫu rễ bệnh được gởi đến Malaysia để phân lập và phân lập được nấm Phytophthora sp. Điều này cho thấy nguyên nhân gây bệnh là do nấm nhưng các nghiên cứu sâu hơn vẫn chưa được tiến hành. Từ các kết quả nghiên cứu ở các vùng trồng tiêu khác nhau của các tác giả, duy nhất chỉ có Muller là người chứng minh được tác nhân gây bệnh hang loạt là do nấm Phytophthora palmivora var. piperis; tuyến trùng Meloidogyne Jamaica được xem là tác nhân tạo ra vết thương tạo điều kiện cho nấm xâm nhập. Các nghiên cứu gần đây của Tsao (1991) đã kết luận nguyên nhân gây bệnh thối chết gốc tiêu là do nấm Phytophthora palmivora MF4 và được xác định lại bằng công nghệ sinh học hiện đại nấm này là Phytophthora capsici. Ewin và Ribiro (1996) cho rằng nấm Phytophthora capsici rất khó phân lập từ cây bệnh. Tuy nhiên, với môi trường chọn lọc chúng ta có thể phân lập được nấm này từ cây bị bệnh. 2.1.2. Tình hình nghiên cứu hồ tiêu ở Việt Nam Vấn đề làm giảm năng suất, diện tích và chất lượng hồ tiêu đối với nước ta hiện nay là sâu bệnh, đặc biệt là bệnh hại tiêu. Theo CABI có khoảng 44 loài dịch hại cây hồ tiêu, riêng Việt Nam theo nghiên cứu của Diệp Hồ Tùng và CTV (1999) có 22 loài sâu bệnh hại tiêu ở Phú Quốc. Theo nghiên cứu của Võ Mai và Nguyễn Hữu Huân (1987) ở huyện Đức Linh - Thuận Hải có 10 giống tuyến trùng hại rễ hồ tiêu, trong đó có tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hiện tượng sần rễ hồ tiêu là phổ biến nhất; có 12 loại bệnh trên thân, lá và gốc tiêu như thán thư (Gloosporium sp.), rụng đốt (Điploia sp.), thối gốc (Fusarium sp., Sclorofium sp…) Hồ Ngọc Thành đã tiến hành nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh hồ tiêu ở Xuân Lộc- Đồng Nai là do nấm Phytophthora sp. Gây ra. Ông đã phân lập nấm này từ cây tiêu bị bệnh và lây bệnh nhân tạo cho tiêu trong vườn ươm và tiêu sản xuất thì cả hai trường hợp đều bị chết nhanh sau 7-9 ngày. Theo Nguyễn Ngọc Châu (1995) thì thành phần bệnh hại hồ tiêu ở Tân Lâm- Quảng Trị có tới 65 loài, trong đó tuyến trùng 49 loài, nấm bệnh 7 loài. Trong số 49 loài tuyến trùng ký sinh có 4 loài ký sinh gây hại nặng trên cây hồ tiêu là Meloidogyne incognita gây sần rễ có khả năng gây thành dịch trên diện rộng, loài Radôphlus reniformis gây đen nụ, loài Xyphenema amenicanum mang virus gây vàng lá tiêu, loài Pratrichodorus nanus mang virus gây bệnh xắn lá tiêu. Trong 7 loài nấm bệnh có các loại gây bệnh chủ yếu là thán thư (Collectotrium goeosprioides), đen lá (Lasiodiplodia theobromae), thối rễ (Fusarium solani) Theo Nguyễn Vĩnh Trường và cộng tác viên (2001) khi phân tích mẫu đất bị bệnh chết héo hồ tiêu ở Tân Lâm- Quảng trị và Long Khánh- Đồng Nai xác định nấm gây chết héo là Phytophthora capsicil. Một số nghiên cứu về tuyến trùng hại rễ hồ tiêu của Vũ Thị Nga ở Bình Long cũng cho thấy các giống Meloidogyne encognita, Criconemoides sp., helicotylenchus sp., Tylencherhynchus sp. đều có tỷ lệ xuất hiện 100% trong các mẫu đất phân lập. Nhìn chung tình hình bệnh hại hồ tiêu ở Việt Nam cũng có diễn bến tương tự trong khu vực và thế giới, đôi lúc còn phức tạp hơn. Đó là những khó khăn, thách thức đòi hỏi chúng ta phải có những nghiên cứu chắc chắn và xây dựng được một chiến lược về phòng trừ bệnh hại hồ tiêu có hiệu quả. 2.2. Giới thiệu chung về bệnh chết chậm Việt Nam là một đất nước có 2 vùng khí hậu khác biệt. Vùng khí hậu Á nhiệt đới từ phía Bắc của đèo Hải Vân với 4 mùa rõ rệt và vùng khí hậu nhiệt đới ở phía Nam đèo hải Vân với 2 mùa là: mùa khô và mùa mưa. Sự có mặt của những dãy núi ở miền Trung và miền Bắc Việt Nam làm gia tăng sự khác nhau giữa các vùng khí hậu, điều đó cho phép trồng nhiều loại cây khác nhau. Những vùng khác nhau của Việt Nam cũng đem lại khí hậu lý tưởng cho những loài Fusarium phát triển mạnh và những dòng Fusarium gây thiệt hại kinh tế lớn cho hàng loạt các cây trồng khác nhau trên cả nước, bao gồm cây ăn quả, cây rau, cây công nghiệp và cây nông nghiệp khác. Hồ tiêu là cây thân thảo, bộ rễ rất mềm yếu và phản ứng nhạy bén với điều kiện môi trường và chế độ chăm sóc, bón phân nên dễ bị các loại bệnh hại như: bệnh tuyến trùng, bệnh chết nhanh, bệnh chết chậm, bệnh thán thư, bệnh khô vằn, bệnh virus (bệnh tiêu điên, bệnh xoắn lùn), bệnh thiếu dinh dưỡng… Bệnh chết chậm do nấm Fusarium.spp nhưng trong nhiều trường hợp là sự kết hợp với các nấm khác như Lasiodiplodia, Pythium, Rhizoctonia cũng làm thối gốc gây hiện tượng chết chậm cây tiêu. Trong đó bệnh chết chậm do nấm Fusarium gây ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng và phát triển. 2.2.1 Triệu chứng Hình 2.1: Cây tiêu bị bệnh chết chậm Bệnh chết chậm thường có triệu chứng vàng lá từ từ, thời gian từ khi có biểu hiện bị bệnh đến khi chết có thể kéo dài cả năm. Bệnh làm chết cả khóm hoặc chỉ chết 1-2 dây.[8] Cây bị bệnh kém phát triển, năng suất thấp, bộ rễ cây thường bị hủy hoại. Quan sát thấy trên rễ có nhiều mụn u sưng, vết thâm đen trên rễ do tập đoàn tuyến trùng gây ra. Gốc thân, cổ rễ bị thâm đen, thối khô. Các bó mạch trong thân bị chuyển màu thâm đen.[Báo cáo dịch hại chính trên hồ tiêu và biện pháp phòng trừ. Viện Bảo vệ thực vật. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam] Do bộ rễ bị tổn hại, quá trình thoát nước, vận chuyển muối khoáng bị gián đoạn nên cây mới bị bệnh có biểu hiện sinh trưởng kém, lá bị vàng và rụng dần dần, cây còn nhỏ có thể bị chết khô hoàn toàn. Trường hợp cây tiêu bị bệnh nhẹ thì dây tiêu không chết nhưng sinh trưởng không bình thường và cằn cỗi. 2.2.2. Nguyên nhân gây bệnh. Có nhiều tác nhân tham gia gây bệnh chết chậm như tuyến trùng vùng rễ, rệp sáp, mối, nấm Fusarium spp, Phytophthora, Pythium….Một số nghiên cứu cho rằng, tuyến trùng ký sinh gây thương tổn cho bộ rễ, sau đó nấm Fusarium và các loại nấm khác ký sinh theo là nguyên nhân gây hiện tượng chết chậm. Ở những vùng có mật độ rệp sáp hại rễ cao và mối gây hại sẽ làm cho triệu chứng của bệnh thêm rõ ràng và phát triển nhanh hơn.[Báo cáo dịch hại chính trên hồ tiêu và biện pháp phòng trừ. Viện Bảo vệ thực vật. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam]. 2.2.3. Biện pháp phòng trừ Các bệnh héo Fusarium nói chung và chết chậm hồ tiêu nói riêng rất khó phòng trừ do bào tử hậu tồn tại qua thời gian dài trong đất, do đó phải: Luân canh các cây trồng có khả năng kháng bệnh ít nhất 2 năm trước khi trồng lại các cây trồng mẫn cảm có thể giúp làm giảm nguồn bệnh. Bón nhiều phân hữu cơ và bón đủ phân NPK và bón thêm vôi cho các gốc tiêu. Đồng thời không để gốc tiêu đọng nước trong mùa mưa. Tiêu hủy các cây bị bệnh và rắc vôi vào gốc diệt mầm bệnh.Tuy nhiên, loại nấm này vẫn có thể tồn tại bằng cách xâm nhiễm vào vỏ rễ các cây trồng không phải là kí chủ và không biểu hiện triệu chứng. Việc này nêu ra sự cần thiết nghiên cứu đặc tính sinh học của loại nấm này ở từng quốc gia, từng vùng, từng địa phương nhằm xác định vai trò của những cây trồng không phải là kí chủ và thời gian tồn tại của bào tử hậu trong đất.Có những giống cây trồng có khả năng kháng bệnh héo Fusarium. Tuy nhiên một giống kháng bệnh không có nghĩa là có khả năng kháng với tất cả các chủng của một dạng loài nào đó.Một số bệnh héo Fusarium đã được phòng trừ thành công bằng phương pháp sử dụng gốc ghép có khả năng kháng bệnh. Ví dụ, phương pháp này đã được áp dụng để phòng trừ bệnh héo Fusarium trên dưa hấu. Hiện nay chưa có thuốc trừ nấm hữu hiệu để phòng trừ. 2.3. Giới thiệu chung về nấm Fusarium spp. Nấm Fusarium spp. Thuộc: Ngành Ascomycota Lớp Deuteromycetes Họ Tuberaulariaceae Bộ Moniliales Chi Fusarium Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như héo do tắc bó mạch, thối rễ, thân và bắp, thối cổ rễ cây con và thối củ. Một số loài gây bệnh cũng sản sinh độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ cốc. Nhiều loài Fusarium khác là hoại sinh phổ biến trong đất. Các loài hoại sinh thường có mặt trên rễ và thân cây bệnh. Những loài hoại sinh này mọc nhanh trên môi trường và được phân lập dễ dàng từ rễ và thân bị bệnh, khiến cho việc phân lập các tác nhân gây bệnh chính trở nên khó khăn. Vì vậy việc lây bệnh nhân tạo các mẫu Fusarium phân lập từ rễ bệnh là rất cần thiết. Đây là phần quan trọng trong quá trình chẩn đoán, và là một trong những lí do tại sao chẩn đoán một bệnh rễ lại khó khăn. Ví dụ, Fusarium oxysporum bao gồm nhiều dạng loài gây các bệnh héo do tắc bó mạch và một số bệnh thối rễ. Tuy nhiên, F. oxysprorum cũng bao gồm nhiều dạng hoại sinh có mặt phổ biến trên rễ cây bệnh sau khi tác nhân gây bệnh đã làm thối mô rễ. Một số loài hoại sinh này cũng có thể sống nội sinh trong các tế bào lớp ngoài của rễ mà không làm tổn thương rễ. Theo các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học, các bệnh héo Fuasarium là vấn đề quan trọng ở Việt Nam. Những bệnh héo này do các dạng loài của F.oxysporum gây ra. Một vài dạng F.oxysporum cũng có thể gây thối dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc dụng cụ gặt hái làm tổn thương. Thối bắp ngô, chủ yếu do F.graminearum và F. verticilliodes gây ra, ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố nấm tồn tại trong hạt. Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu như đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trưởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực gố than cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường làm stress và do các bệnh khác. Fusraium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc Việt Nam ( L. Burgess, thong tin chưa xuất bản) và từ cà phê ơ tỉnh Đắc Lắc (TS. Trần Kim Loang). Nghiên cứu sinh địa lý học chỉ ra rằng, các loài Fusarium khác nhau sẽ phân bố ở các vùng địa lý khác nhau. Sự thay đổi trong cấu trúc và đa dạng của nấm có thể do kết hợp với các vùng khí hậu đặc biệt trên thế giới [19]. Phổ kí chủ: Mỗi dạng loài thường chỉ gây héo do tắc bó mạch trên một loài kí chủ nhất định. Chẳng hạn như F. oxysporum f. sp. Niveum chỉ gây héo trên dưa hấu. Thời tiết : Các bệnh héo Fusarium thường nghiêm trọng hơn trong điều kiện thời tiết ấm và ẩm ướt. Bảo tồn : Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium tồn tại dưới dạng bào tử hậu trong đất qua thời gian dài. Bào tử hậu có hình tròn, là các bào tử một tế bào với vách tế bào dày và có sức chống chịu cao, được hình thành trong mô bệnh. Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium cũng có thể có mặt ở vỏ rễ một số cây không phải là kí chủ, kể cả cỏ dại và cây trồng. Bào tử hậu hình thành trong vỏ rễ khi cây chết. Như vậy những cây trồng không phải là kí chủ phải được kiểm tra trước khi được khuyến cáo là cây trồng luân canh để phòng trừ héo Fusarium. Xâm nhiễm: Sợi nấm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễm vào rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem. Nấm bệnh sau đó sẽ phát triển trong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá trình này gây phản ứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu. Những hợp chất này gây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dấu hiệu dễ nhận thấy của bệnh héo khi cắt ngang thân. Hiện tượng tắc mạch xylem làm giảm lượng nước di chuyển lên cây, khiến cho cây bệnh bị héo rồi chết. Bệnh héo Fusarium thường liên hệ với tuyến trùng nốt sưng. Nấm Fusarium xâm nhiễm vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây ra. 2.3.1. Đặc điểm của nấm Fusarium spp. Fusarium.spp là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ. Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium.spp cũng sản xuất một số chất độc tiết vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium.spp tấn công Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗ thủng đơn giản ở giữa. Trong một tế bào có một nhân hoặc nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan. Nấm sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật, gặp phổ biến trong đất, cũng gặp trên các vật liệu cellulose.[Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương. 1982. Vi nấm. NXB Khoa học và kỹ thuật. Hà Nội] Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là 25 – 30 0C. Hình thái và màu sắc tản mấm trên môi trường nuôi cấy. Nấm Fusarium phát triển nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ 250C và hình thành tản nấm có hình thể tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lan rộng trên môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nấm có thể có màu trắng, kem, vàng, vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím. Mặt dưới nó có thể không màu, vàng cam, màu đỏ, màu tía sẫm, hay màu nâu. [18]. Nghiên cứu về phân loại Fusarium bắt đầu từ năm 1809 nhưng việc xác định số loài Fusarium luôn thay đổi trên một phạm vi rộng lớn: từ 9 loài theo Snyder và Hansen (1945) đến 44 loài và 7 giống theo Booth (1971) [8], 65 loài và 55 giống theo Wollenweber và Reinking (1935) [20], hơn 70 loài và hơn 55 giống theo Gerlach và Nirenberg (1982) [13]. Cho đến bây giờ, hệ thống phân loại Fusarium vẫn còn mơ hồ và không chắc chắn nên không cho phép giải thích sự phát sinh loài một cách phù hợp [15]. 2.3.2. Hình thức sinh sản. Fusarium có 2 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính. Do thiếu giai đoạn sinh sản hữu tính trong vòng đời nên người ta gọi chung là nấm không hoàn chỉnh hay nấm bất toàn.[6]. 2.3.2.1. Sinh sản sinh dưỡng Sợi nấm : Từ 1 sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và phân nhánh thành hệ sợi nấm. Bào tử hậu (bào tử màng dày, bào tử áo : Bào tử hậu là những tế bào hơi tròn, có tế bào chất được cô đặc lại [17], có màng dày bao bọc [5], thỉnh thoảng có bào tử hậu với vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố [18]. Ở bào tử này, chất dinh dưỡng được chuyển từ tế bào kề bên sang tế bào ưu tiên làm tế bào này phồng lên, chứa nhiều chất dự trữ và có thể chịu đựng những điều kiện bất lợi trong một thời gian khá dài. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng sẽ nảy mầm và phát triển thành sợi nấm mới. Bào tử hậu có thể nằm ở giữa sợi nấm hoặc ở đầu tận cùng của nó [5], [17]; có thể ở dạng đơn lẻ, dạng cặp đôi, dạng chuỗi hay dạng cụm. Ở các loài như F. solani và F. oxysporum, bào tử hậu thường ở dạng đơn, đôi, thỉnh thoảng dạng ba và ít khi có dạng cụm. Tuy nhiên, có một số loài (đặc biệt là F. proliferatum) có sợi nấm khí sinh với chuỗi những tế bào phình to, rất dễ bị nhầm là bào tử hậu [18]. Bào tử hậu có thể quan sát dưới kính hiển vi sau 10-14 ngày. Nhưng nhiều loài Fusarium có thời gian hình thành bào tử hậu chậm hơn (20- 42 ngày) và có khi không tạo ra chúng [12], [18]. Một số loài Fusarium có tạo bào tử hậu như F. chlamydosporum, F. napiforme, F. oxysporum, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichoides, F. equiseti, F. tricinctum.[12], [18]. 2.3.2.2. Sinh sản vô tính Bào tử đính thường được hình thành ở các loài nấm bất toàn. Đa số bào tử đính thường sắp xếp thành chuỗi, có khi thành từng khối. Một số bào tử đính nằm đơn độc từng cái một trên cuống bào tử đính. Cuống bào tử đính có thể đơn bào hoặc đa bào, không phân nhánh hoặc phân nhiều nhánh, mọc riêng lẻ hay sắp xếp từng cụm [1]. Ở các loài Fusarium thì bào tử đính thường là bào tử ngoại sinh, có 2 loại: bào tử đính lớn và bào tử đính nhỏ. Bào tử đính lớn ( bào tử lớn) : Bào tử trong suốt, được hình thành từ thể bình trên cành bào tử có nhánh hay không có nhánh [9]. Bào tử lớn có kích thước 3 - 8 x 11 - 70 µm. Kích thước bào tử thường dùng để phân biệt giữa các loài Fusarium quá dài (F. avenaceum, F. coccophilum, F. decemcellulare..) và quá ngắn (F. xylarioides, F. larvarum, F. poae..). Hầu hết các loài Fusarium có bào tử lớn từ 3 - 7 vách ngăn, tuy nhiên có nhiều loài có từ 1 - 3 vách ngăn (F. dimerum, F. dlamini, F. poae..) hoặc nhiều hơn 7 vách ngăn (F. decemcellulare, F. coccophilum..). Bào tử lớn có hình lưỡi liềm hay hình trụ. Các loài Fusarium khác nhau có thể phân biệt được tùy theo mức độ cong của bào tử lớn (thẳng ở bên phải và cong rõ ràng ở bên trái); tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng của bào tử (thon nhọn ở đầu và to ở giữa). Phần to nhất của bào tử lớn cũng có thể là một đặc điểm để nhận dạng các loài Fusarium. Ví dụ như F. culmorum và F. sambucinum có phần đầu bào tử to nhất, giống hình cái nêm còn F. acuminatum có phần cuối bào tử to nhất [18]. Phần đầu và phần cuối bào tử lớn có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau. Phần đầu bào tử có thể có dạng: cái móc, hình núm vú, hình đầu tù, hình nón. Phần cuối bào tử có thể có dạng: hình đầu tù, hình núm vú, hình bàn chân, hình bàn chân được kéo dài, hình thon dài với vết khía hình chữ V [12], [18]. Bào tử đính nhỏ ( bào tử nhỏ) : Kích thước 2-4 x 4-8 µm, được hình thành từ cành bào tử phân sinh phân nhánh hoặc không phân nhánh, mọc trực tiếp từ sợi nấm hoặc tụ lại thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi [4]. Bào tử có 0-1 vách ngăn (đặc biệt có loài có 2-3 vách ngăn). Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như: hình cầu, hình gần cầu, oval, hình cầu với một đầu nhọn, hình thoi, hình quả thận, hình hạt chanh, hình liềm, hình trứng, hình trứng ngược, hình chùy [12]. Các loài Fusarium khác nhau thì có hình dạng bào tử nhỏ khác nhau. Tuy nhiên, có những loài Fusarium mà bào tử nhỏ của chúng có nhiều hơn một hình dạng. Sự có mặt bào tử nhỏ hình cầu là đặc điểm để nhận dạng F. poae cũng như để phân biệt F. sporotrichioides và F. chlamydosporum. Còn bào tử nhỏ hình hạt chanh được tạo ra với số lượng lớn thì chỉ có thể là bào tử của F. tricinctum [18]. 2.3.3. Chu kỳ sống của Fusarium Nấm Fusarium có 2 giai đoạn tồn tại trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích cực và giai đoạn tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ). Ở điều kiện thích hợp, môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm sẽ sinh trưởng tích cực. Ngược lại, khi gặp điều kiện bất lợi, lượng dinh dưỡng trong đất còn rất ít thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc này, các loài Fusarium sẽ hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào tử hậu. Cũng trong giai đoạn này, cường độ hô hấp và nguồn dinh dưỡng dự trữ được tích lũy trong hệ sợi nấm sẽ được các loài Fusarium sử dụng ở mức thấp nhất, nhằm đảm bảo sự tồn tại của chúng trong thời gian dài. Một số loài Fusarium không sản sinh bào tử hậu thì chúng sẽ tiếp tục tồn tại bằng cách làm chậm lại các hoạt động hoại sinh hay ký sinh trong cơ thể vât chủ. Vì thế, sau khi thu hoạch vụ mùa với các cây bị bệnh do Fusarium thì khả năng trong đất còn sót lại Fusarium là rất cao. 2.3.4. Cơ sở lý luận và thực tiễn 2.3.4.1. Cơ sở lý luận. Trong sản xuất nông nghiệp, con người luôn tìm cách để nâng cao năng suất cây trồng tạo ra nhiều sản phẩm đa dạng đáp ứng ngày càng nhiều, càng tố hơn nhu cầu của con người. Khi con người tiến hành các hoạt động sản xuất nông nghiệp đã tác động vào tự nhiên, rõ hơn là tác động vào hệ sinh thái nông nghiệp bằng nhiều biện pháp như: canh tác, hoá học, sinh học,… nhằm tạo ra nhiều sản phẩm thu lợi theo ý muốn chủ quan của mình. Làm cho sâu bệnh gây hại cây trồng cũng tăng lên không kém, phát sinh nhiều loại sâu bệnh mới nguy hiểm hơn, nhiều loại đã xuất hiện hiện tượng kháng thuốc, quen thuốc bảo vệ thực vật. Nếu không có một phương thức canh tác hợp lý, khoa học thì chính hoạt động sản xuất đó rất dễ dàng làm phá vỡ cân bằng vốn rất mỏng manh của hệ sinh thái nông nghiệp. Sự phát sinh thành dịch của một số dịch hại tàn phá mùa màng, cây trồng chính là biểu hiện của sự mất cân bằng trong hệ sinh thái nông nghiệp, là hậu quả của một quá trình sản xuất “thiếu nhìn xa trông rộng của con người”. Hướng phát triển của một nền nông nghiệp hàng hoá bền vững là không làm phá vở mối cân bằng đó mà lợi dụng nó để tác động theo hướng có lợi cho con người. Khả năng gây bệnh của ký sinh vật lên cây trồng là do các đặc tính như: tính xâm lược, tính gây bệnh và tính độc quyết định. Bình thường mổi loại ký sinh vật có một phổ ký chủ, một môi trường sống nhất định nhưng chúng cũng có khả năng tiến hoá để thích ứng khi môi trường thay đổi, thức ăn thay đổi.Do đó khả năng gây bệnh của chúng cũng sẻ thay đổi theo, phổ ký chủ có thể mở rộng hay thu hẹp. Sự xuất hiện những bệnh hại mới trên cây trồng cũng là vì thế. Hiện nay, trái đất đang chịu sự thay đổi bất thường của khí hậu, kéo theo sự thay đổi của hệ sinh thái, đồng thời nhu cầu của con người với nông nghiệp là rất lớn và thực tế sản xuất luôn đi trước khoa học. Chính vì vậy công tác điều tra, kiểm soát và quản lý dịch hại trên cây trồng phải được tiến hành một cách thường xuyên, liên tục. Mặt khác, cây tiêu là loại cây lâu năm, sâu bệnh hại tiêu mà đặc biệt là bênh hại diễn biến rất phức tạp, nguy cơ phát sinh bênh mới và bùng phát dịch bệnh là rất cao. Vì vậy công tác điều tra, thu thập số liệu, thông tin về bệnh hại tiêu là cần thiết để làm cơ sở cho những cải thiện về kỷ thuật sản xuất, đề ra biện pháp phòng trừ và có hướng quản lý thích hợp hơn để từ đó nâng cao năng suất, tăng thu nhập cho người trồng tiêu. Ở Quảng trị cần phải thực hiện nghiên cứu này bởi nơi đây tiềm năng cho cây tiêu phát triển là rất lớn, cho chất lượng hạt tiêu cao.Đồng thời tại đây đang gặp phải một số trở ngại về kinh tế, điều kiện tự nhiên, đặc biệt là phương thức sản xuất hồ tiêu của nông dân ở đây còn lạc hậu,chưa lien kết lại với nhau, phần lớn sản xuất theo kiểu truyền thống, kinh nghiệm, điều đó đã không đáp ứng được nhu cầu sản xuất hàng hoá và làm cho bênh hại tiêu có diễn biến phức tạp hơn. 2.3.4.2. Cơ sở thực tiễn. Từ xa xưa, hạt tiêu đã được xem là một sản phẩm quý dung làm lễ vật triều cống, bồi thường chiến tranh trong thời La Mã cổ đại. Thời nay hạt tiêu lại càng khẳng định hơn nữa giá trị của nó. Là một loại gia vị quan trọng trong công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến đồ hộp, dược sử dụng trong y dược, trong công nghệ hương liệu, ngoài ra còn được dùng để phòng trừ côn trùng gây hại,… Trong phong tục ẩm thực của người phương Đông hạt tiêu là gia vị không thể thiếu được trong việc bêp núc, làm tăng thêm hương vị thơm ngon của món ăn, là bí quyết thành công của những người nội trợ. Trong y dược, do hạt tiêu có chứa chất Piperin, tinh dầu và nhựa nên kích thích được tiêu hoá, chữa đau bụng, ói mữa khi ăn nhầm món lạ,… Trong công nghiệp, chất Piperin là nguyên liệu để sản xuất Piperonal cùng với tinh dầu và sản xuất được chiết xuất từ nhựa hạt tiêu được sử dụng trong kỹ nghệ sản xuất nước hoa, dầu xoa bóp,… Trong phòng trừ côn trùng, người ta lấy dịch chiết từ hạt tiêu để tổng hợp các chế phẩm có khả năng ngăn côn trùng phá hại đồ gia dụng. Việc phát triển nhanh chóng cây hồ tiêu cần phải tiến hành song song với công tác bảo vệ. Điều quan trọng là phải tiến hành điều tra tình hình sâu bệnh hại ở mổi địa phương, xác định các đối tượng gây hại chính và có biện pháp phòng trừ hiệu quả nhằm góp phần nâng cao năng suất sản lượng hồ tiêu. Tuy nhiên trong những năm qua công tác phòng trừ bệnh hại tiêu nói chung và bệnh chết chậm hồ tiêu nói riêng chưa được chú trọng. Kiến thức về bệnh này của đội ngủ cán bộ kỹ thuật cũng như nông dân còn nhiều mặt hạn chế nhất là việc phát hiện sớm và đưa ra phương pháp phòng trừ kịp thời, có hiệu quả, đây là một vấn đề khó khăn cho sản xuất hiên nay. Bệnh chết chậm hồ tiêu là một loại dịch hại khó phòng trừ, vì vậy cho đến nay chưa có biện pháp nào có thể phòng trừ bệnh một cách có hiệu quả để và triệt để có thể sử dụng rộng rãi trong sản xuất. Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu. Nấm Fusarium. spp gây bệnh chết chậm trêm cây tiêu. 3.2.Phạm vi nghiên cứu. Địa điểm: Huyện Cam Lộ - Tỉnh Quảng Trị. Thời gian: Từ tháng 1/2009 – 5/2010 3.3. Nội dung nghiên cứu. Phân lập nấm Fusarium. spp từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh Phân loại các chủng nấm Fusarium spp. dựa vào hình thái và màu sắc tản nấm. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Fusarium spp. Kiểm tra tính gây bệnh của các chủng nấm đại diện trong điều kiện in vivo. 3.4. Phương pháp nghiên cứu.  3.4.1. Phân lập nấm Fusarium spp. từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh. 3.4.1.1.Phương pháp lấy mẫu bệnh. Tiến hành thu thập mẫu rễ ở các vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm tại các vùng trồng tiêu ở các xã Cam Chính , Cam nghĩa huyện Cam Lộ - Quảng Trị . Cách lấy mẫu Đào vùng đất ở gần gốc tiêu cách gốc khoảng 20 – 30cm, chọn những rễ tơ có triệu chứng bị, bệnh biểu hiện là các chấm đen và vết thối trên rễ và đầu mút của rễ, ghi ngày lấy, địa điểm, ký hiệu mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC. 3.4.1.2. Phương pháp phân lập mẫu rễ bị nhiễm bệnh Sau khi thu mẫu về, tiến hành phân lập mẫu rễ trong phòng thí nghiệm. Trong quá trình phân lập không khử trùng bề mặt các rễ con quá mức bởi vì chất khử trùng có thể tiêu diệt tất cả các nấm ký sinh trong rễ con, bao gồm cả nấm gây bệnh. Các bước phân lập: 1. Lau chùi bàn làm việc bằng cồn 70%. 2. Chọn những rễ con có cả phần khỏe (không triệu chứng) và phần bị bệnh, rửa chúng dưới vòi nước đang chảy để loại sạch đất và bụi bấn. 3. Nhúng dụng cụ (kẹp và dao mổ) trong cồn l 96% và hơ khô trên ngọn lửa. 4. Nhúng qua các rễ con trong cồn 70%, rửa nhanh trong nước vô trùng 3 lần và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. 5. Dùng dụng cụ đa khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1-2 mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trường chọn lọc PPA có chứa kháng sinh để hạn chế vi khuẩn phát triển. 6. Ấn nhẹ các miếng cấy lên mặt thạch sao cho chúng tiếp xúc tốt với môi trường phân lập. 7. Đặt đĩa cấy vào tủ định ôn 280C trong 3-5 ngày cho đến khi các tản nấm phát triển. 3.4.1.3. Phương pháp cấy truyền từ các đĩa phân lập. Cấy truyền là bước trung gian giữa phân lập từ mẫu bệnh và làm thuần vi sinh vật gây bệnh. Giai đoạn này giúp xác định vi sinh vật nào đã được phân lập. Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập nấm Fusarium từ rễ và cấy truyền (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) Các bước cấy truyền: 1. Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày và đánh giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. 2. Xác định xem có nhiều hơn một loài nấm mọc lên hay không. 3. Cấy truyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ miếng cấy. 4. Cắt một miếng thạch nhỏ (2 × 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm và cấy sang môi trường PDA. 3.4.1.4.Phương pháp làm thuần mẫu nấm. Sử dụng phương pháp cấy đơn bào tử bằng phương pháp pha loãng. Cấy đơn bào tử là quá trình cấy truyền một bào tử đã nảy mầm để tạo một mẫu nấm thuần. Sơ đồ 3 2: Quy trình cấy đơn bào tử, thao tác chọn lựa một bào tử đúng cách. (Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam) 3.4.2. Sơ bộ quan sát và đánh giá các chủng nấm Fusarium spp. thông qua hình thái nấm. 3.4.2.1.Quan sát màu sắc tản nấm Fusarium spp. Thành phần môi trường: Sử dụng môi trường PSA Cắt miếng thạch (2 x 2 mm) chứa sợi nấm và áp lên đĩa môi trường PSA Nuôi 12 ngày, ở 28 0C trong điều kiện chiếu sáng Quan sát màu sắc tản nấm ở mặt trên, mặt dưới 3.4.2.2. Quan sát tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường PDA Cắt miếng thạch (2 x 2mm) chứa sợi nấm và áp lên đĩa môi trường PDA Nuôi ở 28 0C Đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm sau 24h, 48h, 72h, 96h. 3.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử nấm dưới kính hiển vi. Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường PDA Cắt miếng thạch (2 x 2mm) chứa sợi nấm và áp lên đĩa môi trường PDA Nuôi ở 28 0C Làm tiêu bản để quan sát bào tử dưới kính hiển vi. Có thể quan sát bào tử lớn và bào tử nhỏ sau 4 ngày nuôi cấy. Bào tử hậu có thể quan sát sau 10 ngày. 3.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo Các bước lây bệnh nhân tạo được tiến hành theo quy tắc Koch Tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng phương pháp đưa bào tử nấm vào đất. Chuẩn bị cây tiêu con: Dây tiêu lươn được lấy từ vườn sạch bệnh tại Quãng Trị và được trồng vào ngày: 20 / 9 / 2009 Chọn những dây lươn chắc mập, chiều dài lóng đồng đều. Cắt hom tiêu với độ dài 25 – 30cm, mỗi hom có từ 2 – 3 mắt. Xử lý qua cồn 700. Hỗn hợp đất trồng tiêu được trộn theo tỷ lệ : 2 đất + 1 cát + 1 phân chuồng hoai mục + vôi bột ( tỷ lệ : 15g vôi cho 10kg hỗn hợp trên) đảm bảo pH trung tính. Hỗn hợp đất được phơi nắng 3 ngày để tiêu diệt nguồn bệnh trong đất. Chuẩn bị dịch bảo tử nấm. Chọn lọc những chủng nấm đại diện nuôi cấy trong môi truờng lỏng ½ PDA đến khi sinh bào tử. Sau đó tiến hành thu dịch bào tử và tiến hành tưới trực tiếp vào cây tiêu con. Mổi công thức tưới 250 ml bào tử với nồng độ 105 bào tử/ml. Tiến hành lây bệnh. Chọn 8 chủng nấm đại diện và 1 công thức đối chứng. Mổi công thức được nhắc lại 3 lần. 3.4.4. Xử lý thống kê Số liệu thí nghiệm là kết quả trung bình cộng của 4 lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích Duncan’s test với p<0,05 bằng chương trình SAS. Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập nấm Fusarium spp. từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh 4.1.1. Kết quả phân lập nấm Fusarium spp. Tiến hành phân lập các chủng nấm Fusarium từ 14 vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm tại Cam Chính, Cam Thành - Cam Lộ - Quảng Trị dựa vào các đặc điểm nhận dạng hình thái thông qua màu sắc tản nấm và hình dạng các loại bào tử, đã xác định được 22 chủng là Fusarium spp.. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Qua bảng 4.1, cho thấy hầu hết các mẫu rễ thu thập từ các vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm đều có sự hiện diện của nấm Fusarium.spp. Riêng các chủng nấm phân lập từ các mẫu rễ ở các vườn CC3, CC5, CC6 và CT4 không phải là nấm Fusarium spp. dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước bào tử lớn, bào tử nhỏ). Điều này cho thấy không chỉ có nấm Fusarium spp. trên mẫu rễ mà còn có sự hiện diện của rất nhiều loài nấm khác. Các nấm này có thể là Rhizoctonia, Pythium, Sclerotium, Phytophthora…[9], chúng cùng với Fusarium spp. xâm nhập vào các tế bào ngoài của vỏ rễ mà các tế bào này có thể bị tổn thương do tuyến trùng ký sinh trước đó [10]. Có thể vì nguyên nhân đó nên không thu được Fusarium spp. trong những lần phân lập đầu tiên. Mặt khác, khi phan lập trên môi trường PPA mô có bổ sung thêm chất kháng sinh để ức chế hầu hết các vi khuẩn, cho phép Fusarium mọc chậm, tạo thành các tản nấm nhỏ đường kính 5 - 10 mm sau 5 - 7 ngày. Tuy nhiên một số loài vi khuẩn và loài nấm có khả năng phát triển cạnh tranh với Fusarium spp. trên môi trường phân lập, khiến Fusarium spp. vốn mọc chậm trên môi trường PPA bị các loài này lấn át nên không biểu hiện sự có mặt của chúng. Từ đó có thể giải thích tại sao các mẫu rễ thu thập từ các vườn tiêu có triệu chứng bị bệnh chết chậm (CC3, CC5, CC6, CT4) phân lập được không thành công Fusarium spp. Bảng 4.1. Số chủng Fusarium phân lập từ các mẫu rễ tiêu bị bệnh chết chậm ở Cam Lộ - Quảng Trị STT Địa điểm lấy mẫu Số mẫu lấy Số chủng Fusarium phân lập được Ký hiệu chủng 1 CC1 6 3 CC1.1 CC1.2 CC1.3 2 CC2 2 1 CC2.4 3 CC3 2 0 4 CC4 2 2 CC4.5 CC4.6 5 CC5 2 0 6 CC6 2 0 7 CT1 9 6 CT1.7 CT1.8 CT1.9 CT1.10 CT1.11 CT1.12 8 CT2 2 1 CT2.13 9 CT3 2 1 CT3.14 10 CT4 2 0 11 CT5 6 4 CT5.15 CT5.16 CT5.17 CT5.18 12 CT6 2 2 CT6.19 CT6.20 13 CT7 3 1 CT7.21 14 CT8 2 1 CT8.22 Tổng cộng 22 Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, sự phân bố nấm Fusarium spp. tập trung nhiều ở Cam Thành (Cam Thành phân lập được 16 chủng, Cam Chính phân lập được 6 chủng). Trong đó nhiều nhất là CT1, CT5 và CC1. Những vườn này phân lập được nhiều chủng Fusarium do nhiều nguyên nhân như thành phần cơ giới đất nặng ; độ pH đất thấp, mật độ tuyến trùng, mối và rệp sáp hại rễ có thể cao hơn cao hơn những vườn khác. Ngoài ra, qua đánh giá chung của chúng tôi thì những hộ nông dân ở Cam Thành có chế độ chăm sóc cây tiêu chưa hợp lý như bón quá nhiều phân hóa học không bổ xung phân xanh hay phân chuồng, một số hộ hầu như không quan tâm chăm sóc, có một số vườn bón quá sát gốc làm đứt nhiều rễ dẫn đến hậu quả cây sinh trưởng yếu, tạo điều kiện cho Fusarium spp. xâm nhiễm dễ dàng. Ngày lấy mẫu rễ củng ảnh hưởng nhiều đến số chủng Fusarium phân lập được. Phần lớn các chủng Fusarium phân lập từ mẫu rễ lấy ngày 20/01/2010 (15 chủng). Có thể là do thời điểm lấy mẫu rễ là khoảng thời gian này có nhiều đợt mưa gây nên tình trạng ứ nước tạm thời, làm cho hoạt động sinh lý của cây bị thay đổi đột ngột, cây bị suy yếu tạo điều kiện cho các chủng Fusarium xâm nhiễm dễ dàng và sinh trưởng mạnh trong rễ cây. 4.1.2. Làm thuần mẫu nấm bằng cấy đơn bào tử Hình 4.1. Làm thuần bằng pha loãng và cấy đơn bào tử Các rễ con mảnh, nhỏ, và các rễ phụ làm nhiệm vụ hấp thụ dinh dưỡng cho sự phát triển của cây và quan trọng cho sức khỏe của cây. Các tác nhân gây bệnh trong đất thường gây bệnh ở những bộ phận này. Trên mẫu rễ phân lập không chỉ có 1 chủng nấm Fusarium mà có thể có sự hiện diện của một số chủng khác nên việc phân lập Fusarium bằng phương pháp pha loãng và cấy đơn bào tử nhằm mục đích chọn được 1 chủng duy nhất trên mẫu. Kết quả đã làm thuần được 22 chủng Fusarium phân lập từ các mẫu rễ tiêu bị bệnh chết chậm ở Cam Lộ - Quảng Trị. 4.2. Đặc điểm hình thái các chủng nấm Fusarium spp. phân lập được 4.2.1. Đặc điểm hình thái nấm Fusarium spp. Sau khi phân lập thành công 22 chủng nấm Fusarium, tiến hành kiểm tra sự hình thành bảo từ của từng chủng. Tiếp tục quan sát dưới kính hiển vi để xem hình thái của chúng, những hình ảnh về bảo tử nhỏ, bào tử lớn cũng như bào tử hậu được thấy rõ qua hình 4.2 Bảng 4.2. Sự hình thành bào tử nấm Fusarium spp. phân lập được tại Cam Lộ - Quảng Trị Nhóm Phân nhóm Kí hiệu chủng Bào tử lớn Bào tử nhỏ Bào tử hậu +/- số vách ngăn +/- số vách ngăn I CT5.15 + 2 - 3 + 0 - 1 + CT5.16 + 3 + 0 - 1 + II A CT2.13 + 3 – 4 + 0 – 2 - B CT3.14 + 4 - 5 + 0 - 3 + III A CC1.3 + 1 - 2 + 0 + CC2.4 - - + 0 + B CT1.7 - - + 0 + IV A CT5.18 + 3 + 1 + CT6.20 + 2 - - + B CT1.10 + 3 - 5 + 2 - 3 + V CC1.2 + 2 -4 + 0 - 1 - VI CC1.1 + 2 - 4 + 0 - 1 + CC4.6 + 4 - 5 + 0 - 3 - VII A CT1.9 + 3 - 4 + 0 - 2 + CT1.11 + 2 - 4 + 0 - 1 - CT7.21 + 2 - 3 + 0 - 1 - B CT1.8 + 2 - 4 + 0 - 1 - CT6.19 + 2 -3 + 0 - 1 - CT8.22 + 2 - 3 + 0 - 1 + C CT5.17 + 1 - 4 + 0 - 1 + CC4.5 + 2 - 4 + 0 - 1 - VIII CT1.12 + 3 -5 + 1 - 2 - Ghi chú: +: có bào tử - : không có bào tử Nhóm Tên chủng Bào tử lớn Bào tử nhỏ Bào tử hậu I CT5.16 II CT3.14 IV CT1.10 VI CC4.6 Không có VII CT1.9 CT1.8 Không có CC4.5 Không có VIII CT1.12 Không có Hình 4.2 Hình thái bào tử của 8 chủng Fusarium spp. đại diện Quan sát 45 chủng phân lập được dưới kính hiển vi, thông qua các đặc điểm nhận dạng hình thái, đã xác định 22 chủng là Fusarium. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40 kết hợp với kết quả phân nhóm dựa trên màu sắc được thể hiện ở bảng 4.2. Các chủng Fusarium phân lập được có các đặc điểm: Bào tử lớn có từ 2 đến 5 vách ngăn. Riêng CC1.3 chỉ có 1 đến 2 vách ngăn, CT5.17 có 1 đến 4 vách ngăn. Đặc biệt, 2 chủng CC2.4 và CT1.7 không có sự hiện diện của bào tử lớn. Các bào tử lớn đều có dạng hình lưỡi liềm hay hình trụ; phần đầu có dạng hình đầu tù, hình nón, hình núm vú; phần cuối có dạng hình đầu tù, hình bàn chân. Bào tử nhỏ có từ 0 đến 1 vách ngăn. Riêng CT1.10 có từ 2 đến 3 vách ngăn; CC4.6 có 0 từ đến 3 vách ngăn; CT1.9 có từ 0 đến 2 vách ngăn; CT1.12 có 1 đến 2 vách ngăn. Đặc biệt, chủng CT6.20 và CC1.1 không có sự hiện diện của bào tử nhỏ. Bào tử nhỏ có dạng hình cầu với 1 đầu nhọn, hình quả thận, hình chùy hay hình liềm. Bào tử hậu nằm ở giữa hoặc ở đầu tận cùng của sợi nấm; có dạng đôi, dạng 3 hay dạng chuỗi. Trong số 22 chủng được xác định là Fusarium, 8 chủng không có khả năng hình thành bào tử hậu là CT2.13, CC1.2, CC4.6, CT1.11, CT1.8, CT6.19, CC4.5 và CT1.12 4.2.2. Đặc điểm hình thái và màu sắc tản nấm Fusarium spp. Từ 22 chủng xác định là Fusarium sau 12 ngày nuôi ở 28 0C, trong điều kiện chiếu sáng, chúng tôi phân thành 8 nhóm. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3. Tám nhóm Fusarium được phân biệt dựa vào hình dạng hệ sợi nấm (tơi, xốp); khả năng hình thành khuẩn ty khí sinh nhiều hay ít (tản nấm dày hay mỏng); màu sắc hệ sợi nấm (trắng, trắng ngà, trắng đục, trắng trong, vàng); màu sắc mặt dưới của tản nấm (lục, nâu, nâu nhạt, vàng, vàng nâu, xanh đậm, tím, hồng cam). Đây là sắc tố chính, tập trung ở giữa tản nấm, còn xung quanh tản nấm có màu tương đương với sắc tố chính nhưng nhạt hơn. Trong số 8 nhóm này, có 4 nhóm được phân nhỏ thành các nhóm phụ (II, III, IV, VII). Các phân nhóm phụ này giống nhau về màu sắc, hình thái tản nấm ở mặt trên nhưng khác nhau về màu sắc mặt dưới của tản nấm. Qua bảng 4.2, 4.3, có thể nhận thấy rằng : Các chủng thuộc cùng một phân nhóm phụ hay cùng một nhóm có đặc điểm hình thái, màu sắc tản nấm giống nhau nhưng có thể có đặc điểm hình thái bào tử giống hoặc khác nhau. Cụ thể: Bảng 4.3. Phân nhóm các chủng Fusarium dựa vào hình thái và màu sắc tản nấm Nhóm Phân nhóm phụ Kí hiệu chủng Mô tả hình thái nấm (sau 12 ngày) Màu sắc, hình thái tản nấm (mặt trên) Sắc tố nấm tiết ra môi trường (mặt dưới) I CT5.15 Sợi nấm trắng ngà, tơi mỏng, không xốp, có 1 viền vòng Giữa lục, ngoài cam CT5.16 II A CT2.13 Sợi nấm trắng ngà, tơi, tản nấm phát triển không đều Giữa nâu, ngoài xanh lục B CT3.14 Sợi nấm trắng ngà, tơi dày, không xốp, có 1 viền vòng Vàng III A CC1.3 Sợi nấm màu trắng, tơi, xốp mỏng Xanh đậm CC2.4 B CT1.7 Sợi nấm trắng đục, tơi xốp,mỏng Tím IV A CT5.18 Sợi nấm vàng, xốp bông Vàng CT6.20 B CT1.10 Sợi nấm trắng đục, xốp bông Giữa hồng cam, ngoài vàng V CC1.2 Sợi nấm trắng trong, xốp mịn, có 1 viền vòng Giữa vàng nâu nhạt, viền xanh, trắng đục VI CC1.1 Sợi nấm trắng ngà, tơi dày Nâu nhạt CC4.6 VII A CT1.9 Sợi nấm trắng trong, tơi, có 1 viền vòng Lục CT1.11 CT7.21 B CT1.8 Sợi nấm trắng ngà, tơi Vàng nhạt CT6.19 CT8.22 C CT5.17 Sợi nấm trắng ngà, tơi, tản nấm phát triển không đều Vàng nâu CC4.5 VIII CT1.12 Sợi nấm màu vàng, bông, xốp dày Vàng Nhóm Phân nhóm phụ Tên chủng Hình thái nấm (sau 12 ngày) Mặt trên Mặt dưới I CT5.16 II A CT2.13 B CT3.14 III A CC1.3 B CT1.7 IV A CT5.18 B CT1.10 V CC1.2 VI CC4.6 VII A CT7.21 B CT1.8 C CC4.5 VIII CT1.12 Hình 4.3. Màu sắc của các chủng nấm Fusarium 2 chủng CT5.15 và CT5.16 cùng thuộc nhóm I, đều có bào tử lớn (2 -3 vách ngăn), bào tử nhỏ (0 – 1) vách ngăn và có mặt bào tử hậu. 2 chủng CC1.1 và CC4.6 cùng thuộc nhóm VI nhưng chủng CC1.1 có bào tử lớn với 2 – 4 vách ngăn, bào tử nhỏ có 0 – 1 vách ngăn và có mặt bào tử hậu. Trong khi đó, chủng CC4.6 có bào tử lớn với 4 – 5 vách ngăn, bào tử nhỏ có 0 – 3 vách ngăn và không có mặt bào tử hậu. Các chủng CC2.4 và CT1.7 dù không có bào tử lớn nhưng qua quan sát hình thái, màu sắc tản nấm (CC2.4 có sợi nấm màu trắng, xốp, tơi mỏng, tiết sắc tố xanh đậm; CT1.7 có sợi nấm màu trắng đục, xốp tơi mỏng, tiết sắc tố tím) cùng với sự hiện diện của bào tử nhỏ và bào tử hậu, đây là nấm Fusarium. Theo một số nghiên cứu, bào tử lớn của các loài Fusarium spp. như F. poae, F. subgluninas, F. moniliform, F. lansethiae rất khó phát hiện và chúng chỉ có thể được sản sinh dưới điều kiện có tia UV [12], [18]. Chủng CT6.20 tuy không có bào tử nhỏ nhưng có bào tử lớn với 2 vách ngăn và có sự hiện diện của bào tử hậu, qua đó có thể khẳng định đây là nấm Fusarium vì một số loài Fusarium như F. equiseti hoặc F. acuminatum cũng không hình thành bào tử nhỏ trong quá trình sinh sản vô tính [12]. 4.2.3. Quan sát tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm có liên quan mật thiết đến khả năng gây bệnh nhanh hay chậm của nấm đó. Đo tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ có thể biết được khả năng gây bệnh của từng chủng nấm nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4. Sau 24 giờ, chủng CT1.12 có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, chủng CT2.13 có tốc độ sinh trưởng chậm nhất. Sau 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ, chủng CT1.12 sinh trưởng nhanh nhất, chủng CT1.10 sinh trưởng chậm nhất. Như vậy, sau 4 ngày (96 giờ) có thể kết luận rằng chủng CT1.12 có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, chủng CT1.10 có tốc độ sinh trưởng chậm nhất, còn 20 chủng còn lại có tốc độ sinh trưởng trung bình và tương đương nhau. Bảng 4.4. Tốc độ sinh trưởng của các chủng Fusarium phân lập được Nhóm Phân nhóm Kí hiệu chủng Tốc độ sinh trưởng của đường kính tản nấm (cm) 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ I CT5.15 1,21hij 2,43fg 3,83hij 5,03j CT5.16 1,26fghij 2,51ef 3,75ij 5,14 ij II A CT2.13 1,10j 2,25gh 3,64j 5,18ij B CT3.14 1,23ghij 2,21h 3,36k 4,61 k III A CC1.3 1,20ij 2,59def 4,04efgh 5,25 hij CC2.4 1,41cdef 2,76cd 3,78ij 5,21 ij B CT1.7 1,44cde 3,06b 4,36bc 6,10 bc IV A CT5.18 1,46bcd 2,75cd 3,93 ghi 5,18 ij CT6.20 1,24ghij 2,64de 3,28 k 4,36 l B CT1.10 1,23ghij 2,00i 2,80 l 3,70 m V CC1.2 1,28efghi 2,73cd 4,36 bc 5,78 de VI CC1.1 1,38defgh 2,89bc 4,29 bcd 5.78 de CC4.6 1,39cdefg 2,71cde 4,16 bcdef 5,59 efg VII A CT1.9 1,55abc 2,78cd 4,23 bcdef 5,83de CT1.11 1,30defghi 2,66de 4,09 defg 5,94 cd CT7.21 1,39cdefg 2,58def 4,13 cdefg 5,46 fgh B CT1.8 1,46bcd 2,88bc 4,28 bcde 5,75de CT6.19 1,25fghij 2,64de 4,03 fgh 5,35 ghi CT8.22 1,60ab 3,00b 4,40 b 6,20 b C CT5.17 1,31defghi 2,73cd 4,09 defg 5,49 fgh CC4.5 1,33defghi 2,78cd 4,25 bcdef 5,68 ef VIII CT1.12 1,70a 3,34a 5,01a 6,71 a ( a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m: sai khác giữa các trung bình, p < 0,05 sai khác có ý nghĩa). Cả 2 chủng CT1.10 và CT1.12 đều phân lập từ vườn CT1 nhưng khác thời điểm lấy mẫu rễ: CT1.10 được phân lập từ mẫu rễ lấy ngày 08/01/2010 còn CT1.12 được phân lập từ mẫu rễ lấy ngày 20/01/2010. Nhưng chủng CT1.12 lại là chủng có tốc độ sinh trưởng mạnh nhất còn CT1.10 là chủng có tốc độ sinh trưởng yếu nhất. Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ Sau 96 giờ Hình 4.4. Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm CT5.17 4.3. Lây bệnh nhân tạo Sau 6 tháng trồng từ tháng 9/2009 đến tháng 4/2010, tiến hành lây bệnh nhân tạo trên cây tiêu con. Hình 4.5: Tiêu ươm 4 tuần tuổi Hình 4.6 : Dịch bào tử nấm đang nuôi. Hình 4.7: Khu bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đang được tiếp tục theo dỏi hàng ngày để quan sát sự xuất hiện của triệu chứng bệnh Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đã phân lập được 22 chủng Fusarium từ 14 vườn tiêu là nguyên nhân gây bệnh chết chậm tại 2 xã Cam Chính, Cam Thành - Cam Lộ - Quãng Trị. Từ 22 chủng đã phân lập được, sử dụng phương pháp cấy đơn bào tử bằng phương pháp pha loãng đã làm thuần được 22 chủng Fusarium. Quan sát hình thái bào tử của 22 chủng Fusarium nhìn chung: bào tử lớn có tử 2-5 vách ngăn, bào tử nhỏ hầu hết có từ 0-1 vách ngăn, một số chủng có từ 1- 3 vách ngăn. Trong 22 chủng, có 8 chủng có khả năng hình thành bào tử hậu. Dựa vào hình dạng hệ sợi nấm và màu sắc tản nấm, chúng tôi đã phân thành 8 nhóm. Trong đó, có 4 nhóm được phân nhỏ thành các nhóm phụ ( II, III, IV, VII ) Dựa vào tốc độ sinh trưởng của 22 chủng Fusarium, đã xác định được chủng nấm có khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh nhất đó là CT1.12. Ngược lại, chủng CT1.10 là chủng sinh trưởng phát triển chậm nhất. 5.2. Đề nghị Tiếp tục theo dõi kết quả của bố trí thí nghiệm để khẳng định được những chủng nào có khả năng gây bệnh cao nhất. Tiếp tục nghiên cứu nấm Fusarium với số lượng mẫu đại diện cho nhiều vùng trồng tiêu có nhiều đặc điểm về thổ nhưỡng và điều kiện thời tiết khác nhau. Sử dụng các kỹ thuật phân tử hiện đại bằng vùng ITS và 5,8S rDNA để nhận dạng một cách dễ dàng các loài Fusarium . Hạn chế của đề tài : Đề tài được tiến hành trong thời gian quy định từ 06/01/2009 đến ngày 09/5/2010. Với khoảng thời gian 18 tuần để hoành thành tất cả những nội dung đã đề ra. Tuy nhiên, do trong quá trình thực hiện đề tài đòi hỏi sự chính xác cũng như tính cẩn thận cao cho nên đến thời điểm này, một trong những nội dung của đê tài là: Lây bệnh nhân tạo mới được tiến hành vào ngày 4/5 vẫn chưa cho kết quả rõ ràng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Ngô Anh. 2009. Nấm học. NXB Đại học Huế. Huế Nguyễn Ngọc Châu. 1995. Thành phần sâu bệnh hại hồ tiêu ở Tân Lâm – Quảng Trị. Tạp chí bảo vệ thực vật 1/1995. Trần Văn Hòa. 2001. Trồng tiêu thế nào cho hiệu quả?. Tập 9: 101 câu hỏi thường gặp trong sản xuất nông nghiệp. NXB Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề. 1998. Bệnh cây nông nghiệp. NXB Nông nghiệp Hà Nội. Hà Nội. Lê Xuân Phương. 2001. Nấm mốc. Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây dựng, Hà N Nguyễn Văn Thành, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Bá. Giáo trình môn Nấm học. Tài liệu tiếng anh Aoki T, Nirenberg H.I. 1999. Fusarium globosum from subtropical Japan and the effect of different light conditions on its conidiogenesis. Mycoscience 40: 1-9. Booth C. 1971. Fusarium nomenclature. The genus Fusarium. Commonweath Mycological Institute, Kew, Surrey. Burgess L.W, Knight T.E, Len Tesoriero, Hien Thuy Phan. 2008. Diagnostic manual for plant diseases in Vietnam. Australian Centre for International Agricultural Research. 201. Dropkin V.H. 1980. Introduction to Plant Nematology. John Wiley and Sons. N.Y. 293pp. Ellner F.M. 2002. Mycotoxins in Potato Tubers infected by Fusarium sambucinum. Mycotoxin Research 18: 57-61. Gagkaeva T. 2008. Introduction to Fusarium taxonomy. St. Petersburg, Russia. Gerlach W, Nirenberg HI. 1982. The genus Fusarium - a pictorial atlas. Mitt Biol Bundesanst Land-u Forstwirsch Berlin-Dahlem 209: 1-406. Ghiasian S.A, Rezayat S.M, Kord B.P, Maghsood A.H, Yazdanpanah H, Shephard G.S, Westhuizen L, Vismer H.F, Walter F.O.M. 2005. Fumonisin production by Fusarium species isolated from freshly harvested corn in Iran. Mycopathologia 159: 31– 40. Guadet J, Julien J, Lajay J.F, Brygoo Y. 1989. Phylogeny of some Fusarium, as determined by large_subumit rRNA sequence comparison. Mol. Biol 6(3): 227-242. Hussein H.M. Christensen M.J, Baxter M. 2002. Occurrence and distribution of Fusarium species in maize fields in New Zealand. Mycopathologia 156: 25–30. Lin X, Heitman J. 2005. Chlamydospore Formation during Hyphal Growth in Cryptococcus neoformans. American Society for Microbiology. Seifert K. 1996. Fusarium interactive key. Agriculture and Agri-Food Canada. Vujanovic V, Hamel C, Yergeau E, Arnaud M.S. 2006. Biodiversity and Biogeography of Fusarium Species from Northeastern North American Asparagus Fields Based on Microbiogical and Molecular Approaches. Springer Science and Business Media 51: 242-255. Wollenweber H.W, Reinking O.A. 1935. Die Fusarien, Ihre Beschreibung, Schad_wirbung und Bekampfung. Paul Parey, Berlin.