Mở đầu
Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay ở Việt Nam. Theo thống kê của Hội Ung thư TP. Hồ Chí Minh, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 bệnh nhân ung thư mắc mới với khoảng 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày ở nam giới ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư phổi ở nữ giới. Phần lớn bệnh nhân được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, chi phí điều trị bệnh cao và kéo dài. Các thuốc ung thư thế hệ mới thường có giá thành cao nên ít bệnh nhân có điều kiện tiếp cận trong khi các thuốc hoá trị liệu cổ điển mặc dù có giá thành hạ nhưng nhiều tác dụng phụ.
Gossypol là một hợp chất polyphenol được tìm thấy trong hạt của các loài thuộc chi bông Gossypium, họ Malvaceae. Gossypol đã được biết điến với rất nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tác dụng chống ôxy hoá, tránh thai nam, chống ký sinh trùng, chống HIV và chống ung thư. Gần đây, gossypol đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học với vai trò là một chất “mimetic BH3” (bắt chước BH3) trong tự nhiên, có khả năng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2. Các protein này thường được biểu hiện quá mức ở một số loại tế bào ung thư, làm cho các tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nên kháng thuốc hoặc kém nhạy cảm với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol (cũng như một số thuốc đang được thử nghiệm trên lâm sàng khác như ABT-263, obatoclax (GX15-070) có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis từ đó giúp cho các tế bào ung thư có thể chết theo chương trình, giảm sự kháng thuốc hoặc giúp cho các tế bào ung thư trở lên nhạy cảm hơn với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol có 2 đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)-gossypol, trong đó (-)-gossypol được xem là có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn (+)-gossypol như tác dụng chống ung thư, tránh thai nam, chống HIV. Hiện nay, (-)-gossypol là thuốc đầu tiên được sử dụng theo đường uống tác dụng đến đích Bcl-2 đang được thử nghiệm trên lâm sàng pha II tại Mỹ.
Ở nước ta, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến, chủ yếu để cung cấp xơ bông phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may. Hiện nay, diện tích bông vải được trồng tại Việt Nam ước đạt 8.500 ha, dự kiến đến năm 2020 diện tích bông vải tại Việt Nam lên đến 76.000 ha. Mặc dù nguồn nguyên liệu dồi dào và có nhiều tác dụng sinh dược học có giá trị nhưng gossypol từ hạt bông vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu ở nước ta đặc biệt là từ loài Gossypium barbadense L, thường được biết đến là loài có hàm lượng gossypol cao và có chứa nhiều (-)-gossypol, dạng đồng phân có hoạt tính sinh học mạnh hơn. Xuất phát từ thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài:
“NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ”
Đề tài được thực hiện với những mục tiêu như sau:
- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol từ hạt bông Gossypium barbadense L.
- Nghiên cứu phương pháp tách đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol từ hỗn hợp gossypol racemic.
- Nghiên cứu độc tính tế bào của các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol đã phân lập được trên 3 dòng tế bào ung thư người.
78 trang |
Chia sẻ: banmai | Lượt xem: 2826 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu phân lập và tác dụng gây độc của gossypol từ hạt bông (gossypium barbadense l.) trên một số dòng tế bào ung thư, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ản phẩm ít chịu ảnh hưởng bởi thể tích DEE và lượng acetic acid thêm vào. Trong khi đó, khối lượng gossypol tuyệt đối thu được lại dao động khá lớn (0,30-0,43 g). Có thể nhận thấy khối lượng G-AA kết tinh được càng nhiều khi nồng độ cao DEE càng đặc, tương ứng với lượng dung môi DEE sử dụng càng ít. Khối lượng sản phẩm G-AA tuyệt đối thu được nhiều nhiều nhất (0,43 g và 0,42 g) khi lượng DEE được sử dụng là ít nhất (3 ml) cho dù lượng acetic acid băng được thêm vào theo tỷ lệ tương ứng là 1/5 hay 1/3.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE
đến quá trình kết tinh G-AA
AcOH băng/ DEE (v/v)
Thông số
Thể tích DEE
3 ml
6 ml
9 ml
1/5
Khối lượng G-AA thô (g)
0,57±0,02
0,47±0,02
0,37±0,02
Độ tinh khiết (%)
76,1±1,6
78±2,0
79,2±2,3
Khối lượng G-AA thực (g)
0,43±0,02
0,37±0,02
0,30±0,02
1/3
Khối lượng G-AA thô (g)
0,56 ±0,02
0,50±0,02
0,47±0,03
Độ tinh khiết (%)
75,5±1,5
78,3±1,5
78,3±1,5
Khối lượng G-AA thực (g)
0,42±0,01
0,39±0,02
0,37±0,02
Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số
Lượng acetic acid cũng tác động đến khối lượng sản phẩm G-AA kết tinh từ dung dịch theo xu hướng lượng sản phẩm thu được tăng lên khi lượng acetic acid sử dụng nhiều hơn (1/3). Sự khác biệt này thể hiện rõ rệt nhất khi kết tinh trong dung dịch loãng (sử dụng 9 ml DEE, P0,05).
Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi đã tìm được kiện kết tinh G-AA từ cao chiết DEE với hiệu xuất cao như sau: cao chiết DEE từ 100 g bột hạt bông (G. barbadense L., HD139) được hòa trong 3 ml DEE, thêm 0,6 ml acetic acid (tương ứng 1/5 thể tích DEE) trong điều kiện nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng. Kết quả này rất có ý nghĩa, đặc biệt là khi nâng quy trình tinh chế gossypol lên quy mô lớn.
3.1.3.3. Kết tinh lại sản phẩm G-AA thô
Sản phẩm G-AA thô (sản phẩm kết tinh lần 1) được kết tinh lại nhiều lần để thu được các sản phẩm G-AA tinh khiết. 10 g sản phẩm G-AA thô từ quá trình nghiên cứu kết tinh nêu trên sau khi kết tinh lần 2 thu được 7,1 g (hiệu suất 71%), kết tinh lại lần 3 thu được 6,2 g (hiệu suất 87%), kết tinh lại lần 4 thu được 5,6 g G-AA tinh khiết có mầu vàng sáng (hiệu suất 90%, độ tinh khiết > 98% theo diện tích pic HPLC). Như vây, hiệu suất của cả quá trình tinh chế (3 lần kết tinh lại) từ sản phẩm G-AA thô là 56% .
Sản phẩm gossypol acetic acid tinh sạch cho một vết duy nhất có Rf = 0,67 trên SKLM silica gel GF254 với hệ dung môi khai triển n-hexane/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4; có điểm chảy 178-180ºC và phổ UV (lmax, CHCl3): 242, 288, 363 nm phù hợp với các số liệu đã thông báo trước đây của G-AA. Kết quả phân tích trên HPLC cũng cho thấy sản phẩm có độ tinh khiết rất cao, sắc ký đồ ở bước sóng 254 nm cho một pic duy nhất có thời gian lưu là 7,9 phút. Sản phẩm thu được từ phương pháp kết tinh có độ tinh khiết tương đương với sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel (HPLC tính theo diện tích pic ở bước sóng 254 nm).
Như vậy, chúng tôi đã chiết xuất và tinh chế thành công G-AA từ giống hạt bông HD139 thuộc loài Gossypium barbadense.L. Theo phương pháp chiết soxhlet, khi chúng tôi nâng quy mô lên 1 kg nhân hạt/mẻ chỉ cần 3 lít dung môi mỗi loại. Từ kết quả của quá trình tối ưu hóa điều kiện kết tinh, gossypol từ cao chiết DEE được kết tinh dưới dạng G-AA trong 30 ml DEE và 5 ml acetic acid, thu được 5,67 g sản phẩm G-AA kết tinh lần 1. Sản phẩm G-AA này sau quá trình tinh chế bằng cách kết tinh lại theo phương pháp nêu trên, cuối cùng chúng tôi thu được 3,2 g G-AA tinh khiết (>98% tính theo diện tích pic HPLC). Theo đó hiệu suất của cả quá trình phân lập G-AA từ nhân hạt bông là 0,32%.
Phương pháp chiết soxhlet được chúng tôi sử dụng đã cho phép chiết được gossypol với thể tích dung môi ete dầu và DEE ít hơn nhiều so với việc áp dụng phương pháp của Carruth. Theo Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng sự, để chiết 1,5 kg bột nhân hạt bông G. hirsutum theo phương pháp Carruth cần tới 15 lít ete dầu và 12 lít DEE trong các thiết bị chiết lớn. Mặt khác, để kết tinh G-AA, các tác giả này cần phải sử dụng tới 500 ml DEE và 400 ml acetic acid ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh). Hiệu suất của quá trình kết tinh G-AA mà tác giả trên thu được là 0,45% G-AA kết tinh lần 1 và 0,28% sản phẩm G-AA kết tinh lần 3 [39]. Như vậy, quy trình phân lập gossypol từ hạt bông G. barbadense HD139 mà chúng tôi đã tìm ra khá đơn giản và tiết kiệm hóa chất mà vẫn cho hiệu suất cao. Mặt khác, quy trình này khi được áp dụng để phân lập gossypol từ hạt của một số giống khác của loài G. barbadense, cũng thu được kết quả khả quan. Cụ thể, từ 100 g bột hạt bông của 2 giống HD108 và HD208 sau quá trình phân lập theo quy trình nêu trên chúng tôi cũng thu được G-AA tinh sạch (sản phẩm kết tinh lần thứ 4) với hiệu suất tương ứng là 0,28% và 0,32%.
3.2. Tách đồng phân quang học (-)-gossypol và (+)-gossypol từ (±)-gossypol
Như đã biết, gossypol tồn tại dưới dạng 2 đồng phân atropisomer là (+)-gossypol và (-)-gossypol. Hai đồng phân này có tác dụng sinh học khác nhau, nên việc phân tách hai đồng phân quang học này hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả trên thế giới. Ở trong nước, chúng tôi chưa thấy có tài liệu nào công bố về việc tách đồng phân quang học (+)-gossypol và (-)-gossypol. Do vậy, trong công trình này chúng tôi tiến hành một số khảo sát ban đầu về việc tách (+)-gossypol và (-)-gossypol từ hỗn hợp racemic phục vụ cho các nghiên cứu về tác dụng sinh học của các đồng phân này cũng như hỗn hợp racemic của chúng về sau.
Như trên đã thấy, việc tách trực tiếp hai đồng phân quang học này bằng các phương pháp sắc ký (SKLM điều chế, sắc ký cột, HPLC điều chế) với chất mang thông thường là không thể thực hiện được. Phương pháp HPLC sử dụng cột nhồi là chất mang bất đối đã được sử dụng nhưng có giá thành rất cao, không phù hợp ở Việt Nam và không khả thi ở quy mô lớn [10]. Do đó chúng tôi tiến hành tách hai đồng phân này bằng phương pháp tạo dẫn xuất với amine bất đối là L-phenylalaninol được chúng tôi cải tiến từ phương pháp đã được mô tả bởi Sampatk D. S. [47].
Toàn bộ quá trình tách hai đồng phân (+)- và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±)-gossypol mà chúng tôi thực hiện được tóm tắt trong hình 3.5.
Hình 3.5. Sơ đồ tách đồng phân quang học (+)- và (-)-gossypol từ (±)-gossypol
3.2.1. Điều chế (±)-gossypol-L-phenylananinol dienamine
Do gossypol có 2 nhóm aldehyde có khả năng phản ứng hầu như toàn lượng với các amine bậc 1 để tạo thành các bazơ Schiff tương ứng, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo bazơ Schiff với amine bất đối là L-phenylalaninol (hay (S)-phenylalaninol) để tách riêng 2 đồng phân (+)-gossypol và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±)-gossypol.
Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.6. Phản ứng tổng hợp (±)-gossypol-L-phenylananinol dienamine
(±)-G-AA (0,406 g; 0,70 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào lần lượt 6 ml acetonitrile và L-phenylalaninol (0,233 g, 1,54 mmol). Hỗn hợp phản ứng được khuấy bằng que khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ.
Sau mỗi 0,5 h, một lượng nhỏ dung dịch phản ứng được lấy ra và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn GF254 với hệ dung môi khai triển là n-hexan/EtOAc = 6/4. Sau 30 phút, hỗn hợp phản ứng cho 4 vết, trong đó căn cứ vào Rf cho thấy chất đầu gossypol đã phản ứng hết. Tại các thời điểm 1 h; 1,5 h; 2 h; 2,5 h hỗn hợp phản ứng cho 4 vết trên sắc ký lớp mỏng. Đến thời điểm 3 h, trên sắc ký đồ chỉ còn 2 vết với Rf = 0,58 và Rf = 0,20. Kéo dài phản ứng thêm 0,5 h nữa sắc ký đồ vẫn không thay đổi. Dừng phản ứng. Hỗn hợp này được chuyển vào bình chiết quả lê, thêm 50 ml nước cất và chiết với 50 ml DCM. Quá trình chiết với DCM được lặp lại 3 lần, pha hữu cơ được gộp lại và rửa bằng nước để loại bỏ amine dư, làm khan bằng Na2SO4 và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Kết quả chúng tôi thu được 0,549 g sản phẩm thô dưới dạng chất rắn mầu vàng nâu.
Sản phẩm phản ứng gồm 2 vết có Rf cách xa nhau tương ứng với 2 base Schiff là đồng phân diastereomer của nhau là (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được chúng tôi phân tách và tinh sạch bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel. Kết quả chúng tôi thu được 0,263 g sản phẩm (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine (hiệu suất 95%, [α]D = - 7000 (c 0,1, CHCl3)) và 0,231 g (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine (hiệu suất 83,9%, [α]D = + 2700 (c 0,037, CHCl3)). Sản phẩm được kiểm tra lại bằng phổ khối (negative): [M-H]- (ESI) = 783,4 (Phụ lục 5)
Như vậy, sử dụng amine bất đối L-phenylalaninol, hiệu suất phản ứng tạo bazơ Schiff chúng tôi thu được gần như toàn lượng (99,6%). Điều quan trọng hơn là do sự khác biệt lớn về độ phân cực (Rf = 0,58 và Rf = 0,20) nên hai đồng phân diastereomer này có thể phân tách rất tốt bằng sắc ký cột sillica gel. Theo đó, tính cả giai đoạn phản ứng tạo bazơ Schiff và phân tách qua cột, hiệu suất thu hồi (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine đạt 95% và đối với (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine là 83,9% khi hỗn hợp ban đầu là gossypol racemic. Đây là cơ sở để chúng tôi có thể điều chế các đồng phân gossypol tinh khiết quang học với hiệu suất cao.
3.2.2. Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol
Bằng cách thuỷ phân các dẫn xuất bazơ Schiff tinh khiết quang học chúng tôi thu được sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol tinh khiết tương ứng.
3.2.2.1. Điều chế (-)-gossypol
Hình 3.7. Phản ứng thủy phân bazơ Schiff (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine
Phản ứng điều chế (-)-gossypol được thực hiên theo sơ đồ ở hình 3.7.
(-)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,315 g, 0,40 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 15 ml DEE, 3 ml acetic acid và 0,5 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong điều kiện tránh ánh sáng và môi trường khí nitơ. Kết quả theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy, sau 30 phút phản ứng, sắc ký đồ cho 3 vết, trong đó căn cứ vào chất đối chiếu gossypol và chất đầu (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine chúng tôi có thể xác định 1 vết là gossypol (Rf = 0,67) đã được tạo thành và chất đầu chưa phản ứng hết (Rf = 0,58) cùng với chất trung gian (Rf = 0,65). Sau 1 h; 1,5 h; 2 h; 2,5 h phản ứng, dựa trên mức độ đậm nhạt của các vêt trên sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy lượng sản phẩm gossypol tăng lên cùng với sự giảm dần của chất đầu và chất trung gian. Chúng tôi dự đoán rằng chất trung gian (Rf = 0,65) là sản phẩm thuỷ phân 1 trong 2 nhóm base Schiff của chất đầu. Sau 3 h phản ứng, sắc ký đồ cho thấy chất đầu cũng như sản phẩm trung gian đã phản ứng hết, trên bản mỏng chỉ xuất hiện duy nhất 1 vết của (-)-gossypol. Dừng phản ứng. Sau khi xử lý phản ứng, chúng tôi thu được 0,415 g sản phẩm thô dưới dạng chất rắn mầu nâu vàng. Đây là sản phẩm (-)-gossypol chưa tinh sạch, do đó chúng tôi tinh chế lại bằng phương pháp sắc ký cột. Sau quá trình tinh chế chúng tôi thu được 0,180 g (-)-gossypol dưới dạng chất rắn mầu vàng. Hiệu suất tách (-)-gossypol từ base Schiff sau 2 giai đoạn thuỷ phân và sắc ký cột là 86,5% và cho toàn bộ quá trình phân tách từ hỗn hợp racemic gossypol là 82,1%.
Một số thông số của sản phẩm (-)-gossypol:
[α]D = - 3680 (c = 0,311; CHCl3) (lit. [a]D - 363,6 (c 0,2; CH3OH) [32]
Điểm chảy : 176-1790C.
IR (KBr, cm-1): ν = 3504, 3362 (-OH), 2937, 2873 (-COOH), 1715 (C=O), 1615 (C=C), 1441, 1338, 1294 (CAr-O), 1167, 1052, 839, 770, 611. (Phụ lục 6)
1H MNR (500 MHz, CDCl3): d = 14,72 (s, 2H, -OH); 11,04 (s, 2H, -CHO); 7,73 (s, 2H, -Ar-H); 6,48 (s, 2H, -OH); 6,29 (s, 2H, -OH); 3,86 (s, 2H, -CH(CH3)2); 2,13 (s, 3H, -Ar-CH3); 2,15 (s, 3H, -CH3); 1,52 (d, J= 7,5 Hz; 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 7)
13C MNR (500 MHz, CDCl3): d = 199,2; 155,8; 150,7; 143,1; 134,3; 133,9; 129,6; 117,9; 116,5; 114,8; 111,7; 27,9; 20,4; 20,3 ppm. (Phụ lục 8)
Phổ khối (ESI-MS) (negative): [M-H]- = 517,08. (Phụ lục 9)
3.2.2.2. Điều chế (+)-gossypol
Điều chế (+)-gossypol dựa trên phản ứng thuỷ phân bazơ Schiff tương ứng là (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine. Phản ứng thuỷ phân được tiến hành trong môi trường acid HCl và acetic acid với các điều kiện tương tự như phản ứng thuỷ phân dẫn xuất (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine để điều chế (-)-gossypol. Cụ thể như sau:
(+)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,285 g; 0,36 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào 10,6 ml diethyl ether, 1,5 ml acetic acid và 0,45 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi sự tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là n-hexane/EtOAc = 6/4 (soi UV 254 nm). Sau 30 phút phản ứng, sắc ký đồ cho 3 vết, trong đó 1 vết là (+)-gossypol (Rf = 0,67) đã được tạo thành và chất đầu chưa phản ứng hết (Rf = 0,20), chất trung gian là sản phẩm thuỷ phân 1 nhóm enamine của bazơ Schiff (Rf = 0,43). Sau 1 h; 1,5 h; 2 h; 2,5 h phản ứng, dựa trên sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy phản ứng tiến triển theo hướng lượng sản phẩm (+)-gossypol tăng lên cùng với sự giảm dần lượng chất đầu và chất trung gian. Sau 3 h phản ứng, sắc ký đồ cho thấy chất đầu cũng như sản phẩm trung gian đã phản ứng hết, bản mỏng chỉ xuất hiện duy nhất tương ứng với (+)-gossypol. Dừng phản ứng.
Phản ứng sau khi dừng được xử lý tương tự như phản ứng thuỷ phân bazơ Schiff của (-)-gossypol, cuối cùng chúng tôi thu được 0,407 g (+)-gossypol thô dưới dạng chất rắn mầu nâu. Sau quá trình tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel chúng tôi thu được 0,150 g (+)-gossypol dưới dạng chất rắn mầu vàng. Hiệu suất tách (+)-gossypol từ base Schiff sau 2 giai đoạn thuỷ phân và sắc ký cột là 79,5% và hiệu suất của cả quá trình phân tách từ hỗn hợp gossypol racemic là 66,7%.
Một số thông số của sản phẩm (+)-gossypol:
[α]D= +3290 (c 0,19; CHCl3) (lit. [a]D + 3480 (c 0,05; CH3OH) [32]
Điểm chảy :175-177ºC
UV (lmax; CHCl3): 242, 288, 364 nm.
IR (KBr, cm-1): ν = 3506, 3429 (-OH), 2971, 2886 (-COOH), 1710, 1752 (C=O), 1617 (C=C), 1442, 1339, 1295 (CAr-O), 1172, 1065, 845, 774, 644, 480. (Phụ lục 10)
1H NMR (500 MHz, CDCl3): d = 14,93 (s, 2H, -OH); 11,08 (s, 2H, -CHO); 7,76 (s, 2H, -Ar-H); 6,34 (s, 2H, -OH); 6,16 (s, 2H, -OH); 3,88 (br s, 2H, -CH(CH3)2); 2,15 (s, 6H, -Ar-CH3); 1,54 (s, 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 11)
13C MNR (500 MHz, CDCl3): d = 199,3; 155,9; 150,6; 143,3; 134,2; 133,8; 129,7; 117,5; 116,1; 114,7; 111,7; 27,9; 20,3; 20,2 ppm. (Phụ lục 12)
3.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm (+)-gossypol và (-)-gossypol
Việc đánh giá chất lượng, bao gồm độ tinh khiết hóa học và độ tinh khiết quang học, của các sản phẩm (+)-gossypol và (-)-gossypol tách được giúp sơ bộ đánh giá được hiệu quả của phương pháp tách và phương pháp tinh chế hai đồng phân quang học này từ hỗn hợp racemic. Phương pháp thông dụng để đánh giá độ tinh khiết hóa học (định lượng) và độ tinh khiết quang học của (-)-gossypol đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Tuy nhiên, chúng tôi chưa tìm thấy nghiên cứu nào ở Việt Nam về vấn đề này. Đặc biệt, qua tham khảo tài liệu, chúng tôi chưa thấy công trình nào của Việt Nam nghiên cứu đánh giá độ tinh khiết quang học của một đồng phân quang học (xác định lượng thừa enantiomer - enantiomeric excess hay ee). Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại, có độ chính xác cao và khá phổ biến ở Việt Nam nên được chúng tôi chọn lựa áp dụng. Phương pháp này đã được Robert D. Stipanovic và cộng sự xây dựng để định lượng tỷ lệ các đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hạt bông [51]. Ưu điểm của phương pháp là có độ chính xác cao, có thể áp dụng rộng rãi mà không đòi hỏi cột sắc ký bất đối (chiral column) đắt tiền.
3.2.3.1. Đánh giá độ tinh khiết hóa học của (-)-gossypol và (+)-gossypol
Độ tinh khiết của sản phẩm (-)-gossypol mà chúng tôi đã phân tách được đánh giá bằng phương pháp HPLC. Do không có chất chuẩn (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol nên bước đầu chúng tôi đánh giá độ tinh khiết tương đối của các sản phẩm thông qua diện tích pic trên HPLC.
Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy ở bước sóng 254 nm, sản phẩm (-)-gossypol cho một pic chính có thời gian lưu là 7,95 phút (91% tổng diện tích pic) và 2 pic phụ khác có diện tích rất nhỏ. Căn cứ thêm trên phổ tử ngoại của chất ứng với pic này (trên HPLC) cũng như thời gian lưu của sản phẩm (±)-gossypol (7,94 phút) trong cùng một điều kiện chạy máy, có thể khẳng định píc có thời gian lưu 7,95 phút là tương ứng với sản phẩm (-)-gossypol và có độ tinh khiết hoá học là trên 91% tính theo phần trăm diện tích pic đo ở bước sóng 254 nm (Hình 3.8, Phụ lục 13).
Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của (-)-gossypol. (-)-Gossypol có thời gian lưu
t=7,95 phút, phần trăm diện tích pic là S=91% (254 nm).
Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của (+)-gossypol. (-)-Gossypol có thời gian lưu
t=7,92 phút, phần trăm diện tích pic là S=79,2% (254 nm).
Sản phẩm (+)-gossypol được đem phân tích trên HPLC, với cùng điều kiện như khi phân tích (±)-gosspol và (-)-gossypol. Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy sản phẩm này cho 5 pic trong đó có 1 pic có diện tích lớn nhất chiếm 79,2% với thời gian lưu là 7,92 phút, trùng với thời gian lưu của (±)-gossypol (7,94 phút) và của (-)-gossypol (7,95 phút) (Hình 3.9, Phụ lục 14). Kết hợp với dữ liệu phổ tử ngoại của chất ứng với pic này, chúng tôi khẳng định đây là (+)-gossypol. Các pic còn lại là tạp chất lẫn trong sản phẩm. Tuy độ tinh khiết của (+)-gossypol chỉ đạt 79,2% nhưng trong khuôn khổ của luận văn chúng tôi không tiếp tục tinh chế (+)-gossypol có độ tinh khiết cao hơn. Hiện nay đồng phân (+)-gossypol cũng không phải là đối tượng được các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều như đồng phân (-)-gossypol.
3.2.3.2. Đánh giá độ tinh khiết quang học của (-)-gossypol và (+)-gossypol
Độ tinh khiết quang học của sản phẩm là một trong số các chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tách đồng phân quang học và cũng là để đánh giá chất lượng sản phẩm. Dựa vào giá trị độ quay cực có thể đánh giá được phần nào độ tinh khiết quang học của sản phẩm. Sản phẩm (-)-gossypol chúng tôi đã điều chế được có [α]D = -3680 (c 0,311; CHCl3), được đánh giá là có độ tinh khiết quang học rất cao dựa trên tài liệu tham khảo, [a]D = - 363,6 (c 0,2; CH3OH) [32]. Tuy nhiên, để khẳng định thêm chúng tôi sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá thông qua dẫn xuất bazơ Schiff của sản phẩm (-) -gossypol với amine bất đối (R)-(-)-2-amino-1-propanol theo phương pháp của Robert D. Stipanovic và cộng sự [51].
Hình 3.10. Phản ứng tổng hợp (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol
Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy dẫn xuất bazơ Schiff của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cho một pic chính (86% diện tích các pic ở 254 nm) có thời gian lưu là 8,17 phút (Hình 3.11, Phụ lục 15). Trong khi đó, dẫn xuất (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cho một pic chính (67% tổng diện tích pic ở 254 nm) có thời gian lưu tương ứng là 4,83 phút (Hình 3.12, Phụ lục 16). Mặt khác, trên sắc ký đồ HPLC của sản phẩm (-)-gossypol, tại thời gian lưu 4,83 phút (thời gian lưu đặc trưng của (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol) chỉ thấy một pic rất nhỏ (<1%), chứng tỏ sản phẩm (-)-gossypol phân lập được chỉ lẫn một lượng rất nhỏ (+)-gossypol. Do đó, bước đầu có thể khẳng định sản phẩm (-)-gossypol phân tách được có độ tinh khiết quang học khá cao được thể hiện bằng diện tích các pic của bazơ Schiff tương ứng trên HPLC. Tương tự, trên sắc ký đồ HPLC sản phẩm tạo base Schiff của (+)-gossypol, tại thời gian lưu 8,17 phút (thời gian lưu đặc trưng của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol), chỉ thấy một pic rất nhỏ (<1%), chúng tỏ sản phẩm (+)-gossypol mà chúng tôi phân lập được chỉ lẫn một lượng rất nhỏ (-)-gossypol. Do đó, bước đầu có thể khẳng định sản phẩm (+)-gossypol phân tách được cũng có độ tinh khiết quang học khá cao. Điều này còn chứng tỏ hiệu quả của quá trình phân tách hai đồng phân diastereomer tương ứng của nó qua sắc ký cột và hơn nữa là nó đã chứng tỏ rằng không có quá trình racemic hoá của (-)-gossypol trong quá trình phân lập (trong môi trường acid khi thuỷ phân bazơ Schiff hay trong quá trình tinh chế qua sắc ký cột sillica gel).
Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol.
(-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=8,17 phút, S=86% (254 nm)
Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol.
(+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=4,83 phút, S=67% (254 nm)
Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy cả 2 đồng phân (-)-gossyol và (+)-gossyol tách được đều có độ tinh khiết quang học khá cao, tuy nhiên sản phẩm (-) -gossypol có độ tinh khiết hóa học cao hơn (chiếm 91% tổng diện tích pic), trong khi đó sản phẩm (+)-gossypol có độ tinh khiết hóa học thấp hơn (79,2%). Điều này khá phù hợp với giá trị độ quay cực của các sản phẩm này, [α]D = + 3270 với (+)-gossyol và [α]D = - 3680 đối với (-)-gossyol.
Đã có nhiều nghiên cứu phân tách các đồng phân quang học gossypol thông qua việc tạo bazơ Schiff với các amine bất đối. Đồng phân quang học (+)- và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±) gossypol có thể được phân tách khi sử dụng (-)-norepinephrine hoặc (-)-epinephrine. Tuy nhiên sản phẩm bazơ Schiff của gossypol với các amine này lại kém tan trong các dung môi hữu cơ hơn là sản phẩm bazơ Schiff của gossypol với L-phenylalaninol. Hơn nữa, có thể xảy ra quá trình racemic hóa ở các amine này khi nguyên tử cacbon bất đối xứng liền kề với nhóm aldimine trong cấu trúc của bazơ Schiff [47]. L-phenylalanine methyl ester cũng đã được Matlin A. và cộng sự sử dụng để phân tách các đồng phân quang học của gossypol. Các đồng phân diastereomer bazơ Schiff tạo thành của gossypol với amine này được phân tách bằng sắc ký cột. Tuy nhiên, hiệu suất phân tách chúng qua cột lại rất thấp (60% và 15% tương ứng với dẫn xuất bazơ Schiff của (-)-gossypol và (+)-gossypol) do sự kéo dài đuôi của dẫn xuất bazơ Schiff (-)-gossypol trong quá trình chạy cột [36]. Oliver C. L. và cộng sự, khi sử dụng L-phenylalanyl methyl ester đã tách được (-)-gossypol và (+)-gossypol với hiệu suất chỉ 30-40% [40].
Sampatk D. S. và cộng sự đã sử dụng L-phenylalaninol để phân tách đồng phân quang học gossypol. Tuy nhiên, (±)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được các tác giả phân tách bằng cách sử dụng HPLC với cột pha đảo C18 rồi thủy phân bằng HCl. Phương pháp này có hiệu quả cao, có thể thu được các đồng phân với độ tinh khiết quang học cao ([α]D: +373" (c 0.468, CHC13) và [α]D: +373" (c 0.468, CHC13) tương ứng với (+)-gossypol và (-)-gossypol) và hiệu suất khoảng 50-60% [47]. Nhưng phải sử dụng thiết bị hiện đại là HPLC nên chi phí cao và khó tiến hành ở quy mô lớn. Dựa trên kết quả của nghiên cứu trên, chúng tôi đã sử dụng L-phenylalaninol để tạo base Schiff tương ứng. (±)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine tạo thành được chúng tôi phân tách với hiệu xuất cao (95% với (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và đạt 83,9% đối với (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine) mà không sử dụng phương pháp HPLC với cột pha đảo mà chỉ bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel pha thường. Tính cả giai đoạn thủy phân các bazơ Schiff, toàn bộ quá trình phân tách này chúng tôi thu được với hiệu suât khá cao (66,7% với (+)-gossypol và 82,1% với (-)-gossypol).
3.3. Tỷ lệ (-)-gossyopol/(+)-gossypol trong một số giống bông ở Việt Nam
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, điều kiện môi trường có thể ảnh hưởng đến khối lượng hạt và hàm lượng gossypol tổng số nhưng không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa (-)-gossypol và (+)-gossypol. (-)-Gossypol đã được chứng minh là có các hoạt tính sinh học như chống ung thư, hoạt tính tránh thai nam mạnh hơn và ít tác dụng phụ hơn (+)-gossypol. Tỷ lệ giữa đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol rất đa dạng trong các giống và các loài bông khác nhau. Nhưng cho đến nay chưa có công trình nào được công bố về tỷ lệ các đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol trong các loài và giống bông của Việt Nam. Do đó, từ các sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol đã phân lập được, chúng tôi sử dụng nó với vai trò làm chất đối chiếu để sơ bộ xác định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của một số giống bông thuộc 2 loài bông được trồng phổ biến hiện nay ở Việt Nam là G. barbadense và G. hirsutum bằng phương pháp HPLC. Phương pháp này cũng đã được Stipanovic R. D. và cộng sự sử dụng để đánh giá tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của các loài bông khác nhau [52].
Nguyên tắc chung là tạo dẫn xuất của hỗn hợp (±)-gossypol trong hạt bông với amine bất đối (R)-2-amino-1-propanol để tạo thành các bazơ Schiff (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. Sau đó, các đồng phân diastereomer này được phân tích trên HPLC. Tuy nhiên, trong hạt bông còn có nhiều chất khác nữa, nên ngoài 2 pic của 2 bazơ Schiff nói trên còn có các pic khác. Từ kết quả phân tích độ tinh khiết quang học của các sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol, chúng tôi đã xác định được thời gian lưu của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và của (+)-gossypol-L-2-amino-1-propanol tương ứng là 4,83 phút và 8,17 phút. Do đó, ở cùng điều kiện chạy HPLC, căn cứ theo thời gian lưu cùng với dữ liệu phổ tử ngoại có thể xác định được vị trí pic của hai chất này trong sắc ký đồ HPLC của hạt bông.
Bên cạnh đó, chúng tôi chọn hỗn hợp (±)-gossypol của mẫu hạt bông G. barbadense HD139 ([a]D ≈ 00) làm chất đối chiếu, có tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol ≈ 50/50 để kiểm tra tỷ lệ diện tích pic tương ứng trên HPLC. Thực hiện tạo dẫn xuất bazơ Schiff với amine bất đối (R)-2-amino-1-propanol rồi phân tích bằng HPLC chúng tôi thu được 2 píc chính tương ứng với các dẫn xuất (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có thời gian lưu tương ứng là 4,82 phút và 8,13 phút và có tỷ lệ diện tích pic tương ứng lần lượt là 33,01% và 33,09% (Hình 3.13, Phụ lục 17). Như vậy có thể nhận thấy rằng tỷ lệ diện tích pic trên HPLC của các bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol tương ứng với tỷ lệ các đồng phân (+)-gossypol và (-)-gossypol trong hỗn hợp của nó. Từ kết quả này, chúng tôi có thể đánh giá tỷ lệ các đồng phân quang học (+)-gossypol và (-)-gossypol trong hạt bông thông qua việc xác định tỷ lệ diện tích pic của các bazơ Schiff tương ứng bằng HPLC.
Hình 3.13. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=4,82 phút, S=33,01%, (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=8,15 phút, S=33,09% (254 nm).
Bảng 3.3 là kết quả đánh giá tỷ lệ giữa hai đồng phân quang học (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hạt bông của 4 giống bông thuộc loài G. barbadense và 1 giống bông thuộc loài G. hirsutum bằng phương pháp HPLC.
Bảng 3.3. Tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong một số giống bông ở Việt Nam
Loài
Giống
Tỷ lệ nhân/hạt (%)
(-)-Gossypol/(+)-Gossypol
G. barbadense
HD129
63,1±1,2
51,4: 48.6
HD208
62,5 ±1,7
57,8: 42,2
HD138
58,3 ± 2,0
52,3: 47,7
HD139
62,6 ±1,5
50,3: 49,7
G. hirsutum
VN01-2
60,2 ±1,2
39,7: 60,3
Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số
Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol rất khác nhau trong các loài và các giống bông của cùng một loài. Trong số các giống bông nghiên cứu, mức độ dao động này trong khoảng từ (39,7: 60,3) đến (57,8: 42,2). Các giống thuộc loài G. barbadense có tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol đều trên 50%, giống HD208 có tỷ lệ cao nhất (57,8: 42,2) tức là hàm lượng (-)-gossypol gấp 1,4 lần so với (+)-gossypol. Trái lại, (-)-gossypol có hàm lượng thấp hơn nhiều so với (+)-gossypol (tỷ lệ 39,7 : 60,3) trong giống bông VN01-2 thuộc loài Gossypium hirsutum (Hình 3.14, Phụ lục 18, 19). Từ bảng kết quả cũng cho thấy tỷ lệ nhân hạt bông trên tổng khối lượng hạt của các giống trên cả hai loài đều xấp xỉ 60%, không có sự khác biệt lớn trong số các giống nghiên cứu thuộc 2 loài trên.
Kết quả phân tích tỉ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của 2 loài G. barbadense và G. hirsutum ở Việt Nam phù hợp với những kết quả mà một số tác giả khác đã công bố trước đây trên 2 loài này. Rober D. Stipanovic xác định (-)-gossypol trong loài G. barnadense trong khoảng 44,7-58,4%, và trong G. hirsutim là 2,6-38% [52].
Hình 3.14. Sắc ký đồ HPLC xác định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bông HD208 và VN01-2. (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=4,8 phút, (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=8,1 phút (254 nm).
3.4. Tác dụng gây độc của gossypol trên tế bào ung thư
Các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol được chúng tôi nghiên cứu tác dụng ức chế sự sinh trưởng hay gây độc trên các dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp MTT. Thử nghiệm này được chúng tôi sử dụng để đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các chất tinh khiết điều chế được, so sánh tác dụng của chúng với nhau để làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về sau. Các dòng tế bào được chúng tôi lựa chọn nghiên cứu là các dòng tế bào đại diện cho các loại ung thư phổ biến ở Việt Nam như ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (LU-1) và ung thư gan (Hep-G2). Các thử nghiệm được tiến hành song song với mẫu đối chứng không có thuốc thử và mẫu đối chứng dương vincristine ở các nồng độ từ 0,1 nM đến 500 nM sau 72 h trên 3 dòng tế bào MCF-7, LU-1 và Hep-G2 thu được các giá trị IC50 tương ứng là 80,4 nM, 93,1 nM và 5,0 nM.
3.4.1. Tác dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7
(±)-Gossypol và (-)-gossypol được thử ở các nồng độ từ 0,5 đến 30 µM, (+)-gossypol được thử tại các nồng độ từ 0,5 µM đến 60 µM trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 sau 72 h. Kết quả cho thấy (±)-gossypol và (-)-gossypol đều có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đã thử (Hình 3.15). (±)-Gossypol và (-)-gossypol có tác dụng ức chế mạnh với IC50 lần lượt là 6,2 và 4,0 µM. Ngược lại, khi các tế bào MCF-7 được xử lý với (+)-gossypol tại các nồng độ 10 và 20 µM, không quan sát thấy sự ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào sau 72 h. Giá trị IC50 của (+)-gossypol trên dòng tế bào MCF-7 sau 72 giờ là 30,2 µM. Kết quả này cho thấy (-)-gossypol có tác dụng gây độc tế bào mạnh hơn (±)-gossypol khoảng 1,5 lần và mạnh hơn (+)-gossypol khoảng 7 lần.
Hình 3.15. Tác dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên dòng tế bào MCF-7 sau 72 h
Đối chứng
(-)-Gossypol 10µM
(-)-Gossypol 20 µM
(-)-Gossypol 30µM
Hình 3.16. Tế bào MCF-7 khi không xử lý (đối chứng) và xử lý với (-)-gossypol ở các nồng độ 10 µM, 20 µM, 30 µM sau 72 h.
3.4.2. Tác dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1
Để đánh giá tác dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên khả năng sống sót của các tế bào ung thư phổi LU-1, các tế bào LU-1 được xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 đến 30 µM và với (+)-gossypol ở các nồng độ từ 0,5 đến 60 µM sau 72 h (Hình 3.17). Phép thử MTT cho thấy, (±)-gossypol, (-)-gossypol đều có tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào LU-1 phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đã thử. Ngược lại, các tế bào LU-1 lại kém nhạy cảm hơn đối với (+)-gossypol. Dưới nồng độ 20 µM, không quan sát thấy sự ức chế tăng sinh của (+)-gossypol trên dòng tế bào LU-1 sau 72 h. (±)-Gossypol và (-)-gossypol có tác dụng ức chế mạnh với IC50 lần lượt là 8,7 và 4,3 µM trong khi (+)-gossypol chỉ có tác dụng yếu trên dòng tế bào LU-1 với IC50 = 30,3 µM. Như vậy, (-)-gossypol có tác dụng gây độc trên dòng tế bào LU-1 mạnh hơn (±)-gossypol và (+)-gossypol lần lượt là khoảng 2 và 7 lần.
Hình 3.17. Tác dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên dòng tế bào LU-1 sau 72 h.
Đối chứng
(-)-Gossypol 10 µM
(-)-Gossypol 20 µM
(-)-Gossypol 30 µM
Hình 3.18. Sự phát triển của tế bào LU-1 khi không xử lý (đối chứng) và xử lý với (±)-gossypol (10 µM), (-)-gossypol (10 µM và 30 µM) sau 72 h
3.4.3. Tác dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2
(±)-Gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol cũng được thử trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 sau 72 h ở các nồng độ tương ứng từ 0,5-30 µM (đối với (±)-gossypol và (-)-gossypol ) và 0,5 đến 60 µM (đối với (+)-gossypol) thông qua phép phân tích MTT (Hình 3.19). Kết quả của chúng tôi cho thấy (±)-gossypol và (-)-gossypol có tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đã thử với các giá trị IC50 lần lượt là 8,8 µM và 4,5 µM. Trong khi đó, ở khoảng nồng độ 0,5-10 µM, chúng tôi không quan sát thấy sự ức chế của (+)-gossypol trên dòng tế bào Hep-G2 sau 72 h. Ngược lại, trong khoảng nồng độ từ 10-60 µM, tác dụng ức chế của (+)-gossypol là phụ thuộc theo liều. Giá trị IC50 của (+)-gossypol trên dòng tế bào Hep-G2 được xác định là 32,1 µM sau 72 h.
Hình 3.19. Tác dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên dòng tế bào Hep-G2 sau 72 h.
Đối chứng
(±)-gossypol 10 µM
(-)-gossypol 10 µM
(+)-gossypol 10 µM
Hình 3.20. Sự phát triển của tế bào Hep-G2 khi không xử lý (đối chứng) và xử lý với (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol tại nồng độ 10 µM sau 72 h
Nhận xét chung:
Bảng 3.4. Giá trị IC50 của (±)-, (+)- và (-)-gossypol trên các dòng tế bào ung thư người
Chất nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư
MCF-7
LU-1
Hep-G2
(±)-Gossypol
6,2 ± 1,2 µM
8,7 ± 1,3 µM
8,8 ± 1,1 µM
(-)-Gossypol
4,0 ± 0,3 µM
4,3 ± 0.9 µM
4,5 ± 0,8 µM
(+)-Gossyol
30,2 ± 1,9 µM
30,3 ± 2,7 µM
32,1 ± 3,2 µM
Vincristine
80,4 ± 3,7 nM
93,1 ± nM
5,0 ± 1,2 nM
Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số
Kết quả phân tích MTT cho thấy (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol đều có tác dụng ức chế sự phát triển của cả 3 dòng tế bào nghiên cứu là MCF-7, LU-1 và Hep-G2. Trong đó với giá trị IC50 > 30 µM, (+)-gossyol được xem như có tác dụng ức chế yếu 3 dòng tế bào ung thư đã thử in vitro. (-)-Gossypol ức chế manh nhất sự phát triển của cả 3 dòng tế bào nghiên cứu, tác dụng này gấp từ 1,5 đến 2 lần so với (±)-gossypol và gấp từ 7-7,5 lần so với (+)-gossypol.
Trên thế giới, tác dụng chống ung thư của gossypol đã được chứng minh trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau cả in vitro và in vivo. Trên dòng MCF-7, IC50 của (±)-gossypol trong khoảng 3,4-24 µM [7, 24, 66]. Trên một dòng tế bào ung thư vú khác là T47-D, Benz và cộng sự đã cho thấy IC50 của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol lần lượt là 5,3; 3,1 và 20 µM. Như vậy (-)-gossypol có tác dụng ức chế gấp khoảng 1,7 lần và 6,6 lần so với (±)-gossypol và (-)-gossypol. Chưa thấy công trình nghiên cứu nào công bố về tác dụng của gossypol và các đồng phân quang học của nó trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. Tuy nhiên, trên dòng tế bào ung thư phổi H69, Shelley và cộng sự cho thấy (-)-gossypol có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào gấp 1,5 lần so với (±)-gossypol và 2,5 lần so với (+)-gossypol [50]. Như vậy, tác dụng gây độc trên các dòng tế bào ung thư vú và phổi của các sản phẩm gossypol mà chúng tôi phân lập được khá phù hợp với các công bố trước đây trên thế giới. Trên dòng tế bào ung thư gan, chúng tôi không tìm thấy tài liệu nào công bố về tác dụng của gossypol trên loại tế bào ung thư này.
Với kết quả này, chúng tôi cho rằng, (-)-gossypol có thể là một đối tượng đáng được nghiên cứu kỹ hơn để phát triển thành thuốc chữa ung thư ở Việt Nam.
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau trong quá trình thực hiện luận văn:
Đã nghiên cứu thành công quy trình chiết xuất và tinh chế gossypol từ hạt bông Gossypol barbadense L., quy trình đơn giản, sử dụng ít dung môi, sản phẩm có độ tinh khiết cao (>98%), đạt hiệu suất 0,32% trên giống HD139 và HD208, 0,28% trên giống HD108.
Đã tách thành công đồng phân quang học (-)-gossypol và (+)-gossypol thông qua tạo bazơ Schiff của (±)-gossypol với L-phenylalaninol và sử dụng sắc ký cột. Sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol có độ tinh khiết cao, hiệu suất phân tách tương ứng là 82,1% và 66,7%.
Đánh giá được tỷ lệ đồng phân (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bông của 4 giống bông thuộc loài G. barbadense L. và 1 giống bông thuộc loài G. hirsutum bằng phương pháp HPLC, trong đó HD208 là giống có tỷ lệ đồng phân (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt là cao nhất (57,8: 42,2), và VN01-2 là giống có tỷ lệ này là thấp nhất (39,7 : 60,3).
Đã tiến hành thử độc tính tế bào bằng phương pháp MTT (MTT assay) của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên 3 dòng tế bào ung thư người. Trong đó, đồng phân (-)-gossypol có tác dụng độc tế bào mạnh nhất trên cả 3 dòng tế bào ung thư là ung thư vú (MCF-7, IC50 = 4,0 mM), ung thư phổi (LU-1, IC50 = 4,3 mM) và ung thư gan (Hep-G2, IC50 = 4,5 mM).
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu quy trình tách (-)-gossypol-L-phenylalalinol dienamine từ hỗn hợp (±)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và tinh chế (-)-gossypol sau quá trình thủy phân base Schiff tương ứng bằng phương pháp kết tinh.
2. Nghiên cứu sử dụng đồng phân (+)-gossypol bằng cách racemic hóa các dẫn xuất của nó.
3. Nghiên cứu tác dụng phối hợp của (-)-gossypol với một số thuốc hóa trị liệu đang được sử dụng trên lâm sàng hiện nay.
4. Nghiên cứu cơ chế tác dụng sinh học của (-)-gossypol
5. Nghiên cứu tác dung chống ung thư của (-)-gossypol in vivo, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội
Nguyễn Bá Đức (2003), Hóa chất điều trị bệnh ung thư. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Nguyễn Đăng Quân, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2002), “Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của hoạt chất gossypol và plumbagin trên dòng tế bào ung thư bằng một số phương pháp thử nghiệm”, Tạp Chí Sinh Học, 24 (4), tr. 43-47.
Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1. Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
TIẾNG ANH
Adams M. J., Cory S. (2007), “Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential”, Curr. Opin. Immunol., 19, pp. 448-496.
Band V., Hoffer A. P., Band H., Rhinehardt A. E., Knapp R. C., Matlin S. A., Anderson D. J. (1989), “Antiproliferative effect of gossypol and its optical isomers on human reproductive cancer cell lines”. Gynec. Oncol., 32, pp. 273–277.
Benz C.C, Keniry M.A., Ford J. M, Townsend A. J., Cox S. W, Palayoor S., Matlin S. A., Hait W.N (1990), “Biochemical corrlerates of anti tumor and antimitochrondrial properties of gossypol enantiomer”, Mol. Pharmacol., 37, pp. 840- 847.
Brycki B., Brzezinski B., Marciniak B., and Paszyc S. (1991), “1H and 13C NMR Studies of Tetrabutylammonium Salts of Gossypol in Chloroform Solution”, Spectrosc. Lett., 24, pp. 509–518 (1991).
Carruth, F. E. (1918), “Contribution to the Chemistry of Gossypol, the Toxic Principle of Cottonseed”, JAOCS, 40, pp. 647-663.
Cass B. Q., Bassi L. A., Matlin A. S. (1999), “First direct resolution of gossypol enantiomers on a chiral high-performance liquid chromatography phase”, Chirality, 11, pp. 46-49.
Cass B. Q., Tiritan E., Matlin A. S. Preire C. E. (1991), “Gossypol enantiomer Ratios in cotton seeds", Phytochem., 30 (8), pp. 2655-2657.
Cass B. Q, Oliveira V. R., De Pietro C. A. (2004), “Determination of gossypol enantiomer ratio in cotton plants by chiral highperformance liquid chromatography”, J. Agric. Food Chem., 52, pp. 5822-5827.
Chang J. S., Hsu Y. L., Kuo P. L., Chiang L. C., and Lin C. C. (2004). “Upregulation of Fas/Fas ligand-mediated apoptosis by gossypol in an immortalized human alveolar lung cancer cell line”, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 31, 716–722.
Coutinho E. M. (2002), “Gossypol: A contraceptive for men”, Contraception, 65, pp. 259-263.
Dowd K. M. (2003), “Preparation of Enantiomeric Gossypol by Crystallization”, Chirality, 15, pp. 486-493.
Dowd K. M., Pelitire M. S. (2001), “Recovery of G-AA from cottonseed soapstock”, Ind. Crops Prod., 14, pp. 113–123.
Ergun A. M., Konac E., Erbas D., Ekmekci A. (2004), “Apoptosis and nitric oxide release induced by thalidomide, gossypol and dexamethasone in cultured human chronic myelogenous leukemic K-562 cells”, Cell Biol. Internat., 28, pp. 237-242.
Fan X. H., Wang X., Chen F., Galler D. P., Wan P. J. (2008), “Engine performance test of cottonseed oil biodiesel”, Open Energy Fuels J. , 1, pp. 40-45.
Flack M. R. , Pyle R. G. , Mullen N. M. , Lorenzo B., Wu Y. W. , Knazek R. A., Nisula B. C. , Reidenberg M. M.(1993), “Oral gossypol in the treatment of metastatic adrenal cancer”. J. Clin. Endocrinol. Metab.,, 76(4), pp. 1019-1024.
Gerez de Burgos N. M., Burgos C., Montamat E. E., Rovai L. E., and Blanco, A. (1984), “Inhibition by gossypol of oxidoreductases from Trypanosoma cruzi”. Biochem. Pharmacol., 33, pp. 955–959.
Guangfeng Jia Yonghua Zhan , Daocheng Wu, Yang Meng, Liang Xu (2009), “An Improved Ultrasound-Assisted Extraction Process of G-AA From Cottonseed Soapstock”, AIChE Journal, 55 (3), pp. 797-806.
Hron R. J. ,Kim L. H., Calhoun C. M., Fisher S. G. (1999), “Determination of (+)- (-)- and Total Gossypol in Cottonseed by High-Performance Liquid Chromatography”, JAOCS, 76 (11), pp. 1351-1355.
Hron R. J., Koltun P. S., Pominski J., Abraham G. (1987), “The Potential Commercial Aspects of Gossypol”, JAOCS, 64 (9), pp. 1315-1319.
Jaroszewski J. W., Kaplan O., Cohen J. S. (1990) “Action of gossypol and rhodamine 123 on wild type and mutidrug-resistant MCF-7 human cancer cell: 31P nuclear magneic resonance and toxicity studies”, Cancer Res., 50, pp. 6936-6943.
Jaroszewski J. W., Strom-Hansen T., Hansen L. L. (1992), “Optical Stability of Gossypol”, Chirality, 4, pp. 216-221.
Jiang H., Cao X., Huang H., Jiang B. (2007), “An expedient route for the practical preparation of optically active (-)-gossypol”, Asymmetry, 18, pp. 2437-2441.
Kenar A. J. (2006), “Reaction Chemistry of Gossypol and Its Derivatives”, JAOCS, 83 (4), pp. 269-302.
Laughton M. J., Halliwell B., Evans P. J., and Hoult, J. R. (1989), “Antioxidant and prooxidant actions of the plant phenolics quercetin, gossypol and myricetin. Effects on lipid peroxidation, hydroxyl radical generation and bleomycin-dependent damage to DNA”. Biochem. Pharmacol., 38, pp. 2859–2865.
Le Blanc M., Russo J., Kudelka A. P., Smith, J. A. (2002), “An in vitro study of inhibitory activity of gossypol, a cottonseed extract, in human carcinoma cell lines”, Pharmacol Res, 46, 551-555.
Li A., Bandy B., Tsang S. S., Davison A. J. (2000), “DNA-breaking versus DNA-protecting activity of four phenolic compounds in vitro”. Free Rad., 33, pp. 551-566.
Li Z. M., Jiang W. Q., Zhu Z. Y., Zhu X. F., Zhou J. M., Liu Z. C., Yang D. J., Guang Z. Z. (2008), “Synergistic cytotoxicity of Bcl-xL inhibitor, gossypol and chemotherapeutic gents in non-Hodgkin’s lymphoma cells”, Cancer Biol. Ther., 7, pp. 51-60.
Ligueros M., Jeoung D., Tang B., Hochhauser D., Reidenberg M. M., Sonenberg, M. (1997), "Gossypol inhibition of mitosis, cyclin D1 and Rb protein in human mammary ancer cells and cyclin-D1 transfected human fibrosarcoma cells”, Br. J. Cancer, 76, pp. 21-28.
Lin T. S., Schinazi R., Griffith B. P., August E. M., Eriksson B. F. H., Zheng D. K., Huang L., Prusoff, W. H. (1989), “Selective inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by the (-) but not the (+) enantiomer of gossypol”, Antimicrob. Agents Chemother., 33, pp. 2149-2151.
Macoska A. J., Adsule S., Tantivejkul K., Tantivejkul K., Wang S., Pienta J. K., Lee T. C. (2008), “(−)-Gossypol promotes the apoptosis of bladder cancer cells in vitro”, Pharmacol Res., 58, pp. 323-331.
Marzo I., Naval J. (2008), “Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy”, Biochem. Pharmacol. , 76, pp. 939-946.
Matlin S. A. and Belenguer A., Tyson R. G. and Brookes A. N.(1987), “Resolution of Gossypol: Analytical and Large-Scale Preparative HPLC on Non-Chiral Phases, Journal of High Resolution Chromatography & Chromatography”, Communications, 10, pp. 86-91.
Meng Y., Tang W., Dai Y., Wu X., Liu M., Ji Q., Ji M., Pienta K., Lawrence T., Xu L. (2008) “Natural BH3 mimetic (-)-gossypol chemosensitizes human prostate cancer via Bcl-xL inhibition accompanied by increase of Puma and Noxa”. Mol. Cancer Ther., 7, pp. 2192-2202.
Moon D. O., Kim M. O., Lee J. D., Kim G. Y. (2008), “Gossypol suppresses NF-kappaB activity and NF-kappaB-related gene expression in human leukemia U937 cells”. Cancer Lett. 264, pp.192-200.
Nguyen Kim Phi Phung, Nguyen Ngoc Suong, Pham Dinh Hung, Huynh Huu Tri (1997), “Isolation and purification of gossypol in cotton seeds of Viet Nam”, Tạp Chí Hoá Học, 35 (2), pp. 91-93.
Oliver C. L., Bauer, J. A., Wolter K. G., Ubell M. L., Narayan A., O’Connell K. M., Fisher S. G., Wang S., Wu X., Ji M., Carey T. E., Bradford C. R. (2004), “In vitro effects of the BH3 mimetic, (-)-gossypol, on head and neck squamous cell carcinoma cells”. Clin. Cancer Res., 10, pp. 7757-7763.
Oliver C. L., Miranda M. B., Shangary S., Land S., Wang S., Johnson D. E. (2005), “(-)-Gossypol acts directly on the mitochondria to overcome Bcl-2- and Bcl-X(L)-mediated apoptosis resistance”. Mol. Cancer Ther., 4, pp. 23-31.
Percy G. R., Calhoun, Kim L. H. (1996), “Seed gossypol variation within Gossypium barbadense L. Cotton”, Crop Science, 36, pp. 193-197.
Pitot H, Saleh M., Holmlund J., Maleski J., Forero A. (2007), “Extended phase I trial of the oral pan-Bcl-2 inhibitor AT-101 by multiple dosing scheldules in patients with advanced cancers”, Proc. Am. Sco. Clin. Oncol., 25 (18S), pp. 3583.
Razakantoanina V., Nguyen Kim P. P., Jaureguiberry G. (2000). Antimalarial activity of new gossypol derivatives. Parasitol. Res., 86, pp. 665-668.
Royer R. E., Deck L. M., Campos N. M., Hunsaker L. A., Vander Jagt D. L. (1986), “Biologically active derivatives of gossypol: Synthesis and antimalarial activities of periacylated gossylic nitriles”, J. Med. Chem., 29, pp. 1799-1801.
Ruddon W. R. (2007), Cancer biology, Oxford university press., New York.
Sampatk D. S., Balaram P. A. (1986) “Rapid Procedure for the Resolution of Racemic Gossypol”, J. Chem. Soc. Chem. Commun, pp. 649-650.
Scudiero D. A., Shoemaker R. H., Kenneth D. P., Monks A., Tierney S., Nofziger T. H., Currens M. J., Seniff D., Boyd M. R. (1988), “Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines”, Cancer Res., 48, pp. 4827-4833.
Shandilya L. N., Clarkson T. B. (1982), “Hypolipidemic effects of gossypol in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis)”, Lipids, 17, pp. 285-290.
Shelley M. D., Hartley L., Fish R. G., Groundwater P., Morgan J. J. G., Mort D., Mason M., Evans A. (1999),”Stereo-specific cytotoxic effect of gossypol enantiomers and gossypolone in tumour cell lines”, Cancer Lett.,135, pp. 56
Shelley M. D., Hartley L., Groundwater P. W., Fish R. G. (2000). “Structure-activity studies on gossypol in tumor cell lines”. Anticancer Drugs, 11, pp. 209-216.
Stipanovic D. R., Puckhaber S. L., Bell A. A., Percival E. A., Jacobs J. (2005), “Occurrance of (+) and (-) gossypol in wild species of cotton and in Gossypium hirsutum Var. marie-galante (Watt) Hutchinson”, J. Agric. Food Chem., 53 (16), pp. 6266-6271.
Tuszynski P. G., Cossu G.(1984), “Differential Cytotoxic Effect of Gossypol on Human Melanoma, Colon Carcinoma, and Other Tissue Culture Cell Lines”, Cancer Res., 44, pp. 768-771.
Ueno H., Sahni M. K., Segal S. J., Koide S. S. (1988), “Interaction of gossypol with sperm acromolecules and enzymes”. Contraception, 37, pp.333-341.
Vadehra D. V., Kalla N. R., Saxena, M., Hashia R., Kaur P., Gupta L. K. (1985), “Antimicrobial activity of G-AA”, IRCS Med. Sci. ,13, pp. 10-11.
Van Poznak C., Seidman A. D., Reidenberg M. M., Moasser M. M., Sklarin N., Van Zee K., Borgen P., Gollub M., Bacotti D., Yao T. J., Bloch R., Ligueros M., et al. (2001), “Oral gossypol in the treatment of patients with refractory metastatic breast cancer: A phase I/II clinical trial” Breast Cancer Res. Treat., 66, pp. 239-248.
Vander Jagt D. L., Deck L. M., Royer R. E. (2000), “Gossypol: Prototype of inhibitors targeted to dinucleotide folds”. Curr. Med. Chem., 7, pp. 479-498.
Vogler M., Dinsdale D., Dyer M. J. S., Cohen J. M., (2009), “Bcl-2 inhibitors: small molecules with a big impact on cancer therapy”, Cell Death and Differ., 16, pp. 360-367.
Wang G., Nikolovska-Coleska Z., Yang C. Y., Wang R., Tang G., Guo J., Shangary S., Qiu S., Gao W., Yang D., Meagher J., Stuckey J., Krajewski K., Jiang S., Roller P. P., Abaan H. O., Tomita Y., Wang S. (2006), “Structure-Based Design of Potent Small-Molecule Inhibitors of Anti-Apoptotic Bcl-2 Proteins”, J. Med. Chem., 49 (21), pp. 6139-6142.
Wang N. G., Zhou L. F., Guan, M. H., Lei H. P. (1987), “Effect of (-)- and (+)-gossypol on fertility in male rats”, J. Ethnopharmacol., 20, pp. 21-24. 63
Wang X., Beckham T., Morris J., Chen F., Gangemi D. (2008), “Bioactivities of gossypol, 6-methoxy gossypol and 6, 60-dimethoxy gossypol”, J. Agric. Food Chem., 56, pp. 4393-4398.
Whaley K. J., Sampath D. S., Balaram P. A. (1984), “Circular dichroism study of (þ) gossypol binding to proteins”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 121, pp. 953-959.
Xu L. Y., Wang S., Tang W., Liu, M., Davis M., Chen J., Rae J. M., Lawrence, T., Lippman M.E (2005), “(-)-Gossypol enhances response to radiation therapy and results in tumor regression of human prostate cancer”. Mol. Cancer Ther., 4, pp. 197-205.
Zhang H. P., Wang X., Chen F., Androulakis X. M.,Wargovich M. J. (2007), “Anticancer activity of limonoid from Khaya senegalensis”, Phytother. Res., 21, pp. 731-734.
Zhang M., Liu H., Tian Z., Griffith N. B., Ji M., Li Q. Q. (2007), “Gossypol induces apoptosis in human PC-3 prostate cancer cells by modulating caspase-dependent and caspase-independent cell death pathways”, Life Sciences, 80, pp. 767-774.
Zhang M., Liu H., Tian Z., Huang J., Remo M., Li Q. Q. (2007), “Differential growth inhibition and induction of apoptosis by gossypol between HCT116 and HCT116/Bax (-/-) colorectal cancer cells”, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. ,34, pp. 230-237.
Zhang M., Liu H., Guo R., Ling Y., Wu X., Li B., Roller P. P., Wang S., Yang D. (2003), “Molecular mechanism of gossypol-induced cell growth inhibition and cell death of HT-29 human colon carcinoma cells”, Biochem. Pharmacol. , 66, pp. 93-103.
WEBSITES
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- khoa.doc