Đề tài Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro cây Dầu mè (Jatropha curcas L.) bằng sự phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá nuôi cấy trong ống nghiệm

r sử dụng. Do đó, để hạn chế những ảnh hưởng đến mô cấy do agar không tinh, có thể mua các loại agar tinh, sạch. Có một số công thức môi trường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5 (Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy Ánh sáng Mẫu cấy ở trên môi trường chứa một nguồn năng lượng sẵn có là đường, được sử dụng ít hay nhiều là tùy khả năng quang hợp của cây. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan trọng tạo hình cây nuôi cấy in vitro. Ánh sáng đỏ và xanh của quang phổ khả kiến ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000 lux. Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường độ ánh sáng tăng khoảng từ 3000 đến 10000 lux. Phần lớn các phòng nuôi cấy có thời gian chiếu sáng từ 16-18 giờ/ngày. Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy in vitro. Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại cây trồng trong khoảng 20-25oC vì một số loài cây cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình. Thực tế này cần tôn trọng, bởi vì nhiệt độ thật của các mô trong bình nuôi có thể cao hơn từ 2-4oC đối với nhiệt độ của phòng nuôi cấy. Thông thường, người ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy thấp hơn 2oC đối với nhiệt độ mà người ta muốn cho mô. Các loại cây sống ở khí hậu ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà người ta sẽ có lợi hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 20oC ± 1oC dành cho cây ôn đới và nhiệt độ 25oC ± 1oC dành cho cây nhiệt đới. Một số chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy Có thể nói, khó khăn lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy mô là phải tạo được thể nhân giống in vitro vô trùng. Có nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy. Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số loài thực vật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùng thông thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Để tăng hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng, ngoài ra có thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng 3-5 lần. Một số chất khử trùng thường được sử dụng như: Chlorur thủy ngân (HgCl2): đây là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0.01-0.05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cẩn thận khi tiếp xúc. Sodium hypochlorite (NaOC)l: có trong các dung dịch tẩy trắng 5-20%. Thời gian khử trùng từ 5-30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3-5 lần. Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mô về sau. Calcium hypochlorite (Ca(OCl)2): nồng độ khoảng 5-10%, xử lý mô cấy từ 5-30 phút. Ethyl hay isopropyl alcohol 70%: thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 - 5 phút. Nước oxy già (H2O2): là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở nồng độ 3 - 10% trong 1 - 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc đối với mô thực vật, do đó phải rửa thật sạch. Khí Clo (Cl2): thường sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô. Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mô thực vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất này. Chất kháng sinh (Gentamicine và Ampicilline): những kháng sinh này có tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy. Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán của viện Plant Cell Technology (Washinngton DC) và được quảng cáo là: “ có khả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuôi cấy mô thực vật ”. Cũng đã có những thử nghiệm và khẳng định công dụng diệt trùng của chất này nhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật. Một số vấn đề trong nuôi cấy in vitro Tính bất định về mặt di truyền Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng. Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại. Việc nuôi cấy mô sẹo hay tế bào đơn thường tần số biến dị thường cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số biến dị xảy ra còn phụ thuộc các yếu tố: Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy; Loại mô cấy; Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ xuất hiện cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyền ít và thời gian cấy chuyền giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị. Sự nhiễm mẫu Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật. Có thể giảm khả năng nhiễm bằng cách: Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh; Sử dụng các loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin, Vacomicin hoặc Penicillin với nồng độ phụ thuộc vật liệu nuôi cấy. Sự hóa thủy tinh thể Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi chuyển cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài. Nguyên nhân là do cây in vitro có lớp sáp ở bên ngoài biểu bì mỏng, tế bào chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận các phân tử nước, về cấu tạo khí khổng của cây thường có hình tròn thay vì hình ellip như cây trong tự nhiên, khí khổng mở suốt trong quá trình nuôi cấy và mật độ khí khổng cao. Ngoài ra nhu mô thịt lá và lớp mô bảo vệ mặt ngoài của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc, diệp lục ít so với các cây bình thường nên khi đưa cây ra môi trường ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác, cây không thể thích nghi dẫn đến bị stress và chết. Có một số phương pháp hạn chế quá trình hóa thủy tinh thể như sau: Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao. Tuy nhiên, điều này có thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sự hình thành chồi. Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất. Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy in vitro Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn,) mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền. Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích nhỏ. Tạo cây có khả năng ra hoa, quả sớm. Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gene. Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần khắc phục: Giá thành cây con được sản xuất bằng kỹ thuận vi nhân giống còn khá cao. Tến trình nhân giống còn phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm nhất trong việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống vào sản xuất thương mại là giá thành sản phẩm tạo ra còn quá cao. Theo Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính của vấn đề là sự thất thoát do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của cây trong giai đoạn chuyển ra vườn ươm, giá nhân công lao động chiếm 60 - 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình nuôi cấy,) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,) còn khá cao. Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khi còn làm tăng tính bất thường về di truyền của tế bào. Tuy nhiên, hạn chế nghiên trọng nhất trong kỹ thuật vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây con sau khi chuyển ra vườn ươm thường rất thấp do sự khác biệt lớn giữa điều kiện môi trường in vitro và ex vitro. Hình 2.1. Cây Dầu mè Giới thiệu cây Dầu mè Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Embryophyta Lớp: Spermatopsida Bộ: Malpighiales Họ: Euphorbiaceae Chi: Jatropha Loài: J.curcas Hình 2.2. Thân, lá và quả cây Dầu mè Nguồn gốc Cây Dầu mè (Jatropha curcas L.) thuộc chi Dầu mè (Jatropha), họ Thầu dầu. Chi Jatropha có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ghép từ hai chữ Jatrós (bác sĩ) và trophé (thức ăn), ám chỉ công dụng làm thuốc của cây này. Curcas là tên gọi thông thường của cây Physic nut ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông dụng ở các nước hiện nay là Jatropha, ở Việt Nam gọi là cây Cọc giậu, Dầu mè, Cây li, Dầu mè,... . Jatropha là một loài cây có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, được người Bồ Đào Nha đưa qua Cape Verde, rồi lan truyền sang châu Phi, châu Á, sau đó được trồng ở nhiều nước, trở thành cây bản địa ở khắp các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới trên toàn thế giới. Từ năm 1991, Giáo sư người Đức là Klause Becker của Trường Đại học Stuttgart đã nhận đơn đặt hàng của Tập đoàn Daimler Chrysler hợp tác với hãng tư vấn của Áo tiến hành nghiên cứu cây Jatropha ở Nicaragua để làm nguyên liệu sản xuất diesel sinh học, từ đó dấy lên cơn sốt Jatropha trên phạm vi toàn cầu. Hiện nay nhiều nước trên thế giới đang chạy đua phát triển cây này, nhất là các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaixia, Indonexia, Philippin, Mianma và nhiều nước Châu Phi, nhằm phục vụ nhu cầu năng lượng tại chỗ và xuất khẩu. Đặc điểm cây Dầu mè Cây Dầu mè là một cây nhỏ cao 1 – 5m, có dạng thân bụi sống lưu niên ra hoa quanh năm, cành to mẫm, nhẵn, trên có những vầu nổi lên do sẹo của lá, khi bị khứa sẽ chảy ra một thứ nhựa mủ trắng. Lá đơn, xẻ chân vịt, chia làm 3 – 5 thùy nông, dài 10 – 13cm, rộng 8- 11cm. Hoa màu vàng, nhỏ, cùng gốc, mọc thành chùy tận cùng hay ở nách lá, hoa đực mọc ở đầu các nhánh với cuống ngắn có khủy, hoa cái mọc ở giữa nhánh, với những cuống không có khủy. Quả nang hình trứng, đen nhạt hay đỏ nhạt, lúc đầu mẫm sau thành khô, dai nhẵn, mở theo ba mép ( Đỗ Tất Lợi, 2004 ) Thân mọng nước rất khó cháy nên không gây cháy rừng, mà còn có thể làm hàng rào ngăn lửa. Trâu, bò, gia súc, chuột sợ mùi cây nên ít bị chúng phá. Cây Dầu mè ít bị sâu bệnh, chịu hạn (nếu hạn hán 8, 9 tháng nó vẫn không bị chết), thích hợp với đất cát nhưng cũng có thể mọc ở nhiều loại đất khác, kể cả đất sỏi đá và nhiễm mặn. Có thể trồng bằng hạt hay bằng hom cành. Hiện nay, trồng cây này dùng rất ít phân bón. Cây lớn nhanh, sau 1 năm có thể cho quả, đến 5 năm cho năng xuất cao và sống tới 50-60 năm. Cây có thể sinh trưởng và phát triển ở nơi có độ cao 0 - 500m so với mặt biển, trên các vùng đất xấu, khô hạn. Hình 2.3. Quả và hạt Dầu mè Điều kiện sinh thái: Trồng ở khu vực có khí hậu nóng. Cây chịu được sương giá nhẹ. Nhiệt độ chênh lệch trung bình hàng năm từ 20-28oC. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 200 – 300 mm trở lên. Trời lạnh sẽ làm rụng lá cây. Cây cũng có khả năng chịu được sương mù nhẹ nhưng chỉ trong thời gian ngắn. Cây càng già càng có khả năng kháng cự tốt. Sương mù sẽ làm chết cây non. Dễ bén rễ, phát triển tương đối nhanh, cũng có khả năng chịu rét vừa phải. Giàu nitơ, thức ăn chính là phân bón hữu cơ. Cây thích ứng trên mọi loại đất và không cần chăm bón nhiều. Cây phát triển tốt trong đất khô chứa cacbonic và thích ứng tốt với các loại đất khó trồng có hàm lượng dinh dưỡng thấp. Đất trồng tốt nhất phù hợp cho cây là đất cát khô. Cây sống được trong đất nghèo dinh dưỡng và phát triển trong điều kiện có muối. Những người quan tâm đến cây Dầu mè đều khuyên nên sử dụng phân bón hữu cơ để tăng sản lượng. Giá trị của cây Dầu mè Jatropha vốn dĩ là một cây dại, bán hoang dại mà người dân các nước trồng chỉ để làm bờ rào và làm thuốc, nhưng với những phát hiện mới của khoa học, đã cho thấy Jatropha có tiềm lực giá trị vô cùng to lớn, được đánh giá rất cao, Jatropha vẫn là một loại cây hết sức quý giá mà loài người phải quan tâm khai thác tốt những giá trị sinh học của cây này. Về kinh tế, xã hội  Phát hiện quan trọng nhất từ Jatropha là lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất dầu diesel sinh học. Hạt Jatropha có hàm lượng dầu trên 30%, từ hạt ép ra dầu thô, từ dầu thô tinh luyện được diesel sinh học và glyxerin. Mặc dầu diesel sinh học được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: cải dầu, hướng dương, đậu tương, dầu cọ, mỡ động vật, nhưng sản xuất từ Jatropha vẫn có giá thành rẻ nhất, chất lượng tốt, tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống. Nếu 1 ha Jatropha đạt năng suất 8-10 tấn hạt/hecta/năm có thể sản xuất được 3 tấn diesel sinh học. Loại dầu này sẽ thay thế được 1 phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu được lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính, là loại dầu cháy hết và không có lưu huỳnh, là dầu sạch, thân thiện với môi trường. Hạt Jatropha sau khi ép dầu, 30% là sản phẩm dầu, 70% là khô dầu, có hàm lượng protein khoảng 30%, dùng làm phân hữu cơ, nếu khử hết độc tố có thể làm thức ăn gia súc cao đạm. Một hecta Jatropha, giả thiết đạt 10 tấn hạt/hecta/năm sẽ thu được các loại sản phẩm chủ yếu có giá trị cao như sau: Dầu diesel sinh học: 3 tấn x 700 USD/tấn = 2.100 USD Bã khô dầu: 7 tấn x 300 USD/tấn = 2.100 USD Như vậy 1 hecta Jatropha tạo ra giá trị khoảng 4.200 USD/năm (hơn 60 triệu đồng/hecta/năm), lợi nhuận thu được sẽ phân phối cho nông dân sản xuất nguyên liệu và nhà đầu tư công nghiệp chế biến dầu. Jatropha còn tạo ra hiệu ứng xã hội cực kỳ to lớn. Do trồng ở các vùng miền núi nghèo túng, cây Jatropha sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập khả quan cho đồng bào các dân tộc, trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chưa tìm kiếm được bất cứ cây gì khả dĩ trồng được trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trường ổn định. Về môi trường Jatropha là cây lâu năm, phủ đất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển được ở hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, không cháy, gia súc không ăn. Bởi vậy cây Jatropha trồng trên các vùng đất dốc sẽ được coi là cây “lấp đầy” lỗ hổng sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực bì dày đặc chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì của đất. Không những vậy, Jatropha còn có thể trồng ở các vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần phục hồi hệ sinh thái các vùng này. Vì vậy, cây Jatropha được đánh giá là “vệ sĩ sinh thái”, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trường. Bã sau khi ép dầu làm phân hữu cơ và thức ăn chăn nuôi Sau khi ép dầu, bã khô dầu có hàm lượng 4.14-4.78% N, 0.5-0.66% P2O5, 0.60-0.65% CaO, 0.17-0.21% MgO được sử dụng làm phân hữu cơ rất tốt để bón cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp sạch, vừa góp phần sản xuất sản phẩm sạch, vừa nâng cao độ phì của đất. Trong thành phần hạt Jatropha có độc tố curcin, có thể gây tử vong cho người và gây hại cho vật nuôi. Phân tích 2 giống được sử dụng trong vườn giống của Trường Đại học Thành Tây, hàm lượng dinh dưỡng trong bã khô dầu: protein đạt 25,87-29,91%, xơ đạt 21,41-29,77%, tro đạt 4,86-5,11%, chất béo đạt 28,61-31,67%, sắt đạt 177,89-177,94 mg/kg và nhiều chất khoáng khác. Nếu khử hết độc tố thì bã khô dầu Jatropha trở thành một loại thức ăn giàu đạm cho các loài gia súc, gia cầm, tạo ra nguồn thức ăn chăn nuôi quý, góp phần giải quyết nhu cầu thức ăn công nghiệp sẽ thiếu hụt trầm trọng đối với ngành chăn nuôi nước nhà trong tương lai gần. Để làm thuốc  Trong thành phần cây Jatropha đã chiết xuất được những hợp chất chủ yếu như terpen, flavon, coumarin, lipid, sterol và alkaloid. Nhiều bộ phận của cây này có thể chữa bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu của hạt có thể nhuận tràng; dịch nhựa trắng tiết ra từ vết thương của cành có thể trị viêm lợi, làm lành vết thương, chữa trị bệnh trĩ và mụn cơm; nước sắc từ lá dùng để chữa trị bệnh phong thấp, đau răng Trong cây Jatropha có nhiều thành phần độc tố, nhất là phytotoxin (curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể tạo ra hợp chất mới về nguồn dược, từ đó độc tố thực vật có thể trở thành một loại tài nguyên về nguồn dược liệu mới. Tình hình phát triển cây Dầu mè ở Việt Nam Ở Việt Nam, cây Dầu mè được du nhập từ rất lâu và có mặt ở hầu hết các tỉnh như Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Khánh Hòa, thường được trồng tại các đình chùa, miếu mạo, bờ rào quanh nhà, ven đường và được dùng làm thuốc Nam. Hiện nay, đang được trồng thử nghiệm tại Sóc Sơn, Sơn La, Quảng Trị, Bình Phước, Ninh Thuận, kết quả cho thấy cây Dầu mè thích hợp với điều kiện đất đai, khí hậu nhiệt đới, sinh trưởng nhanh và có thể cho quả trong từ khoảng 6 tháng đến 1 năm sau khi trồng. Phân Viện Hóa hợp chất tự nhiên tại TPHCM đã có bộ sưu tầm hơn 10 giống từ trong nước và 10 giống có nguồn gốc từ Brasil, Senegal, Mali, Ấn Độ, Campuchia, Lào. Năm 2006, tiến sĩ Thái Xuân Du, Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới đã chiết xuất thành công dầu diesel từ hạt Dầu mè (tỷ lệ dầu tới 32-37%) Năm 2007, Trung tâm Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đã tiến hành nghiên cứu gây trồng phát triển cây Dầu mè (Jatropha curcas). Trung tâm đã thu thập được 8 xuất xứ hạt Dầu mè và tuyển chọn được 29 cây trội với các đặc tính vượt trội về sinh trưởng, năng suất hạt (2,8-5,0 kg) và hàm lượng dầu trong hạt (25-39%). Trong khuôn khổ thực hiện đề tài và hợp tác nghiên cứu xây dựng các mô hình gây trồng thử nghiệm cây Dầu mè với Công ty Green Energy Vietnam, đề tài đã thiết lập được vườn tập hợp giống cây trội, xuất xứ, các mô hình thí nghiệm và thử nghiệm gây trồng, khảo nghiệm xuất xứ tại Đại Lải, Phú Thọ, Bình Thuận, Ninh Thuận, Bình Định, Đăk Lăc, Thừa Thiên Huế và Quảng Trị vởi tổng số diện tích là 38 hecta. Sự hợp tác nghiên cứu cũng đã đưa ra được hướng dẫn kỹ thuật về cắt tỉa cành tạo tán làm tăng năng xuất tới 15%. Năm 2008, tỉnh Ninh Thuận đã chấp thuận cho Công ty Năng lượng Xanh tiến hành trồng 100 hecta cây Dầu mè trên vùng đất hoang mạc ở huyện Ninh Phước, Ninh Sơn và Bác Ái với các giống năng suất cao nhập từ Ấn Độ, Thái Lan. Phấn đấu đến năm 2025 phát triển 50.000 hecta trên vùng hoang mạc và gò đồi. Tại tỉnh Kon Tum, Công ty cổ phần Sài Gòn-Măng Đen đã lập dự án trồng 5.000 hecta cây Jatropha. Cuối năm 2007, công ty này đã thành lập Công ty Vinasinh và lập Nông trường Đăk Nên. Trước mắt Công ty đã khảo sát để tiến hành trồng 2.000 hecta cây Jatropha tại xã Đăk Nên huyện Kon Plông vào năm 2008. Cùng với việc lập quy hoạch chi tiết để phát triển vùng kinh tế động lực Khu du lịch sinh thái Măng Đen gắn với phát triển thị trấn Kon Plông, huyện Kon Plông sẽ ưu tiên dành nhiều diện tích đất hoang hoá, đồi núi trọc để trồng cây Jatropha trong những năm đến. Những thành công trong nhân giống in vitro cây Dầu mè Phôi vô tính được cảm ứng trực tiếp từ những mẫu cấy lá mầm xanh trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP. Quá trình ra rễ được tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IAA (K. Kalimuthu và cs., 2007). Môi trường MS có bổ sung 2,3 – 4,6 μM Kinetin và 0,5 – 4,9 μM IBA; 2,3 μM Kinetin và 1,0 μM IBA được chứng minh là sự kết hợp hiệu quả nhất trong việc cảm ứng phôi vô tính ở cây Dầu mè.(Timir baran Jha và cs., 2007) Nuôi cấy mô sẹo từ mẫu cấy lá và trụ dưới lá mầm của cây con Jatropha curcas L. bốn ngày tuổi trên môi trường cơ bản MS (1962) có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau bao gồm 2,4-D, BA, GA3, và nước cốt dừa. Sự tăng trưởng của mô sẹo đạt được tốt nhất trên môi trường chỉ bổ sung 0,5mg/l 2,4-D và với 2% v/v nước cốt dừa đối với các mẫu cấy trụ dưới lá mầm, mô sẹo được hình thành từ các mẫu cấy trụ dưới lá mầm phát triển nhanh hơn trong suốt 7 đến 30 ngày nuôi cấy sau đó được ổ định ở một tỉ lệ tăng trưởng thấp (Shah Abdul Latif University và cs., 2007). Tái sinh chồi bất định trên môi trường MS có bổ sung BA (3,0 mg/l) + IBA (1,0 mg/l) + Adenine sulfate (25 mg/l) + Glutamine (50 mg/l) + L-arginine (15 mg/l) + Citric acid (25 mg/l) sau 3 – 4 tuần nuôi cấy. Chồi in vitro phát triển rễ trên môi trường MS có bổ sung IBA (1,0 – 4,0 mg/l) và NAA (1,0 – 4,0 mg/l). Tần suất cảm ứng rễ cao nhất đạt được trên môi trường có bổ sung 3,0 mg/l IBA (K. Kalimuthu và cs., 2008) Những chồi bất định đã được cảm ứng từ những mẫu lá nuôi cấy còn non của cây trồng từ hạt nảy mầm trong ống nghiệm, cũng như cây trưởng thành ngoài tự nhiên được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2.27 µM TDZ + 2.22 µM BA + 0.49 µM IBA. (Ajay C. Deore và T. Sudhakar Johnson, 2008) CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu này là cây Dầu mè (Jatropha curcas L.) được trồng tại vườn thực nghiệm của Viện Sinh học nhiệt đới. Hạt được thu nhận, khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản. Lá phát triển từ lá mầm của hạt nuôi cấy trên môi trường MS được sử dụng để nghiên cứu cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp. Hình 3.1. Cây Dầu mè ở Viện Sinh học nhiệt đới Hình 3.2. Hạt Dầu mè Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, kệ đặt bình, . Dụng cụ: đĩa petri, dao cấy, kéo, chai nước biển 500ml, đèn cồn, đũa thủy tinh, kẹp, . Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm đều được thực hiện trên môi trường nuôi cấy cơ bản của Murashige và Skoog (1962) có bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (8 - 9g/l) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Tùy vào mục đích của từng thí nghiệm mà bổ sung vào môi trường các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở các nồng độ khác nhau. Môi trường sau khi bổ sung đầy đủ các chất cần thiết thì được điều chỉnh về pH 5.7 ± 1 (bằng NaOH 1N và HCl 1N) trước khi bổ sung agar. Sau đó môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm, 121oC trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy ở phòng nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng: 2500 lux Nhiệt độ : 22 - 25oC Phương pháp nghiên cứu Tạo mẫu lá in vitro cho các thí nghiệm Sử dụng mẫu lá Dầu mè in vitro hình thành từ lá mầm của phôi phục vụ cho thí nghiệm cảm ứng tạo chồi. Khử trùng mẫu Hạt Dầu mè được khử trùng theo các bước sau: Khử trùng sơ bộ Hạt được cho vào các cốc đặt dưới vòi nước chảy khoảng 20 - 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt. Những hạt này sau đó được rửa kỹ bằng xà phòng. Rửa lại bằng nước máy khoảng 4 - 5 lần cho hết xà phòng rồi đưa vào tủ cấy. Khử trùng mẫu trong tủ cấy Chuyển mẫu từ cốc sang một erlen đã được hấp khử trùng Rửa lại mẫu bằng nước cất đã hấp khử trùng. Cho ethanol 70% vào erlen mẫu rồi lắc khử trùng khoảng 3 - 5 phút. Rửa lại mẫu bằng nước cất đã hấp khử trùng 2 - 3 lần để loại bỏ ethanol. Cho dung dịch javel 10% có bổ sung thêm 1 - 2 giọt tween 20% vào erlen mẫu rồi lắc khoảng 20 - 30 phút. Rửa lại mẫu lại bằng nước cất vô trùng khoảng 3 - 4 lần. Tạo mẫu lá in vitro Hạt sau khi khử trùng được bóc bỏ vỏ, cắt ra làm 4 phần. Cấy vào môi trường MS có bổ sung đường sucrose (30g/l), agar (8 - 9g/l) và không bổ sung bất kỳ chất điều hòa sinh trưởng thực vật nào. Sau 1 tuần, lá non hình thành từ lá mầm của phôi và được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinetin lên khả năng phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá in vitro. Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA và Kinetin kết hợp hoặc riêng lẻ lên khả năng phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá Dầu mè in vitro. Tiến hành thí nghiệm Lá non hình thành từ lá mầm của phôi được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 1.0 cm x 1.0 cm để nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 30g/l đường sucrose, 9g/l agar và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật như trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinetin kết hợp hoặc riêng lẻ lên khả năng hình thành chồi trực tiếp từ mẫu lá. Ký hiệu BA (mg/l) Kinetin (mg/l) A1 0.5 - A2 1 - A3 2 - A4 3 - A5 4 - A6 5 - A7 - 0.5 A8 - 1 A9 - 2 A10 - 3 A11 - 4 A12 - 5 A13 0.5 0.5 A14 1 1 A15 2 2 A16 3 3 A17 4 4 A18 5 5 Sau 5 – 6 tuần, ghi nhận khả năng phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá trên môi trường có bổ sung BA, Kinetin ở những nồng độ khác nhau. Tiến hành đếm số lượng chồi và cụm chồi tạo thành trên mỗi mẫu cấy. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng hình thành chồi, đặc điểm chồi. Số lượng chồi và cụm chồi thu được. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin, IBA và GA3 đến sự nhân chồi và kéo dài chồi. Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng thực vật BA, Kinetin, IBA, GA3 đến sự nhân chồi và kéo dài chồi. Tiến hành thí nghiệm Các chồi hình thành trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích tăng trưởng thực vật BA, Kinetin được tách ra, cấy chuyển vào môi trường nhân chồi và kéo dài chồi. Chồi được nhân lên và kéo dài trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 30g/l đường sucrose, 9g/l agar và các chất kích thích tăng trưởng thực vật như trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin, IBA, GA3 đến sự nhân chồi và kéo dài chồi. Ký hiệu BA (mg/l) Kinetin (mg/l) IBA (mg/l) GA3 (mg/l) B1 0.1 0.1 0.05 0.05 B2 0.25 0.25 0.05 0.05 B3 0.5 0.5 0.12 0.12 B4 1 0.5 0.25 0.25 B5 1.5 0.5 0.5 0.5 B6 2 1 1 1 Sau 8 tuần trên môi trường nuôi cấy với việc cấy chuyển cứ sau 4 tuần, tiến hành đếm số lượng chồi được nhân lên và đo chiều dài chồi. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng nhân chồi và kéo dài chồi Số lượng chồi được nhân lên. Chiều dài chồi. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự thành lập rễ. Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng hình thành rễ từ chồi của chất kích thích tăng trưởng thực vật NAA. Tiến hành thí nghiệm Chồi cao khoảng 2 - 3 cm thì được tách ra và cấy chuyển sang môi trường cảm ứng ra rễ gồm đầy đủ nồng độ môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 9g/l agar và NAA ở các nồng độ khác nhau như trong bảng 3.3. Bảng 3.3: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự thành lập rễ. Ký hiệu NAA (mg/l) C1 0.05 C2 0.1 C3 0.25 C4 0.5 Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng hình thành rễ, đặc điểm rễ. Số lượng rễ được hình thành. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các sồ liệu sau khi được đo đạc, tính toán ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được phân tích, xử lý thống kê bằng chương trình EXCEL và Statgraphics. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo mẫu lá in vitro cho các thí nghiệm Sự tái sinh cây qua mẫu lá là một phương pháp thí nghiệm cao trong nuôi cấy mô (Landi và Mezzetti 2006) và kỹ thuật chuyển gene (Tsugawa cùng cộ sự 2004). Krikorian (1982) đã qua sát những mô và cơ quan còn non của cây đặc biệt là những cây non thì đáp ứng cao hơn so với cây trưởng thành. Vì vậy, trong đề tài này tôi chọn mẫu lá Dầu mè in vitro để thực hiện các thí nghiệm. Để tạo ra mẫu lá in vitro phục vụ cho các thí nghiệm thì nguồn mẫu ban đầu sử dụng là hạt Dầu mè. Hạt sau khi khử trùng được bóc bỏ vỏ, cắt làm 4 phần cấy vào môi trường MS không bổ sung bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng thực vật nào. Sau 1 tuần nuôi cấy, lá non hình thành từ lá mầm của phôi và phát triển to hơn, xanh hơn (hình 4.1). Phần cuống lá có hiện tượng phát sinh mô sẹo màu trắng đục. Cắt bỏ phần mô sẹo và rìa lá, chia nhỏ mẫu lá ra thành nhiều mảnh có kích thước 1.0 cm x 1.0 cm, cấy vào môi trường khác nhau ở các thí nghiệm. Hình 4.1. Lá Dầu mè in vitro Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinetin lên khả năng phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá. Các loại cytokinin khác nhau, ở các nồng độ khác nhau sẽ có tương tác khác nhau lên mẫu cấy. Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro. Nhóm cytokinin đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. Các chồi đang tăng trưởng được kích thích mạnh mẽ bởi nồng độ cytokinin. Từ nhiều nghiên cứu, người ta rút ra kết luận vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi: tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định, cản trở sự tạo rễ (nồng độ cytokinin cao từ 0.5 - 10 mg/l thường cản trở hoặc làm chậm sự tạo rễ, đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin). Tác động của chất điều hòa tăng trưởng thực vật BA và Kinetin được ghi nhận sau 5 – 6 tuần nuôi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.1 và bảng 4.2. Bảng 4.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá. Môi trường Mẫu tạo chồi (%) Số chồi trung bình 0.5 mg/l BA 15.15 0.15b(*) 1 mg/l BA 25.93 0.54a 2 mg/l BA 11.11 0.14b 3 mg/l BA 3.03 0.03b 4 mg/l BA 2.38 0.10b 5 mg/l BA 10.00 0.17b Ghi chú: (*) trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa α = 0.05%. Hình 4.2. Chồi và cụm chồi phát sinh trực tiếp trên mẫu lá in vitro. Sau 5 - 6 tuần nuôi cấy, trên tất cả môi trường chứa BA đều có sự phát sinh chồi tuy nhiên số lượng chồi phát sinh không đồng đều, phụ thuộc vào nồng độ BA. Số lượng chồi đạt cao nhất khi mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1 mg/l BA với tỷ lệ phát sinh chồi khoảng 25.93% và trung bình 0.54 chồi/ mẫu. Các nồng độ còn lại cho kết quả tương đương nhau, với lượng chồi và tỷ lệ phát sinh chồi rất thấp. Chồi có trung bình khoảng 2 - 4 lá, nhiều lá chưa bung hết ra. Mẫu lá in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA có xu hướng phái sinh hình thái mô sẹo hơn là phái sinh chồi với tỷ lệ 87.94%. Mô sẹo phát sinh có màu trắng xanh, cứng và không có khả năng tái sinh chồi trên môi trường có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (hình 4.3). 1 2 3 4 5 6 Hình 4.3. Chồi phát sinh trên các môi trường có bổ sung BA với những nồng độ khác nhau. [1]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l BA [2]: Môi trường bổ sung 1 mg/l BA [3]: Môi trường bổ sung 2 mg/l BA [4]: Môi trường bổ sung 3 mg/l BA [5]: Môi trường bổ sung 4 mg/l BA [6]: Môi trường bổ sung 5 mg/l BA 2 1 3 4 6 5 Hình 4.4. Mẫu lá in vitro trên môi trường có bổ sung Kinetin ở các nồng độ khác nhau. [1]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l Kinetin [2]: Môi trường bổ sung 1 mg/l Kinetin [3]: Môi trường bổ sung 2 mg/l Kinetin [4]: Môi trường bổ sung 3 mg/l Kinetin [5]: Môi trường bổ sung 4 mg/l Kinetin [6]: Môi trường bổ sung 5 mg/l Kinetin Mẫu cấy trên môi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng thực vật Kinetin không thích hợp để phát sinh hình thái chồi. Sau 4 - 5 tuần nuôi cấy, quan sát mẫu lá thấy hai trường hợp như sau: Trường hợp 1: mẫu có gia tăng về kích thước nhưng màu nâu dần rồi chết (hình 4.4). Trường hợp 2: mẫu gia tăng về kích thước và có hiện tượng phát sinh hình thái mô sẹo màu trắng xanh, cứng với số lượng không đáng kể (hình 4.4). Từ kết quả của các thí nghiệm cho thấy, khi môi trường nuôi cấy có bổ sung BA thì có sự phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy nhưng khi thay BA bằng Kinetin thì không thấy phát sinh chồi. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006) đã ghi nhận rằng, BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loại thực vật. Các cytokinin khác (kinetin, 2iP, PBA và zeatin) cũng có thể được sử dụng nhưng ít hơn BA . Điều này phù hợp với kết quả ghi nhận được từ các thí nghiệm. Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin lên khả năng phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá. Môi trường Mẫu tạo chồi (%) Số lượng chồi trung bình 0.5 mg/l BA + 0.5 mg/l Kinetin 61.54 1.85b (*) 1 mg/l BA + 1 mg/l Kinetin 94.44 4.31a 2 mg/l BA + 2 mg/l Kinetin 95.65 2.91b 3 mg/l BA + 3 mg/l Kinetin 68.18 1.95b 4 mg/l BA + 4 mg/l Kinetin 6.67 0.07c 5 mg/l BA + 5 mg/l Kinetin 7.69 0.08c Ghi chú: (*) trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b, c thì không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa α = 0.05%. Môi trường với nồng độ 2 mg/l BA kết hợp với 2 mg/l Kinetin có khả năng phát sinh chồi cao nhất đạt khoảng 95.65%. Tuy khả năng tạo chồi trên mẫu lá cao nhưng tổ hợp 2 mg/l BA + 2 mg/l Kinetin lại cho số chồi trung bình phát sinh trên một mẫu lá ít hơn so với tổ hợp 1 mg/l BA + 1 mg/l Kinetin. Khả năng phát sinh chồi kém trên môi trường có bổ sung 4mg/l BA kết hợp với 4 mg/l Kinetin và 5 mg/l BA kết hợp với 5 mg/l Kinetin (hình 4.5). Trên các môi trường nuôi cấy, ta nhận thấy mẫu lá phát sinh cụm chồi nhiều hơn chồi riêng lẻ khi sử dụng BA và Kinetin ở nồng độ cao. Các chồi trong cụm chồi nhỏ và thấp hơn những chồi phát triển đơn lẻ. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài. Sau 5 - 6 tuần nuôi cấy, môi trường có sự kết hợp BA và Kinetin cho kết quả phát sinh chồi tốt nhất so với môi trường chỉ có BA hoặc chỉ có Kinetin. Nếu môi trường chỉ có BA hoặc Kinetin riêng lẻ thì mẫu cấy có xu hướng phát sinh mô sẹo hơn là chồi. Ở môi trường có bổ sung 1 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l Kinetin thì thích hợp nhất để cảm ứng chồi một cách tối đa. Những kết quả này cho thấy rằng BA và Kinetin cùng điều phối kết quả trong việc cảm ứng chồi cây Dầu mè. Nếu vắng một trong hai cytokinin này thì khả năng phát sinh chồi kém hoặc không phát sinh chồi trong trường hợp chỉ có Kinetin. Tuy nhiên khi nuôi cấy mẫu lá Dầu mè 7 tháng tuổi ở ngoài tự nhiên trên môi trường BA kết hợp Kinetin thì mẫu cảm ứng hình thành mô sẹo là chủ yếu (Timir Baran Jha và cs., 2007). Ngoài ra, BA còn có thể kết hợp với TDZ và IBA để cảm ứng tạo chồi trên mẫu lá nuôi cấy. Sự có mặt của TDZ trong môi trường cảm ứng đã có ảnh hưởng lớn hơn đến sự cảm ứng chồi nhưng trái lại có BA mà không có TDZ kích thích hình thành mô sẹo hơn là tạo chồi phù hợp với kết quả ở bảng 4.1 (Ajay C. Deore và T. Sudhakar Johnson, 2007). K. Kalimuthu cùng cộng sự (2007) đã báo cáo những mẫu cấy đốt thân từ cây con in vitro 25 - 27 ngày tuổi được sử dụng để tái sinh chồi và mẫu cấy lá mầm còn non được sử dụng để phát sinh phôi. Ngoài ra, có thể phát sinh phôi qua trung gian mô sẹo được cảm ứng từ mẫu lá ngoài tự nhiên 7 tháng tuổi (Timir Baran Jha và cs., 2007). Từ các kết quả thí nghiệm thấy rằng, khi tăng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì tỷ lệ mẫu tạo chồi và số lượng chồi trung bình tăng. Nhưng đến một giới hạn nhất định mà nồng độ các chất này càng tăng thì kết quả có xu hướng giảm dần. Điều này cũng được chứng minh bởi Filiz Akbas và cs. (2009), ở nghiên cứu hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong cảm ứng tạo chồi Amygdalus communis L. Ông sử dụng BA (0.5 - 4.0 mg/l) cho môi trường cảm ứng tạo chồi. Kết quả ghi nhận được số chồi trung bình tăng khi nồng độ BA tăng: 0.5 mg/l BA cho số chồi trung bình 8.06; 1.0 mg/l BA cho số chồi trung bình 16.10. Tuy nhiên khi nồng độ BA càng tăng thì số lượng chồi trung bình càng giảm. Nồng độ BA tăng lên 2 mg/l thì số chồi trung bình giảm xuống còn 7.93 và số chồi trung bình giảm xuống còn 7.50 khi sử dụng BA với nồng độ cao nhất 4.0 mg/l. Kết quả của Akhar Shekafandef (2010) cũng tương tự khi sử dụng BA (0 mg/l - 3mg/l) để cảm ứng tạo chồi Prunus dulcis Mill. Khi nồng độ BA tăng từ 0 mg/l đến 1.5 mg/l thì số lượng chồi trung bình tăng từ 1.00 đến 4.67 nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ BA thì số lượng chồi lại giảm dần và số chồi trung bình thấp nhất 3.90 chồi/ mẫu đối với nồng độ 3 mg/l. Từ đó thấy rằng, chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sẽ thể hiện tác động kích thích ở nồng độ thấp và tăng dần đến ảnh hưởng tối đa. Khi nồng độ vượt qua mức kích thích tối đa sẽ gây ảnh hưởng ức chế. Nhìn chung đường cong đáp ứng liều lượng cho tất cả những chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã biết có dạng hình chuông (Nguyễn Minh Chơn, 2004). Việc bổ sung BA và Kinetin vào môi trường nuôi cấy đã cảm ứng tạo chồi và cụm chồi trực tiếp trên mẫu lá in vitro. Tuy nhiên số lượng chồi phát sinh trên một mẫu cấy chưa cao và chiều cao của chồi còn thấp, trung bình từ 1 - 2 cm, chưa đủ khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh. Vì vậy, cần cấy chuyển chồi sang môi trường nhân chồi và kéo dài chồi. 2 1 4 3 6 5 Hình 4.5. Chồi phát sinh trên các môi trường có bổ sung BA và Kinetin kết hợp với những nồng độ khác nhau. [1]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l BA và 0.5 mg/l Kinetin [2]: Môi trường bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l Kinetin [3]: Môi trường bổ sung 2 mg/l BA và 2 mg/l Kinetin [4]: Môi trường bổ sung 3 mg/l BA và 3 mg/l Kinetin [5]: Môi trường bổ sung 4 mg/l BA và 4 mg/l Kinetin [6]: Môi trường bổ sung 5 mg/l BA và 5 mg/l Kinetin Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin, IBA, GA3 đến sự nhân chồi và kéo dài chồi. Các loại auxin và cytokinin khác nhau có tương tác khác nhau do đó ảnh hưởng của chúng lên mẫu cấy cũng khác nhau. Để nhân lên và kéo dài, những chồi phát triển tốt thì được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung BA, Kinetin, IBA và GA3. Các gibberellin đã biết đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự sinh trưởng của nhiều loại cây đặc biệt là những cây lùn. Chính vì vậy trong thí nghiệm này tôi sử dụng GA3 là 1 loại gibberellin để kéo dài chồi. Sau 8 tuần nuôi cấy với việc cấy chuyển cứ 4 tuần 1 lần đã không cho kết quả như mong muốn. Số lượng chồi nhân lên không đáng kể và hình thái không rõ ràng. Chồi mới hình thành thấy xuất hiện sự biến dạng khiến chồi không thể phát triển được (hình 4.7). Chồi biến dạng xuất hiện nhiều khi tăng nồng độ cytokinin. Kruczkowska (1986) đã ghi nhận nhận rằng, khi nhân chồi trên nồng độ BA cao liện tục dễ gây các cụm chồi dị dạng, thủy tinh thể. Điều này rất phù hợp với kết quả ghi nhận được khi nồng độ cytokinin cao mà đặc biệt là BA thì hiện tượng biến dạng đa chồi càng tăng mà cụ thể là ở môi trường có bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l Kinetin, 1 mg/l IBA và 1 mg/l GA3 (hình 4.7). Dưới đế chồi có sự hình thành mô sẹo rất lớn làm cản trở sự phát triển của chồi (hình 4.7). Trong môi trường có sự kết hợp của bốn chất kích thích tăng trưởng thực vật là BA, Kinetin, IBA và GA3 thì chồi kéo dài không đáng kể. Chồi ban đầu cấy vào môi trường có chiều cao trung bình đạt 1 - 2 cm. Sau 8 tuần nuôi cấy, chiều cao trung bình của chồi chỉ đạt khoảng 1.5 - 2.7 cm. Ngoài ra do nguồn chồi ban đầu không đồng đều nên rất khó để theo dõi sự kéo dài của chồi. Nhận thấy chồi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA, Kinetin, IBA và GA3 cuống lá lại kéo dài gấp 1.5 - 2 lần chiều dài cuống lá của chồi lúc nuôi cấy (hình 4.7). Tóm lại do nhiều yếu tố như việc kết hợp cũng như nồng độ các chất kích thích chưa thích hợp hay nguồn chồi ban đầu chưa đồng đều mà thí nghiệm nhân chồi và kéo dài chồi chưa đạt được kết quả như mong muốn. Cũng với 4 chất kích thích tăng trưởng thực vật là BA, Kinetin, GA3 và thay IBA bằng IAA lại cho số chồi Dầu mè đạt mức cao nhất (11.5 chồi) sau 12 tuần nuôi cấy với việc cấy chuyển cứ sau khoảng 4 tuần. Sự phát triển nhanh và kèo dài ra của chồi có thể đạt được nhờ có tỷ lệ cytokinin / auxin cao cùng với GA3. Khi sử dụng BA, Kinetin, GA3 kết với IAA thì chồi kéo dài và không có sự hình thành mô sẹo(Ajay C. Deore và T. Sudhakar Johnson, 2007). Tuy nhiên trong thí nghiệm này khi thay IAA bằng IBA thì thấy xuất hiện mô sẹo dưới đế chồi. Điều này cũng gây khó khăn cho sự phát triển của chồi. 2 1 Hình 4.6. Chồi trước và sau khi nuôi cấy trên môi trường nhân, kéo dài chồi có bổ sung 0.5 mg/l BA, 0.5 mg/l Kinetin, 0.12 mg/l IBA và 0.12 mg/l GA3. [1]: Chồi ban đầu cấy trên môi trường nhân và kèo dài chồi. [2]: Chồi sau 6 tuần trên môi trường nhân và kéo dài chồi. 2 1 Hình 4.7. Chồi sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nhân và kéo dài chồi có bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l Kinetin, 1 mg/l IBA và 1 mg/l GA3. [1]: Sự kéo dài cuống lá [2]: Chồi biến dạng và sự phát sinh hình thái mô sẹo dưới đế chồi. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự thành lập rễ. Trong nuôi cấy mô, để giúp mô phân hóa tạo rễ thông thường cần bổ sung các chất kích thích hình thành rễ thuộc nhóm auxin (NAA, IBA, 2,4D,). Trong thí nghiệm, tôi chọn sự dụng NAA để cảm ứng ra rễ. Những chồi phát triển tốt, có chiều cao từ 2 - 3 cm được tách ra, cấy chuyển vào môi trường cảm ứng ra rễ có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau. Tỷ lệ auxin và cytokinin ảnh hưởng lớn đến quá trình phát sinh cơ quan của mẫu cấy. Tỷ lệ nghiêng về phía auxin thường kích thích quá trình ra rễ của chồi. Trong giai đoạn đầu của quá trình ra rễ, thường xuất hiện các khối mô sẹo lớn ở gốc của mẫu cấy. Các khối mô sẹo này xuất hiện từ hiện tượng phản biệt hóa của một số tế bào ở phần giữa hoặc lân cận của mô dẫn truyền. Khối mô sẹo này nhanh chóng phát triển mạnh thành những khối mô sẹo lớn màu trắng bao bọc xung quanh góc cắt trong môi trường thích hợp. Giai đoạn này đòi hỏi nồng độ auxin rất cao để thúc đẩy quá trình phản biệt hóa xảy ra mạnh mẽ. Sau đó, mầm rễ xuất hiện và phát triển thành rễ hoàn chỉnh, hai quá trình này đòi hỏi nhu cầu auxin thấp hơn thậm chí bằng không. Trong giai đoạn cuối, nếu có auxin sẽ làm ức chế sự sinh trưởng của rễ. Rễ bất định có thể tự sinh, có nghĩa là sự sản sinh tự nhiên trong thời gian phát triển của cây. Ở trường hợp cây đơn tử diệp, rễ thường hình thành có ưu thế bất định hơn vì rễ mầm chết rất nhanh chóng sau khi hạt nảy mầm và do đó sự hình thành rễ bất định được thuận lợi. Sự hình thành rễ bất định chia làm 3 giai đoạn: Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hóa mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm móng của rễ. Giai đoạn tiếp theo là sự xuất hiện mầm rễ. Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ chui qua vỏ ngoài tạo nên rễ bất định. Các giai đoạn này khác nhau về yêu cầu đối với auxin. Giai đoạn đầu đòi hỏi hàm lượng auxin cao để khởi xướng sự phản phân hóa tế bào mạnh mẽ. Giai đoạn hai cần hàm lượng auxin thấp hơn cho sự xuất hiện rễ. Ở giai đoạn ba, sự sinh trưởng của mầm rễ để hình thành rễ đòi hỏi hàm lượng auxin rất thấp, thậm chí auxin có thể gây ức chế sự sinh trưởng của rễ. Tác động của chất điều hòa tăng trưởng thực vật NAA đến sự thành lập rễ được ghi nhận sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.3. Hình 4.8. Chồi trước khi cảm ứng ra rễ. 2 1 Hình 4.9. Hình thái rễ trên môi trường có bổ sung NAA. [1]: Môi trường có bổ sung 0.5 mg/l NAA [2]: Môi trường có bổ sung 0.25 mg/l NAA Bảng 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA đến sự thành lập rễ từ chồi. Môi trường Chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình 0.05 mg/l NAA 18.75 0.31b (*) 0.1 mg/l NAA 14.29 0.14b 0.25 mg/l NAA 33.33 0.65b 0.5 mg/l NAA 45.00 1.65a Ghi chú: (*)trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình cùng kí tự a, b thì không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức ý nghĩa α = 0.05%. Sau 2 tuần nuôi cấy, trên tất cả các môi trường có chứa chất kích thích tăng trưởng thực vật NAA ở các nồng độ khác nhau đều tạo rễ nhưng với tỷ lệ chưa cao. Với nồng độ 0.5 mg/l NAA thì tỷ lệ cây ra rễ cao nhất đạt 45%, số lượng rễ được tạo ra nhiều nhất, trung bình khoảng 1.65 rễ trên một cây. Khi nồng độ NAA giảm xuống thấp hơn 0.5 mg/l thì số lượng rễ tạo ra ít hơn nhưng lại dài hơn (hình 4.10). Áp dụng auxin ngoại sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói chung bị ức chế trừ khi áp dụng với nồng độ đủ nhỏ (Nguyễn Minh Chơn, 2004). Auxin ở nồng độ cao sẽ kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng ngăn kéo dài rễ, cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Còn nếu sử dụng auxin với nồng độ thấp sẽ cảm ứng rễ kéo dài. Rễ hình thành có màu vàng kem và có sự hình thành các rễ phụ. Tuy trên tất cả môi trường có chứa NAA ở những nồng khác nhau cây đều hình thành rễ nhưng rễ lại rất mềm và xốp đồng thời có sự hình thành mô sẹo nhỏ ở gốc với tỷ lệ không cao. Tuy nhiên sự hình thành mô sẹo tăng dần theo nồng độ của NAA. 2 1 3 4 1 Hình 4.10. Sự hình thành rễ trên môi trường có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau. [1]: Môi trường có bổ sung 0.05 mg/l NAA [2]: Môi trường có bổ sung 0.1 mg/l NAA [3]: Môi trường có bổ sung 0.25 mg/l NAA [4]: Môi trường có bổ sung 0.5 mg/l NAA Deore và Johnson (2008) đã sử dụng IBA, IAA để cảm ứng tạo rễ trên cây Dầu mè in vitro. Chồi bất định được cảm ứng từ mẫu lá trong và ngoài ống nghiệm, cao khoảng 2 - 3 cm được cấy vào môi trường cảm ứng ra rễ gồm đầy đủ nồng độ môi trường cơ bản MS có bổ sung 0.1 mg/l IBA. Sau 30 ngày nuôi cấy, 80% rễ được ghi nhận là không có bất kỳ sự phát triển của một mô sẹo trung gian nào. Còn K. Kalimuthu và cs (2007), đã ghi nhận rằng, những chồi từ mẫu cấy đốt thân được cấy vào môi trường MS có bổ sung IAA (0.5 - 2.5 mg/l) và IBA (0.5 - 2.5 mg/l) đều có sự hình thành rễ. Tất cả các chồi được nuôi cấy đều phát triển rễ trên môi trường MS có chứa 1.0 mg/l IAA trong vòng 6 - 7 ngày và không có mô sẹo phát triển. Tuy nhiên, khi nồng độ IAA trong môi trường MS cao hơn 1.5 mg/l lại làm giảm số lượng rễ. Còn môi trường chứa IBA thì tần suất ra rễ thấp hơn và hình thành mô sẹo ở phần đế chồi so với môi trường chứa IAA. Một nghiên cứu khác tiến hành cảm ứng tạo rễ trên môi trường ½ MS có bổ sung IBA (1.0 - 4.0 mg/l) và NAA (1.0 - 4.0 mg/l). Kết quả là tần suất cảm ứng tạo rễ cao nhất đạt được 100% trên môi trường có bổ sung 3.0 mg/l IBA và không có sự hình thành mô sẹo trung gian (Sarika Shrivastava và Meenakshi Banerjee, 2008). Để cảm ứng rễ của cùng một đối tượng là chồi Dầu mè nhưng lại cho các kết quả khác nhau. Điều đó còn phụ thuộc vào nguồn chồi muốn cảm ứng ra rễ, chất kích thích tăng trưởng thực vật khác nhau cũng như nồng độ sử dụng khác nhau, thành phần môi trường khác nhau sẽ cho ra những kết quả khác nhau. Vì vậy tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà ta sử dụng chất kích và nồng độ cho thích hợp. Một vấn đề khó khăn gặp phải khi nuôi cấy cây Dầu mè đó là hiện tượng rụng lá. Sau một thời gian nuôi cấy, cây rụng lá càng nhiều và chết dần dần. Hiện tượng này xuất hiện nhiều khi môi trường nuôi cấy có bổ sung NAA ở nồng độ cao nhất 0.5 mg/l. Quan sát kỹ khi lá sắp rụng thì ở cuống lá xuất hiện tầng rời. Do đó cần khắc phục hiện tượng rụng lá ở cây Dầu mè in vitro. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua quá trình tiến hành thí nghiệm, tôi xin tóm tắt lại quy trình nhân giống cây Dầu mè thông qua sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá in vitro như sau: Hạt Dầu mè Lá Dầu mè in vitro Cảm ứng tạo rễ Khử trùng, cấy vào môi trường MS Cảm ứng tạo chồi Nhân chồi và kéo dài chồi Cây con hoàn chỉnh Môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA + 1 mg/l Kinetin Môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA Môi trường MS có bổ sung BA, Kinetin, IBA và GA3 Qua thực nghiệm tôi rút ra một số kết luận : Có thể phát sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá Dầu mè in vitro. Hai cytokinin là BA và Kinetin cùng điều phối kết quả trong việc cảm ứng chồi cây Dầu mè. Nếu vắng 1 trong 2 chất thì khả năng phát sinh chồi kém hoặc không có khả năng phát sinh chồi như trong trường hợp chỉ có Kinetin. Môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA kết hợp với 2 mg/l Kinetin cho tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất đạt 95.65%. Môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l Kinetin tuy có tỷ lệ phát sinh chồi (94.44%) thấp hơn môi trường có bổ sung 2 mg/l BA kết hợp với 2 mg/l Kinetin nhưng cho số lượng chồi trung bình (4.31 chồi / mẫu lá) đạt kết quả cao nhất. Môi trường nhân chồi và kéo dài chồi có sự kết hợp của bốn chất kích thích tăng trưởng thực vật là BA, Kinetin, IBA và GA3 không cho kết quả như mong muốn. Số lượng chồi nhân lên và sự kéo dài chồi không đáng kể. Môi trường MS có bổ sung NAA (0.05 - 0.5 mg/l) đều có khả năng cảm ứng ra rễ tuy nhiên với nồng độ 0.5 mg/l NAA thì đạt kết quả cao nhất với tỷ lệ chồi ra rễ 45%. Kiến nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm và thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm có hạn nên tôi xin đưa ra một số kiến nghị để nghiên cứu này được hoàn chỉnh hơn: Nghiên cứu thêm mẫu cấy khác để tạo chồi như mẫu lá ngoài tự nhiên từ đó ta so sánh được khả năng hình thành chồi của các mẫu cấy. Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác lên khả năng phát sinh chồi. Khảo sát thêm một số chất điều hòa tăng trưởng thực vật ảnh hưởng lên khả năng nhân chồi và kéo dài chồi. Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất đều hòa tăng trưởng thực vật khác lên sự tạo rễ và cho rễ khỏe hơn. Nghiên cứu cách khắc phục cây biến dạng. Nghiên cứu, tìm ra các phương pháp khắc phục hiện tượng rụng lá ở cây Dầu mè in vitro. Đưa cây in vitro ra vườn ươm, có chế độ chăm sóc cây con cho thích hợp. Đồng thời theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của cây Dầu mè trong giai đoạn vườn ươm xem cây in vitro có dễ trồng như cây ngoài tự nhiên. Nghiên cứu thêm các phương pháp nhân giống khác để so sánh hiệu quả nhân giống cũng như chất lượng giống để phục vụ cho sản xuất với số lượng lớn.