Đề tài Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản

o¹i bá vi khuÈn khái t¶o. §Ó lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o chóng t«i ®· thö nghiÖm bæ sung mét sè kh¸ng sinh vµo m«i tr−êng nu«i cÊy t¶o ®Ó nghiªn cøu kh¶ n¨ng lo¹i bá vi khuÈn cña kh¸ng sinh vµ ¶nh h−ëng cña chóng lªn sinh tr−ëng cña t¶o. C¸c 14 kh¸ng sinh ®−îc lùa chän ph¶i ®¸p øng yªu cÇu: cã kh¶ n¨ng lo¹i bá vi khuÈn vµ kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o. Víi môc ®Ých trªn, chóng t«i ®· thö nghiÖm 4 lo¹i kh¸ng sinh : Tetracycline, Peflacine, Erythromycine vµ TA. ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh nh− sau: chuÈn bÞ m«i tr−êng th¹ch Gorbenko cã bæ sung kh¸ng sinh víi nång ®é kh¸c nhau, sau ®ã cÊy dÞch t¶o lªn m«i tr−êng th¹ch ®Ó theo dâi sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn vµ t¶o. KÕt qu¶ thu ®−îc lµ c¬ së ®Ó x¸c ®Þnh ng−ìng nång ®é kh¸ng sinh thÝch hîp nh»m lo¹i bá vi khuÈn ®èi víi tõng lo¹i t¶o. §iÒu nµy rÊt cÇn thiÕt khi gi÷ gièng trong m«i tr−êng th¹ch. ThÝ nghiÖm th¨m dß ¶nh h−ëng cña mét sè lo¹i kh¸ng sinh lªn sinh tr−ëng cña t¶o vµ vi khuÈn trong dÞch t¶o ®−îc tiÕn hµnh b»ng c¸ch bæ sung trùc tiÕp kh¸ng sinh vµo m«i tr−êng nu«i cÊy t¶o, sau ®ã theo dâi sinh tr−ëng cña t¶o vµ kiÓm tra sù cã mÆt cña vi khuÈn. III.2.1 ¶nh h−ëng cña Tetracycline vµ Peflacine lªn viÖc lo¹i bá vi khuÈn vµ sinh tr−ëng cña t¶o. Tetracycline lµ kh¸ng sinh thuéc nhãm quinon cã phæ t¸c ®éng réng, cã t¸c dông ®èi víi vi khuÈn Gram d−¬ng vµ Gram ©m. V× vËy chóng t«i ®· nghiªn cøu th¨m dß viÖc sö dông kh¸ng sinh nµy ®Ó lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o. Tuy nhiªn khi bæ sung Tetracyeline vµo m«i tr−êng nu«i t¶o ®· lµm cho m«i tr−êng bÞ kÕt tña, ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o. V× vËy chóng t«i tiÕp tôc thÝ nghiÖm víi mét kh¸ng sinh kh¸c còng thuéc nhãm quinon lµ peflacine. Peflacine ®−îc bæ sung vµo m«i tr−êng th¹ch ®Æc (Gorbenko) víi nång ®é tõ 2.5µg/ml-150µg/ml, sau ®ã cÊy dÞch t¶o lªn m«i tr−êng th¹ch ®Ó kiÓm tra sù cã mÆt cña vi khuÈn. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 2. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 2 cho thÊy: ë c«ng thøc ®èi chøng (m«i tr−êng kh«ng cã kh¸ng sinh), sau 3 ngµy cÊy dÞch t¶o vµo m«i tr−êng th¹ch, toµn bé diÖn tÝch mÆt ®Üa th¹ch ®Òu cã vi khuÈn ph¸t triÓn. ë c«ng thøc cã bæ sung peflacine nång ®é 2.5µg/ml còng thu ®−îc kÕt qu¶ t−¬ng tù nh− c«ng thøc ®èi chøng, chØ cã ë c«ng thøc ®−îc cÊy chñng t¶o Isochrysis galbana 15 l−îng vi khuÈn gi¶m 50%.Khi t¨ng nång ®é peflacine lªn 20 µg/ml, l−îng vi khuÈn ë c¸c ®Üa ®−îc cÊy c¸c chñng t¶o ®Òu gi¶m ®¸ng kÓ trõ Chlorella. B¶ng 2: ¶nh h−ëng cña peflacine ®Õn sinh tr−ëng cña vi khuÈn trªn m«i tr−êng th¹ch ®Æc (tÝnh b»ng % diÖn tÝch mÆt ®Üa th¹ch cã vi khuÈn mäc) Gièng Nång ®é (µg/ml) T.chuii D.salina Ch.vulgaris N.oculata I.galbana §C 100% (nhiÒu lo¹i khuÈn l¹c ) 100% 100% 100% (nhiÒu lo¹i khuÈn l¹c) 100% 2.5 100% (nhiÒu lo¹i khuÈn l¹c ) 100%, 2 lo¹i khuÈn l¹c 100% 100%, 1 lo¹i khuÈn l¹c 50% 5 20%, chØ cã 2 lo¹i khuÈn l¹c. 10% 100% 20%, khuÈn l¹c bÐ 50% 10 15%, cã 2 lo¹i khuÈn l¹c 9%, 1 lo¹i khuÈn l¹c 100% 10%, khuÈn l¹c rÊt bÐ 40%, khuÈn l¹c bÐ. 20 10%, chØ cã mét lo¹i khuÈn l¹c 7% 100% 0 0 40 10%, chØ cã mét lo¹i khuÈn l¹c 20 khuÈn l¹c 100% 0 0 50 120 khuÈn l¹c( 1 lo¹i) 2 khuÈn l¹c 100% 0 0 80 70 khuÈn l¹c 0 100% 0 0 150 30 khuÈn l¹c ph¸t triÓn bÐ 0 100% 0 0 ë c¸c ®Üa th¹ch ®−îc cÊy dÞch t¶o Chlorella l−îng vi khuÈn vÉn rÊt nhiÒu, chiÕm 100% diÖn tÝch mÆt ®Üa th¹ch. Trong khi ®ã ë c¸c ®Üa th¹ch ®−îc cÊy dÞch t¶o Nannochloropsis oculata vµ Isochrysis galbana kh«ng thÊy xuÊt hiÖn vi khuÈn. KÕt qu¶ t−¬ng tù còng thu ®−îc khi cÊy dÞch t¶o Dunaliella lªn m«i tr−êng th¹ch cøng cã bæ sung peflacine nång ®é 80µg/ml . 16 Tõ kÕt qu¶ trªn cã thÓ nhËn xÐt r»ng viÖc bæ sung peflacine nång ®é 20µg/ml vµo m«i tr−êng th¹ch ®Æc cã kh¶ n¨ng lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn khái t¶o Nannochloropsis oculata vµ t¶o Isochrysis galbana . §èi víi chñng t¶o Dunaliella salina nång ®é kh¸ng sinh cÇn bæ sung lµ 80µg/ml , cßn ®èi víi 2 chñng t¶o Tetraselmis chuii vµ Chlorella nång ®é kh¸ng sinh peflacine 150ml vÉn kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn khái hai chñng t¶o nµy. §Ó t×m hiÓu thªm vÒ kh¶ n¨ng lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o Dunaliella salina cña peflacine, chóng t«i còng ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm t¸c dông diÖt khuÈn cña peflacine trong m«i tr−êng láng nu«i t¶o. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 3. B¶ng 3: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña vi khuÈn trong dÞch t¶o D. salina Nång ®é µg/ml Thêi gian 40 80 150 15 ngµy nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ë b¶ng 3 cho thÊy: viÖc bæ sung kh¸ng sinh trùc tiÕp vµo dÞch t¶o Dunaliella víi nång ®é tõ 40-150µg/ml kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn ra khái t¶o, trong lóc ®ã ë m«i tr−êng th¹ch cøng, l−îng peflacine cÇn sö dông lµ 80µg/ml (b¶ng 2). Cã thÓ ®iÒu nµy phô thuéc vµo l−îng dÞch t¶o( cô thÓ lµ sè l−îng vi khuÈn) cÊy vµo m«i tr−êng th¹ch. KÕt qu¶ nghiªn cøu ë b¶ng 4 còng cho thÊy khi t¨ng nång ®é peflacine trong dÞch t¶o tõ 40µg/ml ®Õn 150µg/ml kh«ng lµm ¶nh h−ëng xÊu ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o mµ ng−îc l¹i, mËt ®é t¶o ë c¸c c«ng thøc cã nång ®é peflacine 80/ml vµ 150µg/ml cã chiÒu h−íng cao h¬n mËt ®é t¶o ë c«ng thøc cã nång ®é peflacine 40µg/ml (§å thÞ 1) . Qua kÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 2 vµ b¶ng 4 cho thÊy cã thÓ sö dông peflacine nång ®é tõ 80-150µg/ml ®Ó lo¹i bá vi khuÈn khái t¶o trong ®iÒu kiÖn gi÷ gièng Dunaliella salina trong m«i tr−êng th¹ch. 17 B¶ng 4: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng (OD)cña t¶o D. salina Thêi gian (ngµy) Nång ®é (µg/ml) 1 3 4 7 11 14 40 0.110 0.212 0.325 0.426 0.555 0.591 80 0.110 0.215 0.336 0.452 0.568 0.609 150 0.110 0.217 0.331 0.422 0.566 0.603 Đồ thị 1: Ảnh hưởng của Peplacine lên sinh trưởng của D.salina 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1 3 4 7 11 14 Thời gian thí nghiệm (ngày) M ật đ ộ (O D ) 40µg/ml 80µg/ml 150µg/ml §èi víi c¸c gièng t¶o Tetraselmis chuii vµ Chlorella vulgaris, sö dông peflacine víi nång ®é tõ 2.5µg/ml -150µg/ml trong m«i tr−êng th¹ch ®Æc kh«ng cã hiÖu qu¶ lo¹i bá vi khuÈn. Trong lóc ®ã ®èi víi t¶o Nannochloropsis oculata , viÖc bæ sung peflacine vµo m«i tr−êng th¹ch ®Æc ë nång ®é 20µg/ml cho kÕt qu¶ tèt, lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn (b¶ng 2). Tuy nhiªn khi nu«i cÊy t¶o nµy trong m«i tr−êng láng nång ®é kh¸ng sinh bao nhiªu lµ phï hîp vµ peflacine ¶nh h−ëng nh− thÕ nµo ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o? §Ó lµm râ h¬n c©u hái trªn chóng t«i ®· tiÕp tôc thö nghiÖm bæ sung peflacine vµo dÞch t¶o Nannochloropsis oculata ®Ó theo dâi. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 5 vµ b¶ng 6. 18 B¶ng 5: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña vi khuÈn trong dÞch t¶o N. oculata Thêi gian (ngµy) Nång ®é (µg/ml) 3 6 9 §C 100% 100% 100% 2.5 100% 100% 100% 5 100% 80% 70% 10 50% 10% 8% 20 30% 10% 7% 40 25% 5% 3% KÕt qu¶ ë b¶ng 5 cho thÊy khi bæ sung peflacine vµo dÞch t¶o nång ®é 20µg/ml vµ 40µg/ml vÉn kh«ng cã kh¶ n¨ng lo¹i bá hÕt vi khuÈn. MÆt kh¸c viÖc bæ sung peflacine vµo dÞch t¶o ®· lµm gi¶m sinh tr−ëng cña t¶o Nannochloropsis oculata (b¶ng 6). V× vËy chóng t«i cho r»ng kh«ng nªn sö dông peflacine ®èi víi t¶o Nannochloropsis oculata. B¶ng 6: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng (OD) cña t¶o N. Oculata Thêi gian (ngµy) Nång ®é (µg/ml) 1 3 6 9 13 §C 0.083 0.155 0.299 0.460 0.604 2.5 0.083 0.149 0.274 0.416 0.616 5 0.083 0.121 0.288 0.58 0.57 10 0.083 0.152 0.288 0.404 0.551 20 0.083 0.139 0.252 0.312 0.439 40 0.083 0.134 0.237 0.316 0.437 19 §èi víi t¶o Isochrysis galbana, bæ sung peflacine vµo m«i tr−êng th¹ch cøng nång ®é tõ 20µg/ml -150µg/ml cã t¸c dông lo¹i bá hÕt vi khuÈn(b¶ng 2). Tuy nhiªn khi bæ sung kh¸ng sinh nµy vµo m«i tr−êng láng nu«i t¶o víi nång ®é tõ 20-150µg/ml kh«ng cã kh¶ n¨ng lo¹i bá hÕt vi khuÈn trong dÞch t¶o(b¶ng 7). B¶ng 7: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña vi khuÈn trong dÞch t¶o I. galbana Nång ®é KS µg/ml Thêi gian TN 20 40 80 150 15 ngµy nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c MÆt kh¸c, khi t¨ng nång ®é kh¸ng sinh peflacine lªn 80µg/ml ®· cã ¶nh h−ëng xÊu lªn sinh tr−ëng cña t¶o (b¶ng 8). V× vËy viÖc sö dông peflacine ®Ó bæ sung vµo dÞch t¶o Isochrysis galbana lµ kh«ng thÝch hîp. B¶ng 8: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña t¶o I.galbana Thêi gian (ngµy) Nång ®é (µg/ml) 1 3 7 10 14 17 20 0.054 0.115 0.269 0.334 0.376 0.470 40 0.054 0.118 0.283 0.357 0.382 0.483 80 0.054 0.119 0.250 0.317 0.340 0.432 150 0.054 0.102 0.211 0.250 0.306 0.359 Tõ nh÷ng kÕt qu¶ thu ®−îc ë trªn cho thÊy chØ nªn sö dông peflacine bæ sung vµo m«i tr−êng th¹ch víi nång ®é tõ 20-40µg/ml ®Ó gi÷ gièng c¸c gièng t¶o Nannochloropsis oculata vµ Isochrysis galbana, kh«ng nªn sö dông peflacine ®Ó bæ sung vµo m«i tr−êng láng nu«i t¶o. 20 Chóng t«i còng tiÕp tôc kiÓm tra hiÖu qu¶ diÖt khuÈn cña peflacine trong dÞch t¶o Chlorella vulgaris. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 9 vµ b¶ng 10. B¶ng 9: ¶nh h−ëng cña nång ®é Peflacine lªn sinh tr−ëng cña vi khuÈn trong dÞch t¶o Ch.vulgaris Thêi gian(ngµy) Nång ®é (µg/ml) 3 6 9 DC 100% 100% 100% 2.5 100% 100% 100% 5 100% 50% 40% 10 20% 20% 20% 20 10% 5% 5% 40 5% 2.5% 2% KÕt qu¶ ë b¶ng 9 cho thÊy l−îng vi khuÈn trong dÞch t¶o tuy cã gi¶m nhiÒu so víi c«ng thøc ®èi chøng tuy nhiªn víi nång ®é peflacine tõ 2.5µg/ml - 40µg/ml vÉn kh«ng cã kh¶ n¨ng lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn. Chóng t«i tiÕp tôc n©ng nång ®é kh¸ng sinh lªn 200-400µg/ml . KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 10 cho thÊy khi nång ®é peflacine trong m«i tr−êng nu«i t¶o ®¹t 400µg/ml vÉn kh«ng cã kh¶ n¨ng lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn trong dÞch t¶o. Tuy nhiªn nång ®é kh¸ng sinh peflacine tõ 2.5-40µg/ml víi thêi gian xö lÝ ng¾n (3-6 ngµy) kh«ng cã ¶nh h−ëng nhiÒu ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o (b¶ng 11, 12). B¶ng 10: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña vi khuÈn trong dÞch t¶o Ch. vulgaris Nång ®é µg/ml Thêi gian 200 300 400 15 ngµy nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c nhiÒu khuÈn l¹c 21 B¶ng 11: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña t¶o Ch. vulgaris Thêi gian (ngµy) Nång ®é (µg/ml) 1 3 6 9 13 §C 0.099 0.180 0.315 0.430 0.520 2.5 0.099 0.168 0.300 0.420 0.554 5 0.099 0.165 0.290 0.415 0.560 10 0.099 0.157 0.285 0.430 0.555 20 0.099 0.170 0.315 0.425 0.570 40 0.099 0.163 0.273 0.470 0.590 B¶ng 12: ¶nh h−ëng cña peflacine lªn sinh tr−ëng cña t¶o Ch. vulgaris (tiÕp) Thêi gian (ngµy) Nång ®é (µg/ml) 1 3 7 10 14 17 200 0.089 0.177 0.268 0.382 0.495 0.541 300 0.089 0.165 0.246 0.356 0.434 0.499 400 0.089 0.177 0.245 0.327 0.401 0.445 Chóng t«i còng ®· thö nghiÖm sö dông peflacine ®Ó bæ sung vµo dÞch t¶o Tetraselimis chuii, kÕt qu¶ cho thÊy ®èi víi t¶o Tetraselmis chuii, nång ®é peflacine tõ 50-200µg/ml kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o. ViÖc bæ sung peflacine vµo m«i tr−êng th¹ch víi nång ®é lªn ®Õn 300µg/ml còng kh«ng cã kÕt qu¶.V× vËy chóng t«i kh«ng tiÕp tôc thö nghiÖm sö dông peflacine ®èi víi t¶o Tetraselmis chuii. Tõ nh÷ng kÕt qu¶ thu ®−îc ë trªn cho thÊy: cã thÓ sö dông peflacine nång ®é 20µg/ml -40µg/ml bæ sung vµo m«i tr−êng th¹ch ®Ó gi÷ gièng c¸c 22 gièng t¶o Nannochloropsis oculata vµ Isochrysis galbana, nång ®é 80µg/ml ®Ó gi÷ gièng Dunaliella salina. Kh«ng nªn dïng Peflacine ®Ó bæ sung vµo dÞch t¶o. Peflacine kh«ng thÝch hîp víi c¸c gièng Chlorella vulgaris vµ Tetraselmis chuii. III.2.2.Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn kh¶ n¨ng thu t¶o s¹ch khuÈn §Ó t×m hiÓu ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn viÖc lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o, c¸c thÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh nh− sau: T¶o ®−îc cÊy vµo m«i tr−êng dinh d−ìng cã bæ sung Erythromycine nång ®é 5-200 µg /ml, sau ®ã theo dâi sinh tr−ëng cña t¶o. Sau thêi gian nu«i cÊy, dÞch t¶o ®−îc cÊy lªn ®Üa th¹ch ®Ó kiÓm tra sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn. B¶ng 13 : ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o D. salina Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 1 5 10 20 80 100 200 1 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 3 100% 100% 100% 100% 50% 50% 30% 6 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 9 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% KÕt qu¶ ë b¶ng 13 cho thÊy víi nång ®é Erythromycine tõ 5-200 µg /ml kh«ng cã t¸c dông øc chÕ sinh tr−ëng cña vi khuÈn trong dÞch t¶o Dunaliella salina. ë tÊt c¶ c¸c mÉu t¶o ®−îc bæ xung kh¸ng sinh vi khuÈn ®Òu phñ kÝn 100% diÖn tÝch bÒ mÆt ®Üa th¹ch. KÕt qu¶ t−¬ng tù còng thu ®−îc khi thÝ nghiÖm víi dÞch t¶o Nannochloropsis oculata (b¶ng 14) vµ t¶o Isochrysis galbana (b¶ng 15). 23 B¶ng 14: ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o N. oculata. Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 3 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 6 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 9 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% B¶ng 15 : ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o I. galbana Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 100% 100% 100% 100% 50% 30% 20% 3 100% 100% 100% 50% 50% 25% 20% 6 100% 100% 50% 30% 30% 25% 20% 9 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®−îc ë b¶ng 14 vµ 15 cho thÊy viÖc dïng kh¸ng sinh Erythromycine kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o. Víi m«i tr−êng ®−îc bæ sung kh¸ng sinh Erythrromycine tõ 5-200 µg /ml, l−îng vi khuÈn trong dÞch t¶o Nannochloropsis oculata kh«ng gi¶m so víi ®èi chøng (b¶ng 14). §èi víi t¶o Isochrysis galbana ë c¸c c«ng thøc cã bæ sung Erythromycine, tuy l−îng vi khuÈn gi¶m nh−ng kh«ng cã hiÖu qu¶ lo¹i bá hÕt vi khuÈn (b¶ng 15). MÆt kh¸c Erythromycine cã ¶nh h−ëng xÊu ®Õn sinh tr−ëng cña Duanliella salina (b¶ng 16, ®å thÞ 2 ). 24 B¶ng 16 : ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sinh tr−ëng cña t¶o D. salina Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 0.119 0.122 0.121 0.118 0.116 0.118 0.114 3 0.153 0.147 0.131 0.125 0.127 0.124 0.123 5 0.201 0.212 0.195 0.157 0.156 0.147 0.129 7 0.232 0.255 0.214 0.172 0.162 0.159 0.134 9 0.258 0.296 0.241 0.211 0.189 0.159 0.127 11 0.275 0.317 0.261 0.233 0.203 0.150 0.109 14 0.309 0.353 0.283 0.240 0.207 0.142 0.100 Đồ thị 2: Ảnh hưởng của Erythrromycine lên sinh trưởng của D.saliana 0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 3 5 7 9 11 14 Thời gian thí nghiệm (ngày) M ật đ ộ tế b ào ( O D ) 0µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 20µg/ml 80µg/ml 100µg/ml 200µg/ml 25 B¶ng 17: ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sinh tr−ëng cña t¶o Nannochloropsis oculata Nång ®é µg ml Thêi gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 0.146 0.147 0.147 0.142 0.141 0.134 0.125 3 0.186 0.189 0.183 0.174 0.172 0.154 0.136 5 0.207 0.210 0.202 0.192 0.186 0.163 0.142 7 0.242 0.246 0.233 0.210 0.200 0.176 0.158 9 0.281 0.285 0.278 0.224 0.213 0.185 0.165 11 0.310 0.321 0.300 0.245 0.236 0.183 0.152 14 0.340 0.353 0.314 0.272 0.261 0.175 0.143 §å thÞ 3:¶ nh h−ëng cña Erythromycine lªn sinh tr−ëng cña t¶o N.oculata 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 1 3 5 7 9 11 14 Thêi gian (ngµy) M Ët ® é tÕ b µo (O D ) 0µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 20µg/ml 80µg/ml 100µg/mll 200µg/ml Erythromycine còng cã ¶nh h−ëng xÊu ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o Nannochloropsis oculata (b¶ng 17, ®å thÞ 3 ) chØ sè OD cña t¶o tØ lÖ nghÞch víi 26 t¨ng nång ®é kh¸ng sinh. ë c¸c c«ng thøc cã bæ sung Erythromycine víi nång ®é 200µg /ml, t¶o hÇu nh− kh«ng sinh tr−ëng. KÕt qu¶ t−¬ng tù còng thu ®−îc ®èi víi t¶o Isochrysis galbana (b¶ng 18 vµ ®å thÞ 4). B¶ng 18 : ¶nh h−ëng cña Erythromycine lªn sinh tr−ëng cña t¶o I. galbana Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày 0 5 10 20 80 100 200 1 0.119 0.115 0.116 0.115 0.111 0.110 0.108 3 0.161 0.153 0.147 0.142 0.141 0.134 0.119 5 0.207 0.173 0.162 0.147 0.146 0.140 0.123 7 0.240 0.191 0.177 0.156 0.154 0.124 0.116 9 0.290 0.200 0.185 0.171 0.145 0.124 0.113 11 0.326 0.195 0.161 0.157 0.133 0.118 0.099 14 0.358 0.192 0.165 0.141 0.125 0.102 0.086 §å thÞ 4: ¶ nh h−ëng cña Erythrromycine lªn sinh tr−ëng cña t¶o I.gabana 0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 3 5 7 9 11 14 Thời gian thí nghiệm (ngày) M Ët ® é tÕ b µo (O D ) 0µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 20µg/mll 80µg/ml 100µg/ml 200µg/ml 27 Nh− vËy tõ kÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy Erythromycine kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o, mÆt kh¸c Erythromycine cã ¶nh h−ëng xÊu ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o. V× vËy kh«ng nªn sö dông Erythromycine. III.2.3 Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña TA lªn viÖc lo¹i bá vi khuÈn ë t¶o §Ó chän kh¸ng sinh thÝch hîp cho viÖc lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o, chóng t«i tiÕp tôc thö nghiÖm víi TA. TA lµ kh¸ng sinh thuéc nhãm carbonhydrat, nång ®é TA ®−îc sö dông trong thÝ nghiªm lµ 0;1; 2.5; 10; 20 (µg/ml). T¶o ®−îc dïng trong thÝ nghiÖm nµy lµ Dunaliella salina. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 19 cho thÊy viÖc bæ sung TA vµo m«i tr−êng nu«i cÊy t¶o Dunaliella salina cã t¸c dông diÖt vi khuÈn tèt. ë c«ng thøc ®−îc bæ sung TA 10µg /ml vµ 20 µg /ml, sau 3 ngµy nu«i cÊy sè l−îng vi khuÈn trong dÞch t¶o Dunaliella salina chØ cßn l¹i rÊt Ýt, trong khi ®ã ë c«ng thøc ®èi chøng (kh«ng bæ sung TA) vi khuÈn chiÕm kÝn 100% bÒ mÆt ®Üa th¹ch (bao gåm nhiÒu lo¹i khuÈn l¹c víi kÝch th−íc, mµu s¾c kh¸c nhau). KÕt qu¶ thÝ nghiÖm sau 6 ngµy nu«i cÊy ®−îc thÓ hiÖn ë ¶nh 3 cho thÊy : B¶ng 19: ¶nh h−ëng cña kh¸ng sinh TA lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o D.salina Nång ®é (µg /ml) Thêi gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 3 100% 100% 100% 1% Ýt 6 100% 100% 20% 0 0 Sau thêi gian 6 ngµy tõ khi bæ sung TA vµo m«i tr−êng nu«i cÊy, l−îng vi khuÈn trong dÞch t¶o ®· ®−îc lo¹i bá hoµn toµn ë c«ng thøc cã nång ®é kh¸ng sinh 10 µg /ml. ThÝ nghiÖm ®· ®−îc lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ cho kÕt qu¶ t−¬ng tù. V× vËy cã thÓ kh¼ng ®Þnh nång ®é TA 10µg /ml - 20µg /ml lµ thÝch hîp cho viÖc tiªu diÖt hoµn toµn vi khuÈn trong dÞch t¶o Dunaliella salina. 28 §èi chøng N§KS : 1.0µg/ml N§KS: 2.5µg/ml N§KS: 10µg/m ¶nh 3: ¶nh h−ëng cña nång ®é TA lªn sinh tr−ëng cña vi khuÈn. §Ó xem xÐt kh¶ n¨ng sö dông kh¸ng sinh nµy trong viÖc lµm s¹ch vi khuÈn ë t¶o Dunaliella salina cÇn t×m hiÓu ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o. KÕt qu¶ thu ®−îc ë b¶ng 20, ®å thÞ 5 vµ b¶ng 21 cho thÊy viÖc bæ sung TA vµo m«i tr−êng nu«i cÊy víi nång ®é tõ 0.5 µg /ml- 40µg /ml kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o Dunaliella salina, ng−îc l¹i ë nh÷ng c«ng thøc cã bæ sung kh¸ng sinh t¶o sinh tr−ëng tèt h¬n, mËt ®é OD cña t¶o cao h¬n so víi c«ng thøc kh«ng bæ sung TA. §å thÞ 5: ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o D.salina 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 1 2 4 6 8 11 13 15 18 20 22 24 Thêi gian thÝ nghiÖm (ngµy) M Ët ® é tÕ b µo (O D ) 0 µg/ml 0.5µg/ml 1µg/ml 1.5µg/ml 2.5µg/ml 29 B¶ng 20 : ¶nh h−ëng cña TA ®ªn sinh tr−ëng cña t¶o D. salina MËt ®é t¶o (OD) Nång ®é KS µg /ml Thêi gian TN (ngày) 0 0.5 1.0 1.5 2.5 1 0.094 0.084 0.094 0.098 0.098 2 0.147 0.134 0.142 0.145 0.147 4 0.11 0.190 0.198 0.204 0.184 6 0.230 0.216 0.226 0.250 0.242 8 0.235 0.242 0.245 0.248 0.241 11 0.380 0.364 0.387 0.372 0.302 13 0.369 0.353 0.365 0.364 0.359 15 0.400 0.384 0.408 0.403 0.409 18 0.367 0.365 0.381 0.387 0.390 20 0.390 0.394 0.420 0.416 0.428 22 0.406 0.411 0.429 0.426 0.438 24 0.381 0.401 0.436 0.414 0.437 Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®−îc cã thÓ kh¼ng ®Þnh viÖc sö dông TA bæ sung vµo dÞch t¶o Dunaliella salina víi nång ®é 10-20 µg /ml cã t¸c dông lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn nh−ng kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o Dunaliella salina. 30 B¶ng 21: Sinh tr−ëng cña t¶o Duanliella salina trong m«i tr−êng cã bæ sung TA MËt ®é t¶o (OD) Nång ®é µg /ml Thêigian (ngày) 0 1.0 2.5 10 20 40 2 0.122 0.120 0.120 0.120 0.102 0.106 4 0.131 0.129 0.134 0.132 0.111 0.122 6 0.140 0.147 0.152 0.157 0.141 0.162 8 0.148 0.139 0.168 0.166 0.151 0.169 10 0.157 0.179 0.206 0.247 0.219 0.224 12 0.170 0.182 0.225 0.267 0.228 0.233 14 0.183 0.184 0.265 0.293 0.233 0.262 TiÕp tôc nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña TA lªn viÖc lo¹i bá vi khuÈn ë t¶o N.oculata. KÕt qu¶ thu ®−îc ë b¶ng 22 cho thÊy TA víi nång ®é 10µg /ml bæ sung vµo m«i tr−êng sau 3 ngµy ®· cã t¸c dông lo¹i bá hÕt vi khuÈn trong dÞch t¶o. Bảng 22 : Ảnh hưởng của TA lên sự có mặt của vi khuÈn trong dịch tảo N. oculata Nång ®é (µg /ml) Thêi gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 3 100% 100% RÊt Ýt 0 0 6 100% 20% 0 0 0 31 NÕu dïng nång ®é thÊp (2.5µg /ml) sau 6 ngµy trong dÞch t¶o ®· hoµn toµn hÕt vi khuÈn. (Trong lóc ®ã ®èi víi t¶o Dunaliella salina víi nång ®é TA 10µg /ml sau 6 ngµy míi cã thÓ lo¹i bá ®−îc hoµn toµn vi khuÈn). B¶ng 23 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o N.oculata Nång ®é µg /ml Thêii gian (ngày) 0 1.0 2.5 10 20 40 2 0.182 0.183 0.181 0.170 0.169 0.168 4 0.237 0.236 0.231 0.239 0.226 0.226 6 0.254 0.248 0.248 0.259 0.237 0.228 8 0.299 0.292 0.296 0.300 0.309 0.279 10 0.374 0.354 0.348 0.353 0.370 0.341 12 0.393 0.356 0.354 0.368 0.370 0.353 14 0.432 0.393 0.374 0.394 0.401 0.370 ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ thu ®−îc kÕt qu¶ t−¬ng tù. Nh− vËy cã thÓ lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o Nannochloropsis oculata b»ng c¸ch bæ sung TA vµo m«i tr−êng nu«i víi nång ®é 2.5 µg /ml sau thêi gian 6 ngµy hoÆc 10 µg /ml sau thêi gian 3 ngµy. Tuy nhiªn ®Ó cã thÓ sö dông kÕt qu¶ trªn vµo viÖc lo¹i bá vi khuÈn, thu t¶o Nannochloropsis oculata s¹ch khuÈn, cÇn xem xÐt møc ®é ¶nh h−ëng cña kh¸ng sinh TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 23 cho thÊy viÖc bæ sung TA víi nång ®é 2.5 µg /ml hoÆc 10µg /ml vµo m«i tr−êng nu«i cÊy kh«ng cã ¶nh h−ëng ®¸ng kÓ ®Õn 32 sinh tr−ëng cña t¶o. MËt ®é t¶o Nannochloropsis oculata (chØ sè OD) sau 6 ngµy nu«i cÊy ë c«ng thøc cã bæ sung TA 2.5µg /ml vµ 10µg /ml lµ 0.248 vµ 0.259 so víi c«ng thøc kh«ng bæ sung kh¸ng sinh lµ 0.254 Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy nång ®é TA tõ 2.5 -10µg /ml (thêi gian xö lý 6 ngµy) cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o nh−ng kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o Nannochloropsis oculata. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 24 cho thÊy khi bæ sung TA vµo dÞch t¶o Isochrysis galbana víi nång ®é tõ 1-10 µg /m sè l−îng vi sinh vËt trong dÞch t¶o ®· gi¶m nhiÒu, tuy nhiªn sau 13 ngµy nu«i cÊy dÞch t¶o vÉn cßn vi khuÈn. Khi t¨ng nång ®é TA lªn 20 µg /ml sau 3 ngµy nu«i trong dÞch t¶o ®· hoµn toµn s¹ch khuÈn. B¶ng 24: ¶nh h−ëng cña TA lªn viÖc lo¹i bá vi khuÈn trong dÞch t¶o I. galbana Nång ®é µg /ml) Thêi gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 40 3 100% 30% 10% RÊt Ýt 0 0 6 100% 20% 5% 0 0 0 9 100% 20% 1% RÊt Ýt 0 0 13 100% 20% 1% RÊt Ýt 0 0 KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ë b¶ng 25 cho thÊy viÖc bæ sung kh¸ng sinh vµo m«i tr−êng nu«i cÊy t¶o Isochrysis galbana víi nång ®é tõ 1-20 µg /ml trong thêi gian 3-6 ngµy kh«ng lµm ¶nh h−ëng nhiÒu ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o. MËt ®é t¶o ë c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm vµ ®èi chøng kh«ng cã sai kh¸c ®¸ng kÓ. Khi t¨ng nång ®é TA lªn 40µg /ml vµ kÐo dµi thêi gian xö lý t¶o sinh tr−ëng kÐm h¬n nhiÒu so víi ®èi chøng. 33 B¶ng 25 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o I. galbana Nång ®é µg ml Thêi gian (ngày 0 1 2.5 10 20 40 1 0.060 0.060 0.060 0.060 0.060 0.060 3 0.084 0.087 0.093 0.098 0.135 0.143 6 0.165 0.156 0.159 0.182 0.186 0.166 9 0.214 0.201 0.197 0.213 0.233 0.172 13 0.260 0.242 0.241 0.251 0.279 0.171 Nh− vËy tõ kÕt qu¶ thÝ nghiÖm thu ®−îc ë trªn cã thÓ kh¼ng ®Þnh: §èi víi t¶o Isochrysis galbana viÖc bæ sung TA víi nång ®é 20µg /ml vµo m«i tr−êng nu«i cÊy 3-6 ngµy ®· lo¹i bá ®−îc hoµn toµn vi khuÈn trong dÞch t¶o nh−ng kh«ng lµm ¶nh h−ëng nhiÒu ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o I.galbana. Tuy nhiªn nÕu tiÕp tôc nu«i t¶o trong m«i tr−êng cã kh¸ng sinh, sinh tr−ëng cña t¶o sÏ gi¶m so víi ®èi chøng (b¶ng 25). V× vËy sau thêi gian nãi trªn cÇn chuyÓn t¶o sang m«i tr−êng míi kh«ng chøa kh¸ng sinh ®Ó t¶o I.galbana sinh tr−ëng tèt. Tõ kÕt qu¶ kh¶ quan thu ®−îc ®èi víi t¶o Dunaliella salina, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, chóng t«i tiÕp tôc më réng thÝ nghiÖm sö dông TA bæ sung vµo m«i tr−êng nu«i cÊy nh»m lµm s¹ch khuÈn ®èi víi t¶o Tetraselmis Chuii vµ Chlorella vulgaris. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ë b¶ng 26 cho thÊy khi bæ sung TA vµo m«i tr−êng nu«i cÊy Tetreselmis chuii víi nång ®é 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5 µg /ml, chØ cã nång ®é 2.5 µg /ml lµ cã hiÖu qu¶ diÖt khuÈn vµ thêi gian thÝ nghiÖm ph¶i kÐo dµi 20- 25 ngµy. V× vËy chóng t«i ®· t¨ng nång ®é kh¸ng sinh lªn c¸c møc 10, 20, 40µg/ml. 34 B¶ng 26: ¶nh h−ëng cña TA lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o T. chuii Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 0 0.5 1 1.5 2.0 2.5 5 100% 100% 100% 100% 100% 100% 10 100% 100% 100% 100% 100% 100% 15 100% 100% 100% 30% 20% 10% 20 100% 20% 20% 10% Ýt 0 25 100% 20% 1% Ýt RÊt Ýt 0 B¶ng 27 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o T.chuii. (tiÕp) Nång ®é (µg /ml) Thêi gian (ngày) 0 2.5 10 20 40 3 100% 100% 30% 1% Ýt 6 100% 80% 0 0 0 Chóng t«i còng ®· t×m hiÓu ng−ìng nång ®é TA thÝch hîp ®Ó lo¹i bá vi khuÈn khi sö dông m«t tr−êng r¾n. KÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 28 cho thÊy khi sö dông m«i tr−êng nu«i cÊy lµ m«i tr−êng th¹ch (r¾n), l−îng TA chØ cÇn bæ sung víi nång ®é thÊp (2.5µg /ml) ®· lo¹i bá ®−îc hoµn toµn vi khuÈn ra khái t¶o. 35 B¶ng 28 : ¶nh h−ëng cña nång ®é kh¸ng sinh TA lªn viÖc lo¹i bá vi khuÈn (khi cÊy trùc tiÕp dÞch t¶o T. chuii lªn m«i tr−êng r¾n cã kh¸ng sinh) Nång ®é (µg /ml) Thêi gian (ngày) 0 2.5 10 20 40 3 100% 0 0 0 0 6 100% 0 0 0 0 B¶ng 29 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng (OD) cña t¶o T.chuii Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 0 0.5 1.0 1.5 2.5 2 0.112 0.128 0.129 0.126 0.133 4 0.156 0.208 0.216 0.207 0.207 6 0.194 0.256 0.271 0.258 0.248 8 0.21 0.317 0.345 0.321 0.296 10 0.310 0.349 0.411 0.378 0.364 12 0.348 0.382 0.445 0.406 0.404 14 0.367 0.415 0.479 0.445 0.439 16 0.390 0.431 0.499 0.460 0.454 18 0.420 0.469 0.531 0.493 0.491 20 0.437 0.489 0.556 0.514 0.515 36 KÕt qu¶ theo dâi sinh tr−ëng cña t¶o T.chuii trong ®iÒu kiÖn cã bæ sung kh¸ng sinh ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 29 vµ ®å thÞ 6 cho thÊy viÖc bæ sung TA vµo dÞch t¶o víi nång ®é tõ 0.5 -2.5µg /ml kh«ng cã ¶nh h−ëng xÊu dÕn sinh tr−ëng cña t¶o. Ng−îc l¹i ë c«ng thøc cã bæ sung kh¸ng sinh, sinh tr−ëng cña t¶o Tetraselmis chuii tèt h¬n, mËt ®é (OD) t¶o cao h¬n so víi c«ng thøc ®èi chøng (kh«ng bæ sung kh¸ng sinh). Trong ®ã c«ng thøc cã bæ sung TA 1µg /ml cã ¶nh h−ëng tèt ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o h¬n so víi c¸c c«ng thøc cßn l¹i (®å thÞ 6). §å thÞ 6: ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng (OD) cña t¶o T.chuii. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thêi gian thÝ nghiÖm (ngµy) M Ët ® é tÕ b µo ( O D ) 0 µg/ml 0.5µg/ml 1µg/ml 1.5µg/ml 2.5µg/ml TiÕp tôc xem xÐt ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o Tetraselmis chuii khi t¨ng nång ®é kh¸ng sinh trong dÞch t¶o lªn 10, 20, 40µg /ml, chóng t«i nhËn thÊy t¶o vÉn sinh tr−ëng tèt (b¶ng 30). MËt ®é t¶o ë c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm ®Òu cao h¬n so víi c«ng thøc ®èi chøng (kh«ng cã kh¸ng sinh). Tõ kÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy: §èi víi t¶o Tetraselmis chuii cã thÓ sö dông TA nång ®é 2.5 µg/ml trong m«i tr−êng th¹ch vµ 10µg /ml trong m«i tr−êng láng ®Ó lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn, thu t¶o s¹ch khuÈn. 37 B¶ng 30 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o T. chuii Nång ®é µg/ml Ngµy 0 10 20 40 0 0.125 0.125 0.125 0.125 3 0.21 0.25 0.26 0.26 3 0.57 0.65 0.725 0.788 3 0.715 0.820 0.915 0.956 4 0.920 0.971 0.988 1.050 3 1.251 1.362 1.384 1.390 B¶ng 31 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sù cã mÆt cña vi khuÈn trong dÞch t¶o Ch.vulgaris Nång ®é µg/ml Thêi gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 40 3 100% 30% RÊt Ýt RÊt Ýt 2-4 khuÈn l¹c 0 6 100% 30% RÊt Ýt 0 0 0 9 100% 30% 10% 1% 0 0 13 100% 30% 7% 1-2 khuÈn l¹c 0 0 38 §èi víi t¶o Ch.vulgaris, viÖc bæ sung kh¸ng sinh TA vµo m«i tr−êng nu«i cÊy tõ 1 ®Õn 20µg /ml ®Òu cã t¸c dông h¹n chÕ sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong dÞch t¶o, nh−ng ®Ó lo¹i bá ®−îc hoµn toµn vi khuÈn khái t¶o cÇn bæ sung TA víi nång ®é 20µg /ml, thêi gian nu«i cÊy 6 ngµy (b¶ng 31).NÕu sö dông TA nång ®é cao h¬n (40µg /ml), thêi gian nu«i cÊy chØ cÇn 3 ngµy ®· cã thÓ thu ®−îc t¶o s¹ch khuÈn. Tuy nhiªn ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é TA thÝch hîp sö dông cho t¶o Ch.vulgaris cÇn xem xÐt ¶nh h−ëng cña kh¸ng sinh nµy lªn sinh tr−ëng cña t¶o. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë b¶ng 32 vµ ®å thÞ 7 cho thÊy t¶o Ch.vulgaris ®−îc bæ sung TA víi nång ®é tõ 1-40 µg /ml sinh tr−ëng nhanh h¬n, mËt ®é OD cña t¶o ë c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm ®Òu cao h¬n nhiÒu so víi c«ng thøc kh«ng ®−îc bæ sung TA. Sau 14 ngµy thÝ nghiÖm ë c«ng thøc cã bæ sung TA 20µg /ml vµ 40µg /ml, mËt ®é OD cña t¶o Ch.vulgaris lµ 0.323 vµ 0.386 so víi ®èi chøng lµ 0.295. B¶ng 32 : ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o Ch.vulgaris. Nång ®é µg /ml Thêi gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 40 1 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 3 0.164 0.180 0.203 0.209 0.245 0.348 7 0.232 0.250 0.263 0.253 0.266 0.295 10 0.286 0.298 0.312 0.290 0.305 0.383 14 0.295 0.320 0.332 0.324 0.323 0.386 39 §å thÞ 7: ¶nh h−ëng cña TA lªn sinh tr−ëng cña t¶o Ch.vulgaris 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 1 3 7 10 14 Thêi gian thÝ nghiÖm (ngµy) M Ët ® é tÕ b µo ( O D ) 0 µg/ml 1 µg/ml 2.5 µg/ml 10 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml Tõ nh÷ng kÕt qu¶ thu ®−îc ë trªn cho thÊy cã thÓ sö dông TA nång ®é 20µg /ml ®Ó lo¹i bá hoµn toµn vi khuÈn trong dÞch t¶o Ch.vulgaris. Nh− vËy TA cã t¸c dông rÊt tèt trong viÖc lo¹i bá vi khuÈn ra khái t¶o ®Ó thu t¶o s¹ch khuÈn. Nång ®é TA thÝch hîp víi tõng chñng t¶o kh¸c nhau: D.salina 10- 20µg /ml; N.oculata 2.5µg /ml; I.galbana 20µg /ml; T.chuii 10µg/ml vµ Ch.vulgaris 20µg /ml. III.3. Nghiªn cøu b¶o qu¶n t¶o b»ng kÜ thuËt lµm bÊt ®éng. Nguyªn t¾c cña ph−¬ng ph¸p lµ cè ®Þnh t¶o trong gel ë d¹ng h¹t vµ b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é thÝch hîp trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã ¸nh s¸ng. Sau thêi gian b¶o qu¶n, tÕ bµo t¶o ®−îc gi¶i phãng b»ng c¸ch hoµ tan c¸c h¹t gel vµ nu«i trong ®iÒu kiÖn thÝch hîp ®Ó t¶o sinh tr−ëng. §Ó t×m ®−îc ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n thÝch hîp ®èi víi c¸c chñng t¶o nghiªn cøu: Dunaliella salina. Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Tetraselmis chuii vµ Chlorella vulgaris, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm mét sè ph−¬ng ph¸p sau: 1. Sö dông chÊt t¹o gel nång ®é 3%(1), gi¶i ®«ng b»ng chÊt chøa phosphate(1). 2. Sö dông chÊt t¹o gel nång ®é 1.5%(2), gi¶i ®«ng b»ng muèi citrate(2) KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ë b¶ng 33 cho thÊy ë c«ng thøc 1 t¶o Ch.vulgaris 40 ®−îc b¶o qu¶n b»ng chÊt t¹o gel nång ®é 3% (1) vµ sö dông chÊt gi¶i ®«ng lµ hîp chÊt chøa phosphate (1), h¹t t¶o ®−îc hoµ tan chËm, sau 4 giê l−îng h¹t hoµ tan kho¶ng 90% vµ 100% sè h¹t ®−îc hoµ tan hÕt sau 45-50 g׬. DÞch tan ë d¹ng gel, sau ®ã dÞch t¶o bÞ ®ôc, t¶o sinh tr−ëng kÐm. B¶ng 33: KÕt qu¶ thö nghiÖm b¶o qu¶n gièng t¶o. C«ng thøc Gièng t¶o Nång ®é chÊt b¶o qu¶n ChÊt gi¶i ®«ng NhËn xÐt 1. 2. 3. Ch.vulgaris Ch.vulgaris Ch.vulgaris (1) (2) (2) (1) (1) (2) H¹t t¶o tan rÊt chËm (sau 45- 50 giê). DÞch t¶o ®ôc, t¶o sinh tr−ëng kÐm. H¹t t¶o tan sau 4h, dÞch t¶o ë d¹ng gel, ®ôc, t¶o sinh tr−ëng kÐm H¹t t¶o tan nhanh (sau 28 phót). DÞch t¶o trong, kh«ng xuÊt hiÖn thÓ gel, t¶o håi phôc nhanh ë c«ng thøc 2, t¶o ®−îc b¶o qu¶n b»ng chÊt t¹o gel nång ®é 1,5%(2), sau ®ã ®−îc gi¶i ®«ng b»ng hîp chÊt chøa phosphate (1) t¶o tan hÕt sau 4h, dÞch t¶o ë d¹ng gel, ®ôc. TiÕp tôc theo dâi sinh tr−ëng cña t¶o sau khi gi¶i ®«ng cho thÊy t¶o håi phôc chËm, sinh tr−ëng kÐm. ë c«ng thøc 3 t¶o ®−îc b¶o qu¶n b»ng chÊt t¹o gel nång ®é 1.5%(2), sau khi b¶o qu¶n, h¹t t¶o ®−îc hoµ tan b»ng muèi citrate (2). KÕt qu¶ cho thÊy sau 28 phót, toµn bé sè h¹t t¶o hoµ tan hÕt, dÞch trong, kh«ng xuÊt hÞªn thÓ gel, t¶o phôc håi tèt. TiÕp tôc thö nghiÖm víi c¸c chñng t¶o Dunaliella salina, Nanochloropsis oculata, Isochrrysis galbana vµ Tetraselmis chuii, chóng t«i cïng thu ®−îc kÕt qu¶ t−¬ng tù. 41 Qua nh÷ng kÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy sö dông chÊt t¹o gel nång ®é 3% hoÆc 1,5% ®Òu cã thÓ t¹o c¸c h¹t t¶o cã kÝch th−íc vµ ®é cøng ®¹t yªu cÇu (¶nh 6). Tuy nhiªn khi gi¶i ®«ng ®Ó gi¶i phãng tÕ bµo t¶o, dïng muèi citrate tèt h¬n muèi phosphate, dÞch t¶o thu ®−îc sau khi ®−îc gi¶i ®«ng kh«ng bÞ ®ôc, t¶o phôc håi nhanh. KÕt qu¶ thö nghiÖm còng cho thÊy nång ®é chÊt t¹o gel 3% hoÆc 1.5% kh«ng cã ¶nh h−ëng ®¸ng kÓ ®Õn thêi gian hoµ tan h¹t t¶o khi gi¶i ®«ng. Tuy nhiªn víi nång ®é chÊt t¹o gel 1.5%, dÞch t¶o sau khi gi¶i ®«ng trong h¬n, thuËn lîi cho sinh tr−ëng cña t¶o. V× vËy nªn sö dông chÊt t¹o gel nång ®é 1.5% ®Ó b¶o qu¶n t¶o . Sau khi b¶o qu¶n hoµ tan h¹t t¶o b»ng muèi citrate. H¹t t¶o sau khi hoµ tan ®−îc bæ sung m«i tr−êng dinh d−ìng vµ ®Æt t¶o d−íi ¸nh s¸ng yÕu, nhiÖt ®é thÊp ®Ó t¶o sinh tr−ëng, sau ®ã kiÓm tra tr¹ng th¸i tÕ bµo vµ ho¹t ®éng sinh lÝ cña t¶o. KÕt qu¶ cho thÊy sau b¶o qu¶n, tÕ bµo t¶o vÉn cßn nguyªn vÑn, kÝch th−íc tÕ bµo t¶o nhá h¬n tÕ bµo ®èi chøng, lôc l¹p vµ c¸c c¬ quan tö lÖch vÒ mét phÝa (¶nh 4, trang 44 ), t¶o Ýt di chuyÓn. TiÕp tôc kiÓm tra tr¹ng th¸i cña c¸c tÕ bµo t¶o sau khi hoµ tan vµ nu«i trong ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng yÕu, nhiÖt ®é thÊp trong 6 ngµy. KÕt qu¶ cho thÊy: t¶o cã mµu xanh h¬n, kÝch th−íc tÕ bµo to dÇn, phÇn lín sè tÕ bµo t¶o cã d¹ng ®Æc tr−ng, tÕ bµo t¶o trë l¹i tr¹ng th¸i b×nh th−êng, chuyÓn ®éng nhanh h¬n. Sau 10-15 ngµy, c¸c tÕ bµo t¶o phôc håi b¾t ®Çu sinh tr−ëng tèt. Tuy nhiªn chóng t«i còng nhËn thÊy c¸c kÕt qu¶ thÝ nghiÖm ë c¸c lÇn lÆp l¹i kh«ng gièng nhau vµ phô thuéc rÊt nhiÒu ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm nh−: mËt ®é t¶o ®−a vµo b¶o qu¶n, ®iÒu kiÖn g©y nu«i sau khi b¶o qu¶n (¸nh s¸ng, nhiÖt ®é m«i tr−êng, dinh d−ìng...).V× vËy viÖc nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn g©y nu«i t¶o sau khi b¶o qu¶n lµ hÕt søc cÇn thiÕt. III.4.¶nh h−ëng cña mét sè ®iÒu kiÖn lªn sinh tr−ëng cña t¶o sau khi b¶o qu¶n. III.4.1 ¶nh h−ëng cña mËt ®é t¶o lªn kÕt qu¶ b¶o qu¶n. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm ®Ó t×m hiÓu ¶nh h−ëng cña mËt ®é t¶o ®−a vµo b¶o qu¶n lªn sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña t¶o sau khi b¶o qu¶n. KÕt 42 qu¶ cho thÊy mËt ®é t¶o khi ®−a vµo b¶o qu¶n cã vai trß rÊt quan träng ®èi víi sinh tr−ëng cña t¶o sau khi b¶o qu¶n.ë c¸c c«ng thøc cã mËt ®é t¶o trong m«i tr−êng b¶o qu¶n lµ 102, 103 tÕ bµo/ml, sau khi gi¶i ®«ng t¶o th−êng bÞ vµng, sinh tr−ëng kÐm vµ chÕt. ë nh÷ng c«ng thøc cã mËt ®é t¶o b¶o qu¶n ®¹t 105, 106 tÕ bµo/ml; sau khi b¶o qu¶n, t¶o phôc håi nhanh, sinh tr−ëng tèt. V× vËy ®Ó thu ®ùoc gièng t¶o cã chÊt l−îng tèt, mËt ®é t¶o ®−a vµo b¶o qu¶n cÇn ®¹t 105, 106 tÕ bµo/ml. III.4.2.Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña ®iÒu kiÖn nu«i cÊy lªn sinh tr−ëng cña t¶o sau khi b¶o qu¶n. Nh»m t×m hiÓu ®iÒu kiÖn thÝch hîp, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm g©y nu«i t¶o sau khi b¶o qu¶n trong c¸c ®iÒu kiÖn nh− sau: T1: Nu«i trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 15-17oC, ¸nh s¸ng 1000 - 15000 lux, thêi gian chiÕu s¸ng 24/24h. T2: Nu«i trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 25-28oC, c−êng ®é ¸nh s¸ng 3000 lux, thêi gian chiÕu s¸ng 8/24h. KÕt qu¶ b¶ng 34 cho thÊy: ë c«ng thøc T1, t¶o phôc håi nhanh, sau 10 ngµy g©y nu«i trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é thÊp 15-17oC, c−êng ®é chiÕu s¸ng 1000- 1500 lux, h×nh th¸i tÕ bµo trë l¹i tr¹ng th¸i b×nh th−êng, t¶o sinh tr−ëng tèt. ë c«ng thøc T2, t¶o sau khi b¶o qu¶n ®−îc g©y nu«i trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 25- 28oC, c−êng ®é chiÕu s¸ng 3000 lux. Kh¶ n¨ng håi phôc cña t¶o chËm. Sau 20 ngµy nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn nãi trªn, c¸c chñng t¶o ®Òu ph¸t triÓn kÐm, dÞch t¶o xuÊt hiÖn tña, t¶o nh¹t mµu dÇn vµ chÕt. Tõ kÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy viÖc duy tr× nhiÖt ®é thÊp (15-17oC) lµ ®iÒu kiÖn tèi cÇn thiÕt ®Ó phôc håi kh¶ n¨ng sinh tr−ëng tèt cña t¶o sau khi b¶o qu¶n. Chóng t«i còng ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm ¶nh h−ëng cña m«i tr−êng dinh d−ìng lªn sinh tr−ëng cña t¶o sau khi b¶o qu¶n. KÕt qu¶ cho thÊy sau khi b¶o qu¶n, t¶o ®−îc g©y nu«i trong m«i tr−êng F/2 thÝch hîp h¬n m«i tr−êng G/3. 43 B¶ng 34: ¶nh h−ëng cña ®iÒu kiÖn nu«i cÊy lªn sinh tr−ëng cña t¶o sau khi b¶o qu¶n (t¶o Tetraselmis chuii). Thêi gian nu«i sau khi b¶o qu¶n. T1 T2 Sau khi gi¶i ®«ng TÕ bµo cã kÝch th−íc nhá h¬n tÕ bµo b×nh th−êng (kh«ng b¶o qu¶n), nguyªn vÑn, c¸c néi bµo quan bÞ lÖch vÒ mét phÝa. TÕ bµo cã kÝch th−íc nhá h¬n tÕ bµo ®èi chøng (kh«ng b¶o qu¶n), tr¹ng th¸i tÕ bµo nguyªn vÑn, c¸c néi bµo quan lÖch vÒ 1 phÝa. 3 ngµy TÕ bµo cã kÝch th−íc lín h¬n, néi bµo quan kh«ng bÞ lÖch. TÕ bµo kÝch th−íc nhá, néi bµo quan vÉn lÖch. 6 ngµy TÕ bµo cã kÝch th−íc b×nh th−êng, xuÊt hiÖn d¹ng tÕ bµo ®Æc tr−ng cña t¶o T.chuii TÕ bµo cã kÝch th−íc nhá, néi bµo quan kh«ng bÞ lÖch. 10 ngµy PhÇn lín tÕ bµo cã kÝch th−íc b×nh th−êng, cã d¹ng ®Æc tr−ng cña t¶o T. chuii TÕ bµo cã kÝch th−íc nhá, nh©n kh«ng bÞ lÖch, ch−a cã h×nh d¹ng ®Æc tr−ng. 20 ngµy TÕ bµo t¶o ph¸t triÓn b×nh th−êng, kh«ng cã kh¸c biÖt so víi tÕ bµo ®èi chøng (kh«ng qua b¶o qu¶n) PhÇn lín tÕ bµo cã kÝch th−íc nhá, ®· cã h×nh d¹ng ®Æc tr−ng cña t¶o T.chuii, m«i tr−êng b¾t ®Çu bÞ ®ôc Nh− vËy viÖc b¶o qu¶n c¸c chñng t¶o nghiªn cøu b»ng kÜ thuËt cè ®Þnh mÉu trong gel, sau ®ã gi¶i ®«ng vµ nu«i trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 15-17oC vµ ¸nh s¸ng 1000-2000 lux, sau thêi gian tõ 10-20 ngµy, c¸c tÕ bµo t¶o phôc håi, sinh tr−ëng tèt (¶nh 5, ¶nh 7). ViÖc cè ®Þnh mÉu b»ng kÜ thuËt lµm bÊt ®éng vµ b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é 4oC vÉn duy tr× ®−îc tr¹ng th¸i nguyªn vÑn cña tÕ bµo vµ ho¹t ®éng sinh lÝ cña t¶o. Tuy sau khi b¶o qu¶n mét sè chñng t¶o cã kÝch th−íc lín nh− T.chuii h×nh th¸i tÕ bµo cã mét sè thay ®æi so víi ®èi chøng: h×nh d¹ng kh«ng ®Æc tr−ng, nh©n tÕ bµo lÖch vÒ mét bªn. Nh÷ng thay ®æi trªn sÏ ®−îc phôc håi, tÕ bµo sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn b×nh th−êng sau khi ®−îc nu«i trong ®iÒu kiÖn thÝch hîp vÒ ¸nh s¸ng vµ nhiÖt ®é. §èi víi c¸c chñng t¶o cßn l¹i: D.salina, N.oculata, I.galbana, 44 Chlorella vulgaris, h×nh th¸i tÕ bµo sau khi b¶o qu¶n kh«ng cã kh¸c biÖt so víi t¶o ®èi chøng ¶nh 4: TÕ bµo T.chuii ngay sau khi gi¶i ®«ng ¶nh 5: TÕ b¶o t¶o T.chuii sau khi gi¶i ®«ng 1 tuÇn ¶nh 6: T¶o b¶o qu¶n ë d¹ng h¹t. 45 ¶nh 7: B×nh t¶o ®èi chøng vµ sau b¶o qu¶n (T.chuii) 1: T¶o ®èi chøng 2: T¶o ®−îc g©y nu«i theo c«ng thøc T1. 3: T¶o ®−îc g©y nu«i theo c«ng thøc T2. Tõ nh÷ng kÕt qu¶ thu ®−îc cho thÊy viÖc ph©n lËp t¶o th«ng qua c«ng ®o¹n lµm s¹ch s¬ bé vµ ly t©m t¸ch t¶o ®· gi¶m bít thêi gian ph©n lËp còng nh− viÖc t×m ®−îc lo¹i kh¸ng sinh thÝch hîp ®Ó lo¹i bá vi khuÈn ra khái t¶o nh−ng kh«ng ¶nh h−ëng ®Õn sinh tr−ëng cña t¶o ®· gióp thu ®−îc nguån t¶o s¹ch khuÈn, ®¶m b¶o chÊt l−îng gièng trong qu¸ tr×nh gi÷ gièng còng nh− nh©n nu«i sinh khèi, tr¸nh t×nh tr¹ng gièng bÞ vãn côc, l¾ng lµm gi¶m n¨ng suÊt, chÊt l−îng t¶o. C¸c kh¸ng sinh sö dông trong thÝ nghiÖm lµ nh÷ng lo¹i kh¸ng sinh th«ng dông: Tetracycline vµ Peflacine lµ nh÷ng kh¸ng sinh thuéc nhãm quinon cã t¸c ®éng réng, cã hiÖu qu¶ chèng l¹i nhiÒu lo¹i vi khuÈn, c¶ gram ©m, gram d−¬ng. Tuy nhiªn khi dïng Tetracycline kh«ng thu ®−îc kÕt qu¶ do Tetracycline bÞ hÊp thu trong n−íc cã ®é cøng cao. Ngoµi ra Canxi vµ Magiª trong m«i tr−êng liªn kÕt víi Tetracycline lµm cho kh¸ng sinh mÊt ho¹t tÝnh. V× vËy Tetracycline kh«ng cã hiÖu qu¶ khi cho vµo m«i tr−êng láng nu«i t¶o. MÆt kh¸c Tetracycline rÊt nh¹y c¶m víi ¸nh s¸ng vµ chuyÓn thµnh mµu n©u khi bÞ ph©n huû, ®iÒu nµy lµm gi¶m chÊt l−îng m«i tr−êng. Ngoµi ra, ®Ó thu ®−îc kÕt qu¶ th−êng ph¶i t¨ng 46 nång ®é kh¸ng sinh nµy lªn trªn møc cÇn thiÕt. §iÒu nµy cã thÓ dÉn ®Õn mét sè vi khuÈn kh¸ng Tetracycline (Nusbawm and Shotts,1981). Erythromycine lµ kh¸ng sinh chèng l¹i c¸c vi khuÈn gram d−¬ng rÊt hiÖu qu¶. Tuy nhiªn trong m«i tr−êng nu«i t¶o cã sö dông n−íc biÓn, ®©y lµ m«i tr−êng thÝch hîp cho vi khuÈn gram ©m ph¸t triÓn. KÕt qu¶ nghiªn cøu cña nhiÒu t¸c gi¶ cho thÊy ®a sè vi khuÈn biÓn lµ vi khuÈn gram ©m, 80% sè loµi t×m thÊy ë vïng biÓn Nam Califonia lµ gram ©m. Víi c¸c khuÈn l¹c ph¸t triÓn trªn ®Üa th¹ch cã chøa n−íc biÓn phÇn lín lµ vi khuÈn gram ©m (Zobll vµ céng sù,1994; Purushothaman A, 1999). T¸c gi¶ NguyÔn ThÞ Thu Hµ (2002) khi nghiªn cøu vi khuÈn dÞ d−ìng ph©n lËp tõ ®Êt rõng ngËp mÆn cña tØnh Nam §Þnh còng cho thÊy 80% sè vi khuÈn ph©n lËp ®−îc lµ vi khuÈn gram ©m. V× vËy Erythromycine kh«ng cã hiÖu qu¶ khi sö dông víi môc ®Ých lo¹i bá vi khuÈn ë c¸c chñng t¶o thÝ nghiÖm. Trong c¸c kh¸ng sinh ®· nghiªn cøu, kh¸ng sinh kÝ hiÖuTA lµ cã hiÖu qu¶ tèt. §©y lµ lo¹i kh¸ng sinh cã phæ t¸c ®éng réng rÊt phï hîp cho viÖc lo¹i bá vi khuÈn ra khái c¸c chñng t¶o nghiªn cøu ®Ó thu t¶o s¹ch khuÈn. ViÖc nghiªn cøu thµnh c«ng ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n t¶o b»ng kÜ thuËt lµm bÊt ®éng ®èi víi c¸c chñng t¶o Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris sÏ gióp nh÷ng ng−êi lµm nghiªn cøu vÒ t¶o, nh©n nu«i t¶o t¹i c¸c tr¹i gièng nu«i trång thuû s¶n chñ ®éng ®−îc nguån gièng t¶o, gi¶m ®−îc chi phÝ nh©n c«ng vµ thêi gian, gi¶m chi phÝ s¶n xuÊt.ViÖc gi÷ gièng t¶o trë nªn ®¬n gi¶n, hiÖu qu¶, gi¶m nguy c¬ bÞ nhiÔm bÈn, b¶o toµn ®−îc gièng víi chÊt l−îng tèt. Gièng b¶o qu¶n b»ng ph−¬ng ph¸p nµy cã thÓ gi÷ ®−îc thêi gian l©u dµi mµ kh«ng bÞ ¶nh h−ëng ®Õn chÊt l−îng. 47 17-18oC, AS 1000-1500 lux Läc Ly t©m Pha lo·ng Pha lo·ng tiÕp (1 tÕ bµo/1 ml) CÊy lªn ®Üa th¹ch Thu mÉu t¶o CÊy vµo èng nghiÖm ®Ó t¶o sinh tr−ëng KiÓm tra, chän èng nghiÖm cã t¶o mong muèn Chän khuÈn l¹c mong muèn CÊy vµo m«i tr−êng láng KiÓm tra cÊy lÆp l¹i trªn ®Üa th¹ch ®Õn khi thu ®−îc t¶o thuÇn Nh©n sinh khèi Xö lý kh¸ng sinh 17-18oC, AS 1000-1500 lux, thêi gian 15-20 ngµy 17-18oC, AS 1500- 2000lux Cè ®Þnh mÉu, b¶o qu¶n ë 4 oC, trong tèi Gi¶i ®«ng Nh©n sinh khèi t¶o S¶n xuÊt t¶o Nu«i con gièng Gi÷ gièng trong th¹ch vµ m«i tr−êng láng Quy tr×nh b¶o qu¶n vµ ph©n lËp t¶o 48 PhÇn IV: KÕt luËn Tõ nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu thu ®−îc chóng t«i ®−a ra mét sè kÕt luËn nh− sau: 1. §· x¸c ®Þnh ®−îc tèc ®é vµ thêi gian ly t©m thÝch hîp ®èi víi tõng chñng t¶o nghiªn cøu tõ ®ã tiÕn hµnh lµm s¹ch s¬ bé b»ng c¸ch läc vµ ly t©m t¸ch t¶o. V× vËy rót ng¾n ®−îc thêi gian ph©n lËp so víi tr−íc. 2. Ph©n lËp ®−îc 5 chñng t¶o thuÇn: Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris 3. §· nghiªn cøu sö dông mét sè lo¹i kh¸ng sinh ®Ó lo¹i bá vi khuÈn ra khái t¶o. KÕt qu¶ cho thÊy Tetracycline vµ Peflacine Ýt cã hiÖu qu¶ ®èi víi viÖc lo¹i bá vi khuÈn ra khái t¶o khi bæ sung vµo m«i tr−êng láng. V× vËy chØ nªn sö dông peflacine ®Ó bæ sung vµo m«i tr−êng th¹ch víi nång ®é tõ 20-40µg/ml ®Ó gi÷ gièng t¶o Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, víi nång ®é 80µg/ml ®Ó gi÷u gièng t¶o Dunaliella salina. Peflacine kh«ng thÝch hîp ®èi víi t¶o Chlorella vullgaris vµ Tetraselmis chuii. 4. Erythromycine kh«ng cã t¸c dông lo¹i bá vi khuÈn ra khái c¸c chñng t¶o nghiªn cøu. MÆt kh¸c kh¸ng sinh nµy cã ¶nh h−ëng kh«ng tèt lªn sinh tr−ëng cña t¶o. V× vËy kh«ng nªn sö dông Erythromycine víi môc ®Ých diÖt khuÈn ®Ó thu ®−îc t¶o s¹ch khuÈn. 5. §· x¸c ®Þnh ®−îc lo¹i kh¸ng sinh thÝch hîp ®Ó lo¹i bá vi khuÈn ra khái t¶o kÝ hiÖu lµ TA. Nång ®é TA thÝch hîp ®èi víi tõng chñng t¶o kh¸c nhau: Dunaliella salina: 10-20µg/ml; Nanochloropsis oculata: 2.5µg/ml; Isochrrysis galbana: 20µg/ml; Tetraselmis chuii: 10µg/ml vµ Chlorella vulgaris: 20µg/ml. Thêi gian xö lÝ 6 ngµy. 6. §· nghiªn cøu ®−a ra ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n b»ng kÜ thuËt lµm bÊt ®éng trong gel ®èi víi 5 chñng t¶o nghiªn cøu: -X¸c ®Þnh ®−îc nång ®é chÊt t¹o gel thÝch hîp lµ 1.5%. ChÊt gi¶i ®«ng lµ muèi citrate. - MËt ®é t¶o ®−a vµo b¶o qu¶n thÝch hîp lµ 106 tÕ bµo/ml. - §iÒu kiÖn thÝch hîp ®Ó g©y nu«i t¶o sau khi b¶o qu¶n lµ nhiÖt ®é 15-17oC, ¸nh s¸ng 1000-2000 lux, m«i tr−êng dinh d−ìng thÝch hîp lµ F/2. 49 T¶o sau khi b¶o qu¶n trong gel ë nhiÖt ®é 4oC, trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã ¸nh s¸ng vÉn gi÷ ®−îc tr¹ng th¸i nguyªn vÑn vµ ®Æc tÝnh sinh lÝ, phôc håi vµ sinh tr−ëng tèt. Kü thuËt b¶o qu¶n t¶o b»ng c¸ch lµm bÊt ®éng lÇn ®Çu tiªn ®−îc nghiªn cøu øng dông t¹i ViÖt nam. 50 Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng ViÖt 1. Hoµng TÝch HuyÒn (2001). H−íng ®Én sö dông kh¸ng sinh. Nhµ xuÊt b¶n y häc, tr 18-30. 2. HoµngThÞ Kim Hoa vµ c¸c céng sù (2003). Nghiªn cøu hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt mét sè loµi vi t¶o (Duanaliella salina vµ Tetraselmis chuii)phôc vô nh©n nu«i mét sè loµi c¸ biÓn (c¸c song, c¸ giß)t¹i C¸t Bµ H¶i Phßng. B¸o c¸o ®Ò tµi cÊp Bé. 3. §Æng XuyÕn Nh−, Hoµng ThÞ Kim Hoa vµ c¸c céng sù (1995). Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ t¸ch chiÕt c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ nguån vi t¶o ®Ó phôc vô dinh d−ìng ng−êi vµ ®éng vËt (1995). B¸o c¸o nghiÖm thu ®Ò tµi cÊp Nhµ n−íc (KC-08-12) thuéc ch−¬ng tr×nh c«ng nghÖ sinh häc. 4. §Æng XuyÕn Nh− vµ c¸c céng sù (1997). Nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn nu«i trång tèi −u nh»m thu sinh khèi t¶o giµu -caroten. B¸o c¸o ®Ò tµi cÊp c¬ së. 5. Th«ng tin khoa häc c«ng nghÖ-kinh tÕ thñy s¶n 2/2004. Trang 13-16. 6. Th«ng tin khoa häc c«ng nghÖ-kinh tÕ thñy s¶n 3/2004. Trang 29-30. TiÕng Anh 1. Alekhina GP; Bukharin O.V; Nemseva N.V; Shabanov S.V (2001). Method of isolation of Microalgal axenic Culturre. Patent number RU 2164940 date 10/4/2001. 2. Aliza L.H and Johnston T.C (1999). Diversity of culturable heterotrophic aerobic bacteria in pristine bed sediment. Canadian Journal of Microbiology, 45, pp.879-884. 51 3. Brown, Mr (1991). The amino acid and sugar composition of 16 species of microalgae use in maricultur. Journal of Experimental marine Biology and Ecology; 145: 79-99. 4. Brown, Mr ; Miller K.A (1992). The ascorbic acid content of eleven species of microalgae used in mariculture. Journal of Appiled Phycology, 4: 205 - 215 5. Brown Mr; Je-frey, S.W; Vikman, J.K, Dunstan, G.A (1997). Nutritional properties of microalgae for mariculture, Aquaculture, 151: 315-331. 6. Brown et al (1999). The vitamin content of microalgae use in aquaculture. Journal of Appiled Phycology, 11:247-255. 7. Hong quan Liu et al (2004). Cryopreservation of protoplasts of the algal porphyza yezoensis by vitrification. Plant science 166: 97-102. 8. Gerllof GC; Fitzgerald GP; Skoog F. (1950). The isolation purification and culture of blue-green. Amer.J. Vol. 37 p.216. 9. Gorbenko Lu. A(1961). Naiboleic blogopriatnoie Kolichesvo "Succhovo pitatelnovo agara" Sredi dlia kuntivirovania morskich getherotrophnich microorganizmov. Microbiologia, Kiev, T30, V.1. st: 168-172. 10. Kbutko K.B (1961). Polytenhie culture otdelnic kletok chlorella 11. Knuckey, R.M et al (2002). Isolation of new nanoplanktonic diatom strains and they evalution as diets for the juvennile pacific oyster Aquaculture. 12. Malcolm R. Brown (1999). Nuritional Value and use of Microalgae in Aquacult. Malcolm. Brown@criro.au 13. Pedro Canavate, Luis M Lubinn (1995). Some aspects on the cryopresevation of microalgae use as food for marine species. Aquaculture 136: 277-290. 14. Purushothaman A(1999). Microbial diversity. Cauter of Advanced study in Marine Biology. Annamalai University, India, pp.6-20. 15. Rheinheimer. G(1985). Vi sinh vËt häc c¸c nguån n−íc (KiÒu H÷u ¶nh dÞch), Nhµ xuÊt b¶n khoa häc kÜ thuËt. 52 16. Renaud, S.M et al (1999). The gross composition and fatty acid composition of 18 species of tropical Australian microalgae for possoble use marinculture. Aquaculture 170: 147-155. 17. Susana Romo and Carmen Peres Martiner (1997). The use immobilization in alginate beads for long term storage of pseudanabaena galeata (Cyanobacteria) in the laboratory. J.phycol 33;1073-1076. 18. Stein (1973). Handbook of phycological Methods. Culture methods and growth measurements. Cambridge university press. 19. Tran Van Tran, Le Xan(2001). Some of studies results on reproductive charactieristies and Technology of seed production of Greasy-Back Shrimp (Metapenaeus Ensis de Haan 1844). In proceedings of Marine fisheries reseach. VII.406-418 20. Yean. Chan Chen (2003). Immobilized Haptophyta for long term srorage and application for feeds and water quality control in clam culture. 21. Zobell C., Upham 4. (1944). A list of marine bacteria includeing description of sixty new species. Bull Scripps Inst,Oceanogr.