Đề tài Nghiên cứu sản xuất nước dừa kefir có bổ sung nha đam

amin Trong nước dừa chủ yếu chứa 2 loại vitamin là vitamin C (acid ascorbic) và vitamin B. Hàm lượng vitamin C từ 2.2 – 3.7 mg/ml và giảm dần khi phần nước càng gần phần thịt quả. Bảng 2.3: Các vitamin có trong nước dừa STT Vitamin Hàm lượng (g/l) 1 Acid ascorbic (Vitamin C) 2.2 – 3.7 2 Acid nicotinic (PP) 0.052 3 Penthothennic 0.064 4 Acid folic (B5) 0.03 5 Riboflavin 0.00001 6 Biotin 0.002 7 Thiamin (B1) Vết 8 Byridoxine (B6) Vết 2.1.2. Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của nước dừa [13], [14] Nước dừa là một thức uống bổ dưỡng, làm mát và tăng cường sinh lực cơ thể. Nước dừa chứa lượng đường vừa đủ cung cấp cho cơ thể dưới dạng đường dễ tiêu hóa (chủ yếu là glucose, fructose và saccharose). Nước dừa chứa nhiều đạm cần thiết cho cơ thể dưới dạng nitơ axit amin thay thế và không thay thế. Nước dừa còn chứa nhiều vitamin và chất khoáng. Lượng vitamin C trong 1 trái dừa đủ cung cấp cho nhu cầu cơ thể mỗi ngày. Ngoài ra nước dừa còn chứa một số vitamin nhóm B như niacin, riboflavin, acid folic, thiamin và pyridoxin tìm thấy ở dạng vết. Nước dừa đặc biệt chứa nhiều khoáng chất như natri, kali, canxi, magiê, sắt, đồng, phốt pho, lưu huỳnh và clorua. Nước dừa có nhiều tính năng chữa bệnh như : Nước dừa tốt cho những trẻ bị rối loạn đường ruột. Nước dừa chứa nhiều hợp chất hữu cơ kích thích cho sự phát triển. Nước dừa dùng cho cơ thể bị đau buốt, nóng vì nhiệt và mụn nhọt (nhất là vào mùa hè); làm giảm bớt phát ban, nổi mụn gây bởi bệnh đậu mùa, sởi, thủy đậu Nước dừa diệt giun, sán, lãi gây bệnh đường ruột. Nước dừa tốt cho các trường hợp mắc bệnh tả. Nước dừa giúp khử trùng và ngăn nhiễm trùng đường tiết niệu, lợi tiểu. Nước dừa loại trừ chất độc trong trường hợp bị ngộ độc khoáng. Nước dừa dùng hiệu quả trong chữa trị bệnh thận và sỏi bóng đái. Nước dừa có thể được tiêm vào tĩnh mạch trong các trường hợp khẩn cấp thay thế huyết thanh máu bởi vì nó vô trùng, không sinh nhiệt và dễ dàng được cơ thể chấp nhận. Nước dừa làm giảm độ axit trong dạ dày và làm giảm sưng tấy trong dạ dày, làm giảm đau cho những người bị đau dạ dày. 2.2. Thành phần dinh dưỡng và lợi ích của nha đam [38], [39], [40] Nha đam còn có tên gọi là Lô hội, tên tiếng Anh là Aloe vera. Thành phần hóa học của nha đam cực kỳ phức tạp, các chất có lợi thường cao hơn so với các loại thực vật khác. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thành phần hóa học của nha đam gồm vài trăm loại chất khác nhau, có hơn 160 loại đã được nghiên cứu rõ ràng và đưa vào sử dụng. Hình 2.2: Nha đam [39] ¯ Carbohydrate Gồm có: Mannose, xylose, glucose, galactose, rhamnose, fucose,Trong đó mannose và glucose là chủ yếu. ¯ Vitamin Nha đam có rất nhiều loại vitamin như A, C, E, B1, B5,vì vậy có khả năng chống oxy hóa, làm chậm quá trình lão hóa tế bào do các gốc tự do gây ra. ¯ Chất khoáng Có 20 loại chất khoáng như: Ca, K, Zn, Cr, Se,; Trong đó Se là một nguyên tố vi lượng rất quan trọng tham gia cấu tạo nên enzyme gluthation – peroxydase, phá hủy các gốc tự do, nhờ vậy nó có tác dụng phòng chống bệnh thoái hóa cơ và ung thư. ¯ Acid amin Có 20 loại acid amin cần thiết cho cơ thể, trong đó có 7 loại acid amin thiết yếu. ¯ Enzyme Gồm: oxydase, protease, catalase, lipase,..., trong đó lipase, protease có khả năng tiêu thực và làm khỏe mạnh bộ máy tiêu hóa, rất tốt cho bệnh nhân đau dạ dày, đường ruột. Theo sách Đông y, nha đam có vị đắng, tính hàn nên có tác dụng thông đại tiện, mát huyết, nhuận gan, thông mật, giải nhiệt cho cơ thể trong những ngày hè nóng cho ta có một làn da tươi trẻ và một cơ thể khỏe mạnh. Phần thịt của nha đam có thể chế biến thành rất nhiều món ăn khác như: nấu chè đậu xanh, trộn salad, , mà tốt nhất nên cắt nhỏ và ướp với đường cát rồi để tủ lạnh ăn. 2.3. Giới thiệu về kefir 2.3.1. Nguồn gốc hạt kefir [19] Sữa lên men kefir đã được người dân vùng núi Caucasus thuộc nước Liên Xô cũ sử dụng từ rất lâu. Họ xem nó như báu vật mà đấng tối cao Alah ban tặng cho con người. Người ta dùng nó làm thức uống và như một loại thuốc để chữa bệnh. Mọi người không hề biết đến bệnh ung thư, bệnh lao, bệnh dạ dày,và sống thọ đến 110 tuổi. Sữa kefir thường được sản xuất từ nguyên liệu là sữa dê, sữa cừu hay sữa bò. Theo Oberman H và Libudiziz Z (1998) đầu tiên người ta lên men sữa thành kefir trong các túi làm bằng da thú hoặc bồn bằng gỗ sồi. Đến cuối thế kỉ xix, kefir đã trở thành sản phẩm quen thuộc của dân các nước vùng Đông Âu ( Balan, Hungari, Nga,), và các nước thuộc Scandinavia. Vì lợi ích mà kefir đem lại cho người dùng nên nó nhanh chóng lan rộng đến Thụy Điển, Na Uy, Phần Lan, Đức (1993), Hy Lạp, Áo, Brazil (1994), Và phổ biến cả Mỹ và Nhật. Kefir được sản xuất theo phương pháp truyền thống, không sử dụng những vật dụng bằng kim loại trong quá trình tiến hành mà chỉ dùng các dụng cụ bằng gỗ, da thú. Nên các sản phẩm lên men từ kefir rất khó để giữ được chất lượng và mùi vị như sản phẩm truyền thống khi đem vào sản xuất thương mại. Đến 1950, phương pháp sản xuất kefir mới đã được công nhận về chất lượng đó là phương pháp lên men có khuấy trộn. Kefir thường dùng để lên men các sản phẩm từ sữa là chủ yếu, ngoài ra nó còn dùng để lên men dịch trái cây, nước dừa, sữa dừa, đậu nành, 2.3.2. Đặc điểm của hạt kefir [4], [12], [18], [19], [20], [21] Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định và chúng thường kết cụm lại với nhau trong giống hoa Choufleur với đường kính trung bình 0.3 - 2.0 cm. Hạt kefir chứa vi khuẩn lactic và nấm men. Đôi khi người ta còn tìm thấy cả vi khuẩn A. aceti và A. racens. Hạt kefir không tan trong nước và hầu hết các dung môi. Khi thả vào sữa thì nó thấm nước (sữa) và trở nên có màu trắng đục. Hình 2.4: Hình dạng hạt kefir [18] ¯ Thành phần hoá học Thành phần hợp thành hạt kefir là phức protein polysacharide béo, protein (chiếm khoảng 30% tổng chất khô) và carbohydrate (25 – 50%). Thành phần hạt giống sấy khô đông lạnh với hàm ẩm 3.5% được tìm thấy bao gồm: béo 4.4%, tro 12.1%, Muco-polysacharide (kefiran) 45.7%; protein tổng số 34.3% gồm có: protein không hoà tan 27%, protein hoà tan 1.6% và acid amin tự do là 5.6%. Thành phần quan trọng của kefir là kefiran: gel hoà tan polisacharide, hình thành ở trung tâm hạt. Polysacharide này gồm hai loại đường đơn glucose và galactose với tỉ lệ cân đối. Cấu trúc phân tử của kefiran có mạch nhánh hexan hoạc heptan saccharide, hoặc do sự liên kết không đặc hiệu của một hay hai đường khử, làm cho kefiran không bị enzyme thuỷ phân. Đó là đặc điểm quan trọng giữ vững cấu trúc và hệ vi sinh vật của hạt kefir. Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của kefiran [20] ¯ Vi sinh vật trong hạt kefir Hình 2.6: Vi khuẩn và nấm men trong hạt kefir [23] Phần ngoài của hạt kefir tập trung các tế bào vi khuẩn lactic dạng que, còn phí trong thì nấm men là thành phần chủ chốt. Ở vùng đệm, tỷ lệ vi khuẩn và nấm men thay đổi và phụ thuộc vào khoảng cách tới bề mặt hạt kefir. Nhóm vi khuẩn lactic lactobacilli chiếm khoảng 65-80% tổng số vi sinh vật trong hạt kefir. Chúng gồm những loài ưa ẩm và ưa nhiệt, thực hiện quá trình lên men lactic theo cơ chế lên men đồng hình lẫn dị hình. Nhóm vi khuẩn lactic Lactococci chiếm 20% tổng số tế bào, Bacilli 69%, Streptococci 11-12% Riêng nấm men chiếm 5÷10% tổng số vi sinh vật trong hạt gồm những loài lên men được lẫn không lên men được đường lactose. Các loài nấm men lên men được đường lactose thường được tìm thấy tại các vị trí gần bề mặt hạt kefir. Ngược lại, các loài nấm men không lên men được đường lactose lại tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong tâm hạt. Bảng 2.4: Một số vi sinh vật chủ yếu trong hạt kefir [18] Vi khuẩn Nấm men Nhóm Leuconostoc L. dextranicum L. mesenteroides L. kefir Nhóm Lactococcus L. lactis subsp. Lactis biovar diacetylactis L. lactis subsp cremoris L. filant Nhóm Lactobacillus L. caucasicus L. brevis L. kefir L. casei L. plantarum L. aciddophilus L. kefiranofaciens L. helveticus subsp. Jugurti L. lactis subsp. Lactis L. rhamnosus L. fermentum L. paracasei L. parakeffir L. viridescens L. delbrueckii subsp. Bulgaricus Nhóm Streptococcus S. thermophilus S. lactis S. filant S. cremoris Nhóm Acetobacter A.casein A.rasens Nhóm Kluyveromyces K. lactis K.marxianus var. Marxianus K.fragilis Nhóm Candida C. kefir C. holmii C. friedrichii C. valida C. pseudotropicalis Nhóm Saccharomyces S. cerevisiae S. .exiguus S. globus S. dairensis S. unispores S. florentinus Nhóm Torulaspora T. delbrueckii Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus Leuconostoc mesenteroides Kluyveromyces lactis Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis Hình 2.7 : Một số vi sinh vật trong hạt kefir [25], [34] 2.3.3. Sự sinh sản của hạt kefir [12], [18] Kefir bao gồm hỗn hợp protein, lipid, polisaccharide và sự cộng sinh của nấm men với vi khuẩn. Sự kết hợp và liên kết không theo quy tắc đã tạo nên từng hạt, các hạt này liên kết với nhau tạo ra hạt mẹ với các thùy con, những thùy con này có đầy đủ bộ phận như một cơ thể hoàn chỉnh. Khi bị tác động bên ngoài các thùy con này có thể tách ra khỏi hạt mẹ và tồn tại độc lập, chức năng giống hạt mẹ. Chu trình đó cứ lặp đi lặp lại, số lượng hạt kefir càng ngày càng được nhân lên. Mặt ngoài của hạt biến đổi từ dạng phẳng đến không đồng đều, có chổ lồi lõm rải rác khắp bề mặt. Một vài hạt có thể có những vùng rộng phẳng, trong khi cùng môi trường đó lại có những hạt có bề mặt không đồng đều. Nếu gặp điều kiện thuận lợi, sau một thời gian, những hạt nhẵn này trở lại dạng nguyên thể với các thùy con bao quanh mình. Những vùng không phẳng, xù xì thường có sự hoạt động mạnh mẽ của nấm men, trong khi ở vùng phẳng vi khuẩn lại chiếm ưu thế. Streptococci thì bện vào nhau với các vi khuẩn khác chứ không hình thành dạng cụm. Ở sâu bên trong hạt, Lactobacilli chiếm ưu thế và có rất ít tế bào nấm men, chúng được gói gọn trong dịch polysaccharide, các vi khuẩn hình que và nấm men hình thành các cụm riêng biệt bên ngoài và bên trong hạt. Ở đó Lb. Kefiranoficients được xem là nguyên nhân hình thành vỏ bọc bên ngoài polysaccharide mà có thể giúp hạt co giãn. Một số nghiên cứu cho rằng vi khuẩn có thể tạo ra sự nhân giống kefir, vì sự nhân giống của hạt không xảy ra khi vắng mặt Lb. Kefiranoficients – là vi khuẩn sinh ra kefiran ở trung tâm hạt. 2.3.4. Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của kefir [29], [30], [31] ¯ Kefir là kết quả cộng sinh của vi khuẩn lactic và nấm men. Nó giống như probiotic, tập hợp của nhiều vi sinh vật sống có lợi, giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giúp cho việc tiêu hóa dễ dàng, đặc biệt là những người không tiêu hóa được đường lactose. ¯ Kefir là một loại thực phẩm tốt, nếu sử dụng thường xuyên có thể giúp giảm bớt sự xáo trộn đường tiêu hóa, bệnh đau thắt dạ dày, viêm ruột mãn tính và những bệnh về gan, mật, thận; cân bằng sự chuyển động của ruột, làm giảm sự đầy hơi và tạo ra một hệ tiêu hóa khỏe mạnh hơn. Ngoài ra, nó còn cân bằng hệ miễn dịch, giảm tiêu chảy, giúp ăn ngon miệng, có lợi cho những người bị mất ngủ và suy nhược. ¯ Kefir có thể giúp kiểm soát mức cholesterol cao, do đó có thể ngăn chặn được những bệnh về tim mạch. ¯ Kefir chứa nhiều chất khoáng vô cơ như K, Fe, Na, Mg, Ca và các acid amin thiết yếu, giúp duy trì các chức năng sinh hóa của cơ thể. Nói chung, kefir là loại thức uống đơn giản, dễ làm, rẻ tiền mà rất có lợi cho sức khỏe. Nếu bạn muốn mình luôn khỏe mạnh, có làn da đẹp, hệ tiêu hóa tốt và ăn ngon miệng,... thì hãy sử dụng kefir. Ngoài ra, nó có thể giúp bạn sống thọ và luôn vui vẻ nhưng bạn đừng lạm dụng nó nếu không bạn sẽ bị dư acid ở dạ dày. 2.4. Giới thiệu một số vi sinh vật trong hạt kefir 2.4.1. Vi khuẩn lactic [1], [16], [17], [18] Ø Vi khuẩn lactic thường là vi khuẩn gram dương, không tạo bào tử, hầu hết không di động. Ø Hô hấp hiếu khí, kỵ khí hoặc tùy tiện. Chúng ít hay không phân giải protein, không có cytochrome và catalase, không phân giải H2O2. Ø Vi khuẩn lactic có loài lên men đồng hình và có loài lên men dị hình. Lên men đồng hình thì sản phẩm tạo thành chỉ có acid lactic. Nó có thể tạo được trên 85% acid lactic. Lên men dị hình ngoài sản phẩm là acid lactic thì còn có các sản phẩm phụ khác. Nó sản sinh được khoảng 50% acid lactic, 25% cồn, STREPCOCCUS Từ Strepcoccus bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp. Từ Streptose nghĩa là mềm dẻo và Kokkos nghĩa là hạt – do đó Strepcoccus có nghĩa là một chuỗi hạt mềm dẻo. Streptococcus thermophilus Nó là tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 0.7-0.9mm, không chuyển động được, thường kết thành chuỗi ngắn, thuộc loại vi khuẩn gram dương, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 40-45oC và pH=5.8-6.0. Chúng sẽ bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 53oC và dưới 20oC. Streptococcus thermophilus là loài rất nhạy cảm với muối, không phát triển được trong môi trường chứa 2% NaCl và 0.01% xanh metylen. Nó có khả năng lên men glucose, fructose, saccharose..., phân giải tinh bột ở môi trường thích hợp nhưng không phân giải gelatin và esculin. Khi lên men thường tạo một lượng nhỏ acetone và các chất tạo hương. Chúng là những loài tất nhạy cảm với các chất kháng sinh, dễ dàng bị ngăn chặn bởi 0.01 mg penicillin hay 5mg streptomycin/ml. Streptococcus lactis Thuộc loài vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, lên men được glucose, lactose, galactose, maltose, dextrin, không lên men được saccharose. Phát triển tốt ở nhiệt độ 30 – 350C, độ chua tạo ra khoảng 110 - 1200T. Streptococcus cremoris Thường tạo thành chuỗi dài, phát triển tốt ở 20 – 250C, lên men lactose,glucose thành acid lactic nhưng không lên men saccharose, maltose, dextrin. LEUCONOSTOC Loại này ban đầu được biết là Betacoccus và tên hiện nay xuất phát từ tiếng Hy lạp. Leucus nghĩa là không màu và nostoc nghĩa là giống có vỏ nang màu xanh da trời. Leuconostoc là tế bào hình cầu tạo thành từng cặp hay chuỗi và có thể xem là Streptococcus lên men dị hình. Chúng tạo ra acid acetic, ethanol, CO2 và acid lactic từ lên men carbonhydrate (thường là glucose). Chúng là loại vi khuẩn đặc trưng tạo hương cho sản phẩm. Leuconostoc dextranicum Leuconostoc dextranicum là vi khuẩn gram dương, đường kính từ 0.6-1m. Nó phát triển tốt ở nhiệt độ 25-300C và phát triển chậm ở 80C, ở 450C ngừng phát triển, không tồn tại khi thanh trùng, rất nhạy cảm với chất kháng sinh penicillin. LACTOBACILLUS Từ này xuất phát từ tiếng Latinh, lac nghĩa là sữa và bacillum nghĩa là hình que. Nó có dạng hình que, dài, nhỏ, thường lên men lactic đồng hình. Lactobacillus acidophilus Nó là trực khuẩn, kích thước trung bình 0.6-0.9 x1.5-6 mm. Khi trẻ là vi khuẩn gram dương, về già trở thành gram âm, phát triển tốt ở 37-40oC, không phát triển ở 4% muối. Lactobacillus acidophilus là một một chuỗi, dài chỉ kết hạt khi nhuộm với xanh methylene. Nó có thể lên men glucose, maltose, saccharose, và lactose, lên men đồng hình tạo sản phẩm chính là acid lactic. Lactobacillus brevis Là trực khuẩn gram dương, kích thước rộng 0.7-1.0m, dài 2.0-4.0m. Chúng có thể lên men các loại đường như arbinose, xylose, glucose, fructose, maltose, nhiệt độ phát triển tối đa là 30oC. Lactobacillus delbrueckii Là vi khuẩn gram dương, không di động, thuộc trực khuẩn dài, kích thước 0.5-0.8mm, 2.0-9.0mm. Nó có khả năng lên men được các loại đường glucose, maltose, fructose, galactose, dextrin; Và không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, mannital. Lactobacillus helveticus Là trực khuẩn, có kích thước 0.7-0.9mm; 2.0-6.0mm, nhiệt độ phát triển cuả vi khuẩn này là 40-42oC. tạo độ chua đến 200-3000T. Nó có khả năng lên men được glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose. 2.4.2. Nấm men [1], [4], [5], [7], [12], [18]. Nấm men thuộc đơn bào, tế bào có hình elip hoặc hình trứng, đường kính 10-15mm, không di chuyển được. Một vài loài nấm men tạo bào tử túi (thường 4 tế bào), chúng sinh sản chủ yếu bằng cách nẩy chồi. Nấm men phát triển tốt ở 24-40oC và có thể chịu được acid cao, pH=3.5. Chúng oxi hóa và lên men mạnh mẽ nguồn nguyên liệu carbonhydate và acid hữu cơ. Nhìn chung, chúng không phân giải protein, một vài loài có thể phân giải lipid. Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-14 mm, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử. Nó có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, galactose, raffinose. Loài này có nhiệt độ lên men thích hợp 28-320C, chịu được độ acid cao. Saccharomyces fragitis Nó có hình trứng hay hình thuôn dài, đường kính 1.8-5.6mm, được đặc trưng bởi khả năng tạo cồn và CO2. Nhiệt độ tối thích là 37oC, không phát triển ở 5oC hay 43oC và không bị tiêu diệt khi thanh trùng. Candida pseudotropicalis var lactose Nó là tế bào hình trứng, dài từ 7-15mm, lên men tạo ra cồn và CO2. Nhiệt độ tối thích 37oC, không phát triển ở 5oC hay 43oC. Nó không sinh bào tử, về mặt sinh hóa Candida oxy hóa tốt hơn lên men và được xem là nấm mốc hơn nấm men. Tế bào có hình hình trụ tròn và sinh sản bằng cách nhân đôi. Tế bào con được tách ra từ sự phân chia tế bào mẹ. Loài vi sinh vật này oxy hóa acid lactic thành CO2 và H2O . 2.4.3. Vi khuẩn Acetobacter [18] Acetobacter aceti Vi khuẩn này có hình dạng giống như vi khuẩn hình que khác, nhưng có kích thước rất ngắn, không tạo được bào tử. Nó chịu được nồng độ rượu 11%, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động sống của vi khuẩn là 34oC. 2.5. Một số quá trình lên men chính tạo nên sản phẩm 2.5.1. Lên men lactic [4] Trong công nghệ vi sinh vật, nhìn chung các vi khuẩn lactic đồng hình luôn chiếm vai trò ưu thế. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất một số sản phẩm lên men truyền thống như phômai, kefir các vi khuẩn lactic dị hình đôi khi vẫn được sử dụng nhằm mục đích đa dạng hóa các chỉ tiêu về mùi, vị và cấu trúc cho sản phẩm. Đối với nhóm vi khuẩn kactic đồng hình như giống Lactococcus, các loài Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis,chu trình đường phân là con đường chính chuyển hóa glucose thành acid lactic. Acid lactic là sản phẩm chủ lực trong quá trình lên men lactic đồng hình. Phương trình tổng quát quá trình lên men lactic đồng hình: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3-CH-COOH + 2ATP OH Các vi khuẩn lactic dị hình như giống Leuconostoc do không có một số enzyme của chu trình đường phân nên chúng chuyển hóa glucose giai đoạn đầu theo chu trình pentose-phosphate và tạo ra sản phẩm trung gian là xylulose-5-P. Chất này sẽ được chuyển hóa tiếp thành glyceradehyde-3-P rồi tiếp tục đi theo giai đoạn cuối của chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic rồi acid lactic như trong quá trình lên men đồng hình. Theo một con đường trao đổi chất khác, xylulose-5-P sẽ được chuyển hóa thành acetyl-P và sau đó là thành ethanol. Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác. Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện hàng trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Hàm lượng của chúng trong dịch lên men thường rất thấp (vài ppm hoặc ít hơn). Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic. Đáng chú ý nhất là diacetyl (CH3COCOCH3) và acetaldehyde (CH3CHO), đây là những hợp chất quan trọng quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men . Quá trình sinh tổng hợp diacetyl liên quan đến sự chuyển hóa citrate. Citrate oxaloacetate acetate CO2 pyruvate CO2 acetaldehyde-TPP Acetyl-CoA CoASH + TPP diacetyl acetoin 2,3 butanediol acetolactate CO2 NAD(P)H NAD(P)H NAD(P+) NAD(P+) Hình 2.8: Sinh tổng hợp các chất tạo hương từ citrate [4] (Cogan và Fordan, 1994) Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, diacetyl được tổng hợp. Hàm lượng diacetyl trong môi trường sẽ tăng dần rồi sau đó sẽ giảm dần vào giai đoạn cuối, đặc biệt khi hàm lượng citrate giảm dần. Một phần diacetyl chuyển hóa thành acetoin và 2,3 butanediol. Acetaldehyde được tổng hợp từ các sản phẩm của quá trình chuyển hóa glucose và một số acid amin. Nhiều loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp acetaldehyde. Ngược lại, một số chủng thuộc giống Leuconostoc lại có khả năng sử dụng và chuyển hóa acetaldehyde. Đây là hợp chất quan trọng quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men. Tỷ lệ hàm lượng diacetyl và acetaldehyde ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm. Tỷ lệ này phụ thuộc vào thành phần các vi sinh vật sử dụng trong tổ hợp giống và các thông số kĩ thuật của quá trình lên men như nhiệt độ, pH đầu, lượng giống cấy... Glucose Glucose 6-phosphate 6-phosphogluconate Xylose-5-phosphate Acetyl-CoA Fructose 1,6-diphosphate Pyruvate Acetate Acetaldehyde Alanin Lysine Serine Hình 2.9: Sinh tổng hợp acetaldehyde ở một số vi khuẩn lactic ưa nhiệt [4] (Varnam và Sutherland, 1994) Glucose Glucose-6-P Fructose 6P Fructose-1,6-DP Dihydroxylacetone-P FDP aldolase Glyceraldehyde-3-P 1,3-diphosphoglycerate 3-phosphoglycerate 2- phosphoglycerate Phosphoenolpyruvate Pyruvate Lactate 6 phosphogluconate 2 ketone-6-phosphogluconate Ribulose 5-P CO2 Xylulose 5-P Acetyl-P Acetyl-CoA Acetaldehyde Ethanlol Hình 2.10: Cơ chế lên men lactic đồng hình và dị hình của vi khuẩn [4] 2.5.2. Lên men ethanol [4] Trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men, quá trình lên men ethanol được thực hiện chủ yếu bởi các nấm men thuộc giống Saccharomyces và Kluyveromyces. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hóa thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hóa thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glyxerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men. Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid. C6H12O6 + 2ADP +2Pi 2 C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và ester. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990). Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Crebs nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic... Glucose Glucose-6-P Fructose 6P Fructose-1,6-DP Dihydroxylacetone-P FDP aldolase Glyceraldehyde-3-P 1,3-diphosphoglycerate 3-phosphoglycerate 2- phosphoglycerate Phosphoenolpyruvate Pyruvate Acetyl P Acetyl CoA Acetaldehyde Ethanol Hình 2.11: Cơ chế lên men rượu của nấm men [4] 2.6. Qui trình sản xuất 2.6.1. Qui trình sản xuất men giống kefir Nước dừa Thanh trùng Cấy giống Lên men Lọc thô Men giống Kefir Làm nguội Hạt kefir 7% Bảo quản Hạt kefir Hình 2.12: Qui trình sản xuất men giống kefir 2.6.2. Thuyết minh qui trình ¯ Môi trường sản xuất giống Chọn dừa non làm môi trường sản xuất vì trái cho nước ngọt và chứa nhiều chất dinh dưỡng hơn nước dừa già. Ta chọn những trái tươi (cho phép trong 1 tuần sau khi chặt khỏi cây), những trái có độ tuổi 6-7 tháng. Sau khi lấy nước dừa, ta đem đi lọc thô để loại tạp chất làm cho nước trong hơn. ¯ Thanh trùng Sau khi lọc thô xong, ta đem nước dừa đi thanh trùng ở 90-950C, trong thời gian 20 phút. Thanh trùng giúp giảm bớt sự có mặt của vi sinh vật, ức chế hoạt động của enzyme. Sau khi gia nhiệt, ta làm lạnh nhanh để giảm nhiệt độ xuống 20-250C, chuẩn bị cho quá trình cấy giống. ¯ Lên men Sử dụng hạt kefir với lượng ban đầu 7% theo khối lượng, quá trình nhân giống cũng được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Do hạt kefir có kích thước lớn, chúng thường bị chìm xuống dưới đáy nên cần phải khuấy trộn môi trường để quá trình lên men xảy ra nhanh. Quá trình nhân giống kết thúc khi pH môi trường giảm xuống trong khoảng 3.8-4.0. ¯ Men giống Khi đạt pH theo yêu cầu, canh trường được lọc. Dịch thu được sau quá trình lọc thô chứa các vi khuẩn lactic và nấm men được sử dụng để cấy vào nước dừa nguyên liệu để sản xuất kefir. Nếu sau quá trình nhân giống như trên vẫn chưa đủ thể tích giống cần dùng, ta tiếp tục nhân giống thêm một cấp nữa. Khi đó ta sẽ sử dụng lượng giống thu được từ qui trình trên để cấy tiếp vào môi trường nước dừa đã thanh trùng. ¯ Bảo quản Sau khi lọc, các hạt kefir được đưa đi xử lý bằng cách rửa chúng trong nước vô trùng ở nhiệt độ thấp (6-100C) để loại bỏ các tạp chất bám trên bề mặt hạt. Hạt kefir đã qua rửa sạch được đem bảo quản trong nước vô trùng hoặc dung dịch NaCl 0.9%. Khi cần nhân giống cho mẻ sản xuất tiếp theo, người ta sẽ sử dụng tiếp các hạt kefir trên để nhân giống. 2.6.3. Qui trình chế biến kefir Nước dừa Thanh trùng Cấy giống Men giống kefir Lên men Ủ lạnh Làm lạnh Phối chế Nha đam Đường Bảo quản Đóng chai Hình 2.13: Qui trình chế biến kefir 2.6.4. Thuyết minh qui trình ¯ Nguyên liệu Nước dừa Sau khi thu mua trái dừa về, ta chỉ lấy nước dừa để làm nguyên liệu chế biến. Để loại bỏ tạp chất và làm nước trong hơn, ta tiến hành lọc thô nguyên liệu. Nha đam Khi mua lá về rửa sạch, sau đó gọt sạch vỏ để lấy phần thịt bên trong, rồi ngâm trong giấm đã pha loãng để loại bớt độ nhớt, vị đắng, giảm bớt mùi khó chịu của nha đam. Sau khi thấy thịt nha đam hết nhớt thì vớt ra, rửa sạch với nước và để ráo. Ta đem phần thịt nha đam này đi xay, lưu ý là không xay nhuyễn. Sau đó đun sôi với agar, đường khoảng 10 phút, rồi đổ vào hộp hình chữ nhật cho đông lại, cắt nhỏ thành khối vuông có kích thước 4mm, đem để vào tủ mát bảo quản. ¯ Thanh trùng Sau khi lọc thô, nước dừa đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 90-950C, trong 20 phút . Thanh trùng giúp loại bớt các vi sinh vật và ức chế hoạt động của enzyme trong nước dừa. Sau đó ta làm lạnh xuống còn 20-250C, để chuẩn bị cấy giống. ¯ Lên men Cấy 7% men giống theo thể tích, lên men ở nhiệt độ phòng (25 -300C), thời gian khoảng 24-48 giờ. Trong thời gian lên men, cần thường xuyên đảo trộn để quá trình lên men xảy ra nhanh hơn. Lúc này, các vi khuẩn lactic cùng với nấm men sẽ chuyển đường thành acid lactic, ethanol, khí CO2, và các chất tạo hương khác như diacetyl, aldehyde, acid fomic,. Ngoài ra còn có quá trình thủy phân protein. Quá trình lên men kết thúc khi pH đạt 3.8 - 4.0. ¯ Ủ lạnh Sau khi pH đạt 3.8- 4.0, ta đem đi ủ ở nhiệt độ 10-150C. Trong thời gian này, các vi khuẩn lactic phát triển kém và giảm lên men tạo acid lactic. Lúc này, nấm men hoạt động mạnh và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Mặt khác, quá trình ủ lạnh giúp lắng cặn, tạo độ trong cho sản phẩm. ¯ Phối chế Sau khi ủ xong, để giảm độ nhớt và tăng tính đa dạng cho sản phẩm, ta phối thêm nha đam và đường cát vào. ¯ Bảo quản Sản phẩm được bảo quản ở 4-60C, để hạn chế hoạt động của vi sinh vật, các quá trình biến đổi hóa lý và giữ được chất lượng, mùi vị của sản phẩm. Sử dụng sản phẩm 1-3 tuần. Hình 2.14: Nguyên liệu sử dụng Hình 2.15: Dụng cụ lọc hạt kefir [18] CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian tiến hành thí nghiệm Từ ngày 1/4/2009 đến ngày 30/6/2009 3.2. Địa điểm Tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc khoa Môi trường và Công nghệ sinh học trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguyên liệu Nước dừa già và dừa non. Hạt kefir Nha đam Đường RE 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị Erlen 100ml Cốc 250ml, 1000ml Ống đong 100ml Pipet 10ml Micropipet 0.1ml, 1ml Buret 20ml Ống bóp bằng cao su Rây Tủ lạnh Tủ ấm Autoclave Cân phân tích Bếp từ 3.3.3. Hoá chất Hoá chất chuẩn độ acid: NaOH 0.1N Hóa chất xác định độ cồn: nitro cromic, KI 10%, K2Cr2O7, Na2S2O3 0.1N. Môi trường đếm vi sinh vật có lợi: Hansen (nấm men) MRS (vi khuẩn) Môi trường đếm vi sinh vật gây hại: + E.coli: Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) Eosine Methylene Blue Lactose Agar (EMB) TSA (Tryptone Soya Agar) Canh Trypton Thạch Simmon Citrate Methyl Red Voges Prokauer ( MRVP) + Salmonella: Rappaport Vassiliadis Soya Pepton Broth (RV) Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD) Buffered Peptone Water (BPW) Triple Sugar Iron Agar (TSI) Mannitol phenol red broth Urea broth Lysine Decarboxylase Broth (LDC) 3.4. Phương pháp 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến quá trình lên men. ¯ Mục đích Chọn nguyên liệu tốt nhất để quá trình lên men xảy ra nhanh, tạo độ chua và độ cồn cao. ¯ Cách tiến hành N G Cấy giống ( 5%) Lên men (25-300C, pH 5.5) Nước dừa Trong đó: N là nước dừa non G là nước dừa già Khảo sát trên môi trường nước dừa non và dừa già (với nồng độ chất khô hòa tan là 5%) Khảo sát với tỉ lệ men giống là 5% Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. Độ cồn theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan trong nguyên liệu đến quá trình lên men. ¯ Mục đích Chọn nồng độ chất khô hòa tan thích hợp trong nguyên liệu để quá trình lên men xảy ra nhanh và tạo ra độ chua, độ cồn cao. Nước dừa (thí nghiệm 1) B B1 B2 B3 Cấy giống ( 5%) Lên men (25-300C, pH 5.5) ¯ Cách tiến hành Trong đó: B: Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 1 Bi : Nồng độ chất khô hoà tan (%) trong nguyên liệu B1: 5% B2: 7% B3: 9% Khảo sát 3 nồng độ chất khô hòa tan (%) trong nguyên liệu: 5%, 7%, 9%. Tỉ lệ men giống là 5% Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. Độ cồn theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ men giống đến quá trình lên men. ¯ Mục đích Xác định tỉ lệ men giống thích hợp để quá trình lên men xảy ra nhanh và tạo ra độ chua, độ cồn thích hợp. ¯ Cách tiến hành Nước dừa (thí nghiệm 2) C1 C3 Cấy giống Lên men (25-300C, pH 5.5) C2 Trong đó: Ci: tỉ lệ men giống C1: 5% C2: 7% C3: 9% Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Khảo sát 3 tỉ lệ men giống: 5%, 7%, 9% Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 4 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua sau 24 giờ Độ cồn sau 24 giờ 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của độ chua đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm. ¯ Mục đích Xác định độ chua thích hợp để kết thúc quá trình lên men và sản phẩm có chất lượng cao. ¯ Cách tiến hành Nước dừa (thí nghiệm 2) Cấy giống (thí nghiệm 3) Lên men (25-300C, pH 5.5) D1 D3 D2 D5 D4 Trong đó : Di : độ chua ( 0T) D1 : 800T D2 : 900T D3 : 1000T D4 : 1100T D5 : 1200T Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Tỉ lệ men giống được chọn ở thí nghiệm 3 Khảo sát độ chua 800T, 900T, 1000T, 1100T, 1200T Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Thời gian lên men Độ cồn Mật độ vi khuẩn và nấm men 3.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ phối chế thích hợp cho thành phẩm sau lên men. ¯ Mục đích Tìm công thức phối chế thích hợp để sản phẩm ngon, lạ mắt và bảo quản được lâu. ¯ Cách tiến hành Phối chế (Nha đam 10% v/v) Nước dừa (thí nghiệm 2) Cấy giống ( thí nghiệm 3) Lên men (25-300C, pH 5.5) Ủ lạnh (140C, 24h) T1 T2 S1 S3 S2 S1 S2 S3 Trong đó: Ti: nồng độ siro (%) T1: 30% T2: 50% Si: tỉ lệ dịch siro phối chế (%) S1: 10% S2: 15% S3: 20% Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Tỉ lệ men giống được chọn ở thí nghiệm 3 Độ chua, độ cồn thích hợp được chọn ở thí nghiệm 4 Thời gian kết thúc quá trình lên men được chọn ở thí nghiệm 4 Khảo sát 2 nồng độ siro: 30%, 50% Khảo sát 3 tỉ lệ dịch siro: 10%, 15%, 20% Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức ¯ Chỉ tiêu theo dõi Đánh giá cảm quan sản phẩm (phụ lục 1) 3.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng sản phẩm. ¯ Mục đích Theo dõi, chọn thời gian bảo quản thích hợp cho sản phẩm để chất lượng được ổn định. ¯ Cách tiến hành Nước dừa (thí nghiệm 2) Cấy giống ( thí nghiệm 3) Lên men (25-300C, pH 5.5) Ủ lạnh (140C, 24h) Đóng chai Bảo quản (4-60C) V1 V3 V2 V5 V4 Phối chế (thí nghiệm 5) Trong đó: Vi: thời gian bảo quản (ngày) V1: 0 ngày V2: 5 ngày V3: 10 ngày V4: 15 ngày V5: 20 ngày Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Tỉ lệ men giống được chọn ở thí nghiệm 3 Độ chua, độ cồn thích hợp được chọn ở thí nghiệm 4 Thời gian kết thúc quá trình lên men được chọn ở thí nghiệm 4 Tỉ lệ phối chế được chọn ở thí nghiệm 5 Khảo sát thời gian 0 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần. ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua Độ cồn Escherichia coli. Salmonella 3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 3.5.1. Phương pháp phân tích Độ acid: phương pháp xác định độ chua của sản phẩm (phụ lục 2) Độ cồn: phương pháp xác định độ cồn (phụ lục 2) Vi sinh vật: xác định vi sinh vật có lợi và gây hại trong sản phẩm (phụ lục 2) 3.5.2. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statgraphic 3.0 (phụ lục 3) CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến quá trình lên men. Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của nước dừa non và dừa già đến độ chua, độ cồn trong quá trình lên men. Nguyên liệu Thời gian (giờ) Độ chua (0T) Độ cồn (g/l) Dừa non (N) 5 15 25 14.45c 39.8b 51.8a 0.02c 0.096b 0.165a Dừa già (G) 5 15 25 9.6c 12.3b 30.55a 0.0195c 0.085b 0.125a Trong đó: Xa, Xa: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê Xa, Xb: Khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê Hình 4.1: Đồ thị thể hiện độ chua (0T) của nguyên liệu theo thời gian Theo bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy, nguyên liệu có ảnh hưởng đến lượng acid, tạo ra trong quá trình lên men. Khi bổ sung men giống vào, các vi khuẩn lactic chưa quen với môi trường mới, số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường thấp, mặc dù đã tạo pH tối ưu 5.5 cho vi khuẩn lactic hoạt động. Thời gian này (5 giờ), độ chua tạo ra trong môi trường tương đối bằng nhau, nguyên liệu sử dụng là nước dừa non hay già hầu như không có ảnh hưởng gì đến quá trình lên men của vi sinh vật. Sau một thời gian (15 giờ), chúng thích nghi và bắt đầu phát triển, tạo ra lượng acid lớn, làm chua môi trường. Lúc này, lượng acid tạo ra trong môi trường giữa nguyên liệu là nước dừa non hay nước dừa già đã có sự khác biệt. Đến 25 giờ, thì lượng acid tạo ra càng nhiều và vẫn có sự khác biệt lớn. Điều này có thể giải thích: Nước dừa non chứa nhiều chất dinh dưỡng, muối khoáng và đặc biệt chứa lượng glucose nhiều, nên tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển. Vi khuẩn lactic là loại đòi hỏi chất dinh dưỡng cao, nên khi đáp ứng được, chúng sẽ phát triển, tạo ra lượng acid lớn và làm chua môi trường. Nước dừa già thường là loại nước lấy từ trái dừa khô (dừa lấy cơm), lượng chất dinh dưỡng giảm (vì tập trung ở cơm dừa), nồng độ glucose thấp chủ yếu là saccharose. Mà vi khuẩn lactic sử dụng chủ yếu là glucose, chỉ một ít loài sử dụng được saccharose. Saccharose phải qua quá trình biến đổi mới tạo ra được glucose và fructose. Vì vậy, nhu cầu dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic bị hạn chế, chúng phát triển kém hơn, tạo ra lượng acid thấp, môi trường chua ít. Hình 4.2: Đồ thị thể hiện độ cồn (g/l) của nguyên liệu theo thời gian Theo bảng 4.1 và hình 4.2 cho thấy, độ cồn tăng theo thời gian, thời gian càng tăng lượng cồn tạo ra càng nhiều. Nhưng về mặt thống kê, nguyên liệu sử dụng cho quá trình lên men không ảnh hưởng đến lượng cồn tạo ra. Có thể do: Trong số vi khuẩn lactic thì có loài lên men lactic dị hình và lên men lactic đồng hình. Những vi khuẩn lên men lactic dị hình, ngoài lên men sinh ra lượng acid, nó còn sinh ra ethanol. Mặc khác, rất nhiều vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng saccharose làm cơ chất lên men chính. Vì vậy, theo thời gian số lượng tế bào vi khuẩn tăng lên, nguồn cơ chất dồi dào nên chúng sản sinh ra lượng cồn cao. Theo thời gian, với sự có mặt của oxy, số lượng tế bào nấm men tăng lên. Lượng acid do vi khuẩn tạo ra làm cho pH môi trường giảm, tạo diều kiện thuân lợi cho nấm men lên men. Chúng sử dụng nguồn cơ chất fructose, glucose, saccharose để lên men tạo ra ethanol, làm cho độ cồn trong môi trường tăng lên. Nguyên liệu sử dụng là nước dừa non hay già tạo ra lượng cồn tương đối, không sai khác về mặt thống kê. Đối với sản phẩm này, đòi hỏi độ chua cao, lượng cồn thấp vừa phải nên việc chọn độ cồn thích hợp cho sản phẩm chỉ cần nhỏ hơn 1g/l là được. Vì nếu cao hơn sẽ không thích hợp cho những người không uống đươc rượu và ảnh hưởng đến trẻ nhỏ. Kết luận Qua quá trình khảo sát dựa vào độ chua và độ cồn, ta chọn nguyên liệu là nước dừa non vì cho cho độ chua cao và lượng cồn vừa phải. 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan trong nguyên liệu đến quá trình lên men. Bảng 4.2: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan (%) ở nguyên liệu đến độ chua, độ cồn trong quá trình lên men. Nồng độ chất khô hòa tan (%) Thời gian (giờ) Độ chua (0T) Độ cồn (g/l) 5 5 15 25 14.45c 36.95b 50.65a 0.02c 0.096b 0.165a 7 5 15 25 14.95c 40.4b 57.7a 0.022c 0.12b 0.18a 9 5 15 25 14.15c 36.7b 49.85a 0.023c 0.125b 0.33a Hình 4.3: Đồ thị thể hiện độ chua (0T) của nồng độ chất khô hòa tan trong nguyên liệu theo thời gian Theo bảng 4.2 và hình 4.3 ta thấy, thời gian càng tăng độ chua càng cao. Sự chênh lệch giữa độ chua theo thời gian được thể hiện rõ trên đồ thị. Nguyên liệu có nồng độ chất khô hòa tan 5%, 9% lượng acid tạo ra trong môi trường tương đương nhau. Còn nguyên liệu có nồng độ chất khô hòa tan 7% thì lượng acid tạo ra nhiều hơn trong cùng thời gian lên men. Do trong nước dừa non nồng độ chất khô hòa tan cao, nên phải tiến hành pha loãng nguyên liệu để đạt được nồng độ mong muốn là 5%. Vì vậy làm cho cơ chất để lên men và chất dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic phát triển bị giảm đi một phần, nên lượng acid tạo ra trong môi trường thấp. Ngược lại, nồng độ chất khô hòa tan 9% thì lượng saccharose bổ sung vào nhiều dẫn đến nồng độ đường cao. Có thể đó là nguyên nhân ức chế một phần sự hoạt động của vi khuẩn lactic, làm ảnh hưởng đến quá trình lên men dẫn đến lượng acid tạo ra thấp. Nồng độ chất khô hòa tan 7% thì lượng saccharose bổ sung vào không đáng kể, cơ chất trong nguyên liệu tương đối. Vì vậy vi khuẩn lactic phát triển nhanh và tạo ra lượng acid cao hơn. Hình 4.4: Đồ thị thể hiện độ cồn (g/l) của nồng độ chất khô hòa tan trong nguyên liệu theo thời gian Theo bảng 4.2 và hình 4.4 ta thấy, độ cồn tăng theo thời gian, thời gian càng tăng lượng cồn sinh ra trong môi trường càng nhiều. Qua đồ thị cũng cho thấy, lượng cồn tạo ra ở nguyên liệu có nồng độ chất khô hòa tan khác nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê. Nhưng ta cũng thấy rõ, lượng cồn sinh ra ở nồng độ 7% vẫn nhiều hơn so với nồng độ 5% và 9%. Vì độ chua sinh ra ở nồng độ chất khô hòa tan 7% cao, làm giảm pH môi trường, tạo điều kiện thuân lợi cho vi khuẩn lên men lactic dị hình và nấm men phát triển mạnh. Khi đó chúng sử dụng nguồn cơ chất sẵn có và tạo ra lượng cồn cao hơn. Tuy vậy, nhưng chọn độ cồn ở nồng độ chất khô hòa tan nào cũng được vì đều không có sự khác biệt về mùi hương. Kết luận Qua khảo sát ta chọn nguyên liệu nước dừa non có nồng độ chất khô hòa tan 7% vì tạo ra được độ acid cao hơn mà nồng độ chất khô hòa tan tan thấp. Mặt khác, lượng cồn tạo ra trong môi trường cũng tương đối nên vẫn giữ được hương đặc trưng cho sản phẩm. 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ men giống đến quá trình lên men Bảng 4.3: Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ men giống đến độ chua, độ cồn trong quá trình lên men sau 24 giờ. Tỉ lệ men giống (%) Độ chua (0T) Độ cồn (g/l) 5 7 9 52.75b 73.375a 71.75ab 0.2175b 0.265a 0.2625ab Hình 4.5 : Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ men giống đến độ chua, độ cồn. Theo bảng 4.3 và hình 4.5 ta thấy, tỉ lệ men giống có ảnh hưởng đến khả năng sinh acid, sinh cồn trong môi trường. Ở tỉ lệ men giống 5% sau 24 giờ lên men tạo ra lượng cồn và acid thấp. Do mật độ vi khuẩn lactic và nấm men trong tỉ lệ men giống thấp, dẫn đến khả năng tạo ra các chất trong môi trường thấp. Mặt khác, có thể tỉ lệ men bổ sung vào thấp, thời gian lên men dài dễ xây ra hiện tượng tạp nhiễm làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Nên lượng acid và lượng cồn tạo ra trong môi trường không đạt được như mong muốn. Ngoài ra có thể do yếu tố oxy, pH,..cũng có ảnh hưởng nhất định. Trong khi đó, với tỉ lệ men giống 7%, 9% thì lượng acid, cồn tạo ra cao tương đương nhau. Mật độ vi khuẩn lactic và nấm men cao, chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng, cơ chất sẵn có trong môi trường để thực hiện quá trình lên men. Khi vi khuẩn lactic phát triển mạnh lượng acid sinh ra nhiều, làm giảm pH của môi trường tạo thuận lợi cho các vi khuẩn sinh hương và nấm men hoạt động. Chúng sẽ tạo ra mùi hương đặc trưng cho sản phẩm. Kết luận Qua khảo sát thì ta bổ sung tỉ lệ men giống 7% là thích hợp nhất. Vì tạo ra được độ acid và độ cồn trong môi trường cao, mà còn tiết kiệm được giá thành hơn so với tỉ lệ men giống 9%. 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ chua đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm. Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của độ chua đến thời gian, độ cồn, vi khuẩn, nấm men trong quá trình lên men. Độ chua (0T) Thời gian (giờ) Độ cồn (g/l) Vi khuẩn (A*1013 cfu/ml) Nấm men (A*1011 cfu/ml) 80 90 100 110 120 25.5d 27cd 30c 38b 43.5a 0.29b 0.325b 0.68a 0.7a 0.72a 1.19bc 2.8b 360a 1.45bc 0.855d 2.11c 4.465bc 31a 13b 3.15c 80 90 100 110 120 Hình 4.6 : Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa độ chua, thời gian lên men và độ cồn. Theo bảng 4.4 và hình 4.6 cho thấy, độ chua biến đổi theo thời gian, khoảng độ chua từ 800T – 1000T thì thời gian biến thiên chậm, cách khoảng 2 giờ thì tăng 100T, chứng tỏ lượng acid tạo ra nhanh. Nhưng để đạt độ chua > 1100T thì thời gian xảy ra lại lâu hơn, như vậy lượng acid tạo ra đang dần chậm lại. Độ cồn ban đầu thay đổi chậm, nhưng ở độ chua > 900T thì độ cồn tăng cao, sau đó tăng chậm lại, thời gian này cũng biến thiên chậm. Hình 4.7 : Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa độ chua, mật độ vi khuẩn lactic Dựa vào hình 4.6 và 4.7 có thể giải thích, khi mới bổ sung men giống vào nguyên liệu, theo thời gian vi khuẩn lactic bắt đầu phát triển. Chúng sử dụng nguồn cơ chất trong nguyên liệu cùng với các chất dinh dưỡng cần thiết và thực hiện quá trình trao đổi chất, giải phóng acid ra môi trường, làm chua môi trường. Theo thời gian, độ chua tăng lên cao, dẫn đến pH môi trường giảm xuống. Nếu quá trình lên men vẫn tiếp tục thì đến một lúc nào đó acid của môi trường sinh ra sẽ ức chế toàn bộ sự phát triển của vi sinh vật và làm cho sản phẩm có vị chua gắt, vị đắng. Hình 4.8 : Đồ thị thể hiện sự tương quan giữa độ chua, mật độ nấm men Ở hình 4.6, 4.7 và 4.8 cũng thể hiện mức độ tăng của hàm lượng cồn theo độ chua, ở độ chua 80 – 1000T, tốc độ sinh cồn nhanh hơn. Do lượng acid tạo ra làm pH giảm, thuận lợi cho vi khuẩn lên men lactic dị hình và nấm men phát triển, nên chúng sinh cồn rất nhanh. Nhưng, khi đạt đến độ chua >1000T, thì quá trình sinh cồn chậm lại. Có thể do mật độ vi khuẩn tăng cao, pH môi trường xuống quá thấp gây ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lên men lactic dị hình và nấm men. Ngoài ra, có thể do lượng cơ chất trong môi trường giảm nên lượng cồn tạo ra giảm. Mặt khác, có thể do sự chuyển hóa cồn thành acid acetic của nhóm vi khuẩn acetic. Quá trình này sẽ giảm độ cồn nhưng độ chua tăng và làm cho sản phẩm có vị chua gắt khó chịu. Chọn độ chua để kết thúc quá trình lên men rất quan trọng. Nếu độ chua quá thấp thì vị không đặc trưng, nên sản phẩm sẽ không đạt chất lượng. Mặt khác, số lượng vi sinh vật trong sản phẩm ít không có tác dụng kích thích tiêu hóa. Nhưng, nếu độ chua cao sẽ ảnh hưởng đến quá trình phối chế, còn tạo ra vị gắt và đắng gây cảm giác khó chịu cho người sử dụng. Do vậy việc lựa chọn độ chua thích hợp rất quan trọng vì nó ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men cũng như chất lượng sản phẩm. Kết luận Ta chọn độ chua 1000T ở thời gian 30 giờ là tốt nhất. Vì ở độ chua này, độ cồn tương đối vừa, mật độ vi khuẩn lactic và nấm men lớn. Nó sẽ thuận lợi cho quá trình phối chế, đảm bảo hình thái của sản phẩm được ổn định trong quá trình bảo quản và tạo cho sản phẩm có vị chua ngọt hài hòa. 4.5. Kết quả khảo sát tỷ lệ phối chế thích hợp cho thành phẩm sau lên men. Bảng 4.5: : Kết quả ảnh hưởng của nồng độ siro, tỉ lệ dịch siro phối chế đến mùi, vị, màu sắc của sản phẩm. Nồng độ siro (%) Tỉ lệ dịch siro phối chế (%) Mùi Vị Màu sắc 30% 10 15 20 3.08a 3.22a 3.21a 2.35a 2.55a 2.9a 3.4a 3.45a 3.3a 50% 10 15 20 3.24a 3.3a 3.17a 3.25b 4.55a 3.2b 3.4a 3.55a 3.52a Dựa vào bảng 4.5 và kết quả xử lý thống kê, ta thấy với tỉ lệ dịch siro phối chế vào sản phẩm giống nhau nhưng nồng độ siro ban đầu khác nhau thì về mặt cảm quan có sự khác biệt đáng kể. Ở nồng độ siro 50% thì về mặt cảm quan cho kết quả tốt hơn ở nồng độ siro 30%. Với nồng độ siro thích hợp là 50% thì tỉ lệ dịch siro phối chế vào sản phẩm cho cảm quan tốt nhất là 15%. Mặc dầu, không có sự khác biệt về mùi và màu sắc của sản phẩm. Nhưng vị của sản phẩm có sự khác biệt rất rõ rệt, vị của sản phẩm là một trong những nhân tố có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm. Ở nồng độ và tỉ lệ phối chế này, cho mùi rất đặc trưng, vị chua ngọt hài hòa và màu sắc cũng đẹp mắt hơn. Trong khi tỉ lệ phối chế vào thấp, ta sẽ cảm nhận được vị rất chua, tuy màu sắc và mùi không khác lắm nhưng cũng không tốt về mặt cảm quan mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng. Còn tỉ lệ phối chế cao, thì sản phẩm quá ngọt làm cho sản phẩm không có sự đặc trưng riêng của mình. Kết luận Với tỉ lệ dịch siro phối chế 15% của nồng độ siro 50% thì về mặt cảm quan cho kết quả tốt nhất và làm cho sản phẩm có vị, mùi, màu sắc đặc trưng riêng của mình. 4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng sản phẩm. Bảng 4.6 : Kết quả ảnh hưởng của thời gian đến độ chua, độ cồn, Salmonella, E.coli Thời gian (ngày) Độ chua (0T) Độ cồn (g/l) Salmonella E.coli (cfu/ml) 0 5 10 15 20 25 30 70f 71ef 71.75de 72.75cd 73.5c 75.25b 77.5a 0.68e 0.68e 0.695de 0.71cd 0.72bc 0.73ab 0.745a Không có Không có Không có Không có Không có Không có Không có 0 0 0 0 0 0 0 Thành phẩm sau khi phối chế sẽ có độ acid là 700T, độ cồn 0.68 g/l, được đưa vào bảo quản ở 4- 60C và tiến hành đo các chỉ tiêu chất lượng theo thời gian. Hình 4.9: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ chua, độ cồn. Qua bảng 4.6 và hình 4.9 cho thấy, khi bảo quản sản phẩm ở 4- 60C, thời gian để chỉ tiêu chất lượng vẫn còn duy trì được trong 20 ngày. Tuy trong thời gian bảo quản vẫn xảy ra sự biến đổi hóa lý nhưng tốc độ chậm hơn. Kết luận Để sản phẩm vẫn đảm bảo chất lượng tốt nên giữ sản phẩm ở nhiệt độ 4- 60C và sử dụng trước 15 ngày. Qua kiểm tra sau 30 ngày sản phẩm không có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Hình 4.10 : Sản phẩm nước dừa kefir có bổ sung nha đam CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Qua quá trình tiến hành thí nghiệm, thu thập số liệu và tổng hợp các kết quả ghi nhận được, tôi rút ra kết luận như sau: Để quá trình lên men xảy ra nhanh và sản phẩm có chất lượng cao, thời gian bảo quản được lâu mà vẫn giữ được hương, vị, hình thái thì: Nguyên liệu sử dụng cho quá trình lên men tốt nhất là nước dừa non Nồng độ chất khô hòa tan hòa tan(%) thích hợp nhất trong nước dừa non: 7% Tỉ lệ men giống tốt nhất cho quá trình lên men là 7% Độ chua thích hợp nhất sau lên men là 1000T ở thời gian 30 giờ. Tỉ lệ phối chế cho thành phẩm sau lên men tốt nhất là nồng độ siro 50% với tỉ lệ dịch siro phối chế 15%. Thời gian bảo quản tốt nhất cho sản phẩm là 20 ngày ở 4 – 60C. Qui trình kết luận: Nước dừa (dừa non với 7% nồng độ chất khô hòa tan Cấy giống ( 7%) Lên men (25-300C, 30h, 1000T) Phối chế (Nha đam 10%, nồng độ siro 50% với tỉ lệ dịch siro phối chế là 15%) Ủ lạnh (140C, 24h) Đóng chai Bảo quản (4-60C, 20 ngày) 5.2. Kiến nghị Kefir là món quà cuộc sống đươc ban tặng cho con người. Từ xa xưa nó đã được sử dụng và lưu truyền đên bây giờ. Sản phẩm sẽ bổ sung một số lượng lớn vi sinh vật cho cơ thể, giúp cơ thể khỏe mạnh và sống lâu hơn. Vì vậy kefir nên được sử dụng rộng rãi và tìm hiểu kỹ hơn. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, thiết bị và phương tiện thí nghiệm còn nhiều hạn chế nên nội dung thí nghiệm không thể khảo sát hết các yếu tố có liên quan đến chất lượng và tính thương mại cho sản phẩm kefir. Vì vậy để nâng cao giá trị dinh dưỡng, đa dạng hóa sản phẩm, cúng như được người tiêu dùng chấp nhận, sản phẩm cần được nghiên cứu thêm: Nghiên cứu sự phát triển của kefir trên các môi trường khác: dịch quả nguyên chất, sữa đậu nành, sữa dừa,... Khảo sát thời gian thời gian khuấy trộn, nồng độ oxy cung cấp cho quá trình lên men. Khảo sát thời gian và nhiệt độ ủ lạnh sản phẩm sau lên men để sản phẩm có hương vị đặc trưng và hấp dẫn. Khảo sát một số nguyên liệu để phối chế vào sau lên men như: cafe, cacao, dịch trái cây,... Nghiên cứu bổ sung chất bảo quản thích hợp cho sản phẩm để sử dụng được lâu mà vẫn đảm bảo chất lượng và không độc hại với con người.