Đề tài Nghiên cứu tái sinh in vitro và chuyển gen green fluorescent protein vào cây loa kèn

Tạp chí Khoa học và Phát triển 2009: Tập 7, số 2: 121- 129 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI 121 NGHI£N CøU T¸I SINH IN VITRO Vμ CHUYÓN GEN GREEN FLUORESCENT PROTEIN VμO C¢Y HOA LOA KÌN (LILIUM LONGGIFLORUM) NHê VI KHUÈN AGROBACTERIUM Study on In vitro Regeneration and GFP Gene Transfer in Lilium longiflorum via Agrobacterium tumefaciens Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Hoa Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội TÓM TẮT Kỹ thuật chuyển gen được sử dụng để chọn tạo các giống cây trồng mang đặc tính mong muốn. Thông qua nghiên cứu nuôi cấy mô vảy củ in vitro và chuyển gen GFP (green fluorescent protein) vào callus hoa loa kèn trắng (Lilium longiflorum) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đã xác định được môi trường tái sinh thích hợp cho mô nuôi cấy và làm rõ ảnh hưởng của một số khâu kỹ thuật đến quá trình chuyển gen. Khẳng định được môi trường tốt nhất để tạo callus là MS +8% saccarose + 0,5mg/l BA + 0,5mg/l 2,4D và để tái sinh chồi từ callus nên sử dụng môi trường MS + 2% saccarose + 0,25mg/l BA. Quá trình chuyển gen GFP đạt hiệu quả cao khi callus được nuôi cấy khởi động 5 ngày trước khi lây nhiễm vi khuẩn và để lây nhiễm vi khuẩn callus được cắt trên giấy thấm, ngâm trong dung dịch vi khuẩn trong 5 phút, sau đó đồng nuôi cấy trong 3 ngày. Gen GFP được biểu hiện với tỷ lệ cao ở callus (52,38 – 62,35%) và rễ của cây tái sinh (31,25 – 52,94% ) trong khi ở chồi tái sinh tỷ lệ này chỉ đạt 1,25%. Các kết quả này là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong tạo giống hoa loa kèn chuyển gen. Từ khoá: Chuyển gen, GFP, Lilium longiflorum, tái sinh. SUMMARY The in vitro regeneration and GFP gene transfer to Lilium longiflorum via Agrobacterium tumefaciens were studied with the aim to determine optimal regeneration medium and influences of technical stages on gene transformation. The combination of 2.4D and 6-benzyladenine (BA) in Murashige and Skoog (1962) basic medium proved effective in inducing callus formation. The MS medium containing BA at 0.5 mg/liter and 2.4D at 0.5 mg/liter was found suitable for callus induction, while the MS basic medium supplemented with 0.25 mg BA/liter, 20 gram sucrose, with pH adjusted to 5.8 before autoclave appeared optimal for shoot induction from callus. To successfully transform GFP gene the callus should be pre-cultured on regeneration medium before co-culture with A. tumefaciens. The callus should then be cut on filter paper, dipped in A. tumefaciens solution for 5 minutes and co- cultivated with A. tumefaciens for 3 days on regeneration medium. GFP gene expression was clear with high expression rate (52.38 to 62.35% in calli, 31.25 to 52.94% in roots and 1.25% in shoots). Key words: GFP gene transfer, Lilium longiflorum, regeneration. 1. §ÆT VÊN §Ò Hoa loa kÌn (Lilium longiflorum) lμ mét trong nh÷ng loμi hoa ®Ñp, bÒn, rÊt ®−îc −a thÝch vμ ®· ®−îc trång phæ biÕn ë n−íc ta tõ rÊt l©u ®êi. Do ®ã, viÖc nghiªn cøu nh»m c¶i tiÕn c¸c ®Æc tÝnh n«ng sinh häc cña c©y hoa loa kÌn tr¾ng Lilium longiflorum lμ rÊt cÇn thiÕt. HiÖn nay, viÖc c¶i tiÕn vμ t¹o gièng c©y trång míi b»ng kü thuËt chuyÓn gen ®· trë nªn phæ biÕn trªn thÕ giíi (Clive, 2008) vμ ®· cã nhiÒu nghiªn cøu chuyÓn gen nh»m t¹o ®−îc c©y hoa loa kÌn mang c¸c gen mong muèn. Watad vμ cs. (1998) ®· tiÕn hμnh nghiªn cøu chuyÓn gen thμnh c«ng cho Lilium longiflorum b»ng c¸ch sö dông Nghiên cứu tái sinh in vitro và chuyển gen green fluorescent protein vào cây hoa loa kèn... 122 H×nh 1. Lilium longiflorum ph−¬ng ph¸p b¾n gen vμo callus t¸i sinh tõ vÈy cñ. Mercuri vμ cs. (2003), Hoshi (2004, 2005) ®· sö dông thμnh c«ng ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p gen cho c©y hoa loa kÌn b»ng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens. ë ViÖt Nam, nhiÒu kÕt qu¶ nghiªn cøu nh©n gièng in vitro trªn ®èi t−îng hoa loa kÌn ®· ®−îc c«ng bè (Mai Xu©n L−¬ng, 1993; NguyÔn Quang Th¹ch 1996, 1999; D−¬ng TÊn Nhùt, 2004). NguyÔn ThÞ Lý Anh (2007), NguyÔn Quang Th¹ch (2006) vμ NguyÔn ThÞ Ph−¬ng Th¶o (2008) còng ®· nghiªn cøu sù t¸i sinh in vitro vμ thö nghiÖm chuyÓn gen cho c¸c gièng hoa lily Lilium Oriental hybrid “Siberia”, Lilium × formolongo. Tuy nhiªn, ®Õn nay viÖc nghiªn cøu sù t¸i sinh vμ chuyÓn gen cho c©y hoa loa kÌn ch−a ®−îc ®Ò cËp ë n−íc ta. Môc ®Ých cña c«ng tr×nh nμy lμ x¸c ®Þnh ®−îc m«i tr−êng t¸i sinh thÝch hîp ®ång thêi lμm râ ¶nh h−ëng cña mét sè b−íc kü thuËt ®Õn qu¸ tr×nh chuyÓn gen GFP (green fluorescent protein) vμo c©y hoa loa kÌn tr¾ng Lilium longiflorum lμm c¬ së cho c¸c nghiªn cøu tiÕp theo trong t¹o gièng hoa loa kÌn chuyÓn gen. 2. NGUY£N LIÖU Vμ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU 2.1. VËt liÖu Sö dông v¶y cñ in vitro cña gièng hoa loa kÌn Lilium longiflorum ®−îc trång phæ biÕn ë B¾c ViÖt Nam lμm nguån mÉu cÊy ban ®Çu. C¸c ho¸ chÊt sö dông ®Ó t¹o m«i tr−êng nu«i cÊy, c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng: 2,4D, BA Vector chuyÓn gen: vi khuÈn A.tumefaciens dßng AA16 chøa plasmid pBINm-GFP5-ER mang gen m· ho¸ cho protein cã kh¶ n¨ng ph¸t huúnh quang (green fluorescent protein - GFP) do ViÖn Di truyÒn cung cÊp (H×nh 2). 2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Nghiªn cøu sö dông ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« hiÖn hμnh vμ ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens. C¸c thÝ nghiÖm ®−îc thiÕt kÕ hoμn toμn ngÉu nhiªn, mçi c«ng thøc ®−îc bè trÝ 3 lÇn nh¾c l¹i, mçi lÇn nh¾c l¹i 50 - 200 mÉu tuú tõng thÝ nghiÖm. M«i tr−êng nu«i cÊy m« lμ m«i tr−êng MS (1962), pH 5,8 tr−íc khi khö trïng vμ cã bæ sung ®−êng saccarose, c¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr−ëng ë c¸c nång ®é kh¸c nhau tïy tõng thÝ nghiÖm. §èi víi nghiªn cøu x¸c ®Þnh m«i tr−êng t¸i sinh t¹o callus tõ m« v¶y cñ, tæ hîp c¸c chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng BA vμ 2,4D ®−îc bæ sung vμo c¸c c«ng thøc kh¸c víi c¸c nång ®é tõ 0,5 ®Õn 1,5 mg/l (trõ c«ng thøc ®èi chøng). Callus t¹o ®−îc tõ c«ng thøc tèi −u cña thÝ nghiÖm trªn ®· ®−îc cÊy chuyÓn vμo m«i tr−êng cã bæ sung BA ë c¸c nång ®é kh¸c nhau: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg/l ®Ó x¸c ®Þnh m«i tr−êng t¸i sinh c©y tõ callus. Sau khi cã ®−îc nguån mÉu thÝch hîp, tiÕn hμnh chuÈn bÞ dÞch vi khuÈn tr−íc khi l©y nhiÔm: vi khuÈn ®−îc nu«i trªn m«i H×nh 2. S¬ ®å plasmid mang gen ph¸t huúnh quang GFP Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Hoa 123 H×nh 3. ¶nh h−ëng cña BA vμ 2.4D ®Õn kh¶ n¨ng ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« v¶y cñ tr−êng LB láng: Tripton 10 g/l + NaCl 10 mg/l + cao nÊm men 5g/l (200 vßng/phót, 240C, 24 giê). DÞch vi khuÈn ®−îc ly t©m lÊy sinh khèi ë tèc ®é 5000 vßng/phót ë nhiÖt ®é phßng vμ ®−îc pha trong m«i tr−êng ®ång nu«i cÊy lo·ng. M«i tr−êng ®ång nu«i cÊy (m«i tr−êng nu«i cÊy mÉu sau l©y nhiÔm víi vi khuÈn): MS (kh«ng cã NH4NO3) + 20 mg AS/l + 20 g sucrose/l + 10 g gluco/l + 10 mM MES + 0,25 mgBA/l + 1g cassamino acid/l + 700 mg L- asparagine monohydrat/l + 700 mg L- glutamine/l + 7 g agar/l. §iÒu kiÖn ®ång nu«i cÊy: 240C, tèi. MÉu ®−îc ng©m trong dung dÞch vi khuÈn trong 5 phót, thêi gian ®ång nu«i cÊy lμ 3 ngμy. MÉu sau khi ®ång nu«i cÊy víi vi khuÈn ®−îc röa khuÈn nhanh 3 - 5 lÇn trong n−íc cÊt v« trïng hoÆc trong m«i tr−êng MS v« trïng, sau ®ã chuyÓn mÉu sang nu«i cÊy trªn m«i tr−êng diÖt khuÈn.M«i tr−êng diÖt khuÈn gåm m«i tr−êng t¸i sinh chåi tèt nhÊt tõ callus cã bæ sung 500 mg/l cefotaxime. MÉu cÊy t¸i sinh ®−îc nu«i trong ®iÒu kiÖn 16 giê s¸ng/8 giê tèi, c−êng ®é chiÕu s¸ng 2500 lux, nhiÖt ®é nu«i cÊy 25 ± 20C. Tû lÖ t¹o chåi, t¹o rÕ ®−îc tÝnh theo sè mÉu sèng sau khi t¸i sinh. Sù biÓu hiÖn cña gen GFP trªn callus, chåi vμ rÔ ®−îc kiÓm tra t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp. Mçi c«ng thøc kiÓm tra 20 mÉu. Sè liÖu ®−îc xö lý thèng kª theo ch−¬ng tr×nh IRISTAT 4.0. 3. KÕT QU¶ NGHI£N CøU Vμ TH¶O LUËN 3.1. Nghiªn cøu m«i tr−êng t¸i sinh C¸c nghiªn cøu vÒ nh©n gièng in vitro c©y hoa loa kÌn ®Òu kh¼ng ®Þnh m« v¶y cñ lμ lo¹i m« cã kh¶ n¨ng t¸i sinh cao (NguyÔn Quang Th¹ch, 1996, 1999; D−¬ng TÊn Nhùt, 2004). §Ó cã nguån mÉu thÝch hîp cho thÝ nghiÖm chuyÓn gen, chóng t«i ®· tiÕn hμnh x¸c ®Þnh m«i tr−êng t¹o callus tõ m« v¶y cñ vμ m«i tr−êng t¸i sinh c©y tõ callus. 3.1.1. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña BA vμ 2,4D ®Õn sù h×nh thμnh callus cña m« v¶y cñ §Ó tÕ bμo v¶y cñ cã thÓ ph¶n ph©n ho¸ vμ h×nh thμnh callus, m«i tr−êng nu«i cÊy ®· ®−îc bæ sung tæ hîp BA vμ 2,4D víi c¸c nång ®é kh¸c nhau. Sè liÖu thùc nghiÖm trong b¶ng 1 cho thÊy, CT1 (§/C) cho tû lÖ sèng, tû lÖ t¹o callus lμ cao nhÊt ®ång thêi ®©y lμ c«ng thøc duy nhÊt cã mÉu cÊy t¸i sinh t¹o chåi víi tû lÖ kh¸ cao, ®¹t 46,67%. §iÒu nμy kh¼ng ®Þnh kÕt luËn cña c¸c t¸c gi¶ nªu trªn vÒ kh¶ n¨ng ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« v¶y cñ. Tuy nhiªn, callus t¸i sinh ë c«ng thøc nμy l¹i kh«ng cã kh¶ n¨ng t¹o chåi. Bæ sung nång ®é cao cña BA vμ 2,4D ®· lμm gi¶m tû lÖ sèng cña v¶y cñ Lilium longflorum mét c¸ch râ rÖt. Tû lÖ sèng ®· gi¶m tõ 100% ë CT1 (§/C) vμ CT2 xuèng chØ cßn 41,38% ë CT7. Bªn c¹nh ®ã, tû lÖ t¹o callus gi¶m tõ 90% ë CT1 xuèng cßn 14,29% ë CT7 (B¶ng 1). Quan s¸t h×nh th¸i cña callus cho thÊy, callus t¸i sinh tõ CT2 lμ nh÷ng callus ph¸t triÓn tèt, mμu vμng xanh, kh«ng xèp vμ cã kh¶ n¨ng t¸i sinh t¹o chåi trong khi callus t¸i sinh tõ c¸c c«ng thøc kh¸c ®Òu cã chÊt l−îng kh«ng tèt, kh¶ n¨ng t¸i sinh t¹o chåi kÐm (H×nh 3). Nh− vËy, cã thÓ sö dông m«i tr−êng MS bæ sung 0,5 mg BA/lÝt + 0,5 mg 2,4D/lÝt ®Ó lμm m«i tr−êng t¸i sinh t¹o callus tõ m« v¶y cñ lμm nguån nguyªn liÖu cho c¸c thÝ nghiÖm chuyÓn gen. Nghiên cứu tái sinh in vitro và chuyển gen green fluorescent protein vào cây hoa loa kèn... 124 3.1.2. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña BA ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi tõ callus Callus t¹o ®−îc tõ c«ng thøc tèi −u cña thÝ nghiÖm trªn ®· ®−îc cÊy chuyÓn vμo m«i tr−êng cã bæ sung BA ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. KÕt qu¶ tr×nh bμy ë b¶ng 2 chØ râ, tû lÖ sèng vμ t¹o callus trªn tÊt c¶ c¸c c«ng thøc ®Òu ®¹t 100%. Nh− vËy, BA ®· kh«ng g©y ¶nh h−ëng tíi tû lÖ sèng cña callus. Tuy nhiªn, bæ sung BA ë nång ®é tõ 0,5 mg/lÝt trë lªn kh«ng nh÷ng g©y øc chÕ kh¶ n¨ng t¸i sinh t¹o chåi ®ång thêi sè chåi t¸i sinh/mÉu cÊy còng gi¶m ®i râ rÖt. C«ng thøc bæ sung 1,0 mgBA/lÝt chØ cho tû lÖ mÉu t¸i sinh t¹o chåi cßn 63,33% (CT5), trong khi ®ã c«ng thøc bæ sung 0,25 mgBA/lÝt (CT2) cho tû lÖ mÉu t¸i sinh t¹o chåi cao nhÊt vμ ®¹t 94,4% (B¶ng 2). Bªn c¹nh ®ã, chÊt l−îng chåi còng gi¶m ®i khi t¨ng nång ®é BA trong m«i tr−êng t¸i sinh. Nh− vËy, nång ®é cña BA ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn kh¶ n¨ng t¹o chåi tõ callus cña hoa loa kÌn. M«i tr−êng thÝch hîp cho t¸i sinh chåi tõ callus hoa loa kÌn lμ MS + 2% ®−êng sucrose + 0,25 mgBA/l. B¶ng 1. ¶nh h−ëng cña BA vμ 2,4 D ®Õn sù t¸i sinh callus cña m« v¶y cñ (sau 8 tuÇn) CT BA (mg/l) 2,4D (mg/l) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ tạo callus (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Đặc điểm hình thái mẫu cấy 1 0,0 0,0 100,0 90,00 46,67 Callus phát triển bình thường, màu vàng hơi thâm, chồi mập, khoẻ 2 0,5 0,5 100,0 76,67 0,00 Callus phát triển tốt, màu vàng xanh, không xốp 3 0,5 1,0 93,33 51,72 0,00 Callus phát triển bình thường, màu vàng hơi thâm 4 1,0 0,5 73,33 30,43 0,00 Callus phát triển chậm, màu vàng hơi thâm 5 1,0 1,0 93,33 67,86 0,00 Callus phát triển khá, chặt, màu vàng 6 1,5 0,5 81,25 34,78 0,00 Callus phát triển kém 7 1,5 1,0 41,38 14,29 0,00 Callus phát triển rất kém, rất ít, màu vàng hơi đen Ghi chú: Nền môi trường: MS + 8% sucrose, pH: 5,8, CT: công thức B¶ng 2. ¶nh h−ëng cña BA ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi tõ callus (sau 6 tuÇn) CT BA (mg/l) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ tạo callus (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số chồi/ mẫu cấy (chồi) Đặc điểm hình thái mẫu cấy 1 0,00 100 100 86,33 83,33 4,47 b Rễ khoẻ, nhiều lông hút, dài, chồi khoẻ, mập 2 0,25 100 100 94,44 94,44 5,36 a Rễ to, cứng, nhiều lông hút, dài, chồi rất mập, khoẻ, 3 0,50 100 100 80,56 77,78 3,72 c Rễ dài, mảnh, nhiều lông hút, chồi khoẻ, 4 0,75 100 100 72,22 91,67 2,89 d Rễ nhiều nhỏ, nhiều lông hút,hơi ngắn, chồi bé, ít, 5 1,00 100 100 63,33 86,67 1,86 e Rễ nhiều lông hút, ngắn, chồi ít, bé, CV% 4,70 LSD0,05 0,196 Ghi chú: Nền môi trường MS + 2% sucrose, pH = 5,8 Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Hoa 125 3.2. Nghiªn cøu chuyÓn gen GFP 3.2.1. ¶nh h−ëng cña thêi gian nu«i cÊy khëi ®éng ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn gen nhê vi khuÈn A.tumefaciens KÕt qu¶ chuyÓn gen nhê A.tumefaciens phô thuéc chÆt chÏ vμo tr¹ng th¸i cña tÕ bμo mÉu cÊy. TÕ bμo thùc vËt sinh tr−ëng tèt vμ b−íc vμo qu¸ tr×nh ph©n chia th−êng cã kh¶ n¨ng tiÕp nhËn gen chuyÓn cao. §iÒu nμy ®−îc thÓ hiÖn râ trong thÝ nghiÖm: callus ®−îc cÊy chuyÓn trªn m«i tr−êng t¸i sinh (MS + 2% ®−êng sucrose + 0,25 mg BA/l) tr−íc khi l©y nhiÔm víi vi khuÈn (mÉu cÊy ®−îc nu«i cÊy khëi ®éng) tõ 2 ®Õn 5 ngμy cã ¶nh h−ëng tÝch cùc tíi kh¶ n¨ng sèng vμ t¸i sinh cña chóng. Ngoμi ra, c¸c c©y t¸i sinh tõ callus ®−îc tiÒn nu«i cÊy cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng tèt h¬n h¼n so víi c©y t¸i sinh tõ callus kh«ng qua giai ®o¹n nu«i cÊy khëi ®éng (B¶ng 3). B¶ng 3. ¶nh h−ëng cña thêi gian nu«i cÊy khëi ®éng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh mÉu vμ chuyÓn gen (sau 8 tuÇn) Tỷ lệ biểu hiện gen GFP CT Thời gian nuôi cấy khởi động (ngày) Tỷ lệ mẫu sống sau tái sinh (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Chiều cao TB cây (cm) Số lá TB (lá/cây) Số chồi/ mẫu cấy (cây) Callus (%) Chồi (%) Rễ (%) 1 (Đ/C) Không lây nhiễm 100 100 100 5,8 3,7 4,2 0,00 0,00 0,00 2 0 70,93 59,09 61,36 3,2 1,7 2,1 52,38 0,00 45,83 3 2 94,12 73,17 70,73 3,7 1,9 3,2 62,50 0,00 52,94 4 3 87,01 81,82 70,45 4,3 2,0 3,2 59,09 0,00 31,25 5 5 86,11 86,67 73,33 4,7 2,3 3,6 50,00 1,25 54,17 CV% 3,1 5,1 3,8 LSD0,05 0,158 0,139 0,144 . H¬n thÕ, c¸c c«ng thøc cã mÉu cÊy ®−îc tiÒn nu«i cÊy ®Òu cho tû lÖ vμ møc ®é biÓu hiÖn gen GFP cao h¬n so víi c«ng thøc kh«ng qua giai ®o¹n tiÒn nu«i cÊy. Sù biÓu hiÖn cña gen GFP lμ t−¬ng ®èi râ, tû lÖ biÓu hiÖn tõ 52,38 - 62,5% ®èi víi callus vμ 31,25 - 52,94% ®èi víi rÔ. Riªng c«ng thøc 5 lμ c«ng thøc duy nhÊt cã sù biÓu hiÖn cña gen GFP trªn chåi t¸i sinh. Tuy nhiªn, tû lÖ chåi cã biÓu hiÖn gen GFP chØ ®¹t 1,25% vμ gen GFP chØ ®−îc biÓu hiÖn ë mét vμi vÞ trÝ trªn mét sè l¸ cña chåi (B¶ng 3). Nh− vËy, ®Ó t¨ng kh¶ n¨ng chuyÓn gen mÉu cÊy lμ callus nªn ®−îc nu«i cÊy khëi ®éng 5 ngμy tr−íc khi l©y nhiÔm víi vi khuÈn A.tumefaciens nh»m thÝch øng mÉu trong m«i tr−êng nu«i cÊy vμ kÝch thÝch sù ph©n chia cña tÕ bμo callus. 3.2.2. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña ph−¬ng ph¸p l©y nhiÔm ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn gen nhê vi khuÈn Agrobacterium tumerfaciens Ph−¬ng ph¸p l©y nhiÔm vi khuÈn víi mÉu cÊy kh«ng chØ b¶o ®¶m ®ñ l−îng vi khuÈn tiÕp xóc vμ b¸m dÝnh trªn bÒ mÆt bÞ th−¬ng cña m« thùc vËt mμ cßn ph¶i Ýt g©y t¸c h¹i ®Õn kh¶ n¨ng sèng vμ t¸i sinh cña mÉu. KÕt qu¶ trªn b¶ng 4 cho thÊy, tû lÖ sèng cña callus ®· l©y nhiÔm víi vi khuÈn sau khi chuyÓn qua m«i tr−êng t¸i sinh dao ®éng tõ 48,1% (CT5) ®Õn 70,23% (CT2). Trong khi ®ã, CT1 (kh«ng l©y nhiÔm víi vi khuÈn) cã tû lÖ mÉu sèng lμ 100%. Bªn c¹nh ®ã, kh¶ n¨ng t¸i sinh t¹o chåi, t¹o rÔ, còng nh− c¸c chØ tiªu sinh tr−ëng vÒ chiÒu cao, sè l¸ cña chåi t¸i sinh còng gi¶m ®i râ rÖt trªn Nghiên cứu tái sinh in vitro và chuyển gen green fluorescent protein vào cây hoa loa kèn... 126 c¸c c«ng thøc cã l©y nhiÔm víi vi khuÈn A.tumerfaciens. Trong c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm, CT2 cho tû lÖ t¹o chåi vμ hÖ sè t¹o chåi lμ cao nhÊt. Bªn c¹nh ®ã, côm chåi t¸i sinh ë CT2 cã chÊt l−îng tèt, chåi cã mμu xanh, cao, sinh tr−ëng m¹nh. ViÖc nhá trùc tiÕp dung dÞch vi khuÈn A.tumefaciens lªn callus ®· lμm gi¶m râ rÖt tû lÖ sèng, kh¶ n¨ng t¸i sinh cña callus còng nh− sinh tr−ëng cña c¸c chåi t¸i sinh. ë CT3 vμ CT5 thÊy râ sù ph¸t triÓn rÊt m¹nh cña vi khuÈn A.tumefaciens xung quanh callus sau 5 ngμy ®ång nu«i cÊy. Sù c¹nh tranh m«i tr−êng vμ t¨ng sinh qu¸ møc cña vi khuÈn khi ®ång nu«i cÊy lμ nguyªn nh©n cña kÕt qu¶ nªu trªn. MÆc dï vËy, ë c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm nμy l¹i cho sù biÓu hiÖn gen GFP lμ kh¸ cao vμ ®¹t tû lÖ 83,33% mÉu sèng ë CT3. Gen GFP chØ ®−îc biÓu hiÖn ë callus vμ rÔ mμ kh«ng biÓu hiÖn ë chåi t¸i sinh. Cã thÓ chåi t¸i sinh ®· kh«ng t¸i sinh tõ c¸c callus ®· ®−îc chuyÓn gen GFP hoÆc gen GFP ®· kh«ng ®−îc biÓu hiÖn ë c¸c lo¹i m« kh¸c ngoμi callus vμ rÔ. B¶ng 4. ¶nh h−ëng cña ph−¬ng ph¸p l©y nhiÔm ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh mÉu vμ chuyÓn gen (sau 8 tuÇn) Biểu hiện gen GFP (%) Cây CT Tỷ lệ mẫu sống sau tái sinh (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Chiều cao TB cây (cm) Số lá TB (lá/cây) Số cây/ mẫu cấy (cây) Callus Chồi Rễ 1 (Đ/C) 100,00 100,0 100,0 7,8 3,2 6,5 0,00 0 0,00 2 70,23 93,3 100,0 4,7 2,9 4,5 66,67 0 75,00 3 63,53 90,3 74,2 3,5 2,3 3,8 83,33 0 47,37 4 58,33 75,9 72,4 3,5 2,2 2,8 33,33 0 31,58 5 48,10 80,0 43,3 2,5 2,1 1,7 36,84 0 41,67 6 53,33 86,7 73,3 3,2 2,0 2,3 30,00 0 30,77 CV% 4,8 4,5 5,5 LSD0,05 0,24 0,1 0,23 Ghi chú: Tỷ lệ tạo chồi, tạo rễ được tính theo số mẫu sống sau khi tái sinh CT1: Đối chứng (không lây nhiễm với vi khuẩn). CT2: Mẫu được cắt trên giấy thấm, sau đó ngâm trong dung dịch vi khuẩn trong 5 phút. CT3: Mẫu được cắt trên giấy thấm, sau đó nhỏ dung dịch vi khuẩn lên mẫu cấy. CT4: Mẫu được cắt trong môi trường đồng nuôi cấy, sau đó ngâm trong dung dịch vi khuẩn trong 5 phút. CT5: Mẫu được cắt trong môi trường đồng nuôi cấy, sau đó nhỏ dung dịch vi khuẩn lên mẫu cấy. CT6: Cắt và ngâm mẫu trong dung dịch vi khuẩn trong 5 phút. §¸nh gi¸ tæng hîp vÒ kh¶ n¨ng sèng, t¸i sinh vμ sù biÓu hiÖn gen GFP cña m« callus sau khi l©y nhiÔm víi vi khuÈn A.tumefaciens, chóng t«i nhËn thÊy CT2 lμ c«ng thøc cho hiÖu qu¶ cao nhÊt. Nh− vËy, ë giai ®o¹n l©y nhiÔm, cã thÓ sö dông ph−¬ng ph¸p c¾t mÉu trªn giÊy thÊm sau ®ã ng©m mÉu cÊy trong dung dÞch vi khuÈn A.tumefaciens trong 5 phót. Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Hoa 127 B¶ng 5. ¶nh h−ëng cña thêi gian l©y nhiÔm ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh mÉu vμ chuyÓn gen (sau 8 tuÇn) Tỷ lệ biểu hiện gen GFP Công thức Thời gian lây nhiễm (ngày) Tỷ lệ mẫu sống sau tái sinh (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Chiều cao TB cây (cm) Số lá TB (lá/cây) Số chồi/ mẫu cấy (cây) Callus (%) Chồi (%) Rễ (%) 1 (Đ/C) Không lây nhiễm 100 100 100 4,5 3,0 5,5 0 0 0 2 3 70,32 90,00 80,0 2,2 2,1 3,2 68,42 7,50 60,00 3 5 54,02 83,33 63,3 2,0 2,0 2,4 63,16 5,13 61,54 4 7 48,10 70,00 46,7 1,4 1,7 2,2 57,14 5,00 52,50 CV% 4,5 5,0 5,1 LSD0,05 0,14 0,13 0,2 . A B C A B C H×nh 4. Sù biÓu hiÖn gen GFP (A) kh«ng biÓu hiÖn, (B) biÓu hiÖn trªn callus, (C) biÓu hiÖn trªn rÔ H×nh 5. Sù biÓu hiÖn cña gen GFP trªn: A - callus, B - rÔ, C - l¸ Nghiên cứu tái sinh in vitro và chuyển gen green fluorescent protein vào cây hoa loa kèn... 128 Thêi gian l©y nhiÔm chÝnh lμ thêi gian ®ång nu«i cÊy gi÷a vi khuÈn vμ callus ®Ó vi khuÈn A.tumefaciens thùc hiÖn qu¸ tr×nh chuyÓn gen vμo tÕ bμo thùc vËt. Qua b¶ng 5 nhËn thÊy: thêi gian ®ång nu«i cÊy víi vi khuÈn A.tumefaciens cμng dμi th× tû lÖ mÉu sèng, kh¶ n¨ng t¸i sinh t¹o chåi, t¹o rÔ cña callus cμng gi¶m. Tû lÖ sèng cña callus ®· gi¶m tõ 100% ë c«ng thøc ®èi chøng xuèng cßn 70,32% ë c«ng thøc ®ån nu«i cÊy trong thêi gian 3 ngμy (CT2) vμ chØ cßn 48,1% ë c«ng thøc cã thêi gian ®ång nu«i cÊy lμ 7 ngμy (CT4). Tû lÖ t¸i sinh t¹o chåi ®¹t 90% ë CT2 vμ gi¶m xuèng cßn 70% ë CT4. Bªn c¹nh ®ã, c¸c chØ tiªu vÒ sè chåi t¸i sinh, chiÒu cao c©y, sè l¸ trung b×nh ®Òu gi¶m khi t¨ng thêi gian ®ång nu«i cÊy. Theo dâi thÝ nghiÖm cho thÊy, c¸c c«ng thøc CT3 vμ CT4 cã sù ph¸t triÓn m¹nh cña vi khuÈn A.tumefaciens (vßng khuÈn nh×n râ, sinh khèi vi khuÈn nhiÒu) l¹i cho tû lÖ mÉu cã biÓu hiÖn gen GFP Ýt h¬n so víi CT2 (vßng khuÈn mê, sinh khèi vi khuÈn Ýt). Tû lÖ mÉu cã biÓu hiÖn gen ë CT2 lμ cao nhÊt vμ ®¹t 68,42% ë callus, 7,5% ë chåi vμ 60% ë rÔ. §©y lμ c«ng thøc cã tû lÖ mÉu biÓu hiÖn gen kh¸ cao vμ ®Æc biÖt lμ ®· thu ®−îc c¸c chåi t¸i sinh cã biÓu hiÖn cña gen GFP trªn l¸ (mét vμi l¸ hoÆc mét phÇn l¸ c©y) ®Ó h×nh thμnh thÓ kh¶m. Râ rμng thêi gian ®ång nu«i cÊy ¶nh h−ëng ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn gen cña vi khuÈn A.tumefaciens vμo callus cña hoa loa kÌn. Thêi gian ®ång nu«i cÊy gi÷a callus vμ vi khuÈn A.tumefaciens thÝch hîp lμ 3 ngμy. 4. KÕT LUËN §· x¸c ®Þnh ®−îc m«i tr−êng t¸i sinh thÝch hîp, ®ång thêi b−íc ®Çu nghiªn cøu chuyÓn gen GFP (green fluorescent protein) vμo c©y hoa loa kÌn tr¾ng Llium longiflorum v¬i c¸c kÕt qu¶ sau: Cã thÓ sö dông m«i tr−êng MS bæ sung 8% ®−êng sucrose vμ 0,5 mg BA/lÝt + 0,5 mg 2,4D/lÝt lμm m«i tr−êng t¸i sinh t¹o callus tõ v¶y cñ lμm nguån m« cho chuyÓn gen. M«i tr−êng thÝch hîp cho t¸i sinh t¹o chåi tõ callus hoa loa kÌn lμ: MS + 2% ®−êng sucrose + 0,25 mgBA/l. Callus nªn ®−îc nu«i cÊy khëi ®éng 5 ngμy tr−íc khi cho l©y nhiÔm víi vi khuÈn A.tumefaciens. ë giai ®o¹n l©y nhiÔm, callus ®−îc c¾t trªn giÊy thÊm sau ®ã ng©m trong dung dÞch vi khuÈn A.tumefaciens trong 5 phót. Thêi gian l©y nhiÔm (®ång nu«i cÊy) gi÷a callus vμ vi khuÈn A.tumefaciens thÝch hîp lμ 3 ngμy. Gen GFP ®· biÓu hiÖn trªn callus còng nh− ë rÔ vμ chåi cña c©y t¸i sinh tõ callus. Sù biÓu hiÖn cña gen GFP lμ t−¬ng ®èi râ, tû lÖ biÓu hiÖn tõ 52,38 - 62,5% ë callus, 31,25 - 52,94% ë rÔ vμ 1,25% trªn chåi. TμI LIÖU THAM KH¶O NguyÔn ThÞ Lý Anh, §inh Tr−êng S¬n, Bïi ThÞ Mü H¹nh, NguyÔn ThÞ H−¬ng (2007). Nghiªn cøu chuyÓn gen GFP vμo c©y Lilium Oriental hybrid “Siberia”. C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c«ng t¸c nh©n gièng vμ chän t¹o gièng hoa. NXB. N«ng nghiÖp, 2007, tr.195-202. D−¬ng TÊn Nhùt (1994). Nh©n gièng HuÖ T©y b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy v¶y cñ. T¹p chÝ Sinh häc 3/1994, tr.29 - 30. NguyÔn Quang Th¹ch, NguyÔn ThÞ Ph−¬ng Th¶o, NguyÔn ThÞ Lý Anh (2006). C¶m øng t¹o callus vμ t¸i sinh chåi tõ callus ë c©y hoa loa kÌn Lilium formolongo lμm c¬ së cho c«ng t¸c chän t¹o gièng b»ng kü thuËt chuyÓn gen. T¹p chÝ C«ng nghÖ sinh häc 3(4),tr.495-502. Nguyen Thi Phuong Thao, Nguyen Quang Thach (2008). Developing an Agrobacterium - mediated transformation system for lilium × formolongo thin cell layer of bulb scales. T¹p chÝ Khoa häc vμ Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Hoa 129 ph¸t triÓn - Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hμ Néi, sè ®Æc biÖt, 4/2008, tr.123- 128. Clive J.(2008). Reporte on global status of biotech/GM crops. Brief 39. International service for the acquisition of Agri-Biotech applications. Hoshi Y., M.Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano, H.Kobayashi (2004). Production of transgenic lily plants by Agrobacterium - mediated transformation, Plant Cell Rep. 22:359-364. Hoshi Y., Kondo M., Kobayashi H., Mori S., Nakano M. (2005). Agrobacterium- mediated transformation of Lilium longiflorum. Acta Hort 673, vol 2: 543-547. Mercuri A., L.De Benedtti, S.Bruna, R.Begliano, C.Bianchini, G.Foglia, T.Schiva. Agrobacterium - mediated transformation with rol genes of Lilium longiflorum Thumb. ISHS Acta Horticluturae 612. Ogaki M., Furuichi Y., Kuroda K., Chin D. P.; Ogawa Y., Mil M. (2008). Importance of co-cultivation medium pH for successful Agrobacterium - mediated transformation of Lilium × formolongo. Plant cell reports 2008, vol. 27, no4, pp. 699-705. Watada A. , Yun D. J., Matsumoto T., Niu X., Wu Y., Kononowicz A. K., Bressan R. A. , Hasegawa P. M. (1998). Microprojectile bombardment - mediated transformation of Lilium longiflorum. Plant cell reports , vol. 17, no4, pp. 262- 267 (37 ef.).