Đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây cà phê chè (coffea arabica, rubiacea)

đƣợc tạo ra khác với của vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram(+) và khuẩn xoắn rất nhạy cảm với các kháng sinh β-lactam. Các vi khuẩn Gram(-) phần lớn kháng thuốc đối với các penicillin cổ điển. Tuy nhiên, các penicillin bán tổng hợp (ampicillin, carbenicyllin) và cephalosporin đều có tác dụng đối với vi khuẩn Gram(-). N S CH3 CH3 COOH HH O N H C O R 3.25 Một số kháng sinh penicillin quan trọng R Tên Ph-CH2- Penicillin G CH3-CH2-CH=CH-CH2- Penicillin F CH2=CH-CH2-S-CH2- Penicillin O Ph-O-CH2- Penicillin V HOOC CH CH2 NH2 CH2 CH2 Penicillin N N S R2 COOH R3 O HNC O R1 3.26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Một số cephalosporin quan trọng R1 R2 R3 Tên Cách dùng HOOC CH NH2 CH2 5 AcOCH2- H Cephalosporin C Thuốc uống S CH2CO- AcOCH2- H Cephalotin Thuốc dùng ngoài ruột CH NH2 D CH3- H Cephalexin Thuốc uống N N N N CH2 CO N S N S3 CH2 H Cephazolin Thuốc dùng ngoài ruột S CH2CO -CH2-O-CONH2 CH3O Cefoxitin Thuốc dùng ngoài ruột  Kháng sinh aminoglycozit (nhóm streptomycin) Một số chế phẩm kháng sinh streptomycin quan trọng. Hoạt chất Tên Phổ tác dụng Điều trị OH HO H N HO C NH NH2 N H C NH NH2 O O O O CHOHO H3CHOH2C OH HO NH CH3 3.27 Streptomycin A Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Bệnh lao, Viêm màng não, Viêm màng tim O CH2NH2 OH OH OH O NH2 NH2 OH O O H2C OH NH2 OH HO 3.28 Kanamycin A Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Bệnh lao, Viêm màng não, Viêm màng tim Nhiễm khuẩn ruột NH CH3 H3C O H2N HO NH2 O O CH3 OH HN CH3 3.29 Gentamycin Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Pseudomonas Nhiễm khuẩn đường liệu đạo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Các kháng sinh streptomycin, sản phẩm sinh ra trong quá trình sống của nấm Streptomyces griseus, đƣợc Waksman và cộng sự phân lập vào năm 1944. Về mặt cấu tạo, chúng là các aminoglycosit, gồm 2 phần, phần genin (aglicon) là các dẫn xuất của streptamin, phần đƣờng là các monosacarit nhƣ L-xilozơ, L-streptozơ, 5-hydroxistreptozơ, N-metyl-L-glucozamin, D- mannozơ. Steptomycin có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-). Các kháng sinh streptomycin có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-), không có tác dụng với phần lớn khuẩn Samonella và Pseudomonas. Hoạt tính quan trọng nhất là kháng vi trùng lao (TBC). Tuy nhiên chúng dễ bị kháng thuốc khi dùng điều trị đơn lẻ. Các kháng sinh streptomycin không bền đối với kiềm, chỉ dùng dƣới dạng muối.  Kháng sinh tetracyclin Năm 1947, ngƣời ta phát hiện ra chlotetracyclin là kháng sinh đƣợc tạo ra bởi nấm Streptomyces aureofaciens. Năm 1949, ngƣời ta phân lập đƣợc oxitetracyclin từ loài Streptomyces rimosus. Tetracyclin là các kháng sinh có phổ tác dụng rất rộng, nó có hoạt tính đối với tất cả các loại khuẩn, các loại khuẩn Proteus, Pseudomonas và khuẩn xoắn. Chlotetracyclin có hoạt tính yếu hơn, còn doxicyclin và minocyclin có thể điều trị hiệu quả đối với các bệnh lậu và viêm màng não. O OH O OH CO-NH-R1 R2R3R4R5 OH OH NMe2 3.30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Tên R1 R2 R3 R4 R5 Độ bền Chlotetracyclin (Aureomycin) H H OH CH3 Cl Không bền Oxitetracyclin (Terramycin) H OH OH CH3 H Không bền Metacyclin H OH =CH H Bền Doxicyclin (Vibramycin) H OH H CH3 H Bền Minocyclin (Klinomycin) H H H H Me2N- Bền  Kháng sinh chlorocid (chloramphenicol) Năm 1947, ngƣời ta phát hiện ra một chủng Streptomyces mới có thể tạo ra chlorocid trong quá trình sống. Ngày nay, chlorocid đã đƣợc điều chế bằng con đƣờng tổng hợp toàn phần [2], [36]. Kháng sinh chlorocid có phổ tác dụng rộng nhất bên cạnh tetracyclin. Nó có tác dụng lên mọi vi khuẩn trừ khuẩn Pseudomonas. Tuy nhiên, nó lại có hoạt tính cả với khuẩn Salmonella, khuẩn Proteus, Trùng rận, khuẩn Chlamydia. Lĩnh vực sử dụng điều trị hiện nay chủ yếu là chữa viêm màng tim, bệnh nhiễm trùng nặng do vi khuẩn Gram(-) gây ra. R CH CH OH CH2-OH NH-CO-CHCl2 3.31a R = NO2 Chlorocid 3.31b R = MeSO2 Thimaphenicol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 CHƢƠNG 2 PHẦN THỰC NGHIỆM Cây cà phê chè (Coffea arabica) là loại cây công nghiệp đƣợc du nhập sớm vào Việt Nam. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hạt cà phê chè nhƣng những hiểu biết về thành phần hoá học và tác dụng dƣợc lí của lá cây cà phê chè vẫn còn rất sơ sài. Ở Malaysia và Indonesia, ngƣời ta sử dụng lá cây cà phê chè sắc nƣớc để làm thuốc lợi tiểu. Cà phê chè còn đƣợc dùng nhƣ bài thuốc cổ truyền điều trị các bệnh hen xuyễn, nhiễm độc atropin, cúm, đau đầu,... Từ bài thuốc cổ truyền khá độc đáo của dân tộc Dao, sử dụng lá cây Cà phê chè để bài sỏi thận với kích cỡ nhỏ hơn 10 mm trong thời gian khoảng 20 - 30 ngày. Vì thế, lá cây cà phê chè đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu hoá thực vật. Nhiệm vụ của luận văn là tìm hiểu một số thành phần hoá học có trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc trồng tại xã Hoàng Quế, huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh. 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là lá cây Cà phê chè, lá cây tƣơi đƣợc thu hái 12/2008 tại Lâm Xá - Tràng Bạch - Hoàng Quế - Đông Triều - Quảng Ninh. Mẫu lá cà phê chè để nghiên cứu hoá thực vật đã đƣợc TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là Coffea arabica (chi: Coffea, họ: Rubiacea, bộ: Gentianales, lớp: Magloniopsida, ngành: Magloniophta, giới: Platae). 10,5 kg mẫu cây tƣơi đem sấy ở nhiệt độ 110 0C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 0C - 60 0C tới khi độ ẩm dƣới 10% đƣợc 1,2 kg mẫu khô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.1.2. Phƣơng pháp ngâm chiết 1,2 kg mẫu khô đã nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với từng loại dung môi: n-Hexan, etylaxetat, metanol trong thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ 50 0 C, thời gian ngâm mỗi lần 1 giờ. Mẫu nghiên cứu đƣợc ngâm với từng loại dung môi trên mỗi loại 5x 5lit. Dồn chung mỗi loại dịch chiết riêng biệt và làm khan bằng Na2SO4. Sau đó các dịch chiết riêng biệt đƣợc lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt ≤ 50 0C dƣới áp xuất giảm. Thu đƣợc thu đƣợc 3 cặn tƣơng ứng n -Hexan, etylaxetat và metanol. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm 2.1.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với 3 loại cặn thô thu đƣợc ở trên tại Phòng thử hoạt tính sinh học -Viện Hoá học -Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.4. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng nhƣ phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phƣơng pháp sắc ký nhƣ: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột thƣờng dùng Silica gel Merck 63-200 nm, cột pha đảo bằng các dung môi và hệ dung môi thích hợp. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại . 2.1.5. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất Các chất phân lập đƣợc ở dạng tinh khiết là đối tƣợng để khảo sát các đặc trƣng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy (Mp), đo độ quang hoạt (αD) v.v.. khi thu đƣợc các chất sạch, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch đƣợc dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thƣớc khác nhau đã dùng loại silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ độ dày 0,2 mm (Art. 5554). Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM: STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu 1 n-Hexan - EtOAc (8: 1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4: 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (2: 1) hệ C 4 Cloroform - metanol (9: 1) hệ D 5 Cloroform - metanol (5: 1) hệ E 6 Cloroform - metanol (3: 1) hệ F Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 oC, để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thƣờng sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dƣới dạng viên nén KBr. - Phổ khối lƣợng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Khoa học và Công nghệ Việt nam) ion hóa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD. - Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6. 2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết Mẫu tƣơi sau khi diệt men, sấy khô, nghiền nhỏ rồi ngâm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Phần bã tiếp tục ngâm, chiết lần lƣợt với etylaxetat và metanol. Các dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đó, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi ở áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu đƣợc các cặn tƣơng ứng. Đem cân để xác định khối lƣợng các cặn. Việc thu nhận các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) xem sơ đồ 2.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) MÉu kh« nghiÒn nhá 1,2 kg CÆn n-Hexan Cof H: 80g B· 1 CÆn EtOAc Cof E: 42,3 g B· 2 B· 3 (Bá) n-Hexan(5x5l) C« kh« EtOAc 5x5l C« kh« MeOH5x5l C« kh« CÆn MeOH Cof M: 92,7g Cặn đƣợc làm khô đến khối lƣợng không đổi và cân xác định trọng lƣợng. Từ lá cây Cà phê chè đã thu đƣợc 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu là: Cof H, Cof E, Cof M Ở đó: Cof H : Cặn chiết n-Hexan Cof E : Cặn chiết EtOAc Cof M : Cặn chiết MeOH Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ lá cây Cà phê chè ở Hoàng Quế, Đông Triều, Quảng Ninh đƣợc nêu trong bảng 2.1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Bảng 2.2: Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) Mẫu thu vào tháng 12/2008 Khối lƣợng mẫu khô (g) (% so với trọng lƣợng khô) Khối lƣợng cặn chiết khô (g) n-Hexan (% so với trọng lƣợng khô) EtOAc (% so với trọng lƣợng khô) MeOH (% so với trọng lƣợng khô) Lá 1200 (11,43%) 80,0 (6,67%) ( Cof H) 42,3 (3,53%) ( Cof E) 92,7 (7,73%) (Cof M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dƣơng tính. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit. Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dƣơng tính. Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tính. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tính với các flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tính đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dƣơng tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dƣơng tính. Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trƣờng axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dƣơng tính đối với cumarin. 2.3.2.5. Định tính các glucosit tim Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm nhƣ mục 2.3.2.1. + Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dƣơng tính với vòng butenolit. + Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5% Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim. 2.3.2.6. Định tính các saponin Chuẩn bị dịch thử nhƣ ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dƣơng tính. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.3: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Cặn tổng 1 Sterol Lieberman-Bourchardt Màu xanh Màu vàng + 2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam + 3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt _ H2SO4 đặc Hồng nhạt _ NaOH đặc Vàng _ FeCl3 5% Xanh thẫm _ 4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa bông Có kết tủa _ 5 Glucosit trợ tim FeCl3 trong CH3COOH +H2SO4đ Vàng nâu rõ ─ 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH + Chú giải: + : Phản ứng dƣơng tính ─ : Phản ứng âm tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 2.3.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) * Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở ngƣời gồm các nhóm: - Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa(Pa) ATCC 15442. Escherichia coli (Ec)ATCC 25922, - Vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus(Sa) ATCC 13709. Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633 Lactobasillus fermentun N4, Enterococus faecium B650 - Nấm men: Candida albicans (Ca) ATCC10231. * Môi trƣờng nuôi cấy. MHB (Mueller - Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar)cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm * Pha loãng mẫu thử. - Mẫu ban đầu đƣợc pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. - Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml đƣợc pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 256 μg/ml, 64μg/ml, 16μg/ml; 4μg/ml, 1μg/ml. * Thử hoạt tính các cặn. - Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.10 cfu/ml khi tiến hành thử. - Lấy 10μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã đƣợc pha loãng, thêm 200μl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thƣờng. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 + Thử định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn. + Các mẫu cho hoạt tính (+) ở bƣớc 1 sẽ đƣợc tiến hành thử tiếp bƣớc 2 để tính ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phƣơng pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink tiến hành trên phiến vi lƣợng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampicilin, Tetracylin, Amphoterixin B và Nystatin. Bảng 2.4: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết của lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định ChủngVSV vi Gram dƣơng Chủng VSV Gram âm Nấm men Staphylococcus aureus IC50(g/ml) Bacillus subtilis IC50(g/ml) Escherichia coli IC50 (g/ml) Pseudomonas aeruginosa IC50 (g/ml) Candida albicans IC50 (g/ml) 1 Cof H > 256 >256 >256 >256 >256 2 Cof E > 256 >256 >256 >256 >256 3 Cof M > 256 >256 >256 >256 >256 Nhận xét: Các mẫu thử không có tác dụng kháng các chủng vi sinh vật trên. 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan (Cof H) Lấy 45 g cặn n-hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan-etylaxetat có tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 - 100% etylaxetat. Dịch rửa giải đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc dồn làm một rồi đem cất loại dung môi. Sau đó để yên dịch cô ở nhiệt độ phòng cho tự kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 tinh, các chất kết tinh thể thu đƣợc tiếp tục cho kết tinh lại bằng dung môi thích hợp để nhận đƣợc chất tinh khiết (sạch) và ghi các loại phổ để xác định cấu trúc hoá học, các chất thu đƣợc nhƣ sau: 2.4.1.1. Ancol mạch dài E4C (hexatriacontan-1-ol) Chạy sắc ký cột 45 g cặn Cof H bằng dung môi n - hexan thu đƣợc khối chất rắn, kết tinh là những tinh thể hình kim, không màu, có khối lƣợng 7,7 mg (0,0257%), kiểm tra SKLM trong hệ dung môi chloroform: metanol (9:1) (Hệ D) hiện màu bằng hơi I2 thấy có 1 vết tròn trên bản mỏng . Xác định Rfx100= 81, nóng chảy ở 88 - 89 C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 3.64 (t, 2H1), 1.55 (m, 2H2), 1.28 (H3-35, br), 0.88 (t, 3H36). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 63.12 (t, C1), 32.83 (t, C2), 31,93 (t, C34 ), 29.62(br, C3-32), 25.75(t, C3 ), 22.69(t, C35 ), 14.11 (q, C36). 2.4.1.2. -Sitosterol Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan/etylaxetat (20:1), thu đƣợc khối chất rắn vô định hình, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đã thu đƣợc những tinh thể hình kim, không màu, có khối lƣợng 23mg (0,051%), Rfx100=50, nóng chảy ở 135-136C. Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm -1 ): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3): (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Phổ 13C -NMR (125MHz, CDCl3):  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.1.3. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol . Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan:etylaxetat (10:1), sau khi cất lại dung môi, cặn thu đƣợc kiểm tra SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung môi n-hexan thu dƣợc 19 mg (0,042%) tinh thể hình kim, không màu, không mùi, Rf100 = 64, nóng chảy ở 155-157 0 C, []25D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Phổ FT-IR(KBr): νmax(cm -1 ):3429,1(OH); 2864,9(C-H); 1642,5 và 1651,4(C=C) Phổ EI-MS (m/z (%): 412[M+](7), 300(7), 255(11), 231(4), 213(8), 173(7), 145(20), 133(20), 83(49,3), 55(100), 43(90). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 5.35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H6); 5.14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5.03 (1H, dd, J23,22=15 Hz, J23,24=5 Hz, H-23); 3.49 (1H, m, H-3). Phổ 13C -NMR (125MHz, CDCl3),  (ppm): 36.5 (t, C-1); 29.67 (t, C-2); 71.8 (d, C-3); 42.25 (t, C-4); 140.71 (s, C-5); 121.67 (d, C-6); 37.21 (t, C-7); 31.84 (d, C-8); 51.2 (d, C-9); 36.11 (s, C-10); 24.32 (t, C-11); 42.17 (t, C-12); 31.6 (s, C-13); 56.83 (d, C-14); 25.38 (t, C-15); 31.6 (t, C-16); 55.9 (d, C-17); 12.01 (q, C-18); 18.95 (q, C-19); 40.47 (d, C-20); 21.03 (q, C-21); 138.3 (d, C-22); 129.3 (d, C-23); 50.01 (d, C-24); 33.9 (t, C-25); 21.19 (q, C-26); 19.79 (d, C-27); 28.89 (q, C-28); 12.22 (q, C-29). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 2.4.2. Cặn dịch chiết etylaxetat. Lấy 30 g cặn etylaxetat đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform: metanol có tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 - 100% metanol. Dịch rửa thoát ra từ cột đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% xấy ở nhiệt độ > 100 0C, sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc gộp lại một và đuổi kiệt dung môi. 2.4.2.1. Tritecpen (COF18E3). Rửa giải cột bằng dung môi chlorofom, cất loại dung môi, thu đƣợc khối chất rắn, kiểm tra SKLM trong hệ dung môi chlorofom: metanol (9:1) thấy chất rắn có hai chất là thành phần chính. Phân tích tiếp bằng cột nhỏ bắt đầu từ hệ hexan: etylaxetat (5:1), (3:1), (2:1), (1:1), etyl axetat, chloroform, chloroform: metanol (9:1), (7:1), (5:1), (3:1), (1:1) và MeOH đã thu đƣợc hai nhóm chất rắn là tinh thể hình kim, không màu trong dung môi chloroform . Nhóm I kí hiệu là COF18E3 có khối lƣợng 118,7 mg (0,394%), nhóm II kí hiệu là COF.Anc, khi phân tích cặn Cof M cũng thu đƣợc COF.Anc có tổng khối lƣợng 520,7mg (1,74%). Kiểm tra SKLM với 18E3 trong hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin thấy một vệt tròn màu hồng trên bản mỏng, Rfx100 = 62, nóng chảy ở 258 - 259 o C. IR: (ν cm-1); 3440,3 (OH); 2930,19-2873,52 (C-H: metyl, metylen, metin); 1691,09 (C=O), ... ESI-MS, m/z: 457,36 [M + +H], 1 H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi (CDCl3 + CD3OD): H1 (1,7); H2 (1,55); H3 (3,15); H5 (0,69); H6 (1,3 và 1,49); H7 (1,3); H9 (1,93); H11 (1,8); H12 (5,2); H15 (1,82); H16 (1,93); H18 (2.16); H19 (1,65); H20 (1,65); H21 (1,9); H22 (1,72); H23 (1,05); H24 (0,7); H25 (0,8); H26 (0,9); H27 (0,7); H29 (0,85); H30 (1,1). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 13 C-NMR: 125 Mhz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi (CDCl3 + CD3OD): C1 (t, 38,8); C2 (t, 27); C3 (d, 79); C4 (s, 38,7); C5 (d, 55.3); C6 (t, 18,8); C7 (t, 33,1); C8 (s, 39,6); C9 (d, 47,7); C10 (s, 37,1); C11 (t, 23,4); C12 (d, 125,7); C13 (s, 138,4); C14 (s, 42,2); C15 (t, 28,1); C16 (t, 30,8); C17 (s, 47,9); C18 (d, 52,9); C19 (d, 39,2); C20 (d, 39); C21 (t, 24,3); C22 (t, 36,9); C23 (q, 28,2); C24 (q, 17); C25 (q, 17,1); C26 (q, 21,2); C27 (q, 15,5); C28 (s, 180,7); C29 (q, 15,7); C30 (q, 23,5). 2.4.2.2. 3-O--Sitosteryl-glucopyranosit. Tiếp tục rửa giải cột bằng dung môi chloroform thu đƣợc khối chất rắn vô định hình, kết tinh lại trong dung môi n-hexan thu đƣợc 16 mg (0,036%), kiểm tra SKLM bằng hệ dung môi CM(9:1) (hệ D) Rfx100=35, nóng chảy ở 279-280 o C. Phổ FT-IR max (cm -1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6] + (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C-6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C- 9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C-20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 2.4.3. Cặn dịch chiết MeOH Lấy 45 gam cặn MeOH cho vào axit hoá để PH = 1. Sau đó, lọc qua giấy lọc đƣợc dịch đem kiềm hoá bằng NaHCO3 đến PH = 10 rồi đem chiết với chloroform mỗi lần chiêt 150 ml dịch với 200 ml chloroform, dịch sau khi chiết đem làm khô và cất dƣới áp xuất giảm thấy những tinh thể màu trắng, rửa bằng MeOH đƣợc tinh thể đem xác định nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc cho kết quả giống nhƣ COF.Anc. COF.Anc thu đƣợc bằng phƣơng pháp sắc kí cột khi phân tích cặn Cof E. Kểm tra SKLM với COF.Anc hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin không hiện màu trên bản mỏng nhƣng dùng hơi I2 thấy có 1 vết tròn. Xác định Rfx100= 84,3 nóng chảy ở 237 - 238 C. Phổ 1H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3: H8 (s, 7,53); H10 (s, 3,4); H11 (s, 3,58); H12 (s, 4,0). Phổ 13C-NMR: 125 MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3: C2 (s, 151,8); C4 (s, 148,8); C5 (s, 107,7); C6 (s, 155,5); C8 (d, 141,4); C10 (q, 27,9); C11 (q, 29,8); C12 (q, 33,6). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 CHƢƠNG 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG Để phân lập đƣợc các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hƣởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trƣớc khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải đƣợc đƣa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v.... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/ nƣớc. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần nhƣ phƣơng pháp 1 để thu đƣợc các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tƣơng đối giống nhau. Quá trình ngâm chiết lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc thực hiện theo phƣơng án 1 (Sơ đồ 2.1). 3.2. PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ Các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột nhƣ: Cột nhồi silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thƣờng phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thƣờng dùng phƣơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu đƣợc các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập đƣợc từ các đối tƣợng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ lá cây cà phê chè đƣợc thực hiện nhƣ sơ đồ 2.1 và đã thu đƣợc các hợp chất sạch gồm các nhóm chất: ancol mạch dài, sterol, terpenoit và cafein 3.2.1. Ancol mạch dài (hexatriacontanol) COF.E4C: C36H74O Chất rắn vô định hình, không màu, Kiểm tra SKLM trong hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng hơi I2 hiện màu thấy có 1 vết tròn có Rfx100 = 81, nóng chảy ở 88-89 0C, có mặt trong dịch chiết hexan của lá. Trong phổ 1H- NMR của chất này cho thấy tín hiệu của nhóm CH3 ở độ dịch chuyển hoá học 0.88 ppm tƣơng ứng với 3 proton, tín hiệu singlet của nhóm OH nằm trong vùng 2.16 ppm, ngoài ra còn có tín hiệu 3.64 ppm ở dạng triplet tƣơng ứng với 2 proton của nhóm CH2 có liên kết với OH. Đƣờng tích phân phổ 1 H- NMR cho biết có 60 proton ở độ dịch chuyển hoá học 1.28 ppm và 8 proton ở 1.55 ppm đều là các tín hiệu của nhóm CH2, nhƣ vậy tổng số proton có mặt trong phân tử là 74. Mặt khác, trong phổ 13C-NMR và DEPT cũng quan sát thấy tín hiệu của nhóm CH3 ở 14.11ppm, một tín hiệu của nhóm CH2 liên kết với OH ở 63.12 ppm và một dãy CH2 mạch dài nằm trong khoảng 22.69 - 32.83 ppm hoàn toàn phù hợp với phổ 1H-NMR. Những số liệu phổ nói trên cho phép kết luận hợp chất COF4C là một ancol mạch dài có công thức phân tử C36H74O với tên gọi: hexatriacontanol. 3.2.2. Các hợp chất sterol Những chất có khung steran đƣợc tìm thấy trong các dịch chiết của cây Cà phê chè thƣờng là các sterol C29 với bộ khung 3-ol  5 -pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập đƣợc, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dƣới đây: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 3.2.2.1. -sitosterol Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu đƣợc từ dịch chiết n- hexan của lá cây cà phê chè, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH): max = 3426 cm -1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C: max = 1651cm -1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C- 5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm. Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol chuẩn. Độ dịch chuyển hoá học các nguyên tử C của nó đƣợc nêu trong bảng 3.1. 3.2.2.2. Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol Cặn thô màu trắng thu đƣợc kết tinh lại trong dung môi n-hexan cho tinh thể hình kim, không màu, không mùi. Nóng chảy ở 155-1570C, []25D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Trong phổ EI-MS có thể thấy pic ion phân tử [M] + ở 412 m/z, các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và FT-IR khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl (OH) H3 = 3,49 ppm và C3 = 71,8 ppm và max = 3406cm -1 , có 3 proton thuộc nhóm metin (CH) của 2 nối đôi không liên hợp (FT-IR: 1621cm -1 ), 1 H-NMR: H6 = 5,33ppm, dd, J=5Hz và 2Hz; H22 = 5,11 ppm, dd, J=15Hz và 5Hz; H22 = 5,03 ppm; dd, J=15Hz và 5Hz; 13 C-NMR: C5 = 140,7 ppm, C6 = 121,6 ppm, C22 = 138,3 ppm, C23 = 129,2 ppm. Các số liệu về phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nó hoàn toàn phù hợp với phổ của stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Bảng 3.1. Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số sterol trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 3β-Sitosteryl-1-O-β- D-glucopyranosit 1 36.5 t 37.3 t 36.3 t 2 29.1 t 31.7 t 27.9 t 3 71.7 d 71.8 d 77.1 d 4 42.2 t 42.3 t 38.4 t 5 140.7 s 140.8 s 140.6 s 6 121.7 d 121.7 d 121.3 d 7 37.2 t 31.9 t 31.5 t 8 31.8 d 31.9 d 31.5 d 9 51.2 d 50.2 d 50.7 d 10 36.1 s 36.5 s 35.6 s 11 24.3 t 21.1 t 21.0 t 12 42.2 t 39.8 t 39.9 t 13 39.7 s 42.3 s 45.2 s 14 56.8 d 56.8 d 56.3 d 15 25.4 t 24.3 t 23.9 t 16 29.7 t 28.3 t 29.4 t 17 56.0 d 56.1 d 55.5 d 18 11.8 q 11.9 q 11.9 q 19 19.4 q 19.4 q 19.8 q 20 40.5 d 36.2 d 36.9 d 21 18.8 q 18.8 q 19.2 q 22 138.3 d 33.9 t 33.4 t Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 3β-Sitosteryl-1-O-β- D-glucopyranosit 23 129.2 d 26.1 t 28.8 t 24 50.1 d 45.9 d 49.7 d 25 31.6 d 29.2 d 25.5 d 26 21.2 q 19.1 q 19.0 q 27 21.0 q 19.4 d 20.7 d 28 18.9 t 23.13 t 19.4 t 29 12.0 q 11.9 q 12.0 q 1' 100.9 d 2' 73. 6 d 3' 76.8 d 4' 70.2 d 5' 76.8 d 6' 61.2 t 3.2.2.3. 3β-Sitosteryl-1-O-β-D-glucopyranosit GluO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Tiếp tục rửa giải cột bằng dung môi chlorofom thu đƣợc khối chất rắn vô định hình, Kiểm tra SKLM trong hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin thấy có 1 vệt tròn, Rfx100 = 35, nóng chảy ở 279-280 o C. Phổ FT-IR max (cm -1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6] + (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C-6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C- 9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C-20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18). 3.2.2.4. Hợp chất axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic (COF18E3-C30H48O3) Hợp chất COF18E3 là chất rắn màu trắng vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 2580C- 2590C, Rf x100 = 62, phân lập đƣợc từ dịch hexan của lá cà phê chè, các số liệu phổ IR, MS, proton (1H) và cacbon (13C) NMR (xem phần thực nghiệm). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 H ìn h 3 .1 : P h ổ F T - I R c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 H ìn h 3 .2 : P h ổ E S I – M S c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 H ìn h 3 .3 . P h ổ 1 H -N M R c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 H ìn h 3 .4 : P h ổ 1 3 C - N M R c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 H ìn h 3 .5 : P h ổ D E P T c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 H ìn h 3 .6 : P h ổ H S Q C c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Hình 3.7: Phổ HMBC của COF18E3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Quan sát phổ FT-IR của COF18E3 (trang 56)cho thấy các vân phổ đặc trƣng cho các dao động hóa trị của các liên kết sau: 3440,3 (OH); 2930,19- 2873,52 (C-H: metyl, metylen, metin); 1691,09 (C=O). Phổ ESI-MS của COF18E3 (trang 57) cho pic phân tử [M+] = 456,36 ([M + +H] = 457,36), ứng với công thức phân tử C30H48O3, điều này cũng phù hợp với số lƣợng nguyên tử cac bon quan sát từ phổ 13C-NMR (trang 59) của nó. Từ số liệu các phổ IR, MS, 1H, 13C, DEPT và phổ 2D NMR có thể khẳng định COF18E3 là một triterpen thuộc khung lupan. Phổ 1H-NMR cho biết một vài độ dịch chuyển hóa học đặc trƣng của các H gắn trên các C nhƣ: δH3 (3,15 ppm) là tín hiệu của H3 mà nguyên tử C3 liên kết trực tiếp với nguyên tử ô-xi, δH12 (5,2 ppm) là tín hiệu của H12 mà nguyên tử C12 và C13 liên kết với nhau bằng liên kết đôi (liên kết olefin). Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho biết một số tín hiệu singlet của một số nhóm metyl có trong phân tử ở trƣờng cao (δH trong khoảng 0,7 -1,1 ppm). Phổ 13 C-NMR và DEPT (trang 60) cho biết phân tử COF18E3 có 30 nguyên tử C, trong đó gồm 7 nhóm metyl (CH3) ở các độ dịch chuyển hóa học (ppm) δC23 = 28,2; δC24 = 17; δC25 = 17,1; δC26 = 21,2; δC27 = 15,5; δC29 = 15,7; δC30 = 23,5; 9 nhóm metylen (CH2) ở các độ dịch chuyển hóa học (ppm) δC1 = 38,8; δC2 = 27; δC6 = 18,4; δC7 = 33,1; δC11 = 23,4; δC15 = 28,1; δC16 = 30,8; δC21 = 24,3; δC22 = 36,9; 7 nhóm metin (CH) ở các độ dịch chuyển hóa học (ppm) δC3 = 79; δC5 = 55,3; δC9 = 47,7; δC12 = 125,6; δC18 = 52,9; δC19 = 39,2; δC20 = 39 và 7 các bon bậc 4 ở các độ dịch chuyển hóa học (ppm) δC4 = 38,7; δC8 = 39,6; δC10 = 37,1; δC13 = 38,3; δC14 = 42,2; δC17 = 47,9; δC28 = 180,7. Phân tích phổ HSQC (trang 61) của COF18E3 có thể xác định đƣợc từng độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử các bon và các nguyên tử H tƣơng ứng (xem phần thực nghiệm). Quan sát và phân tích phổ HMBC (trang 62), cho phép xác định đƣợc các tƣơng tác xa dị hạt nhân (qua 2 hay nhiều liên kết) trong bảng dƣới đây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Bảng 3.2: Bảng tƣơng tác xa C H(HMBC) của COF.18E3 STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) C1 H2 C16 H15 C2 H1, H3 C17 H18, H22 C3 H2, H23, H24 C18 H19 C4 H3, H23, H24 C19 H21, H20 C5 H6, H23, H24 C20 H19, H30,H29 C6 H5, H7 C21 H19, H22 C7 H6 C22 H21 C8 H9, H7 C23 H5, H3 C9 H11, H26 C24 H5, H3 C10 H1, H9, H25 C25 H1, H9 C11 H9, H12 C26 H9, H7 C12 H11 C27 H15 C13 H12, H18 C28 H22, H216 C14 H15, H27 C29 H20 C15 H16 C30 H20 Qua phân tích các số liệu phổ IR, ESI-MS và 1D, 2D NMR của hợp chất COF18E3 nhƣ trên và so sánh với các số liệu phổ 13C-NMR của các hợp chất khung lupan tƣơng tự [25] có thể khẳng định nó là một triterpen khung lupan và tên của nó là axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic (C30H48O3), đây là hợp chất mới lần đầu tiên phân lập đƣợc từ cây Coffea arabica với cấu trúc hóa học nhƣ sau. Axit lup-3-ol-12(13)-en-28-oic COOH HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 3.2.2.6. Hợp chất cafein (COF.Anc - C8H10N4O2) 1 H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3: H8 (s, 7,53); H10 (s, 3,4); H11 (s, 3,58); H12 (s, 4,0). 13 C-NMR: 125 MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3: C2 (s, 151,8); C4 (s, 148,8); C5 (s, 107,7); C6 (s, 155,5); C8 (d, 141,4); C10 (q, 27,9); C11 (q, 29,8); C12 (q, 33,6). Phổ 1H-NMR cho biết phân tử COF.Anc có 4 loại H xuất hiện ở các độ dịch chuyển hóa học 3,4; 3,58; 4,0 và 7,53 ppm. Theo tính toán tích phân cho biết trong phân tử có 10 nguyên tử H. Phân tích phổ 13C-NMR thấy rằng phân tử nay có 8 cacbon ở các độ dịch chuyển hóa học 151,8; 148,8; 107,7; 155,5; 141,4; 33,6; 29,8; và 27,9 ppm. Các phổ 13C-NMR, DEPT và HSQC cho biết trong phân tử có 3 nhóm metyl (CH3) ở các độ dịch chuyển hóa học 33,6; 29,8; và 27,9 ppm, 1 nhóm metin (CH) ở độ dịch chuyển hóa học 141,4 ppm và 4 cacbon bậc 4 ở các độ dịch chuyển hóa học 151,8; 148,8; 107,7; 155,5. Quan sát phổ HMBC của COF.Anc cho thấy các tƣơng tác xa nhƣ bảng sau. Bảng 3.3: Bảng tƣơng tác xa C H(HMBC) của COF.Anc STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) C2 H10, H11 C8 H11 C4 H8 C10 - C5 H8, H11 C11 - C6 H10 C12 - Qua phân tích các số liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất COF.Anc và so sánh các số liệu phổ chất chuẩn cafein có thể khẳng định hợp chất COF.Anc chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch chiết EtOAc của lá cây cà phê chè là cafein với cấu trúc hóa học nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 O N N N N O 1 2 3 4 56 7 8 9 10 11 12 Cafein 3.3. VỀ HOẠT TÍNH BÀI SỎI THẬN CỦA LÁ CÀ PHÊ CHÈ Để thử hoạt tính bài sỏi thận của lá cây cà phê chè, chúng tôi đã thực hiện theo phƣơng pháp Đông Y kết hợp với việc kiểm tra bằng phƣơng pháp siêu âm cho 5 bệnh nhân sỏi thận đã đƣợc điều trị bằng thuốc kim tiền thảo mà không có kết quả tích cực. Cả 5 bệnh nhân sỏi thận đƣợc sử dụng bài thuốc độc vị lá cà phê chè trong thời gian 25 - 30 ngày cho kết quả rất tốt (các bệnh nhân sỏi thận đƣợc kiểm tra kích cỡ trƣớc, trong và sau khi sử dụng thuốc). Tất cả các bệnh nhân đều khỏi bệnh sau khi điều trị. Kết quả siêu âm cho thấy bệnh nhân đều hết sỏi và trở lại trạng thái bình thƣờng. Các kết quả về hoạt tính bài sỏi thậncủa lá cây cà phê chè xem phần phụ lục. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 KẾT LUẬN 1. Lần đầu tiên lá cây cà phê chè trồng ở Việt Nam đƣợc sàng lọc hoá thực vật cho biết trong lá cây cà phê chè có các lớp chất sau: ancol mạch dài (chất béo), phytosterol, ancaloit, glycosit, triterpen . 2. Các dịch có n-hexan, EtOAc và MeOH của lá cà phê chè không có tác dụng kháng các vi sinh vật đã thử gồm: - Vi khuẩn Gr (-) - Vi khuẩn Gr (+) - Nấm men 3. Từ lá cây cà phê chè đã phân lập đƣợc 6 chất sạch gồm: Ancol mạch dài (hexatriacontanol), -sitosterol,, Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol, 3β-Sitosteryl-1-O- β-D-glucopyranosit, axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic và cafein. 4. Triterpen (axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic) là một chất lần đầu tiên phân lập đƣợc từ lá cà phê chè. Bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại (IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, 1D và 2D) cấu trúc hoá học của nó đã đƣợc chứng minh. 5. Hoạt tính bài sỏi thận của lá cây cà phê chè đã đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp Đông Y thực nghiệm và kiểm tra bằng phƣơng pháp siêu âm cho kết quả tốt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Báo cáo hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: „„VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ CÀ PHÊ CHÈ (COFFEA ARABICA)’’ Nguyễn Quyết Tiến1, Phạm Thị Hồng Minh1, Nguyễn Quốc Nam Hải2 1. Viện Hóa học, Viện KH và Công nghệ Việt Nam, 18-Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 2. Đại học Thái Nguyên, Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, thành phố Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt 1 Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, tr. 155, 1999. 2 Phan Đình Châu, Hoá Dƣợc và Kĩ Thuật Tổng Hợp I, tr. 244- 245,186-187, 2006. 3 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, quyển III, NXB trẻ, tr. 175- 176, 2003 4 Phạm Hữu Điển, Nguyễn Quyết Tiến, Giáo trình Hoá Dƣợc. NXB ĐHSP 2008. 5 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, (9/1993). 6 Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề, Giáo trình cây nông nghiệp, tr.168- 169, 2001 7 Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, NXB Y- Dƣợc, Tp. Hồ Chí Minh. B. Tiếng nƣớc ngoài 8 Schlee, D. et al.,biosynth, Phytochemistry, 1963, 2, 231-236 . 9 Weckerle, B. et al., coffee constits, Phytochemistry, 2002, 60, 409-414. 10 Hasan, C.M. et al., Nat. Prod. Lett., 1994, 5, 55 (isol, pmr, cmr) 11 Weinberg, B.A. et al., The World of Caffeine, Routledge, 2001 (book) 12 Gremaud, G. et al., Phytochemistry, 1996, 42, 1547 (isol) 13 Folstar, P. et al., J. Agric., coffee amides, hplc, Food Chem, 1979, 27, 12-15 14 Nishida, R. et al., Experientia, 1987, 43, 342-344 (5-Hydroxy-N- methyltryptamine) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 15 Wanner, H. et al., Phytochemistry, 1975, 14, 747-750 (isol, synth, uv, ms) 16 Zheng, X.-Q. et al., Phytochemistry, 2002, 60, 129-134 (isol, bibl) 17 Ducruix, A. et al., Chem. Comm., 1975, 396 (Mascaroside) 18 Prewo, R. et al., Phytochemistry, 1990, 29, 990 (cryst struct, Mozambiosi_ de) 19 Murata, M. et al., Biosci., Biotechnol., Biochem., 1995, 59, 1887 (cinnamoyltryptophans) 20 Natural products Dictionary CD-ROM 2007 21 Végh Anital- Szász György- Takács Mihály, Gyógyszerészi kémia, Franklin nyomda, Budapest, 1977. 22 Töke László, Szeghy Lajos, Fejzetek a gyógyszerkémiából, Tankönyvkiadó, Budapest, 2002. 23 Pual Pual Cos, Louis Maes, Jean - BoscoSindambiwe, Arnold J.Vlietinck, Dirk Vanden Berghe,” Bioassay for antibacterial and antifungal activities”, Laboratory for Microbiology, Pasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp Belgium, tr. 1-13, 2005. 24 Franz Hadacek, Harald Greger “ Testing of Antifungal Natural Products: Methodologies, Comparability of Results and Assay Choice”, Phytochemical analyis, tr. 137-147, 2000. 25 Shashi B., Mahato and Asish P. Kundu; 13 C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids - a compilation and some salient features; Phytochemistry, Vol.39, No.6, pp. 1517-1575; 1994 26 Arnoln Weiss Berger and Edward C. Taylor, Indoles Parts 1, 2, The chemistry of Heterocyclic compounds, John Wiley and Sons. Inc, New York, London, Sydney, Toronto, 1972. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 C. Trang Web 27 &sid=344 28 VanS_ /SoiThan.htm 29 BA%A_ dn 30 uong_ /soithan.html 31 YHCT/Chua-soi-than-bang-Dong-y/60/20085209275869.htm 32 33 34 35 36 37 38 - Wiki Cà phê chè.htm 39 40 41 24h.htm 42 43 NÔNG HỌC.htm 44 dap ve ca phe-Rubiaceae 45 http:// www.diendan.bacgiangview.com/showthread.php?t=401 46 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 PHỤ LỤC 1. Ancol mạch dài (hexatriacontanol) COF.4C 1.1. Phổ 1H - NMR của COF.E4C ...................................................... 69 1.2. Phổ 13C-NMR của COF.E4C ....................................................... 70 1.3. Phổ DEPT của COF.E4C ............................................................. 71 2. Các hợp chất sterol 2.1. -Sitosterol 2.1.1.Phổ hồng ngoại FT-IR ............................................................... 72 2.1.2. Phổ khối lƣợng EI-MS .............................................................. 73 2.1.3. Phổ 1H-NMR ........................................................................... 74 2.1.4. Phổ 13C-NMR.......................................................................... 75 2.2. Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol 2.2.1. Phổ hồng ngoại FT-IR .............................................................. 76 2.2.2. Phổ khối lƣợng EI-MS .............................................................. 77 2.2.3. Phổ 1H-NMR ............................................................................ 78 2.2.4. Phổ 13C-NMR ........................................................................... 79 2.3. 3β-Sitosteryl-1-O-β-D-glucopyranosit 2.3.1. Phổ 1H-NMR ............................................................................ 80 2.3.2. Phổ 13C-NMR và DEPT ............................................................ 81 3. Hợp chất caffein COFE.4C 3.3.1. Phổ 1H-NMR ............................................................................ 82 3.3.2. Phổ 13C-NMR .......................................................................... 83 3.3.3. Phổ DEPT ................................................................................ 84 3.3.4. Phổ HSQC ................................................................................ 85 3.3.5. Phổ HMBC .............................................................................. 86 4. Kết quả thử hoạt tính chữa sỏi thận của chị Tùng ..................... 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 P h ổ 1 H -N M R c ủ a C O F E 4 C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 P h ổ 1 3 C – N M R c ủ a C O F E 4 C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 P h ổ D E P T c ủ a C O F 4 E C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 P h ổ 1 H -N M R c ủ a C O F .A n c Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 P h ổ 1 3 C – N M R c ủ a C O F .A n c Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 P h ổ D E P T c ủ a C O F .A n c Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Phổ HMBC của COF.Anc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89