Đề tài Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột và ứng dụng trong xử lý nước thải sản xuất nui

ng khoai mì lát,…chiếm tỷ lệ cao trong cơ cấu ngành chế biến lương thực và hầu hết lại ñược sản xuất bởi các nhà máy lớn, trang thiết bị hiện ñại…vì khoai mì ñược xem là mặt hàng ñắt giá và là ngành kinh tế nông nghiệp xuất khẩu quan trọng. Như vậy có thể thấy chế biến tinh bột ñóng vai trò rất lớn không những ñối với ngành lương thực – thực phẩm Việt Nam mà còn ñóng vai trò quan trọng trong việc phát triển nền kinh tế, nâng cao kim ngạch xuất khẩu cho ñất nước. 2.3.2 Tác ñộng của nước thải sản xuất tinh bột ñến môi trường Thời gian gần ñây số lượng các nhà máy chế biến tinh bột bị ñình chỉ hoạt ñộng như nhà máy chế biến tinh bột sắn VEDAN Hà Tĩnh, nhà máy tinh bột sắn Thanh Chương Nghệ An; các nhà máy bị lên án về tình trạng ô nhiễm môi trường do xả nước thải chưa qua xử lý hay xả nước thải chưa ñạt tiêu chuẩn ra môi trường như: nhà máy tinh bột sắn Intimex tỉnh Nghệ An; nhà máy tinh bột sắn Pococev tỉnh Thừa Thiên Huế, cơ sở chế biến tinh bột mì Ngọc Thạch tỉnh Bình Thuận; nhà máy sản xuất tinh bột sắn Tịnh Phong, nhà máy chế biến tinh bột sắn ðắk … Mặt khác, hiện nay các cơ sở chế biến tinh bột tập trung thành làng nghề với trang thiết bị còn lạc hậu và quy mô sản xuất nhỏ nên hầu như không có hệ thống xử lý nước thải riêng và ñúng kỹ thuật. Còn các nhà máy sản xuất với quy mô lớn tuy ñã trang bị hệ thống xử lý nước thải nhưng mới chỉ có rất ít hệ thống hoàn chỉnh có khả năng xử lý triệt ñể nước thải trước khi xả ra môi trường. Gần ñây nhất là hậu quả tác ñộng lên sông Thị Vải của Nhà máy Vedan – ðồng Nai. Theo kết quả mô phỏng của Viện Tài nguyên Môi trường, khu vực ô nhiễm khiến hoạt ñộng nuôi trồng, ñánh bắt thủy sản bị ảnh hưởng nặng có diện tích gần 2.000ha thuộc ñịa bàn các xã Phước An, Long Thọ (huyện Nhơn Trạch), Long Phước, Phước Thái (huyện Long Thành) của tỉnh ðồng Nai cùng các xã Mỹ Xuân, Phước Hòa và thị trấn Phú Mỹ của huyện Tân Thành, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Vùng ô nhiễm gây ảnh hưởng nhẹ ñến nuôi trồng, ñánh bắt thủy sản có diện tích gần 700ha - 17 - thuộc các xã Phước An, Vĩnh Thanh (huyện Nhơn Trạch, ðồng Nai), Phước Hòa (huyện Tân Thành, Bà Rịa - Vũng Tàu) và xã Thạnh An, huyện Cần Giờ, TP.HCM. Trong ñó, diện tích bị ảnh hưởng của xã Thạnh An ước tính chỉ gần 84ha. Trên sông Vàm Cỏ - Tây Ninh, chỉ tính riêng khu vực xã Phước Vinh, tháng 5/2009 ñã có hơn 150.000 con cá lăng nha 10 tháng tuổi và 1 tháng tuổi nuôi trong bè chết, gây thiệt hại nhiều tỷ ñồng. ðầu tháng 4/2010 vừa qua, khoảng 80.000 con cá nuôi của 16 hộ tại ấp Phước Lập, Phước Trung lại tiếp tục chết. Tại Báo cáo kết quả kiểm tra mẫu nước mặt trên sông Vàm Cỏ Ðông ñoạn Ðồi Thơ - khu vực ranh giới giữa huyện Châu Thành và huyện Tân Biên (nơi có hai nhà máy chế biến khoai, mì thường xuyên xả nước thải ra sông vào ban ñêm) cho thấy hàm lượng COD vượt gấp 2,2 lần, hàm lượng BOD5 vượt 3,5 lần so với QCVN 08:2008/BTNMT quy ñịnh cho cấp nước sinh hoạt. Nguyên nhân chết cá nuôi ở những khu vực này ñược xác ñịnh do nước thải từ hơn 80 nhà máy sản xuất mì trong khu vực. 2.3.3 ðặc ñiểm nguồn nước thải nhà máy sản xuất tinh bột Nước thải sản xuất tinh bột mì gồm hai loại chính: - Nước rửa củ: nước thải từ công ñoạn rửa, loại bỏ phần rễ, lớp vỏ gỗ và ñất cát bám trước khi ñưa vào nghiền. Theo ước tình, lượng nước thải rửa củ chiếm 42% tổng lượng nước thải của nhà máy. Nước này chỉ ô nhiễm bởi cát ñất tách ra từ củ, ít ô nhiễm chất hữu cơ hòa tan. Do ñó, ñối với nước rửa củ nên tách riêng nhằm giảm lượng nước thải và có thể tái sử dụng sau khi xử lý ñơn giản. - Nước thải chế biến: nước thải từ các công ñoạn nghiền, tách bã, lọc … trong quá trình sản xuất. Nước thải chế biến có chứa hàm lượng cặn lơ lửng và chất hữu cơ rất cao. Thành phần nước thải chế biền gồm tinh bột, ñường, protein, cellulose, các khoáng chất và ñộc tố CN- Khi ñề cập ñến ñặc ñiểm của nước thải nhà máy chế biến tinh bột thì cần xem xét ở cả hai quy mô sản xuất là quy mô nhỏ với các sản phẩm như bún, phở, nui…và quy mô lớn hơn với sản phẩm là tinh bột khoai mì. Quy mô sản xuất nhỏ - 18 - Hình 2.3 Quy trình sản xuất nui và công ñoạn phát sinh nước thải - 19 - Hình 2.4 Quy trính sản xuất tinh bột mì và các công ñoạn phát sinh nước thải (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp Nhà nước (KC.05.11. 2005), Viện nghiên cứu thiết kế chế tạo máy Nông nghiệp) - 20 - Từ các quy trình sản xuất mì, nui và tinh bột khoai mì trên nhận thấy nguồn phát sinh của nước thải tinh bột chủ yếu từ các công ñoạn trích ly, tách nước và tách bã, nước rửa dụng cụ thiết bị. Với hàm lượng chất hữu cơ cao, COD dao ñộng từ 13.300 – 19.500 mg/l, N và P tổng dao ñộng 86 – 115, pH 3.8 – 5.2, về mặt cảm quan, nước thải sản xuất tinh bột có màu trắng ngà, ñục, bốc mùi chua nồng. Hàm lượng cặn lơ lửng của tương ñối cao vì xác mì mịn và khó lắng nên bị cuốn theo nước xả từ bể ngâm, SS có thể lên ñến vài ngàn mg/l tùy thuộc vào công nghệ sản xuất. ðộc tố CN- trong nước thải dao ñộng từ 2 – 75 mg/l, ñây là yếu tố cản trở hoạt ñộng của vi sinh vật trong quá trình xử lý. Mức ñộ ô nhiễm của một số loại nước thải tinh bột ñiển hình ñược trình bày trong các bảng 2.5, 2.6, 2.7. Bảng 2.5 Thành phần nước thải nhà máy chế biến tinh bột mì (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp Nhà nước (KC.05.11–2005), Viện nghiên cứu thiết kế chế tạo máy Nông nghiệp) Các chỉ tiêu ðơn vị tính Giá trị pH COD BOD5 SS N – NH3 N- NO2 N – NO3 P tổng CN- SO4 2- - mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 4.2 – 5.1 2.500 – 17.000 2.120 – 14.750 120 – 3.000 136 – 300 0 – 0.2 0.5 – 0.8 250 – 450 2 – 75 52 - 65 - 21 - Bảng 2.6 Thành phần nước thải cơ sở tinh chế tinh bột mì làng nghề Mỹ ðức (Nguồn: ðề tài nghiên cứu khoa học (QMT06.03), ðại học Quốc gia Hà Nội) Thông số Hàm lượng COD 4768 mg/l BOD5 3190 mg/l BOD5/COD 0.76 NH4 + 37.69 mg/l NO2 - 0.61 mg/l pH 3.54 Bảng 2.7 Thành phần nước thải cơ sở sản xuất bún (Nguồn: ðề tài nghiên cứu khoa học (QMT06.03), ðại học Quốc gia Hà Nội) Thông số Hàm lượng COD 3076.3 mg/l BOD5 2154.2 mg/l BOD5/COD 0.7 NH4 + 29.89 mg/l NO2 - 0.56 mg/l pH 4.91 2.3.4 Hệ thống xử lý nước thải yêu cầu cho nhà máy sản xuất tinh bột Với ñặc trưng hàm lượng COD và BOD của loại nước thải này rất cao, tỷ lệ BOD/COD khoảng từ 0.5 – 0.7 và thành phần gồm các chất hữu cơ dễ phân hủy nên thích hợp cho quá trình xử lý bằng phương pháp sinh học, kết hợp giữa xử lý kỵ khí và hiếu khí. Tuy nhiên, nước thải sản xuất tinh bột có chứa hàm lượng ñộc ñố CN-, là yếu tố gây ức chết hoạt ñộng của vi sinh vật. Do ñó, trong quá trình xử lý, trước hết phải loại bỏ ñộc tố này. Phương pháp hiệu quả nhất là lên men acid dưới tác dụng của vi sinh vật trong bùn tự hoại.  Một số hệ thống xử lý nước thải tinh bột thường ñược áp dụng - 22 - Hình 2.5 Quy trình xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp Nhà nước (KC.05.11. 2005), Viện nghiên cứu thiết kế chế tạo máy Nông nghiệp) Hình 2.6 Quy trình xử lý nước thải cục bộ cho một cơ sở sản xuất quy mô gia ñình (A) và cụm các cơ sở sản xuất tập trung (B) (Nguồn: Công trình xử lý nước thải làng nghề lương thực Hoài Hảo, Công ty Môi Trường Ngọc Lân) (A) (B) - 23 - Từ các hệ thống xử lý nước thải tinh bột trên nhận thấy các hệ thống xử lý ñều áp dụng phương pháp sinh học. Bản chất của phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là sử dụng khả năng sống và hoạt ñộng của vi sinh vật ñể khoáng hóa các chất bẩn hữu cơ trong nước thải thành các chất vô cơ, các chất khí ñơn giản và nước. Vai trò của giai ñoạn xử lý sinh học ñối với nước thải tinh bột Công nghệ xử lý nước thải nói chung và nước thải tinh bột nói riêng ngày càng ñi sâu vào áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp sinh học cũng ñã chứng minh hiệu quả xử lý triệt ñể hơn hẳn những biện pháp xử lý hóa lý khác, ñể xử lý các chất hữu cơ hòa tan và keo dễ phân hủy. Chi phí xử lí bằng phương pháp sinh học, so với các phương pháp hóa học và hóa lý là thấp hơn một cách ñáng kể. Kết quả của quá trình xử lý là các chất thải ñược chuyển hóa hoàn toàn thành dòng thải ñáp ứng tiêu chuẩn ñè ra với các mục ñích sử dụng khác nhau. 2.4 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT PHÂN HỦY TINH BỘT 2.4.1 Tổng quan về tinh bột Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu trong thực vật, ñặc biệt là trong những cây có củ. Trong tế bào thực vật, tinh bột tồn tại ở dạng các hạt tinh bột. Các loài thực vật khác nhau thì các hạt tinh bột có kích thước và hình dạng khác nhau, ñồng thời tính chất vật lý và hóa học cũng khác nhau. Tinh bột là một polysaccaride chứa hỗn hợp amylose và amylopectin. Trong tinh bột tỷ lệ amylose thường chiếm 25% còn amylopectin chiếm 75%. Tỷ lệ này thay ñổi tùy theo từng loại thực vật. Cả amylose và amylopectin ñều ñược cấu tạo tử ñơn phân là D-glucose. Amylose tan ñược trong nước nóng, còn amylopectin không tan ñược trong nước nóng mà tạo thành các thể keo. Amylose có trọng lượng phân tử 50.000 - 160.000 Dallton, ñược cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose, liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylose chứa 0.03% photpho và bắt màu xanh với Iot, khi bị ñun nóng màu xanh này nhanh chóng biến mất. - 24 - Hình 2.7 Cấu trúc phân tử amylose (Nguồn: www.starch.dk/isi/starch/starch.htm) Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 ñến hàng chục triệu Dallton, ñược cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, liên kết với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside tạo thành mạch thẳng phân nhánh, mỗi nhánh có khoảng 8 – 30 gốc α-D glucopyroranose. Amylopectin chứa 0.1 – 0.8% photpho và bắt màu tím hay màu ñỏ tím với Iot. Hình 2.8 Cấu trúc phân tử amylopectin (Nguồn: www.starch.dk/isi/starch/starch.htm) 2.4.2 Quá trình phân hủy tinh bột Tinh bột bị phân hủy bời enzyme amylase. Sản phẩm của quá trình phân hủy tinh bột gồm ñường glucose, ñường maltose, dextrin …. Một phần các ñường này sẽ tan trong nước, một phần ñi vào tế bào vi sinh vật và tham gia các quá trình chuyển hóa khác trong tế bào. - 25 - Hình 2.9 Quá trình chuyển hóa tinh bột của vi sinh vật (Nguồn: Nguyễn ðức Lượng (2003), Công nghệ xử lý nước thải) Glucose ñi vào trong tế bào vi sinh vật, chúng sẽ ñi theo hai hướng chuyển hóa cơ bản. Hướng thứ nhất, vi sinh vật dùng glucose như nguồn vật liệu xây dựng tế bào. Từ glucose tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các polysaccharide của tế bào (protein, lipid trung tính, acid nucleic, photpholipid). Hướng thứ hai, ngoài sự tham gia vào quá trình tổng hợp vật chất của tế bào thì vi sinh vật còn thực hiện các quá trình hô hấp hiếu khí giải phóng toàn bộ năng lượng có trong glucose. Trong hô hấp yếm khí, năng lượng không ñược giải phóng hết mà chúng ñược giữ lại trong các sản phẩm trung gian. 2.4.3 Hệ enzyme tham gia quá trình phân hủy tinh bột Nhóm enzyme có tên gọi chung là glycoside hay carbohydase xúc tác cắt liên kết glucoside nối các ñơn vị ñường ñơn trong thành phần tinh bột, giải phóng glucose và các loại ñường khác. Trong ñó glucose là nguyên liệu ñầu vào ñể sản xuất ra - 26 - nhiều sản phẩm công nghiệp quan trọng. Các vi sinh vật tham gia quá trình thủy phân tinh bột thường có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase ngoại bào, các enzyme này ñược chia ra làm 4 nhóm: - Enzyme α-amylase (α-1,4 glucan-4-glucanohydrolase) : có khả năng tác ñộng vào bất kỳ liên kết 1,4-glucoside nào trong phân tử tinh bột, do ñó α-amylase còn ñược gọi là endoamylase. Dưới tác ñộng của α-amylase, phân tử tinh bột ñược cắt thành nhiều ñoạn ngắn gọi là sự dịch hóa tinh bột, tạo ra dextrin có phân tử lượng thấp và một lượng nhỏ maltose. Hình 2.10 Các giai ñoạn quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase (Nguồn: www.starch.dk/isi/starch/starch.htm) - Enzyme β-amylase (α-1,4 glucan-maltohydrolase) : có khả năng cắt ñứt liên kết 1,4 glucoside ở cuối phân tử tinh bột, bởi thế còn gọi là exoamylase, tạo ra sản phẩm là maltose và β-limit dextrin. (chiếm khoảng 40 – 45%) - R-enzyme (α-1,6-glycosiadse) có khả năng cắt ñứt mối liên kết 1,6 glucoside tại những chỗ phân nhánh của amylopectin. - Amyloseglycosidase phân giải tinh bột thành glucose và các oligosaccharide, enzyme này có khả năng phân cắt cả hai loại liên kết 1,4 glucosice và 1,6 glucoside. - 27 - Hình 2.11 Cơ chế thủy phân tinh bột (Nguồn: Nguyễn Tiến Thắng (2008), Giáo trình công nghệ enzyme). Ngoài amylase, trong thực tế còn có sự hiện diện của các enzyme khác thủy phân tinh bột và ñường oligo như dextranase, glycosidase, β-glucosidase, lactase. Tuy nhiên hệ enzyem amylase thường ñược quan tâm và sử dụng phổ biến hơn. 2.4.4 Vi sinh vật phân hủy tinh bột Các vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột khi chúng có hệ enzyme amylase. Một số vi sinh vật có hệ enzyme amylase ñược trình bày ở bảng 2.13 Bao gồm nhiều loại nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn, trong ñó chiếm vai trò quan trọng là vi khuẩn - 28 - Bảng 2.8 Các vi sinh vật có hệ enzyme amylase (Nguồn: Nguyễn ðức Lượng, Công nghệ vi sinh tập 2-Vi sinh vật học công nghiệp) STT Vi sinh vật Hệ enzyme 1 2 3 4 5 6 7 Asp. Awamori Asp.niger Asp.usami Asp.oryzae Bacillus.spp Endomyces.spp Phizopus delemar α-amylase β-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase α-amylase β-amylase glucoamylase α-amylase β -amylase glucoamylase glucoamylase Bảng 2.9 Một số chủng vi khuẩn trong nước thải có hệ enzyme α- amylase : vi sinh vật khối lượng phân tử của enzyme pH tối ưu nhiệt ñô tối ưu B.amilotiquefaciens 49000 5.9 65 B.licheniformics 22500 5.0-9.0 76 B.stearothermophilus 49000 5.4-6.1 70 B.subtilis 47000 5.3-6.4 50 - 29 - Bảng 2.10 Một số chủng vi khuẩn trong nước thải có hệ enzyme β- amylase : vi sinh vật khối lượng phân tử của enzyme pH tối ưu nhiệt ñô tối ưu B.cereus 58000 7 40 B.polymyxa 42000 7.5 40 B.megaterium 58000 6.5 40-65 2.5 PHÂN LẬP VI SINH VẬT PHÂN HỦY TINH BỘT 2.5.1 Nguyên tắc phân lập Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban ñầu và ñưa về dạng thuần khiết. ðây là một bước có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. ðể phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột, ñầu tiên, phải lựa chọn nguồn lấy mẫu là nguồn có sự hiện diện của tinh bột (nước thải tinh bột, bùn hoạt tính tinh bột, các chế phẩm xử lý nước thải tinh bột…). Tách rời các tế bào vi sinh vật và nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng ñặc trưng ñể cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau (môi trường dinh dưỡng ñặc trưng ở ñây thành phần phải có tinh bột là nguồn carbon duy nhất). Kiểm tra và khẳng ñịnh các ñặc ñiểm hình thái và các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật. Sau cùng, giữ giống và bảo quản giống mới phân lập. 2.5.2 Phương pháp phân lập Lựa chọn nguồn lấy mẫu: có ba cách lựa chọn nguồn lấy mẫu: phân lập giống trong tự nhiên, phân lập giống trong ñiều kiện sản xuất và phân lập từ các ống giống bị thoái hóa. - Phân lập giống trong tự nhiên: lựa chọn nguồn phân lập là từ môi trường tự nhiên bản thân vi sinh vật. Ví dụ, cần phân lập các vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột, trước hết phải xác ñịnh ñược các chủng vi sinh vật có hệ enzyme amylase và nơi sinh sống của chúng, từ ñiểm xuất phát ñó sẽ xác ñịnh ñược nguồn lấy mẩu phân lập. Ví dụ như vi khuẩn Bacillus subtilis có hệ enzyme amylase rất mạnh có thể phân lập chủ yếu từ môi trường ñất. - 30 - - Phân lập giống trong ñiều kiện sản xuất: chọn vị trí nguồn phân lập từ nguồn phát sinh cơ chất cần cho quá trình sống của vi sinh vật ñó. Ví dụ cần phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột và ứng dụng ty trong xử lý nước thải tinh bột thì nguồn lấy mẫu phân lập ở ñây chính là nước thải hoặc bùn hoạt tính của nhà máy sản xuất tinh bột. - Phân lập giống trong các ống giống thoái hóa: do các ñiều kiện bảo quản và giữ giống không ñảm bảo ảnh hưởng ñến các ñặc tính của vi sinh vật từ ñó làm kéo theo ảnh hưởng ñến khả năng ứng dụng của giống trong ản xuất nên ta phải phân lập lại giống. Mục ñích của phương pháp này là luôn luôn duy trì ñược giống tốt cho sản xuất. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban ñầu: bằng các phương pháp tạo khuẩn lạc riêng rẽ như trải ñĩa, cấy ria, ñổ ñĩa, tiến hành cấy truyền ñến khi ñạt ñược thuần nhất một loại khuẩn lạc trên môi trường. Sau ñó, pha loãng khuẩn lạc với nước muối sinh lý, dùng kỹ thuật cấy trang và quan sát sự thuần nhất của khuẩn lạc khi phát triển trên môi trường. Kiểm tra các ñặc ñiểm hình thái và khẳng ñịnh các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật: bao gồm các phương pháp nhuộm gram, nhuộm bào tử, nguộm vỏ nhày, kiểm tra khả năng di ñộng… khẳng ñịnh các phản ứng sinh hóa bằng các phương pháp kiểm ñịnh catalase, indol, metyl red, citrate… sau ñó thống kê kết quả và ñưa ra dự ñoán giống cần phân lập. Giữ giống và bảo quản giống: có thể áp dụng một trong những phương pháp như phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản trong ñất hoặc cát, phương pháp bảo quản giống trong hạt ngũ côc, phương pháp bảo quản giống trong lớp dầu, phương pháp ñông khô, phương pháp làm lạnh ñông… ðược sử dụng rộng rãi hiện nay là cấy chuyền và bảo quản lạnh, phương pháp ñông khô và phương pháp làm lạnh ñông. Ở phần tìm hiểu chung về nước thải tinh bột nhận thấy thành phần của nước thải tinh bột chứa hàm lượng chất hữu cơ rất cao, ñồng thời tỷ lệ BOD5/COD khoảng 0.5 - 0.6 do ñó thích hợp cho xử lý bằng phương pháp sinh học. Trong số các vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột thì Bacillus là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng - 31 - và tiềm năng nhất. ðây là cơ sở cho lý do chọn lọc các chủng có khả năng phân hủy tinh bột trong giai ñoạn phân lập. - 32 - Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM 3.1.1 Thời gian Thí nghiệm ñược thực hiện từ ngày 5/04/2010 – 28/06/2010 3.1.2 ðịa ñiểm ðịa ñiểm lấy mẫu: Công ty TNHH SX - TM - DV Phương ðông (FUDO food). ðịa chỉ: 8/30A - Ấp 4 - Xã ðông Thạnh - Huyện Hóc Môn - Tp. Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm của trường ðại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 3.2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 3.2.1 Dụng cụ Các dụng cụ và thiết bị dùng trong phân tích chỉ tiêu nước thải (bình ñịnh mức, ống nghiệm, bếp ñun, bình phá mẫu, pipet…) Các dụng cụ và thiết bị dùng trong phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột (ống nghiệm, ñĩa petri, autoclave, micro pipet, bếp ñun, cốc thủy tinh…) Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong các phương pháp ứng dụng chủng phân lập vào xử lý nước thải (máy lắc, tủ sấy…) 3.2.2 Hóa chất Hóa chất dùng cho phân tích chỉ tiêu môi trường (K2Cr2O7, H2SO4, NaOH, CuSO4, Na2S2O3, FAS, feroin, hồ tinh bột, molybdate…) Hóa chất dùng cho phân lập và xác ñịnh vi sinh vật phân hủy tinh bột (pepton, tinh bột tan, cao nấm men, agar, cimmon citrate, trypton, MRPV, urea…) - 33 - 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu Mẫu dùng ñể phân lập ñược lấy từ nước thải và bùn hoạt tính của cơ sở sản xuất nui gạo Ký hiệu mẫu tương ứng như sau : nguồn nước thải (N) và bùn hoạt tính (B). 3.3.2 Phương pháp phân lập và xác ñịnh vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột: 3.3.2.1 Phương pháp phân lập Giai ñoạn phân lập - Bước 1: tách các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trong mẫu. Mẫu nước thải tinh bột và bùn hoạt tính từ nhà máy tinh bột ñược xử lý bằng cách ñun ở 85oC trong 15 phút. Sau ñó tiến hành pha loãng ở ba ñộ pha loãng khác nhau và cấy trang trên môi trường dinh dưỡng X
ủ 37oC
sau 24 giờ tiến hành cấy ria từng loại khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường dinh dưỡng X ñến khi thuần khiết các khuẩn lạc. Môi trường X là môi trường có chứa nguồn C, N cơ bản và một lượng tinh bột tan làm chất cảm ứng cho vi sinh vật phân hủy tinh bột phát triển. - Bước hai: kiểm tra và khẳng ñịnh khả năng phân hủy tinh bột. Sau khi có các khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành cấy vạch các khuẩn lạc vào môi trường dinh dưỡng Y, ủ 37oC. Sau 24 giờ, nhỏ dung dịch thuốc thử lugol vào các khuẩn lạc. Các chủng có khả năng phân hủy tinh bột sẽ xuất hiện vòng tan trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trường còn lại trên ñĩa có màu xanh dương. Chủng nào không có khả năng phân hủy tinh bột thì xung quanh bắt màu xanh dương và không có vòng tan trong suốt. Môi trường Y là môi trường dinh dưỡng trong với nguồn C duy nhất là tinh bột. Chỉ những chủng vi sinh vật phân hủy ñược tinh bột mới có ñược nguồn C ñể phát triển. - 34 - Hình 3.1 Quy trình phân lập Mẫu nước thải N Mẫu bùn hoạt tính N Cấy trang trên môi trường dinh dưỡng X chứa tinh bột tan Cấy ria tạo khuẩn lạc riêng rẽ Cấy khuẩn lạc thuần khiết Thử khả năng phân hủy tinh bột trên môi trường dinh dưỡng Y với thuốc thử lugol (+) giữ cấy truyền Nhuộm gram (+) giữ cấy truyền Xác ñịnh các ñặc ñiểm hình thái Xác ñịnh các phản ứng sinh hóa Tổng hợp kết quả (-) loại (-) loại - 35 - 3.3.2.2 Các phương pháp xác ñịnh hình thái vi khuẩn Bảng 3.1 Các phương pháp xác ñịnh hình thái vi khuẩn STT Tên thử nghiệm Thuốc nhuộm Kết quả 1 Nhuộm Gram Tím tinh thể, lugol, fucshin Gram dương: màu tím Gram âm: màu hồng 2 Vỏ nhày Tím tinh thể, CuSO4 20% Tế bào màu tím Vỏ nhày màu nhạt 3 Bào tử Malichite, fucshin Tê bào màu hồng Bào tử màu lục 3.3.2.3 Các phản ứng sinh hóa xác ñịnh vi sinh vật Bảng 3.2 Các phản ứng sinh hóa xác ñịnh vi sinh vật Stt Tên thử nghiệm Môi trường sử dụng Thuốc thử Kết quả dương tính Kết quả âm tính 1 Phân hủy tinh bột Y Lugol Xung quanh vết cấy có vòng tan, phần môi trường màu xanh lam Xung quanh vết cấy không có vòng tan, phần môi trường màu xanh lam 2 Di ñộng Z - Vi khuẩn mọc lan ra vết cấy, môi trường ñục Vi khuẩn chỉ mọc dọc vết cấy, môi trường vẫn trong 3 Indol Trypton Kovac’s Bề mặt môi trường xuất hiện vòng ñỏ Bề mặt môi trường không xuất hiện vòng ñỏ - 36 - 4 Metyl red MRPV Metyl red Môi trường chuyển sang màu ñỏ Môi trường không ñổi màu 5 Voges- proskauer MRPV KOH, α- naphtol Xuất hiện vòng ñỏ trên bề mặt môi trường Không xuất hiện vòng ñỏ trên bề mặt môi trường 6 Citrate Simmon citrate - Môi trường chuyển sang màu xanh lam Môi trường không ñổi màu – màu xanh lục 7 Nitrate A diphenyla min Môi trường chuyển sang xanh lam Môi trường không ñổi màu 8 Urease Ure broth - Môi trường chuyển sang màu ñỏ hồng Môi trường không ñổi màu – màu tím 9 Lipase B - Xung quanh vết cấy có vòng tan trong suốt Xung quanh vết cấy không có vòng trong suốt 10 Catalase Y H2O2 Có sủi bọt Không sủi bọt 11 KIA/TSI TSI - Sử dụng gucose và lactose: toàn môi trường màu vàng. Không sử dụng hai nguồn ñường: toàn môi trường màu ñỏ. Phần nghiên màu ñỏ, phần sâu màu vàng: sử dụng glucose và ko6ng sử dụng lactose. Môi trường có phần màu ñen: sinh H2S Môi trường có khoảng trống, nứt thạch: có sinh hơi - 37 - 3.3.3 Phương pháp xác ñịnh thời gian tăng trưởng tối ưu của các chủng Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập ñược ở ñiều kiện lắc trong các bình erlen có 50ml môi trường dinh dưỡng chứa khoáng và tinh bột là nguồn C duy nhất. Sau các khoảng thời gian nhất ñịnh, ño mật ñộ sinh khối tế bào bằng máy ño quang phổ ở bước sóng 610nm. 3.3.4 Phương pháp xác ñịnh các thông số ô nhiễm ñầu vào của nước thải Các thông số môi trường cần ñược xác ñịnh bao gồm: thông số BOD, COD, N tổng số, P tổng số, pH. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành kiểm tra chỉ số Coliform tổng ñể ñánh giá mức ñộ ô nhiễm phân của nước thải trước khi xử lý. - 38 - Bảng 3.3 Các thông số môi trường và phương pháp xác ñịnh. Các thông số môi trường Phương pháp xác ñịnh COD (nhu cầu oxy hóa học) Oxy hóa chất hữu cơ trong mẫu bằng hỗn hợp K2Cr2O7 và H2SO4 có xúc tác. Lượng K2Cr2O7 và H2SO4 sẽ giảm tương ứng với lượng chất hữu cơ có trong mẫu. Lượng K2Cr2O7 dư sẽ ñược ñịnh phân bằng dung dịch Fe(NH4)2(SO4)2 với chỉ thị feroin. Từ ñó tính ñược lượng chất hữu cơ trong mẫu tỉ lệ với lượng K2Cr2O7 ñã phản ứng với chất hữu cơ. BOD (nhu cầu oxy sinh học) Sử dụng chai DO có V = 300ml. ðo hàm lượng DO ban ñầu và sau 5 ngày ủ ở 20oC. Lượng oxy chênh lệch do vi sinh vật sử dụng chính là BOD. pH Máy ño pH Nitơ kenñan (Nitơ hữu cơ + NH3) Phương pháp chưng cất Kenñan Tổng Phospho Trong môi trường acid các dạng của phosophat ñược chuyển về dạng orthophosphate và phản ứng với ammonium molybdate và SnCl2 cho phức molybdenum màu xanh dương. Xác ñịnh ñộ hấp thu của phức tạo thành bằng phương pháp ño quang ở bước sóng 690nm. Coliform tổng Phương pháp lên men nhiều ống (MPN) 3.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm ứng dụng các chủng vi khuẩn ñã phân lập ñược trong xử lý nước thải sản xuất nui. - 39 - Hình 3.2 Quy trình bố trí thí nghiệm ứng dụng chủng xử lý nước thải - 40 - Nước thải ñầu vào giá trị COD khoảng gần 9000, do ñó ñể vi sinh vật có thể xử lý ñược trong ñiều kiện hiếu khí thì cần ñược pha loãng tới giới hạn phù hợp sao cho COD khoảng 400 – 600mg/l. Ngoài ra ñể tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho các vi sinh vật phát triển thì các yếu tố pH, dinh dưỡng (N,P) cũng ñược hiệu chỉnh phù hợp, trong ñó pH ñược chỉnh về khoảng 6.5 – 7.0, còn N và P ñược bổ sung thêm vào nước thải dưới dạng dung dịch NH4NO3 và dung dịch K2HPO4 sao cho tỷ lệ BOD : N : P = 100 : 5 : 1 ñược thỏa mãn. Bổ sung tỷ lệ giống lần lượt 1%, 1.5% và 2% vào các bình erlen chửa nước thải ñể khảo sát tỷ lệ giống tối ưu của các chủng. Các erlen ñược lắc liên tục trên máy lắc ở tốc ñộ 120 vòng/phút. Mẫu ñối chứng (DC) gồm nước thải ñã pha loãng, chỉnh pH, bổ sung N, P nhưng không bổ sung giống và cũng lắc liên tục. Cứ sau 24h, tắt máy lắc ñể lắng 1.5h rồi tiến hành ño COD, ghi nhận kết quả xử lý nước thải thông qua COD của các chủng ở các tỷ lệ trên và so sánh với mẫu ñối chứng (DC). ðối với phương pháp phối hợp thì từng chủng thuộc nhóm mạnh nhất ñược phối với các chủng còn lại thep quy tắc chập ba, tỷ lệ giống cho vào sẽ là 0.4:0.3:0.3 (0.4ml cho chủng mạnh nhất), do ñó ở mỗi bình tỷ lệ giống sẽ là 1%. ðồng thời tiến hành phối 6 chủng với nhau. Tỷ lệ giống ñược cho vào mỗi chủng là 0.67ml. Các bước còn lại thực hiện tương tự như phương pháp xác ñịnh hiệu quả xử lý của từng chủng. 3.3.5.1 Phương pháp xác ñịnh tỷ lệ giống tối ưu Dựa trên các thông số BOD, COD, N tổng và P tổng ñầu vào, chúng tôi sẽ tiến hành cân bằng các thông số ñể ñạt ñược tỷ lệ BOD:N:P = 100:5:1. Mặt khác, nước thải sản xuất tinh bột có hàm lượng chất hữu cơ cao, nên ñể có thể xử lý bằng phương pháp sinh học, chúng tôi sẽ tiến hành pha loãng ñể giá trị BOD, COD ñạt ñược trong ngưỡng có thể xử lý ñược bằng phương pháp sinh học. Các chủng vi sinh vật tuyển chọn ñược từ giai ñoạn phân lập sẽ ñược tăng sinh 24h và bổ sung vào nước thải theo các tỷ lệ 1%, 1.5% và 2%. ðồng thời tiến hành song song với mẫu ñối chứng (DC) là nước thải ñã pha loãng, chỉnh pH, bổ sung N, P - 41 - Sau thời gian 24h, 48h, 72h, tắt máy lắc ñể lắng 1,5h rồi tiến hành ño COD, ghi nhận kết quả của các chủng ở các tỷ lệ và mẫu ñối chứng (DC). 3.3.5.2 Phương pháp xác ñịnh hiệu quả xử lý của các thí nghiệm phối chủng ðối với phương pháp phối hợp thì từng chủng thuộc nhóm mạnh nhất ñược phối với các chủng còn lại thep quy tắc chập ba, tỷ lệ giống cho vào sẽ là 0.4:0.3:0.3 (0.4ml cho chủng mạnh nhất), do ñó ở mỗi bình tỷ lệ giống sẽ là 1%. ðồng thời tiến hành phối 6 chủng với nhau. Tỷ lệ giống ñược cho vào mỗi chủng là 0.067ml. Các bước còn lại thực hiện tương tự như phương pháp xác ñịnh hiệu quả xử lý của từng chủng. 3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu Sổ liệu ñược xử lý bằng phần mềm Excel. - 42 - Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kết quả phân lập Sau giai ñoạn phân lập và thuần nhất, chúng tôi thu ñược 25 chủng vi khuẩn trên môi trường X. Trong quá trình phân lập, chúng tôi chọn lựa các chủng vi khuẩn dựa trên hai yếu tố quan trọng. Một là khả năng phân hủy tinh bột mạnh, ñường kính phân hủy phải ñạt trên 0.5 cm vì khi ñó khả năng xử lý của chủng cao và rút ngắn ñược giai ñoạn thích nghi khi ñưa chủng vào môi trường nước thải. Yếu tố thứ hai là vi khuẩn gram (+) vì chúng tôi muốn tập trung vào các loài trong chi Bacillus – hầu hết là những vi khuẩn gram dương có hệ enzyme phân hủy tinh bột ña dạng nhất. ðo ñó, chúng tôi loại bỏ 11 chủng vi khuẩn gram âm và tiến hành thử nghiệm khả năng phân hủy tinh bột trên môi trường Y với 14 chủng vi khuẩn gram dương. Kết quả xác ñịnh ñường kính phân hủy tinh bột của 14 chủng này ñược trình bày trong bảng 4.1. - 43 - Bảng 4.1 Kết quả thử nghiệm khả năng phân hủy tinh bột của 14 chủng vi khuẩn gram dương phân lập ñược Mẫu Gram Bán kính phân hủy tinh bột (cm) B1 (+) 1.2 B2 (+) 1.0 B3 (+) 0.95 B4 (+) 1.2 N5 (+) 1.3 B6 (+) 1.15 N10 (+) 0.75 B11 (+) 0.30 B12 (+) 0.20 N15 (+) 0.3 N19 (+) 0.15 N20 (+) 0.60 N21 (+) 0.55 N25 (+) 0.65 Kết quả cho thấy 14 chủng vi khuẩn gram dương này ñều có khả năng phân hủy tinh bột. ðường kính phân hủy trung bình là 0.73 cm. Trong ñó, có 10 chủng có ñường kính phân hủy tinh bột ñạt yêu cầu trên 0.5cm (B1, B2, B3, B4, N5, B6, N10, N20, N21, N25), ñường kính phân hủy từ 0.55 – 1.3cm. Tuy nhiên ñể xử lý nước thải ñạt hiếu quả cao thì ñường kính phân hủy của các chủng phải lớn hơn 1cm, do ñó chỉ giữ lại 6 chủng là B1, B2, B3, B4, N5, B6 với ñường kính phân hủy trong khoảng từ 0.95 – 1.3 cm và loại 4 chủng là N10, N20, N21 và N25 với ñường kính phân hủy từ 0.55 – 0.75cm. Các chủng giữ lại ñược ñổi ký hiệu tương ứng như sau : B1
1, B2
2, B3
3, B4
4, N5
5, B6
6. 4.1.1 Kết quả xác ñịnh các ñặc ñiểm hình thái - 44 - Bảng 4.2 Kết quả xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái 6 chủng phân lập ñược. Chủng gram Vỏ nhày Bào tử Di ñộng Bán kính phân hủy tinh bột 1 dương + + + 1.2 cm 2 + + + + 1.0 cm 3 + + + + 0.95 cm 4 + + + + 1.2 cm 5 + + + + 1.3 cm ðặc ñiểm hình thái 6 + + + + 1.15 cm Bảng kết quả cho thấy 6 chủng này ñều có bào tử, vỏ nhày, có khả năng di ñộng. Trong ñó chủng số 5 có bán kính phân hủy lớn nhất là 1.3cm và chủng số 3 có bán kính phân hủy nhỏ nhất là 0.95cm. Bảng 4.3 Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử của các chủng. Tên chủng Kết quả nhuộm Gram Kết quả nhuộm bào tử 1 2 - 45 - 3 4 5 6 - 46 - Bảng 4.4 Kết quả xác ñĩnh khả năng phân hủy tinh bột và di ñộng Chủng Kết quả thử khả năng phân hủy tinh bột Kết quả thử khả năng di ñộng 1 2 3 4 5 6 - 47 - 4.1.2 Kết quả xác ñịnh các phản ứng sinh hóa Bảng 4.5 Kết quả xác ñịnh phản ứng sinh hóa 6 chủng vi khuẩn phân lập ñược Chủng 1 2 3 4 5 6 Indol - - - - - - Metyl red + + + + + + Voges-p - - - - - - Citrate + + + + + + Ureas - - - - - - Lipase + + + + + + Nitrate + + + + + + Glucose + + + + + + Lactose + - - - - - Catalase + + + + + + - 48 - Bảng 4.6 Kết quả xác ñịnh các phản ứng sinh hóa (thứ tự các chủng từ 1 – 6 tính từ trái sang) Thử nghiệm catalase Thử nghiệm TSI Thử nghiệm Indol Thử nghiệm Metyl red Thử nghiệm Voges- proskauer Thử nghiệm ureas Thử nghiệm Nitrte Thử nghiệm Lipase Thử nghiệm Citrate - 49 - Từ kết quả tổng hợp các phản ứng sinh hóa của 6 chủng, nhận thấy tất cả 6 chủng ñều mang ñầy ñủ các ñặc tính của Bacillus khi so sánh với bảng phân loại của Bergey. Sáu chủng vi khuẩn này ñược giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong tủ mát và ñược tiến hành tăng sinh ñể sử dụng trong xử lý nước thải ở giai ñoạn tiếp theo. 4.2 Kết quả xác ñịnh thời gian tăng trưởng tối ưu Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, có lắc, cả 6 chủng ñều có ñường cong sinh trưởng tương tự nhau, bao gồm các giai ñoạn: thích ứng, tăng trưởng, cân bằng và suy vong. Tuy nhiên, thời gian ñạt giá trị OD cực ñại, tương ứng với thời gian tăng trưởng tối ưu của các chủng có sự khác biệt. Các chủng 1, 4 ñạt giá trị OD cực ñại sau 24h, các chủng 2, 3, 5 tăng trưởng tối ưu sau 28h, riêng chủng 6 lại có giá trị OD cực ñại sau 26h. Mặt khác, xét về mật ñộ sinh khối của các chủng nuôi cấy trong khoảng thời gian 24h – 28h, chúng tối nhận thấy giá trị OD không tăng ñáng kể. Do ñó, chúng tôi chọn thời gian tăng trưởng tối ưu trung bình cho tất cả 6 chủng là 26h. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 thời gian nuôi cấy g iá t rị O D chủng 1 chủng 2 chủng 3 chủng 1 1.535 1.974 1.932 1.921 1.926 1.9 1.349 chủng 2 1.1 1.4 2.1 2.67 2.72 2.66 1.87 chủng 3 0.865 1.186 1.35 1.83 1.81 1.862 1.5 18h 24h 26h 28h 32h 34h 48h Hình 4.1 ðồ thị biểu diễn sự tương quan giữa giá trị OD và thời gian nuôi cấy của chủng 1, 2, 3. - 50 - 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 thời gian nuôi cấy g iá t rị O D chủng 4 chủng 5 chủng 6 chủng 4 1.37 1.892 1.816 1.85 1.77 1.69 1.03 chủng 5 1.05 1.42 2.04 2.4 2.36 2.4 2.1 chủng 6 1.17 1.63 2.2 2.19 2.22 2 1.38 18h 24h 26h 28h 32h 34h 48h Hình 4.2 ðồ thị biểu diễn sự tương quan giữa giá trị OD và thời gian nuôi cấy của chủng 4, 5, 6. 4.3 Kết quả các thông số ñầu vào của nước thải Nước thải nhà máy sản xuất nui có nồng ñộ COD khá cao nên ở 3 nồng ñộ pha loãng là 10, 20 và 30 lần, chúng tôi không xác ñịnh ñược giá trị COD. Ở nồng ñộ pha loãng 50 lần và 70 lần, giá trị COD trung bình là 8840 mg/l nước thải. Kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu cho thấy nước thải tinh bột ñều có giá trị COD trong khoảng 2500 – 17000 mg/l. ðể xử lý sinh học, giá trị BOD phải gấp khoảng 0.5 – 0.7 lần giá trị COD của nước thải ñầu vào. Với kết quả COD là 8840 mg/l nước thải, nồng ñộ pha loãng của mẫu ñể ñạt ñược tỷ lệ BOD/COD = 0.5 là 850 lần. Thể tích nước thải dùng là 0.35ml trong 300ml dung dịch pha loãng. Kết quả BOD ño ñược là 4888 mg/l nước thải, tỷ lệ BOD/COD là 0.56. Kết quả này cũng phù hợp với một số kết quả phân tích BOD trong nước thải tinh bột là từ 2120 – 14750mg/l - 51 - Từ ñường chuẩn và giá trị ñộ hấp thụ của mẫu, chúng tôi tính ñược nồng ñộ P tổng là 4,55 mg/l. Kết quả này là không cao và nằm trong giới hạn cho phép các thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp loại B (QCVN 24: 2009/BTNMT) Hàm lượng N tổng số cũng khá thấp (40.47 mg/l) so với các công trình nghiên cứu về nước thải tinh bột khác (136 – 300 mg/l) và nằm trong giới hạn cho phép các thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp loại B (QCVN 24: 2009/BTNMT). ðể có thể xử lý bằng phương pháp sinh học, tỷ lệ BOD:N:P là 100:5:1. Do ñó, chúng tôi bổ sung thêm Phopspho dưới dạng K2HPO4 với hàm lượng 0.13g/100ml nước thải pha loãng 20 lần và bổ sung thêm N dưới dạng NH4NO3 với hàm lượng 0.3g/100ml nước thải pha loãng 20 lần ñể sử dụng cho quá trình xử lý bằng các chủng phân lập ñược. ðồng thời do pH nước thải khá thấp ño ñược chỉ khoảng 4.2 – 4.6 nên tiến hành ñiều chỉnh pH về 6.5 – 7.0 bằng dung dịch NaOH. ðối với kết quả chỉ tiêu Coliform tổng, chúng tôi nhận thấy tổng số Coliform trong nước thải tinh bột không cao, khoảng 210x102 MPN/100ml. Nguyên nhân có thể do nước thải tinh bột có ñộ pH khá thấp, chứa một lượng CN- nhất ñịnh. ðây là yếu tố ức chế quá trình phát triển của vi sinh vật. ðồng thời, thành phần nước thải chủ yếu là tinh bột nên chỉ một số vi khuẩn có hệ enzyme amylase mới phát triển ñược. Một lượng nhỏ Coliform có trong nước thải có thể do các nguyên nhân khác bị nhiễm vào như nước mưa rửa trôi lẫn nước thải sinh hoạt rơi vào hệ thống thu nước thải… Do ñó yếu tố Coliform tổng là không ñáng kể. Bảng 4.7 Kết quả các thông số ñầu vào của nước thải Chỉ tiêu ðơn vị Kết quả Kết quả của các công trình nghiên cứu khác QCVN 24: 2009/BTNMT pH - 4.2 – 4.6 4,2 – 5,1 5.5 – 9.0 COD mg/l 8840 2500 – 17000 50 - 100 BOD5 mg/l 4888 2120 – 14750 30 - 50 N mg/l 40.47 136 – 300 15 - 30 P mg/l 4,55 4 - 70 4 - 6 Coliform MPN/100ml 210x102 - 3000 - 5000 - 52 - 4.4 Kết quả khảo sát tỷ lệ giống tối ưu cho từng chủng Hiệu quả xử lý của các chủng càng cao khi giá trị COD ño ñược sau thời gian xử lý càng thấp. Sau khi tăng sinh các chủng với thời gian tăng trưởng tối ưu ñã chọn là 26h, ở các tỷ lệ giống 1%, 1,5% và 2% của mỗi chủng, chúng tôi ghi nhận kết quả COD sau ba khoảng thời gian xử lý là 24h, 48h và 72h. Biểu ñồ biểu diễn kết quả của từng chủng ñược trình bày trong Phụ lục 5. Giá trị COD ghi nhận ñược ở tỷ lệ 1% các chủng 1, 2, 3, 5 qua ba thời ñiểm 24, 48 và 72h ñều thấp hơn so với tỷ lệ 1,5 và 2%. ðối với chủng 4, giá trị COD ở tỷ lệ 1,5% vào thời ñiểm 24h là 48 mg/l, thấp hơn ở tỷ lệ 1% là 80 mg/l. Sau 72h, giá trị COD ở tỷ lệ 1,5% lại tăng cao, trong khi ở tỷ lệ 1% lại có xu hướng bắt ñầu giảm. Chênh lệch COD ở thời ñiểm 24h của hai tỷ lệ giống này không nhiều, nên chúng tôi chọn tỷ lệ 1% là tối ưu cho chủng 4. ðối với chủng 6, giá trị COD 24h ở tỷ lệ 1,5% là 64 mg/l, thấp hơn nhiều so với giá trị COD ở tỷ lệ giống 1% là 143 mg/l. Sau 72h, giá trị COD ở tỷ lệ 1,5% tăng mạnh lên 160 mg/l trong khi giá trị COD ở tỷ lệ giống 1% lại giảm dần xuống 96 mg/l. Như vậy, ở tỷ lệ giống 1,5% sau 24h, chủng 6 bắt ñầu mất hiệu quả xử lý. Ngược lại, khuynh hướng quá trình xử lý bắt ñầu có hiệu quả ñối với tỷ lệ giống 1%. Do ñó, trong thí nghiệm xử lý với khoảng thời gian từ 24h ñến 72h, chúng tôi chọn tỷ lệ 1% là tỷ lệ giống tối ưu cho chủng 6. Về thời gian xử lý, các chủng 5, 6 có giá trị COD thấp nhất sau 72h, các chủng 1, 2, 3, 4 có giá trị COD thấp nhất sau 24h. ðiều này tùy thuộc vào khả năng thích nghi với ñặc ñiểm nước thải và khả năng sử dụng nguồn cơ chất có trong nước thải của từng loại vi sinh vật. So sánh giá trị COD thì hiệu quả xử lý cao nhất là chủng 1 sau 24h (COD = 48 mg/l). Chủng 1 cũng cho thấy hiệu quả xử lý sau 24h ngang bằng với chủng 5 sau 72h (COD = 48 mg/l). Nhìn chung, giá trị COD cả 6 chủng ñều giảm mạnh so với COD ñầu vào của nước thải là 420 mg/l. Mẫu ñối chứng ñược tiến hành trong ñiều kiện tương tự nhưng không bổ sung vi sinh vật giảm COD 176 mg/l sau 48h và 72h So sánh tỷ lệ % hiệu quả xử lý của các chủng 1, 4, 5 xử lý COD còn 48mg/l và của các chủng 2, 3, 6 xử lý COD giảm lần lượt còn 64 , 96 và 64mg/l. Vậy mẫu ñối chứng có hiệu quả xử lý không cao bằng các mẫu nước thải có bổ sung các chủng - 53 - phân lập ñược vì bản thân nước thải sản xuất tinh bột cũng có một tỷ lệ nhất ñịnh vi sinh vật, nếu hàm lượng BOD, COD không quá cao, nước thải có thể tự làm sạch sau một thời gian. Tuy nhiên, với tải lượng và hàm lượng nước thải sản xuất tinh bột thường cao, do ñó việc bổ sung vi sinh vật có khả năng phân hủy tinh bột ñẩy mạnh quá trình xử lý và cho hiệu quả cao hơn. Bảng 4.8 Kết quả giá trị COD (mg/l) của 6 chủng ở tỷ lệ giống 1% Thời gian Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 Chủng 4 Chủng 5 Chủng 6 ðối chứng ðầu vào 24h 48 64 96 80 134 143 224 48h 64 96 112 96 128 128 176 72h 8 96 112 100 48 96 176 400 Tỉ lệ % tối ưu 88 84 76 88 88 84 56 Như vậy, tỷ lệ giống tối ưu cho các chủng là 1%. Chủng 1, 4, 5 ñược xem là các chủng mạnh, có hiệu quả xử lý cao hơn các chủng 2, 3, 6. Tổng hợp ở phẩn phục lục 5. Kết quả này phù hợp với kết quả xác ñịnh bán kính phân hủy tinh bột. Các chủng 1, 4, 5 có bán kính phân hủy cao nhất (1.2 và 1.3 cm) trong 6 chủng phân lập ñược. 4.5 Kết quả xử lý nước thải khi phối hợp các chủng Từ kết quả quá trình khảo sát tỷ lệ giống và hiệu quả xử lý của từng chủng ở trên, ta tiến hành phối các chủng ñể nâng cao hiệu quả xử lý. 3 chủng thuộc nhóm mạnh nhất (1, 4, 5) ñược phối với 3 chủng thuộc nhóm yếu hơn (2, 3, 6) theo phương pháp chập ba. ðồng thời tiến hành phối 6 chủng với nhau - 54 - Bảng 4.9 Bố trí thí nghiệm phối hợp các chủng Chủng 1 4 5 2 Thí nghiệm 123 Thí nghiệm 423 Thí nghiệm 623 3 Thí nghiệm 136 Thí nghiệm 436 Thí nghiệm 536 6 Thí nghiệm 126 Thí nghiệm 426 Thí nghiệm 526 Với tỷ lệ giống tối ưu là 1%, 3 chủng trong mỗi thí nghiệm phối hợp ñược bổ sung vào nước thải theo tỷ lệ 0,4:0,3:0,3. Trong ñó, các chủng mạnh hơn (chủng 1, 4, 5) ñược bổ sung với tỷ lệ 0,4%, các chủng còn lại (2, 3, 6) ñược bổ sung với tỷ lệ 0,3%. Ở thí nghiệm phối 6 chủng với nhau, tỷ lệ giống ñược cho vào mỗi chủng là 0.067 ml/100 ml nước thải. Giá trị COD ñược xác ñịnh ở bốn thời ñiểm là 24h, 48h, 72h và 96h. 4.5.1 Kết quả xử lý nước thải của các thí nghiệm phối hợp với chủng 1 Hiệu quả xử lý của thí nghiệm phối hợp các chủng ñược ñánh giá qua giá trị COD. COD càng thấp nghĩa là hiệu quả xử lý càng cao. Ở 3 thí nghiệm phối hợp với chủng 1, giá trị COD ñều giảm mạnh theo thời gian và ñạt giá trị nhỏ nhất ở 72h. Sau ñó, giá trị COD tăng cao ñến thời ñiểm 96h. Trong chu trình sinh trưởng, sau giai ñoạn tăng trưởng tối ưu và bước vào giai ñoạn cân bằng, vi sinh vật sẽ thực hiện quá trình phân hủy nội bào. Chính vì thế làm tăng giá trị COD trong bình thí nghiệm. Ở thí nghiệm 123, giá trị COD thời ñiểm 48h ñạt 136 mg/l, tăng nhẹ so với giá trị COD thời ñiểm 24h là 128 mg/l. Khi phối hợp chủng 1, 2 và 3 có thể có sự ức chế lẫn nhau giữa các chủng làm giảm số lượng vi sinh vật ban ñầu. Sau ñó, các vi sinh vật thích nghi dần và phát triển mạnh trở lại, làm tăng hiệu quả xử lý. Mặt khác, có thể do sai sót trong thao tác xác ñịnh COD nên kết quả không phù hợp mà chúng tôi không có ñủ ñiều kiện thời gian ñể tiến hành lại thí nghiệm này. Tuy nhiên, ñến thời ñiểm 72h, giá trị COD là 80 mg/l, giảm 83% so với COD ñầu vào. Giá trị COD thấp nhất là ở thí nghiệm 136. Vào thời ñiểm 72h ñạt giá trị 28 mg/l, tỷ lệ % xử lý ñạt 93%. ðiều này cho thấy chủng 1 phối hợp với chủng 136 cho hiệu quả cao nhất. - 55 - 0 50 100 150 Thời gian xử lý G iá t rị C O D m g/ l TN 123 TN 126 TN 136 TN 123 128 138 80 128 TN 126 128 80 64 96 TN 136 120 80 28 96 24h 48h 72h 96h Hình 4.3 Kết quả thí nghiệm phối với chủng 1 Bảng 4.10 Kết quả tối ưu của các thí nghiệm phối hợp 123, 126, 136 Thí nghiệm COD tối ưu (mg/l) Thời gian tối ưu Tỷ lệ % xử lý COD ñầu vào 123 80 72h 83% 480 mg/l 126 64 72h 87% 480 mg/l 136 28 72h 94% 480 mg/l 4.5.2 Kết quả xử lý nước thải của các thí nghiệm phối hợp với chủng 4 Các thí nghiệm 423 và 436 cũng cho kết quả xử lý tối ưu vào thời ñiểm 72h với giá trị COD thấp nhất ñạt 80 và 64 mg/l. Thí nghiệm 426 có sự gia tăng giá trị COD từ thời ñiểm 24 ñến 96h. Có hai khả năng xảy ra. Thứ nhất có thể sự phối hợp chủng 4 và chủng 2, 6 không ñạt hiệu quả xử lý vì các chủng ức chế nhau trong quá trình phát triển. Thứ hai, có thể hiệu quả phối hợp này là rất mạnh và nhanh chóng trong khoảng thời gian ngắn hơn 24h. Tuy nhiên, ở ñây, chúng tôi không có ñiều kiện ñể thực hiện lại thí nghiệm 426 ở các khoảng thời gian ngắn hơn. Về giá trị COD, tại thời gian tối ưu 72h, giá trị COD của thí nghiệm 423 và 436 lần lượt là 80 và 64 mg/l, bằng với kết quả của thí nghiệm 123, 126, nhưng cao hơn giá trị COD 28 mg/l của thí nghiệm 136. - 56 - 0 100 200 300 Thời gian xử lý G iá t rị C O D TN 423 TN 426 TN 436 TN 423 160 120 80 96 TN 426 112 128 136 140 TN 436 192 128 64 68 24h 48h 72h 96h Hình 4.4 Kết quả thí nghiệm phối với chủng 4 Bảng 4.13 Kết quả tối ưu của các thí nghiệm phối hợp 423, 426, 436 Thí nghiệm COD tối ưu (mg/l) Thời gian tối ưu Tỷ lệ % xử lý COD ñầu vào 423 80 72h 83% 480 mg/l 426 112 24h 77% 480 mg/l 436 64 72h 87% 480 mg/l 4.5.3 Kết quả xử lý nước thải của các thí nghiệm phối hợp với chủng 5 Ở các thí nghiệm phối hợp với chủng 5, chỉ có thí nghiệm 523 là cho kết quả xử lý tối ưu sau 72h tương tự như thí nghiệm phối hợp với hai chủng mạnh 1 và 4 ở trên. Thí nghiệm 526 và 536 cho kết quả COD thấp nhất ñều là 112 mg/l sau 48h xử lý. Giá trị COD ñạt ñược tối ưu của các thí nghiệm này vẫn cao hơn so với giá trị COD của thí nghiệm 136. Tỷ lệ phần trăm xử lý của các thí nghiệm phối hợp với chủng 5 là thấp nhất so với các thí nghiệm phối hợp với chủng 1 và 4. - 57 - 0 50 100 150 200 250 Thời gian xử lý G iá t rị C O D m g/ l TN 523 TN 526 TN 536 TN 523 144 128 96 128 TN 526 160 112 112 120 TN 536 196 112 128 136 24h 48h 72h 96h Hình 4. 5 Kết quả thí nghiệm phối với chủng 5 Bảng 4.10 Kết quả tối ưu của các thí nghiệm phối hợp 523, 526, 536 Thí nghiệm COD tối ưu (mg/l) Thời gian tối ưu Tỷ lệ % xử lý COD ñầu vào 523 96 72h 80% 480 mg/l 526 112 48h 77% 480 mg/l 536 112 48h 77% 480 mg/l 4.5.4 Kết quả xử lý nước thải của thí nghiệm phối hợp 6 chủng Trong tự nhiên hoặc trong các hệ thống nhân tạo, việc phân hủy các chất có trong nước thải luôn cần sự hỗ trợ lẫn nhau giữa các quần thể vi sinh vật. Với 6 chủng vi khuẩn phân lập ñược là ít so với số loài thực tế có trong nước thải. Tuy nhiên, ở ñây chúng tôi chọn lựa những nhóm có khả năng phân hủy tinh bột mạnh nhất. Vì vậy, thí nghiệm phối hợp cả 6 chủng vi khuẩn nhẳm xem xét khả năng hỗ trợ nhau giữa các chủng này trong quá trình xử lý. - 58 - TN 123456 0 50 100 150 200 Thời gian xử lý G iá t rị C O D m g/ l TN 123456 TN 123456 176 112 96 64 24h 48h 72h 96h Hình 4.6 Kết quả xử lý COD của thí nghiệm phối 6 chủng Kết quả cho thấy giá trị COD giảm dần theo thời gian xử lý. Giá trị COD ño ñược vào thời ñiểm 96h là 64 mg/l, giảm 87% so với COD ñầu vào là 480 mg/l. ðường biểu diễn giá trị COD cho thấy vẫn còn khuynh hướng giảm tiếp tục. Tuy nhiên, do ñiều kiện thí nghiệm không cho phép nên chúng tôi không tiếp tục theo dõi ở các thời gian tiếp theo. Như vậy, việc phối hợp 6 chủng với nhau có tiềm năng xử lý nước thải tinh bột cao hơn so với các chủng phối trên. Song song với thí nghiệm phối hợp các chủng, chúng tôi cũng tiến hành ño giá trị COD ở thí nghiệm ñối chứng. Bình ñối chứng ñược cân bằng tỷ lệ BOD:N:P là 100:5:1 và cũng ñược lắc ở ñiều kiện như các bình thí nghiệm, tuy nhiên không bổ sung vi sinh vật. Kết quả COD bình ñối chứng ở các thời ñiểm 24h, 48h, 72h cũng có sự giảm dần giá trị COD và ñạt giá trị nhỏ nhất ở là 192 mg/l ở thời ñiểm 72h. Như vậy, bản thân hệ vi sinh vật trong nước thải sản xuất tinh bột cũng có khả năng tự làm sạch, nhưng cần cung cấp thêm hàm lượng N, P, giảm tải trọng ñồng thời cung cấp ñầy ñủ oxi. Quá trình tự làm sạch này cần một khoảng thời gian lâu hơn so với quá trình có bổ sung vi sinh vật cho nguồn nước. Kết quả xử lý nước thải của các thí nghiệm phối hợp chủng sau 24h, 48h, 72h và 96h. - 59 - 0 50 100 150 200 250 300 350 12 3 12 6 13 6 42 3 42 6 43 6 52 3 52 6 53 6 12 34 56 DC Thí nghiệm phối chủng G iá tr ị C O D m g/ l 24h 48h 72h 96h Hình 4.7 Kết quả xử lý của các thí nghiệm phối chủng So sánh với quy chuẩn xả thải của QCVN 24:2009/BTNMT, hàm lượng COD ñầu ra tối ưu của hầu hết các thí nghiệm ñều ñạt tiêu chuẩn xả thải loại B (COD<=100 mg/l). Ở thí nghiệm 426, 526, 536, giá trị COD tối ưu cao hơn tiêu chuẩn (COD = 112 mg/l) nhưng không vượt chỉ tiêu cho phép quá nhiều. Thí nghiệm 136 có giá trị COD tối ưu là 28 mg/l ñạt tiêu chuẩn xả thải loại A (COD < 50 mg/l). Tuy nhiên, ở ñây chúng tôi chỉ thử nghiệm trên 100ml nước thải và tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm. Trong các hệ thống thực tế, còn nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình xử lý, cũng như tác ñộng ñến vi sinh vật. Do ñó, kết quả này còn phải ñược kiểm tra ở các quy mô thực nghiệm lớn hơn. Như vậy, so sánh giá trị COD, chúng tôi nhận thấy hiệu quả xử lý của thí nghiệm phối hợp chủng 1, 3, 6 là cao nhất, giá trị COD là 28 mg/l sau 72h, hiệu quả xử lý ñạt 94%. Tuy nhiên thí nghiệm phối hợp cả 6 chủng lại có tiềm năng cao hơn vì giá trị COD vẫn giảm sau 96h lưu nước. Hầu hết các thí nghiệm ñều ñạt tiêu chuẩn xả thải loại B theo QCVN 24:2009/BTNM. - 60 - Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Từ mẫu bùn và nước thải nhà máy sản xuất tinh bột, phân lập và tuyển chọn ñược 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột mạnh nhất. - Thời gian tăng trưởng tối ưu cho hầu hết các chủng là 26h. - Tỷ lệ giống tối ưu của các chủng là 1%. - Kết quả phối hợp giữa chủng 1, 3 và 6 cho kết quả xử lý tốt nhất. Giá trị COD là 28 mg/l sau 72h xử lý. Tuy nhiên, kết quả phối hợp cả 6 chủng có tiềm năng xử lý nhất vì giá trị COD vẫn giảm sau 96h lưu nước. - Các thí nghiệm xử lý ñều ñạt ñược tiêu chuẩn xả thải loại B theo QCVN 24: 2009/BTNMT 5.2 KIẾN NGHỊ - HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO - Các vi khuẩn phân lập trong ñề tài chỉ lấy từ mẫu bùn và nước thải của Công ty TNHH SX - TM - DV Phương ðông (FUDO food). ðịa chỉ: 8/30A - Ấp 4 - Xã ðông Thạnh - Huyện Hóc Môn - Tp. Hồ Chí Minh. Do ñó Cần tiến hành phân lập và tuyển chọn thêm các chủng vi sinh vật từ nhiều nguồn nước thải của các nhà máy sản xuất tinh bột khác trên ñịa bàn Tp HCM. - Do ñiều kiện thí nghiệm còn hạn chế nên chỉ dựa vào bảng phân loại Bergey tạm nghi ngờ các chủng phân lập ñược là Bacillus. Cần có những thí nghiệm ñịnh danh chính xác 6 chủng vi khuẩn này ñể có căn cứ khoa học hơn trong việc giải thích hiệu quả xứ lý của mỗi chủng. - ðề tài chỉ khảo sát ñược hiệu quả xử lý của các chủng phối theo quy tắc chập ba giữa các chủng thuộc nhóm mạnh với các chủng thuộc nhóm yếu hơn. Cần tiến hành thêm các thí nghiệm phối hợp khác như chập bốn, chập ba chuảng mạnh nhất…ñể tìm ra những nhóm vi khuẩn ñạt hiệu quả xử lý cao hơn. - Tiếp tục theo dõi hiệu quả xử lý của thí nghiệm phối hợp 6 chủng trong các thời gian xử lý tiếp theo. - 61 - - Thử nghiệm khả năng xử lý của 6 chủng vi khuẩn này ở các mô hình xử lý nước thải, sau ñó tiến hành thực nghiệm tại một hệ thống xử lý nước thải trong ñiều kiện thực tế.