Đề tài Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc tạo dòng phục hồi phục vụ công tác chọn giống lúa lai ba dòng

có ý nghĩa rất quan trọng trong di truyền chọn giống, nó cho phép nhà chọn giống hiểu được mối quan hệ giữa Kiểu gene – Tính trạng – Môi trường, trên cơ sở đó có thể đề ra một phương pháp chọn tạo thích hợp. [3][4][5] Sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật chỉ thị phân tử DNA đã cung cấp một công cụ hết sức hữu hiệu trong việc lập bản đồ di truyền. Để thiết lập bản đồ di truyền phân tử, các nhà khoa học tiến hành theo các bước sau: - Chọn tạo quần thể lập bản đồ thích hợp. - Tính toán chính xác tần số tái tổ hợp xảy ra trong quần thể này. - Thiết lập nhóm liên kết và khoảng cách lập bản đồ. - Xác định trật tự các gen ( hoặc các loại chỉ thị di truyền phân tử) trên từng nhiễm sắc thể của hệ gen. Trong việc lập bản đồ di truyền phân tử, việc phân tích và xử lý số liệu được thực hiện băng các chương trình máy tính. Sử dụng số liệu thu từ quần thể phân ly để tính toán tần số tái tổ hợp mà sau đó được sử dụng để xác định trật tự và vi trí tuyến tính của các loại chỉ thị di truyền.[3][4][5] 2.1.6. Lập bản đồ phân tử cho tính trạng phục hồi hữu dục đực tế bào chất Gen phục hồi bất dục tế bào chất đã được xác định, lập bản đồ cho các loại bất dục tế bào chất tại các locus/gen khác nhau trên các nhiễm sắc thể khác nhau (Gramene website). Trên trang Gramene website những gen phục hồi bất dục đực tế bào chất Rf đã được công bố với vị trí trên nhiễm sắc thể và được kí hiệu từ Rf1 đến Rf17. Gene phục hồi bất dục đực tế bào chất cũng được xác định bởi chỉ thị marker phân tử như Rf-1. Gen Rf-1 là gen phục hồi bất dục đực đầu tiên của cây lương thực đã được phân lập [19]. Sau đó, rất nhiều các gen phục hồi trên các nhiễm sắc thể khác nhau của cây lúa như: xác định được gene viz. Rf4 (Rf-WA-1) và Rf6 (Rf-WA-2) trên nhiễm sắc thể 7 và 10. Năm 1997 xác định gen Rf3 gene liên kết chỉ thị RFLP markers trên nhiễm sắc thể 1 [21]. Cũng vào năm 1997 xác định được hai gen phục hồi bất dục đực tế bào chất kiểu WA CMS trên nhiễm sắc thể 1 (Rf3) và 10 (Rf6)… [20] Gene phục hồi bất dục đực có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác chọn giống lúa lai. Chọn lọc dòng bố lúa lai 3 dòng mang gen phục hồi sau khi xác định được chỉ thị phân tử gắn với gen phục hồi Rf, vật liệu phân ly của các tổ hợp lai MK63, Q99, Trắc 64... x IRBB5, IRBB21, IRBB7, IRBB4 [12]. Gần đây, Sử dụng dữ liệu về đặc điểm phân tách của chỉ thị phân tử thu được từ việc phân tích bản đồ quần thể, vị trí liên kết cục bộ của vùng nhiễm sắc thể xung quanh gen Rf – 4, một locus phục hồi hữu dục quan trọng trên nhiễm sắc thể số 10 được xây dựng lên. [18] Vật liệu phân ly F2, BC1F1, BC2F1, BC5F2....của các tổ hợp lai: RTQ5 x Giống kháng rầy nâu, bạc lá, các dòng phân ly có dạng hình đẹp, kháng sâu bệnh bạc lá, rầy nâu, sẽ được chọn lọc. Những dòng có gen phục hồi Rf, những dòng bố tốt có thể sử dụng cho lai tạo lúa lai 3 dòng. Tuy nhiên chỉ có những dòng có gen phục hồi mới có thể sử dụng cho phát triển lúa lai 3 dòng.[12] Các nghiên cứu sâu về sinh học phân tử để xác định vị trí của gen phục hồi trên các nhiễm sắc thể trong bộ genom lúa cũng đã có được nhiều kết quả. Về cấu trúc tế bào thì gen trong tế bào chất có thể là gen kiểm soát tính hữu dục đực hoặc bất dục đực (S hoặc F), nhưng gen trong nhân là đồng hợp tử trội (RfRf) hoặc ở trạng thái dị hợp tử (Rfrf) kiểm soát tính trạng hữu dục phấn. Do gen trong nhân ở hai trạng thái khác nhau nên khi lai với dòng CMS sẽ xảy ra hiện tượng phục hồi hoàn toàn hoặc phục hồi một phần.[12] 2.1.7. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) Chỉ thị di truyền và bản đồ di truyền cho phép các nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ “ Tính trạng – kiểu gen (QTLs) – môi trường”. Do vậy họ sẽ dễ dàng đưa ra một chiến lược thích hợp và chuẩn xác trong chương trình chọn giống của mình nhằm: - Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền trong số các cá thể giữa cá giống, loài. - Lai tạo để tạo ra các tổ hợp lai mới. - Chọn lọc chính xác các tổ hợp gen quan tâm. Trong cả ba lĩnh vực này chỉ thị phân tử và bản đồ di truyền đều có khả năng hỗ trợ một cách đắc lực. Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với các gen được sử dụng để chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn rất sớm mà không phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Quá trình này được gọi là quá trình chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) hay còn gọi là chọn giống phân tử. Kỹ thuật MAS hết sức thích hợp với các tính trạng mà chọn giống cổ điển không thể làm được nhanh chóng. Hơn nữa, MAS không những cho các nhà chọn giống chọn lọc những tính trạng đơn gen mà còn cả đối với các tính trạng đa gen [4][5]. Trong quá trình chọn giống có sử dụng phương pháp lai trở lại, MAS sẽ giúp cho quá trình những gen quan tâm vào giống có cấu trúc hệ gen khác nhau một cách nhanh chóng. Bởi lẽ, MAS cho phép tối ưu hóa số cây cần chọn, số lần cần lai trở lại, hoặc loại bỏ các cá thể không liên quan đến những gen quan tâm. Ở cây lúa, MAS đã được tiến hành ứng dụng và có được thành công với các gen kháng bệnh bạc là, kháng đạo ôn, . . .[5]. Như vậy, chọn giống với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng, nó như một nhịp cầu gắn kết giữa công nghệ sinh học với phương pháp chọn giống cổ điển. Nó đã trở thành một hợp phần phổ biến của các quá trình lai trở lại, quá trình lập bản đồ cũng như quá trình chọn lọc các tính trạng đơn gen, đa gen có giá trị cao về mặt di truyền và kinh tế. Các kỹ chỉ thị phân tử được sử dụng để trợ giúp và đảm bảo sự chính xác cho các nhà chọn tạo giống nhận diện đúng và thiết lập được ranh giới bản quyền của những loài mới được phát hiện.[5] 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài 2.2.1. Các nghiên cứu ngoài nước 2.2.1.1. Tình hình nghiên cứu lúa lai trên thế giới - Trung Quốc là nước đầu tiên trên thế giới sử dụng lúa lai trong sản xuất đại trà. Năm 1993 diện tích lúa lai của Trung Quốc mới có 133 ngàn ha. Năm 1994, năm có diện tích lúa lai đạt cao nhất là 18 triệu ha. Diện tích trồng lúa của Trung Quốc hiện nay là 31 triệu ha trong đó diện tích lúa lai chiếm khoảng 16 triệu ha, năng suất bình quân riêng lúa lai 6.9 tấn/ha so với lúa thuần năng suất bình quân là 5.4 tấn/ha, tăng 1,5 tấn/ha trên toàn bộ diện tích. Diện tích sản xuất hạt lai F1 là: 140.000ha, năng suất hạt giống bình quân 2,5 tấn/ha. Những năm gần đây, ngày càng nhiều các dòng bố mẹ được chọn tạo ở nhiều cơ quan nghiên cứu nông nghiệp như: Mian 2A, D702A, Bức khôi 838, Thục khôi 527, Miên khôi 725....( Tứ Xuyên), Y hoa Nông A, Quảng khôi 128...(Quảng đông), Peiai 64s, Xiang 125S, Zhu1S, II-32A, Xinxiang 2A....(Hồ Nam), E 9311....(Giang Tô), Minh khôi 86 (Phúc Kiến). Cácdòng bố mẹ này có nhiều ưu điểm như: nguồn tế bào chất bất dục phong phú, khả năng kết hợp cao, khả năng nhận phấn ngoài cao.[7] [12] - Trung Quốc đã chọn tạo thành công một vài tổ họp phù hợp với kiểu siêu lúa lai như: Peiai 64s/E32, liangyou Peijiu (Peiai64/9311), Er you Ming 86(II 32A/Minh khôi) Ngoài ra các nhà khoa học Trung Quốc còn áp dụng nhiều kỹ thuật công nghệ cao như: nuôi cấy bao phấn, chuyển gen..... nhằm đưa các gen quý như: WC, Xa21, gen chịu thuốc trừ cỏ HR vào các dòng bố mẹ làm tăng năng suất, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh, tăng độ thuần của các tổ hợp lai.[12] * Sử dụng genomic ADN từ cỏ Barnyard Grass để tạo ra những nguồn vật liệu mới cho lúa lai. Đoạn DNA có Barnyard được chuyển vào dòng R207 (khẳng định qua phân tích chỉ thị di truyền). * Gen C4 từ ngô đã được phân lập và đang đưa vào lúa lai năng suất cao. Trên cơ sở này siêu lúa lai phấn đấu đạt năng suất 13,5 tấn/ha trên diện rộng vào năm 2010. - Tình hình phát triển lúa lai của các nước khác: Ngoài Trung Quốc, diện tích trồng lúa lai thương phẩm ở các nước tăng nhanh, theo thống kê tính đến năm 2004 các nước lần lượt như sau: - Ấn độ: 560 000 ha, Philippin:192 330 ha và Banglades:40 000 ha. - Ở Mỹ, lúa lai được trồng đại trà từ năm 2000 và đến năm 2004, diện tích lúa lai đã lên tới 43.000 ha, các nước Inđônêsia, Srilanca, Ai Cập, Nhật Bản, Braxin cũng đã trồng lúa lai tuy nhiên diện tích còn ở mức khiêm tốn. - Về năng lực sản xuất hạt lai F1: Trung Quốc đã đạt năng suất bình quân 2.750 kg/ha, Ấn Độ đạt 1.600 kg/ha. Các nước khác năng suất của ruộng sản xuất hạt lai đạt thấp từ 500 – 900 kg/ha. Tuy nhiên, một số công ty tư nhân ở các nước này đạt tương đối khá như: SL. Agritech của Philippines đã đạt năng suất 2.000 kg/ha. Họ đã cơ giới hoá cao độ khâu thu hoạch hạt lúa từ cây mẹ. Mỗi năm SL. Agritech đã sản xuất 1.500 ha/năm.[7] 2.2.1.2. Nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên thế giới Việc sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới triển khai rộng rãi. Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm soát các tính trạng khác nhau đã được định vị thay thế cho những phương pháp đánh giá theo hình thái cổ điển thông thường [16] [17]. Các nhà khoa học ở Trường Đại học Tổng Hợp Cornel (Mỹ) là những người đầu tiên định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa. Trong chương trình genom lúa do Nhật chủ trì, các nhà khoa học đã phát hiện và tách dòng hơn 3000 đoạn ADN bổ trợ. Đến nay đã có khoảng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng [17]. Hiện nay có khoảng 20 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ôn và rầy nâu đã được phát hiện [7] [22]. Ngoài ra gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng... cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống. Nhiều chỉ thị phân tử liên kết với các gen nói trên đã được phát hiện bởi các tác giả trong nước. Ngoài ra, thông qua việc đánh giá đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền, chỉ thị phân tử còn giúp các nhà chọn giống xác định gián tiếp các cặp lai có khả năng cho ưu thế lai.[7] [4] 2.2.2. Các nghiên cứu trong nước 2.2.2.1 Tình hình nghiên cứu lúa lai ở Việt Nam Lúa lai bắt đầu được trồng đại trà ở Việt Nam từ những năm 1990, từ đó đã bắt đầu phát triển nhanh chóng và mạnh mẽ. Động lực thúc đẩy phát triển lúa lai với tốc độ nhanh là sự kết hợp giữa ba yếu tố: tiềm năng ưu thế lai cao về năng suất của giống, sự quan tâm của lãnh đạo và chính sách khuyến khích của nhà nước, và yêu cầu bức xúc lương thực của nông dân. Chỉ trong 5 năm đầu phát triển, tuy năng suất chưa thật cao nhưng tốc độ phát triển bình quân diện tích và sản lượng đều đạt trên 55% Bảng 1.1: Sự phát triển của lúa lai trong 5 năm 1992 – 1996 1992 1996 Tốc độ phát triển bình quân (%) Diện tích (ha) 11.340 102.800 + 55,5 Năng suất (tấn/ha) 6,66 6,58 - 0,2 Sản lượng (tấn) 75.525 677.172 + 55,3 (Nguồn: Website: Diện tích lúa lai cộng dồn trong vòng 5 năm đạt trên 280 ngàn héc ta, góp phần tăng them 350 ngàn tấn thóc do khai thác ưu thế lai của giống, chiếm 13% sản lượng thóc tăng trong 5 năm này, trong khi tỷ lệ lúa lai chỉ chiếm 2,2%. Năng suất bình quân chung của lúa lai trong giai đoạn này đạt 6,32 tấn/ha, tăng 3,12 tấn/ha so với lúa thường giai đoạn này. [12] Từ 1997 – 2001, khi lúa lai đã có diện tích vài trăm ngàn héc ta, vẫn được duy trì nhịp độ phát triển cao, bởi vì nông dân hiểu rõ lúa lai là biện pháp kỹ thuật tạo ra bước đột phá về năng suất, sản lượng, giúp cho họ thoát hiểm về lương thực Bảng 1.2: Sự phát triển của lúa lai trong giai đoạn 1997 – 2001 1997 2001 Tốc độ phát triển bình quân (%) Diện tích ( ha) 187.700 438.700 + 23,6 Năng suất lúa (tấn/ha) 6,35 5,85 - 0,2 Sản lượng (tấn) 1.191.895 2.763.711 + 23,4 (Nguồn: Website: Như vậy, sau 10 năm phát triển lúa lai chiếm gần 6% diện tích gieo trồng lúa trên cả nước, trên 18% diện tích gieo trồng ở miền Bắc.[12] Năm 2003, năm thứ 12, Việt Nam mở rộng gieo cấy lúa lai ra sản xuất đại trà , cũng là năm có diện tích và năng suất lúa cao nhất từ trước đến nay. Năm 2004 tổng diện tích lúa lai là 577.000 ha với năng suất là 6.04 tấn /ha. Từ năm 2005 đến 2007 mỗi nămdiện tích lúa lai là : 600-650.000 ha. - Thông qua dự án giống giai đoạn 2000-2006, mỗi năm các cơ sở nghiên cứu và sản suất giống trong nước đã nhân thuần và đưa vào sản suất 70-80 tấn giống bố mẹ lúa lai. Đây là sự đóng góp quan trọng để Việt nam tự sản suất được 3.500-4000 tấn giống/năm trong giai đoạn 2000-2003 - Kết quả lai tạo các dòng TGMS, PGMS mới cho phát triển lúa lai 2 dòng ở Việt nam: + Thông qua nhập nội, lai hữu tính, nuôi cấy hạt phấn, đột biến, kết hợp với lai tạo và chọn lọc truyên thống, các viện nghiên cứu đã tạo ra nhiều dòng TGMS mới đang được sử dụng ở nhiều mức độ khác nhau: 103S, TiS-96 đang được khai thác để sản suất hạt lai cho các tổ hợp VL20, TH3-3, TH3-4, các dòng AMS27A, AMS30, AMS31S, AMS32S, AMS33S đang là mẹ của nhiều tổ hợp lúa lai 2 dòng rất triển vọng như: HYT 103 (AMS30S/R103), HYT 100 (AMS30S/GR10), AMS29S/R1025, AMS30S/R253, AMS30S/9311, 25A/KB1, năng suất 7,5-8tấn/ha, có thời gian sinh trưởng ngắn (100-110 ngày trong vụ mùa và 120-125 ngày trong vụ xuân muộn), rất có triển vọng ở các tỉnh phía Bắc và Bắc trung bộ.[4] [7] [12] + Trong đề tài nghiên cứu lúa lai giai đoạn 2001-2005, một chương trình lai tạo các dòng TGMS mới được thực hiện giữa 29 giống lúa thuần thấp cây có nhiều đặc điểm tốt ở Việt Nam: Khang Dân 18, CR203, các dòng 25B, II-32B, BoB, Quế 99, Trắc 64 với các dòng TGMS đã đựoc chọn lọc từ các thế hệ lai lại khác nhau, hàng chục dòng TGMS đã thuần, có thời gian sinh trưởng ngắn thấp cây, có đặc tính nở hoa tốt, bất dục đực ổn định trong điều kiện Việt nam được chọn tạo ở các đơn vị nghiên cứu như: 25S, KimS, BoA, II-32S . . . Đây là nguồn vật liệu quan trọng đã được tiếp tục hoàn thiện để tạo ra những tổ hợp lúa lai 2 dòng mang thương hiệu Việt nam giai đoạn 2006-2010. [12] * Kết quả lai tạo những giống lúa lai mới: Trong 7 năm, từ 2000-2007 đã lai tạo và sản suất thử nghiệm nhiều tổ hợp lúa lai có triển vọng. Các tổ hợp lúa lai tốt nhất đã được công nhận và đưa vào sản suất đại trà ở các mức độ khác nhau như: Các tổ hợp lúa lai 3 dòng: Tổ hợp HYT83: (IR58025A/RTQ5), Tổ hợp HYT 100: (IR58025A/R100), Tổ hợp chất lượng cao HYT92: (IR58025A/PM3).[4] [7] Các tổ hợp lúa lai hai dòng: VL20: (103S/R20), Tổ hợp 2 dòng TH3-3 (T1S-96/R3), Tổ hợp TH3-4: (T1S-96/R4), Tổ hợp HC1: (103S/R6) , Tổ hợp HYT102: (AMS30S/GR10), Tổ hợp HYT 103: (AMS30S/R103) [4] [7] 2.2.2.2. Nghiên cứu về chỉ thị phân tử ở Việt Nam - Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống cũng được triển khai và thu được những kết quả khả quan. Tại một số Viện nghiên cứu và trường ( Đại học Nông Nghiệp I, Viện Di truyền Nông Nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viên Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long,...) đã triển khai sử dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ gen kháng đối với một số cây trồng chính, trong đó có nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá đối với cây lúa [10]. Đã có những báo cáo về ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá, và đã có một số dòng kháng có triển vọng được tạo ra bằng kỹ thuật này.[11] - Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu sử dụng chỉ thị phân tử để xác định lập bản đồ và chuyển những gen kháng đạo ôn vào những giống có tính trạng ưu việt. Phạm Thị Bảy và cộng sự (2000) đã phân tích phân tử AND của các dòng lúa chọn lọc đã phát hiện dòng B12 mang đoạn AND dài 1200bp là đoạn AND liên kết chặt với gen kháng Pi-2(t) và dòng B12 kháng 100% với 4 nòi nấm lây bệnh. [1] Tuy nhiên cho đến nay ngoài đề tài chọn tạo giống kháng bạc lá với lúa thuần của Viện Di truyền, chưa có đề tài nghiên cứu chọn tạo giống lúa lai kháng với bệnh bạc lá nhờ ứng dụng công nghệ sinh học. Ở Việt nam việc nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng rầy nâu. Lần đầu được tiến hành tại Viện lúa đồng Bằng sông Cửu Long, Nguyễn Thị Lang và ctv. (1999) đã sử dụng STS để phân tích sự du nhập gen kháng rầy nâu từ loài hoang dại Oryza australiensis vào giống lúa trồng Oryza sativa L. (IR31917-45-3-2).[7] Ở Việt Nam, Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang và cộng sự đã lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng rầy nâu bphX, bph4, Bph6 và phát hiện được 1 loạt chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các gen kháng đó. Ngoài ra Nguyễn Thị Lang với sự cộng tác của các tác giả thuộc Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI đã thành công trong việc lập bản đồ gen kháng Bph10 – 1 gen kháng tốt đối với quần thể rầy nâu thuộc đồng bằng Sông Cửu Long. [7] Ngoài ra các nhà khoa học nước ta cũng đã thu được những kết quả khác trong việc ứng dụng công nghệ sinh học nghiên cứu lúa lai như: xác định và lập bản đồ gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ. tgms-VN1 là gen bất dục mẫn cảm nhiệt độ đã được xác định trên nhiễm sắc thể số 2, liên kết với marker E5/M12-600 [5]. Ứng dụng marker phân tử cho gen chống chịu mặn trên bộ giống lúa cải tiến. [8] Nuôi cấy bao phấn làm thuần nhanh các dòng lúa lai bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ (TGMS). Nuôi cấy bao phấn chọn dòng TGMS mới phục vụ phát triển lúa lai ở Việt Nam [14]. Tác giả đã chọn và xác định được một số dòng TGMS mới có triển vọng như: BioMS 2, BioMS10. Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu - Dòng mẹ IR58025A là dòng bất dục đực tế bào chất được chọn tạo tại IRRI - Dòng bố R100 dòng mang gen phục hồi là dòng được nghiên cứu chon tạo tại Trung tâm nghiên cứu lúa lai, Viện cây lương và cây thực phẩm. - Quần thể F2 giống HYT100 của tổ hợp lai giữa IR58025A/R100 Việc lai tạo quần thề F2 được áp dụng theo phương pháp lai tạo lúa lai ba dòng của IRRI lai giữa dòng bất dục đực tế bào chất (CMS) AMS20A (IR58025A) với dòng bố R100. Dòng mẹ AMS20A là một trong 60 dòng CMS nhập nội được chọn lọc cá thể theo phương pháp lai  cặp để chọn cá thể có độ bất dục ổn định. Dòng bố R100 được chọn lọc trong các giống lúa thuần hiện có của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển lúa lai. R100 là dòng bố mang gen phục hồi hữu dục đực tế bào chất . Giống lúa HYT-100 được công nhận là giống lúa tạm thời từ năm 2005. - 44 dòng phục hồi triển vọng bao gồm: R7, BB4/4492, IR35, BB11/RTQ5, RV268, BB5/Q99, R286, IR29, BB15/Tr64, R119, IR30, RCT, AH, N19, R544, GR10, D16, S. Thanh, CC/RTQ5, CB/RTQ5, BB5/R23, CB/Đ. Thanh, BB4/RTQ5, D47, D19, BB4/Q99, RV114, BB13/R838, CC/R838, R725, BB11/Đ. Thanh, R280, BB11/R23, DT57, IR78, BB14/R242, BB15/TR64, BC15, BB60, BoB, KimB, 25B – B, II32B, Q99. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu: - Trung tâm nghiên cứu và phát triển lúa lai, Viện cây lương thực và thực phẩm, Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam. - Phòng sinh học phân tử Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam. 3.2. Nội dung nghiên cứu. - Nghiên cứu di truyền và cơ chế tác động giữa gen phục hồi hữu dục đến dòng bất dục đực tế bào chất - Nghiên cứu xác định liên kết của các chỉ thị phân tử với gene phục hồi phục vụ trong công tác chọn tạo lúa lai - Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các dòng mang gen phục hồi hữu dục đực tế bào chất 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng - Bố trí thí nghiêm và đánh giá các chỉ tiêu theo phương pháp nghiên cứu lúa lai của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI). - Bố trí thí ngiệm ngoài đồng ruộng + Thời vụ: Vụ xuân năm 2009 + Các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại. + Cấy 1 dảnh, mật độ 45 khóm/m2 + Cây cách cây 11 cm, hàng cách hàng 18 cm. + Bón phân và chăm sóc như đại trà. - Thu nhận mẫu là của quần thể theo nguyên tắc ngẫu nhiên hoàn toàn, lấy 100 mẫu lá của 100 cây được đánh số ngẫu nhiên. - Thu lá của 44 dòng phục hồi triển vọng để lựa chọn một số dòng tốt. - Phương pháp đo đếm một số chỉ tiêu nông sinh học trên cây lúa theo tiêu chuẩn của Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) [13] 3.3.2. Tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị phân tử 3.3.2.1. Kỹ thuật tách chiết và tinh sạch DNA. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá theo phương pháp CTAB cải tiến. DNA lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến ( của phòng thí nghiệm trường đại học Ghent, Vương quốc Bỉ). A. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA + Dung dịch đệm chiết ( extraction buffer) gồm có các thành phần theo bảng sau: Bảng 3.1: Thành phần dung dịch đệm EB (extraction buffer) Thành phần Thể tích (V= 100ml) dH2O (Nước cất khử ion) 63 ml Tris HCl 1M; pH= 8.0 10 ml EDTA 0.5M; pH= 8.0 10 ml NaCl 5M 10 ml β – Mercaptol ethanol 7 µl + Dung dịch CTAB Buffer và TE ( 10:0,1) Bảng 3.2: Thành phần dung dịch CTAB buffer Đệm CTAB Thể tích (V=500ml) CTAB 10 g EDTA 0.5M; pH= 8.0 50 ml NaCl 5M 200 ml TrisHCl 1M;pH= 7.5 100 ml dH2O ( nước cất hai lần) 150 ml Bảng 3.3: Thành phần dung dịch TE (10:0,1) Đệm TE (10:0.1) Thể tích (V= 100 ml) TrisHCl 1M; pH= 8.0 1000 µl EDTA 0.5M; pH= 8.0 20 µl dH2O 98.8 ml + Dung dịch SDS (Sodium dedoxyl sulfat) 10% + Ethanol 96% + Ethanol 70% + Isopropanol alcohol + Chloroform : Isomyl alcohol (24:1) + Rnase (10mg/ml) B. Các bước tách chiết DNA - Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai – Maroof ( năm 1984). Phương pháp này cho DNA có chất lượng cao, rẻ tiền nhưng tốn nhiều thời gian hơn so với các phương pháp khác. Quy trình thực hiện gồm các bước: Bước 1: Lá của các dòng, giống lúa nghiên cứu được cắt và lấy mẫu vào các ống eppendorf 1,5ml để trong đá lạnh để giữ cho lá được tươi. Lá được lấy vào buổi sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzyme hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết DNA. Bước 2: Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf hoặc trong cối, đến khi thành dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng. Bước 3: Cho mẫu đã nghiền mịn vào trong ống eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết EB (extraction buffer) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50µl SDS 10%. Bước 4: Đặt vào thiết bị ủ trong 30 phút ở 65oC, thỉnh thoảng đảo cho dung dịch được trộn đều. Bước 5: Ly tâm 13500 vòng/ phút trong 20 phút. Bước 6: Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang 1 eppendorf mới thêm 1ml Isopropanol alcohol rồi để vào tủ 4oC cho kết tủa khoảng 30 phút ( hoặc qua đêm), không để vào tủ lạnh sâu – 20oC vì sẽ gây hiện tượng kết tủa muối. Bước 7: Ly tâm 13500 vòng/ phút trong 25 phút. Bước 8: Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại phần kết tủa ở dưới đáy eppendorf. Cho 400 µl đệm TE ( 10:0.1) cho vào tủ ấm 65oC ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hòa tan tủa, có thể giữ ở 4oC qua đêm. Bước 9: Cho 3 µl Rnase ( 10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC trong 3 tiếng. Bước 10: Thêm 400 µl đệm CTAB, đặt vào nhiệt độ 65oC trong 15 phút thỉnh thoảng trộn, lắc đều. Bước 11: Cho vào tủ hút thêm 800 µl Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein. Bước 12: Ly tâm 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong eppendorf tách thành hai phần. Bước 13: Sử dụng pipet hút chuyển phần dịch nổi ở phía trên sang 1 eppendorf mới. Nếu chưa sạch có thể chiết lại lần hai bằng Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) Bước 14: Thêm 2.5 lần thể tích Ethanol 96% và cất giữ trong tủ lạnh sâu (-20oC). Bước 15: Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút. Loại bỏ cồn để giữ lại phần tủa trắng ở đáy ống. Bước 16: Rửa tiếp bằng 400 cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Bước 17: Đổ cồn đi giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10 phút làm khô kết tủa (DNA), sau đó cho 100µl TE (10:0,1) vào mỗi eppendorf hòa tan kết tủa. Bước 18: Giữ DNA trong tủ lạnh sâu ( -20oC) để sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2.2. Nhân DNA bằng kỹ thuật PCR với các mồi SSR. Các chu trình của phản ứng PCR với các mồi SSR + Bước biến tính: Ở chu kỳ đầu tiên biến tính mẫu DNA ở nhiệt độ 94oC trong 5 phút 30 giây. + Bước gắn mồi: thực hiện ở nhiệt độ 55oC trong 30 giây. + Bước tổng hợp ở nhiệt độ 72oC trong 30 giây. Bảng 3.4: Thành phần phản ứng PCR cho một mẫu Thành phần Thể tích ( µl) DNA 5 10x buffer 2 dNTPs 1 Mồi (primer) 1 Taq polymerase 0,06 Nước cất 2 lần 11,64 Tổng thể tích 20 Hình 3.1: Sơ đồ chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Thực hiện các bước trên với 35 chu kỳ sau đó ở chu kỳ cuối cùng chạy thêm bước 72oC trong 7 phút sau đó bảo quản ở 4oC. Sau khi chạy PCR xong cất giữ mẫu ở 4oC. Trước khi đem phân tích cần phải nhỏ thuốc nhuộm (loading dye) vào các mẫu, sau đó đưa vào máy PCR gây biến tính ở 94oC trong 5 phút sau đó bỏ ra để ngay vào đá lạnh rồi tiến. hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di. 3.3.2.3. Phân tích kết quả PCR bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide A. Chuẩn bị bản gel: Lau 2 tấm kính 1 tấm lớn và 1 tấm nhỏ. Lau 2 lần bằng nước cất khử trùng và 2 lần bằng cồn 70%. Sau đó, lau kính lớn với 300 µl dung dịch Glass coat, kính nhỏ lau với 300 µl dung dịch Glass bind. Để sau 5 phút, lau lại kính lớn bằng giấy sạch, riêng với kính nhỏ lau lại bằng cồn 70% và ghép 2 kính lại. Pha gel acrylamide: Các hóa chất dùng để pha acrylamide phải giữ trong tủ lạnh 4oC. Sau khi lau kính xong, lấy các hóa chất ra pha: Bảng 3.5: Thành phần gel polyacrylamide cho một bản gel. Thành phần Thể tích (µl) Polyacrylamide 4% 20 ml TEMMED 19 ml APS 190 ml Cho các hóa chất vào cốc, lắc đều, sau đó đổ nhanh tay vào tấm kính đã ghép, cài tấm lược để tạo lỗ giếng, lấy thăng bằng cho bản gel. Sau đó chờ 1 – 2 tiếng để bản gel đông lại. Trước khi tra mẫu PCR vào bản gel cần phải đưa tấm kính vào máy điện di chạy trước 10 – 20 phút để bản gel nóng lên sau đó mới được tra mẫu vào giếng. B. Kỹ thuật nhuộm bạc bản gel polyacrylamide Chuẩn bị các dung dịch nhuộm: *) Dung dịch cố định, dừng phản ứng (Fix, Stop solution) gồm: 100 ml dung dịch Glacial acetic acid và 900ml nước cất. *) Dung dịch hỗ trợ (Enhancing solution): pha 1,5 ml Enhancing 100% vào 1 lít nước khuấy đều. *) Dung dịch nhuộm (Staining solution) gồm: 1g bạc nitrat ( AgNO3) vào 1l nước cất, sau đó trước khi nhuộm bổ sung thêm 1,5 ml formaldehyd 37%. *) Dung dịch hiện (Developing solution): hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1l nước cất và để lạnh ở 4oC. Trước khi sử dụng cho thêm 1,5 ml formaldehyd 37% và 200µl natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O). Tiến hành nhuộm *) Sau khi chạy điện di xong, tháo lấy tấm kính nhỏ có bám bản gel để tiến hành nhuộm. *) Cố định gel: đặt tấm kính vào khay sao cho mặt có bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định, dừng phản ứng ( Fix, Stop solution) vào để khoảng 20 – 30 phút. *) Tăng khả năng bắt màu: Chuyển tấm kính từ dung dịch cố định sang dung dịch hỗ trợ, để khoảng 20 – 25 phút. *) Rửa tấm kính: cho tấm kính vào nước cất trong 2 – 3 phút, rửa như vậy 2 lần. *) Nhuộm bản gel: Sau khi rửa sạch tấm kính chuyển sang dung dịch nhuộm ( Staining solution), nhuộm trong khoảng 25 – 30 phút. Sau đó bỏ ra tráng qua nước cất khoảng 10 giây. *) Hiện bản gel: cho bản gel vào dung dịch hiện (Developing solution) đã được để lạnh ở 4oC. Chú ý quan sát đến khi nào các băng DNA xuất hiện thì kết thúc phản ứng. *) Cố định bản gel: Chuyển tấm kính sang dung dịch cố định/dừng phản ứng trong 5 – 10 phút. *) Rửa lại tấm kính bằng nước cất 3 – 5 phút, để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả. Chú ý: Tất cả các bước đều được thực hiện trên máy lắc với tốc độ 75 – 90 vòng/phút. - Phân tích chỉ thị phân tử SSR của quần thể F2 theo phương pháp của Panaud và cộng sự (năm 1996). - Phương pháp chọn lọc chỉ thị phân tử liên kết với gen phục hồi IR58025A x R100 (P1) ¯ (P2) Phenotyping, genotyping ← F2 ← F1 x P2 ¯ BC1F1 ¯ BC1F2 Genotyping, phenotyping ¯ BC1F3 Phenotyping (Khẳng định lại liên kết markers phân tử với gen phục hồi) Hình 3.2: Sơ đồ chọn chỉ thị phân tử cho gen phục hồi Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân tích di truyền của tính trạng phục hồi hữu dục. Sự di truyền của tính trạng phục hồi được đánh giá thông qua sự phân ly của quần thể F2 tương ứng. Các thí nghiệm về phân tích sự di truyền của tính trạng phục hồi trong nghiên cứu này được thực hiện trên 100 cá thể được đánh số ngẫu nhiên trong quần thể F2 của tổ hợp lai IR58025A và R100. Để đánh giá sự phân ly di truyền của tính trạng phục hồi, đặc tính hữu dục và bất dục của quần thể F2 luôn được đánh giá và phân tích cùng với dòng bố mẹ tương ứng và trong cùng một điều kiện môi trường như nhau. Để đánh giá chính xác di truyền tính phục hồi hữu thụ chúng tôi sử dụng 100 cá thể trong quần thể F2, chúng tôi tiến hành theo dõi thời gian sinh trưởng, đến giai đoạn trổ bông, tiến hành cách ly 100 cá thể đã được lựa chọn bằng cách bao kín các bông lại. Đến khi hạt chín thu hoạch đưa về phòng tiến hành đo đếm và tính toán các số liệu. Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 để tính toán chỉ số X2 qua đó đưa ra kết quả phân tích sự di truyền của tính trạng phục hồi bất dục đực tế bào chất. Bảng 4.1: Kết quả phân tích sự di truyền của tính trạng phục hồi Đối tượng theo dõi Số cây hữu dục Số cây bất dục IR58025A 0 30 R100 30 0 Quần thể F2 của tổ hợp lai IR58025A/R100 Phân ly thực nghiệm 72 28 Phân ly lý thuyết 75 25 X2 X2= 0,48 Bảng 4.1 chỉ ra kết quả phân ly ở quần thể F2 là xấp xỉ tỷ lệ 1:2:1 đúng theo quy luật của Menden, chỉ số X2 =0,48 là đủ độ tin cậy, sự sai khác giữa thực nghiệm và lý thuyết là chấp nhận được. Hơn thế nữa, những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng tính trạng phục hồi là tính trạng đơn gen. Như vậy, có thể kết luận rằng tính trạng phục hồi là tính trạng đơn gen và di truyền theo định luật của Menden. 4.2 Kết quả tách chiết và tinh sạch mẫu DNA thu nhận từ lá. Ngày nay, với các kỹ thuật hiện đại và sự phát triển của các loại thiết bị máy móc trở thành một công cụ đắc lực giúp các nhà nghiên cứu tách chiết DNA một cách nhanh chóng, dễ dàng, các mẫu DNA nguyên vẹn, chất lượng DNA tốt, nồng độ cao. Mặc dù ra đời từ khá lâu, tuy nhiên phương pháp tách chiết DNA bằng Chlorofrom – CTAB vẫn được sử dụng rộng rãi và đến nay đã được cải tiến để trở nên ưu việt hơn. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp CTAB có cải tiến để tách chiết mẫu DNA từ lá các dòng bố mẹ cũng như các cá thể trong quần thể thí nghiệm. Tách chiết, tinh sạch DNA là bước đầu tiên trong quá trình làm thí nghiệm. Thao tác này đóng vai trò tiên quyết trong cả quá trình thí nghiệm, bởi nếu không có được mẫu DNA tốt, các bước tiếp theo của thí nghiệm có làm tốt đến đâu thì cũng không thể cho kết quả như ý muốn được. Các mẫu lá của dòng mẹ IR58025A và dòng bố R100 mang gen tương hợp rộng, quần thể F2 của tổ hợp lai IR58025A/R100 và 44 dòng phục hồi có triển vọng ( Nguồn vật liệu do Trung tâm nghiên cứu và phát triển lúa lai – Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm cung cấp). Thu các mẫu lá lúa 3 tuần tuổi. Sau khi tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB có cải tiến, các mẫu DNA thu được sẽ được tinh sạch và kiểm tra bằng cách điện di trên gel Agarose 0,8% cùng với DNA chuẩn nồng độ. Chỉ khi nào DNA còn nguyên vẹn và đủ độ tinh sạch thì các thí nghiệm tiếp theo mới thực hiện được. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Chú thích: 8: DNA Chuẩn nồng độ 200ng/µl 1 – 17: Các dòng của quần thể F2 Hình 4.1: Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của DNA trên gel Agarose. Hình 4.1 cho thấy, số băng xuất hiện ít chứng tỏ DNA còn nguyên vẹn, các băng hiện lên rõ ràng. Như vậy, mẫu DNA tách chiết đều đạt yêu cầu để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả tách chiết DNA cho thấy DNA có chất lượng tốt, nồng độ trong khoảng từ 200 – 300ng/ml khi so sánh với lambda DNA chuẩn nồng độ 200ng/ml giếng số 8. DNA không bị đứt gãy, việc loại bỏ RNA bằng RNase tiến hành khá tốt thể hiện các băng điện di gọn, sáng rõ. Sau khi tách chiết, tinh sạch DNA đảm bảo đủ độ tinh sạch, bước tiếp theo cần thiết là kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR có chính xác hay không, nghĩa là đoạn DNA được nhân lên trong phản ứng PCR có phải là đoạn quan tâm hay chỉ là một đoạn bắt cặp tương đồng nào đó. Sau khi có DNA tổng số và xác định được nồng độ, tiến hành pha loãng lại để được nồng độ DNA từ 10 – 20 ng/ml. Làm phản ứng với các mồi nghiên cứu và kiểm tra trên gel agarose 0,8% với đệm TBE 0,5x. Kết quả kiểm tra được minh họa ở hình 4.2 và Hình 4.3. Kết quả cho thấy phản ứng PCR được tiến hành khá tốt, các băng sáng rõ và gọn tương đối đồng đều đúng kích thước khi so sánh với thang chuẩn (ladder), có thể tiến hành phân tích trên gel polyacrylamide với những đoạn DNA có sự sai khác về kích thước nhỏ. Sau khi có kết quả điện di trên gel agarose phản ứng PCR có kết quả tốt, tiến hành điện di trên gel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 polyacrylamide 4,5%. Chú thích: 10: Thang chuẩn 1kb 1 – 17: Các dòng quần thể F2 Hình 4.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi RM258 Chú thích: 9: Thang chuẩn 1kb 1 – 17: Các dòng quần thể F2 Hình 4.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi RM171 Sự đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình DNA giữa các dòng cho gen và nhận gen với chỉ thị liên kết chặt là điều kiện tiên quyết để có thể sử dụng MAS trong phát hiện sự có mặt của gen phục hồi trong các thế hệ lai sau này. 4.3. Xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen phục hồi. 4.3.1. Thu thập chỉ thi phân tử sử dụng trong nghiên cứu xác định chỉ thị liên kết gen phục hồi Các nghiên cứu về gen phục hồi hữu dục trên thế giới đã chỉ ra chính xác vị trí của các locus phục hồi trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 32 chỉ thị SSR để kiểm tra sự đa hình giữa dòng mẹ IR58025A và dòng bố R100 mang gen phục hồi hữu dục hạt phấn. Tất cả các chỉ thị phân tử được đặt mua tại hãng Sigma Genosis, Hoa Kỳ. Bởi chị thị SSR rất đặc trưng cho từng locus cho nêu việc thiết kế mồi rất khó khăn và tốn kém. Tiến hành chạy PCR với các mồi SSR theo quy trình đã nêu ở phần trên. Bảng 4.2: Thông tin về các chỉ thị phân tử SSR sử dụng để chạy kiểm tra sự đa hình. TT Chỉ thị SSR NST Mồi xuôi Mồi ngược Kích thước đoạn nhân Nhiệt độ gắn mồi 1 RM1201 1 TTACCGCGCCACATATACAC CGTACGAGCCCTAGTTACCG 186 55 2 RM3627 1 GGCTACTCGAGCAAGCTCTG ACCTACCCGTCATCCCTCTC 116 50 3 RM3740 1 ATCCCAACTCTAAGCCACCC CTACCCGTCACCAACTCACC 135 50 4 RM315 1 CGGTCAAATCATCACCTGAC CAAGGCTTGCAAGGGAAG 133 55 5 RM3148 1 GACTATTGCTCGAACACTTTG TTGTCTGCTTTGGTATTTGC 166 55 6 RM443 1 GGGAGTTAGGGTTTTGGAGC TCCAGTTTCACACTGCTTCG 124 55 7 RM3865 2 AACCATGGACAGTTGAACAC CTCCGACAAGAACTTCCTC 223 55 8 RM5699 2 ATCGTTTCGCATATGTTT ATCGGTAAAAGATGAGCC 167 55 9 RM7426 2 TGACATGGATCGATCAGCTC ATAAGGGTACGGGGAACCAG 139 55 10 RM6318 2 TGCTGCTTCTGTCCAGTGAG GGATCATAACAAGTGCCTCG 199 55 11 RM525 2 AGAGTTATGAGCCGGGTGTG GATTTGGCGATCTTAGCAGC 131 55 12 RM497 2 AAGATGTACGGGTGGCATTC TATGAGCTGGTGAGCAATGG 214 55 13 RM1942 2 CTGCTCAATGATACAGGA GGCATCCACTAAATTTAGATA 132 55 (Nguồn: Website: Bảng 4.2: (Tiếp) TT Chỉ thị SSR NST Mồi xuôi Mồi ngược Kích thước đoạn nhân Nhiệt độ gắn mồi 14 RM1358 2 GATCGATGCAGCAGCATATG ACGTGTGGCTGCTTTTGC 180 55 15 RM5688 4 GCAGTGTCCAACCATCTGTG ATCTGGTCACCCTTTGCTTG 150 55 16 RM3345 5 AGTGTCCCCTTTTCTCTCCC GCTTCTTTGCTTCCTATGGG 116 55 17 RM6836 6 TTGTTGTATACCTCATCGAC AGGGTAAGACGTTTAACTTG 240 55 18 RM6344 7 ACACGCCATGGATGATGAC TGGCATCATCACTTCCTCAC 111 55 19 RM8043 8 ACTTTCTAACATATTAACCA TAAGATTTTCTAGCATTATC 100 55 20 RM288 9 ATGCCGCCAGTGAATAGC CTGAGAATCCAATTATCTGGG 125 55 21 RM1553 9 AATTAGAGGGTCCACATGTC ATTACCCTCATTTTCTACGC 161 55 22 RM591 10 CGGTTAATGTCATCTGATTGG TTCGAGATCCAAGACTGACC 258 55 23 RM258 10 GCATGGCCGATGGTAAAG TGTATAAAACCACACGGCCA 148 55 24 RM3123 10 ATTTCCCACACATCTCGCTG GTGTCGCCGGTCAAGAAC 191 50 25 RM5271 10 CGGTGTAGATTGTAGGTACA GTAGTTTAGTTATTGCGCAC 184 55 26 RM171 10 CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTG CGCCGGATGTGTGGGACTAGCG 328 55 27 RM7376 12 TCACCGTCACCTCTTAAGTC GGTGGTTGTGTTCTGTTTGG 195 55 28 RM491 12 CCATGGCCTGAGAGAGAGAG AGCTAAATGGCCATACGGTG 263 55 29 RM1261 12 GTCCATGCCCAAGACACAAC GTTACATCATGGGTGACCCC 167 50 30 RM7003 12 GGCAGACATACAGCTTATAGC TGCAAATGAACCCCTCTAGC 101 55 31 RM6123 12 TCGCCATTGCTCCTCCTC ACTCTCTCCTCTCCCCTTCG 68 61 32 RM179 12 CATAGTGGAGTATGCAGCTGC CCTTCTCCCAGTCGTATCTG 190 55 (Nguồn: Website: Chúng tôi tập trung vào nghiên cứu gen phục hồi trên các nhiễm sắc thể của cây lúa, kết hợp với việc tham khảo các nghiên cứu trước đây, để xác định vùng mang gen phục hồi trên các nhiễm sắc thể, sau đó lựa chọn và thiết kết các chỉ thị liên kết với gen phục hồi. Chỉ thị SSR dựa trên các trình tự lặp lại đặc hiệu cho từng cá thể, vì thế việc thiết kế mồi cho vùng gen quan tâm gặp nhiều khó khăn. Sau khi tiến hành chạy PCR chúng tôi kiểm tra độ chính xác của phản ứng bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 0,8 – 1,2% để kiểm tra kích thước các đoạn PCR với (ladder) thang chuẩn. Kết quả ở hình 4.2 và hình 4.3 cho thấy phản ứng PCR cho kết quả chính xác. Đoạn DNA đích được nhân lên đúng với kích thước của mồi. Bảng 4.2 đưa ra thông tin tương đối đầy đủ về các chỉ thị phân tử SSR được sử dụng trong nghiên cứu. Thông tin của các chỉ thị phân tử được tìm kiếm trên trang website nghiên cứu, trang website này là một công cụ hữu hiệu giúp các nhà nghiên cứu có thể tìm chính xác các thông tin và các bài báo liên quan đến các chỉ thị phân tử cần quan tâm. Khi đã có đầy đủ thông tin về các chỉ thị phân tử, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR các chỉ thị này với vật liệu nghiên cứu là dòng mẹ bất dục đực IR58025A và dòng bố R100 mang gen phục hồi để xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen quy định tính trạng phục hồi hữu dục hạt phấn Chú thích: 1: Dòng IR58025A 2: Dòng R100 Hình 4.4a: Kết quả điện di xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen phục hồi Chú thích: 1: Dòng IR58025A 2: Dòng R100 Hình 4.4b: Kết quả điện di xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen phục hồi Kết quả cho thấy có các chỉ thị SSR RM258, RM171, RM591, RM3123, RM5271 và RM6100 cho kết quả đa hình giữa dòng bố mẹ. 4.3.2. Kết quả xác định chỉ thị phân tử liên kết gen phục hồi hữu dục đực tế bào chất trên quần thể F2 . Trong thí nghiệm này, chúng tôi thu mẫu lá của 40 cá thể thuộc quần thể F2 (Nguồn vật liệu của Trung Tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Lúa Lai) cùng với dòng mẹ IR58025A và dòng bố R100. Những chỉ thị phân tử cho đa hình giữa dòng mẹ IR58025A và dòng bố R100 được sử dụng chạy kiểm tra di truyền các cá thể trong quần thể F2 để xác định liên kết của CTPT với gen phục hồi bất dục đực tế bào chất. Kết quả bảng 9 cho thấy các chỉ thị phân tử SSR RM258 và RM171 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen phục hồi. Sử dụng các chỉ thị SSR kết quả đa hình với gen phục hồi bất dục đực tế bào chất giữa 2 dòng bố mẹ để kiểm tra kiểu gen của quần thể F2. (Xem kết quả ở hình 4.4a và hình 4.4b). Bảng 4.3: Kết quả phân tích sự đồng phân ly giữa kiểu hình và kiểu gen của chỉ thị SSR cho gen phục hồi bất dục đực tế bào chất trong quần thể F2 Stt RM258 RM171 Tỷ lệ đậu hạt (%) Tỷ lệ hạt phấn hữu dục (%) 1 2 2 85,8 99 2 1 1 3,2 2 3 3 3 96,6 99 4 1 1 1,6 3 5 2 2 98,2 99 6 2 2 99,0 99 7 1 1 2,0 5 8 2 3 99,0 99 9 2 2 90,6 85 10 2 2 98,8 99 11 1 1 2,7 2 12 2 2 93,3 96 13 2 2 95,0 97 14 3 3 97,1 98 15 3 3 98,3 99 16 2 2 90,7 98 17 2 2 95,7 98 18 2 2 98,1 99 19 1 1 1,0 2 20 2 2 91,2 99 Bảng 4.3: (Tiếp) Stt RM258 RM171 Tỷ lệ đậu hạt (%) Tỷ lệ hạt phấn hữu dục (%) 21 2 3 94,7 99 22 2 2 95,8 99 23 3 2 99,0 98 24 2 3 98,1 98 25 1 1 2,2 3 26 1 1 3,2 1 27 3 3 98,7 99 28 3 2 96,4 99 29 2 2 89,8 65 30 2 2 92,0 90 31 3 3 97,5 40 32 2 2 92,6 70 33 3 3 97,2 95 34 3 3 99 99 35 1 1 2,3 5 36 1 1 1,7 2 37 1 2 1,1 1 38 2 2 94,7 95 39 1 1 0,8 0 40 1 1 1,9 3 Kết quả chạy điện di kiểm tra kiểu gen của quần thể F2 cho thấy, các dòng phân ly theo dòng bố là các dòng có mang gen phục hồi. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận 2 chỉ thị phân tử SSR là RM171 và RM258 là các chỉ thị cho kết quả đa hình rõ ràng nhất trong các chỉ thị đã chạy. Hai chỉ thị RM171 và RM258 cho kết quả tương đối giống nhau khi chạy kiểm tra trên quần thể F2. Nói theo cách khác, hai chỉ thị RM171 và RM258 liên kết chặt với gen phục hồi của dòng R100 và khi chạy kiểm tra sự phân ly di truyền ở quần thể F2 thì hai chỉ thị này đã cho kết quả chính xác các dòng mang gen phục hồi. Chú thích: 1: IR58025A 2: R100 3 – 20: Các dòng quần thể F2 Hình 4.5: Kết quả chạy điện di quần thể F2 với marker RM258 Hình 4.6: Bản đồ chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen phục hồi trên nhiễm sắc thể số 10 Các dòng được lựa chọn sẽ tiếp tục được đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học để lựa chọn những dòng phục hồi tốt thực sự cho công tác lai tạo. Sau khi xác định được các chỉ thị liên kết với gen phục hồi, chúng tôi đã xây dựng được bản đồ phân bố các chỉ thị phân tử liên kết với gen phục hồi nằm trên nhiễm sắc thể số 10 hình 4.6. Qua bản đồ này, chúng tôi đã lựa chọn hai chỉ thị liên kết chặt với gen phục hồi là RM258 và RM171 để ứng dụng vào công tác chọn lọc các dòng triển vọng sử dụng làm dạng bố trong các tổ hợp lúa lai. 4.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các dòng phục hồi triển vọng Kết quả chạy với quần thể F2 chỉ ra rằng hai chỉ thị phân tử RM171 và RM258 liên kết chặt với gen phục hồi. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong công tác chọn giống. Điều này giúp các nhà chọn giống giảm thời gian và khối lượng công việc rất nhiều. Chúng tôi tiếp tục sử dụng hai chỉ thị RM171 và RM258 để hỗ trợ chọn lọc các dòng phục hồi triển vọng đang được nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Lúa Lai – Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm. Để xác định những dòng phục hồi triển vọng, chúng tôi đã thu thập được 44 dòng phục hồi để kiểm tra kiểm tra bằng các chỉ thị phân tử. Các mẫu lá non, khỏe mạnh, không có sâu bệnh được thu từ 40 dòng khác nhau ngoài đồng ruộng. Sử dụng các chỉ thị RM258 và RM171 cho kết quả đa hình ở phần 4.3, chạy với các dòng triển vọng này để lựa chọn các dòng có mang gen phục hồi. Sử dụng hai chỉ thị liên kết chặt với gen phục hồi là RM258 và RM171 để kiểm tra trên các dòng phục hồi triển vọng, xác định các cá thể mang gen phục hồi bất dục đực tế bào chất. Kết quả được minh họa ở hình 4.7. Bằng việc sử dụng hai chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen phục hồi là RM258 và RM171 chúng tôi đã chọn lọc được ra các dòng mang gen phục hồi trong số các dòng phục hồi được tuyển chọn và lai tạo qua nhiều thế hệ, các dòng này sẽ được sử dụng làm các dạng bố mẹ trong các tổ hợp lúa lai ba dòng . Đó là các dòng được ghi trong bảng 4.5 Bảng 4.4: Các dòng phục hồi triển vọng Stt Tên dòng Stt Tên dòng 1. R7 23. BB4/RTQ5 2. BB4/4492 24. D47 3. IR35 25. D19 4. BB11/RTQ5 26. RV114 5. RV268 27. BB4/Q99 6. BB5/Q99 28. BB13/R838 7. R286 29. CC/R838 8. IR29 30. R725 9. BB15/Tr64 31. BB11/Đ. Thanh 10. R119 32. R280 11. IR30 33. BB11/R23 12. RCT 34. DT57 13. AH 35. IR78 14. N19 36. BB14/R242 15. R544 37. BB15/TR64 16. GR10 38. BC15 17. D46 39. BB60 18. S. Thanh 40. BoB 19. CC/RTQ5 41. KimB 20. CB/RTQ5 42. 25B – B 21. BB5/R23 43. II32B 22. CB/Đ. Thanh 44. Q99 Chú thích: 1: IR58025A 2: R100 3 – 12: Các dòng phục hồi triển vọng Hình 4.7: Kết quả chạy điện di mồi RM258 với các dòng phục hồi triển vọng Bảng 4.5: Các dòng mang gen phục hồi được chọn lọc bằng chỉ thị phân tử RM258 RM171 Stt Tên dòng Stt Tên dòng 1 R7 5 RV268 3 IR35 6 BB5/Q99 6 BB5/Q99 8 IR29 7 R286 11 IR30 8 IR29 12 RCT 9 BB15/TR64 15 R544 11 IR30 17 D46 13 AH 19 CC/RTQ5 14 N19 23 BB4/RTQ5 15 R544 24 D47 16 GR10` 27 BB4/Q99 27 BB4/Q99 29 CC/R838 28 BB13/R838 31 BB11/Đ.Thanh 29 CC/R838 32 R280 30 R725 33 BB11/R23 31 BB11/Đ.Thanh 35 IR78 33 BB11/R23 36 BB14/R242 35 IR78 37 BB15/TR64 36 BB14/R242 38 BC15 38 BC15 42 Q99 42 Q99 Qua bảng 4.5 cho thấy trong các dòng triển vọng có nhiều dòng mang gen phục hồi. Đặc biệt các dòng 6, 8, 11, 15, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 44 là các dòng cho kết quả với cả hai chỉ thị RM258 và RM171. Sau khi chọn được các dòng bằng chỉ thị phân tử, chúng tồi chọn các dòng có điểm 3 như trong bảng 4.5 để chạy lại một lần nữa nhằm khẳng định sự chính xác của chỉ thị phân tử. Chú thích: 1: IR58025A 2: R100 3 – 12: Các dòng mang gen phục hồi đã được chọn lọc. Hình 4.8: Chạy điện di kiểm tra lại cho các dòng mang gen phục hồi Kết quả chạy kiểm tra cho thấy tất cả các dòng mang điểm 3 đều chính xác. Khi chạy lại với 2 mồi thì không có sự phân ly, tất cả đều theo dòng bố R100. Chứng tỏ, các dòng này đều mang gen phục hồi. Vậy, sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen phục hồi hữu dục là RM171 và RM258 chúng tôi đã chọn được một số dòng phục hồi triển vọng phục vụ công tác chọn tạo giống lúa lai ba dòng như: IR7, IR35, BB5/Q99, IR29, IR30, R544, BB4/Q99, CC/R838, BB11/Đ.Thanh, BB11/R23, IR78, BC15, Q99. Kết hợp với việc lựa chọn kiểu hình để lựa chọn ra các dòng phục hồi tốt nhất. Nếu chỉ dựa vào chỉ thị phân tử không thể đánh giá hết được tiềm năng của các dòng này. Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra kết luận - Hai chỉ thị phân tử SSR RM258 và RM171 liên kết chặt với gen phục hồi của dòng R100. - Đánh giá được một số dòng mang gen phục hồi triển vọng như: 5, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 22, . . . để tiếp tục lai tạo thành các dòng, giống lúa triển vọng. - Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) chúng tôi đã chon tạo được các dòng IR35, R7, BB13/R838, RV114, CC/R838, BB11/R23, IR78, BB14/R242, BB15/TR64, Q99 là các dòng mang gen phục hồi liên kết với cả hai chỉ thị phân tử. 5.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu các dòng phục hồi triển vọng sử dụng làm dạng bố trong các tổ hợp lúa lai ba dòng. - Tiếp tục tìm kiếm các chỉ thị phân tử liên kết với gen phục hồi để phục vụ công tác chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Bảy, Lê Thị Bích Thủy, Đào Thị Hạnh, Quách Thị Liên, Lê Thị Muội, Nguyễn Đức Thành; Đánh giá tính kháng bệnh đạo ôn ở một số dòng lúa dựa vào các chỉ thị phân tử STS và gây bệnh trong nhà kính; tạp chí công nghệ sinh học 3(4): 471 – 478, 2005. 2. Bổng B.B.,Mùi P.T., Vóc P.C., Luật N.V. (1997). Kết quả nghiên cứu lúa ưu thế lai ở đồng bằng sông Cửu long. Kết quả nghiên cứu khoa học 1977-1997. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 230 trang. 3. Bùi Trí Bửu, Nguyễn Thị Lang; Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến giống lúa. N.X.B. Nông Nghiệp; 1995. 4. Bùi Trí Bửu, Nguyễn Thị Lang; Di truyền phân tử.N.X.B. Nông Nghiệp; 2004. 5. Nguyễn Văn Đồng, Luận án tiến sĩ nông nghiệp. Nghiên cứu phát hiện và lập bản đồ phân tử gen bất dục đực nhân nhạy cảm nhiệt độ, phục vụ chương trình chọn tạo lúa lai hai dòng. 2000 6. Nguyễn Trí Hoàn, “Hội thảo cây lúa vùng sông MeKoong” , Thành phố Hồ Chí Minh, 15 – 17/10, 2004 7. Nguyễn Trí Hoàn; Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc tạo dòng bố, mẹ phục vụ cho chọn giống lúa lai siêu cao sản ở Việt nam. Chương trình KC.04/06 – 10. 2009 8. Nguyễn Thị Lang, Hoàng Thị Ngọc Minh; Viện Nghiên cứu Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long; Ứng dụng marker phân tử cho gen chống chịu mặn trên bộ giống lúa cải tiến. 2006 9. Hoàng Tuyết Minh; Lúa lai hai dòng, Nxb. Nông Nghiệp 2002. 10. Nguyễn Vĩnh Phúc, Nguyễn Thị Lang. 2005. Ứng dụng marker phân tử để đánh giá gen bệnh bạc lá (bacterial leaf blight) trên cây lúa Oryza santiva L., Nông nghiệp và phát triển nông thôn,  số17, trang. 28-30, ISSN 0866-7020 11. Trần Duy Quý; Cơ sở di truyền và công nghệ sản xuất lúa lai. N.X.B. Nông Nghiệp; 2002 12. Nguyễn Công Tạn, Ngô Thế Dân, Hoàng Tuyết Minh, Nguyễn Thị Trâm, Nguyễn Trí Hoàn, Quách Ngọc Ân; Lúa lai ở Việt Nam. Nxb. Nông Nghiệp; 2002 13. Trung tâm tài nguyên di truyền, Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), Mạng lưới quốc tế đánh giá di truyền lúa (INGER); Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa; 1996 14. Võ Thị Minh Tuyết, luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Bước đầu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn để tạo chọn dòng TGMS mới phục vụ cho phát triển lúa lai hai dòng ở Việt Nam; 2002 Tài liệu tiếng Anh 15. FAO (2004). Hybrid rice for food security. 16. Linh L.H, Hang N. T., Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.N (2008). Introgression of a quantitative trait locus for spikelets per panicle from Oryza minuta to the O. sativa cultivar Hwaseongbyeo. Plant Breeding doi:10.1111/j.1439-0523.2007.01462.x 17. Linh L.H, Jin F.X, Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.N (2006) Mapping quantitative trait loci for heading date and awn length using an advanced backcross line from a cross between Oryza sativa and O. minuta. Breeding Science 56: 341-349 18. N. K. Sheeba; B. C. Viraktamath; S. Sivaramakrishman; M. G. Gangashetti; Pawan Khera; R. M. Sundaram; Validation of molecular markers linked to fertility restorer gene(s) for WA – CMS lines of rice; Euphytica; Volume 167: 217 – 227, Number 2 / May, 2009 ; DOI10.1007/s10681-008-9865-4. 19. Toshiyuki, K., Shozo Ohta. 2004. Map-based clone of a fertility retorer gene, Rf-1, in rice oryza sativa. The plant Journal 37, 315-325. 20. Yao F. Y., Xu C. G., Yu S. B., Li J. X., Gao Y. J., Li X. H. and Zhang Q.; Mapping and genetic analysis of two fertility restorer loci in the wild abourtive cytoplasmic male sterility system of rice ( O. sativa L.); Euphytica 98, 1997, 183 – 187. 21. Zhang Q., S. C. Lin, B. Y. Zhao, C. L. Wang, W. C. Yang, Y. L. Zhou, D. Y. Li, C. B. Chen, and L. H. Zhu, 1998: Identification and tagging a new gene for resistance to bacterial blight (Xanthomonas oryzae pv oryzae) from O. rufipogon. Rice Genetic. Newsl. 15, 138—142. 22. Zhang G.; Bharaj T.S.; Virmani S.S. and Huang N.; Mapping of the RFLP – 3 nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD and RFLP markers; Theor. Appl. Genet. 83, 1997, 495 – 499.