Đề tài Nghiên cứu xác định Se, As trong mẫu máu và nước tiểu bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hidrua hoá

thể đốt nóng ống thạch anh bằng lò điện và sự phân huỷ AsH3 xảy ra trong môi trường khí trơ (Ar hoặc Ne, H2), Groulden và Brookband đã sử dụng loại thiết bị này. Ưu điểm của việc đốt Nuoc.com.vn Page 31 nóng ống thạch anh bằng lò điện là có thể điều khiển để đạt được nhiệt độ tối ưu nhất, nhiệt độ phân bố cho ống thạch anh đều hơn, độ nhiễu nền thấp hơn. Bằng kĩ thuật hidrua hoá độ nhậy của phương pháp tăng lên rất nhiều so với kĩ thuật mù hoá dung dịch thông thường.Dùng nguồn năng lượng là ngọn lửa và không khí thì độ nhạy phép xác định là 1g/ml theo vạch 196,1 nm, còn khi dùng ngọn lửa axetilen – không khí thì độ nhạy là 0,25 g/ml. Kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa xác định Se trong máu và serum, giới hạn phát hiện là 0,8 g/ml, còn khi nối với cột Cellex làm giàu thì giới hạn phát hiện tương ứng là 2,1 và 2,4 ng/ml. Kirkbring & Ranson, 1971 đã xác định As khi sử dụng kĩ thuật nguyên tử hoá ngọn lửa thông thường thì giới hạn phát hiện là 0,5-1 g/ml, còn khi sử dụng kĩ thuật không ngọn lửa, giới hạn phát hiện 0,1 mg/l. Phương pháp hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hidrua hoá để phân tích As, Se đã tăng độ nhạy lên một cách vượt bậc cỡ vài g/l. Đây cũng chính phương pháp mà chúng tôi sử dụng nghiên cứu trong bản luận văn này. Nuoc.com.vn Page 32 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung Như đã đề cập ở trên, điều kiện thí nghiệm với các thiết bị và đối tượng khác nhau là rất khác nhau, mẫu sinh học nói chung với máu và nước tiểu nói riêng là các đối tượng phân tích đòi hỏi độ chính xác cao, vì vậy vấn đề đầu tiên đặt ra là tối ưu hoá các điều kiện tiến hành thí nghiệm, khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu đến chất phân tích rồi mới phân tích thật, mẫu tiêu chuẩn để đánh giá kiểm tra phương pháp. Trên nguyên tắc thay đổi một yếu tố và cố định tất cả các yếu tố còn lại, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố một. Điều kiện phù hợp nhất vừa khảo sát và được chọn sẽ dùng cho thí nghiệm sau. Trên cơ sở đó chúng tôi xây dựng kế hoạch thực nghiệm để giải quyết các nhiệm vụ sau: Thí nghiệm tiến hành theo 6 bước: Nuoc.com.vn Page 33 Bước1: Chọn các thông số đo của máy đo phổ bao gồm:  Bước sóng hấp thụ của nguyên tố cần phân tích.  Khe sáng  Chiều cao Burner  Cường độ dòng đèn catot rỗng  Lưu lượng khí axetylen và khí đẩy (khí dẫn mẫu) Bước 2: Khảo sát các điều kiện tạo hợp chất hidrua  Tốc độ bơm nhu động  Tốc độ dẫn dung dịch NaBH4, HCl và khí Ar  Nồng độ NaBH4, HCl ảnh hưởng đến sự tạo asin, selenua  Nồng độ HCl, KI, thời gian khi tiến hành khử As (V) về As (III)  Nồng độ HCl, thời gian khi tiến hành khử Se (Vi) về Se (IV)  Thời gian bền của dung dịch sau khi khử.  Xây dựng đường chuẩn Bước 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nguyên tố có mặt trong dung dịch mẫu. Bước 4: Lấy và bảo quản mẫu Bước 5: Chọn phương pháp phân huỷ mẫu. Bước 6: Đánh giá sai số và giới hạn của phương pháp 2.2. Giới thiệu chung về phương pháp hấp thụ nguyên tử kĩ thuật hidrua hoá 2.2.1. Nguyên lý của phương pháp Nuoc.com.vn Page 34 Dựa vào tính chất dễ tạo hợp chất hidrua cộng hóa trị của một số nguyên tố As, Sb, Se, Te, Bi,… các hidrua này đều dễ bay hơi, dễ bị phân huỷ người ta chế tạo bộ tạo khí hidrua kết hợp phương pháp HTNT, khí này được dẫn vào bộ phận nguyên tử hoá mẫu đo quang độ hấp thụ của chúng. As, Se tạo hợp chất hidrua công hoá trị có công thức AsH3, SeH2, trong hợp chất này As có số oxy hoá -3, Se có số oxy hoá -2. Trong các hợp chất As thường thể hiện số oxy hoá +3 và + 5 còn Se là +4 và +6, vì vậy người ta phải tiến hành phản ứng khử về As-3 và Se- 2, với cả hai nguyên tố này chúng tôi đều dùng chất khử là NaBH4, trong môi trường axit NaBH4 có phản ứng: NaBH4 + 3H2O + HCl H3BO3+ 8H+NaCl H* là hidro mới sinh có tính khử mạnh nên khi có mặt các hợp chất của As, Se nó thực hiện ngay quá trình khử: Mn+ + (m+n)H MHn+ mH+ Với As, hợp chất hydrua AsH3; với Se hợp chất selenua SeH2 được tạo thành nhờ NaBH4 trong môi trường axit. Hợp chất AsH3, SeH2 được mang vào buồng nguyên tử hoá bằng dòng khí trơ (Ar) liên tục. Để chuyển hoá toàn bộ As thành AsH3, Se thành SeH2 thì trước hết phải oxi hoá As lên As5+, Se lên Se6+ sau đó khử về As3+ và Se4+ và cuối cùng chuyển hoá thành AsH3, SeH2 theo sơ đồ:     3)()(),( AsHIIIAsVAsVIIIAs hoahidroKO       2)()(),( SeHIVSeVISeVIIVSe hoahidroKO   Nuoc.com.vn Page 35 Dung năng lượng ngọn lửa C2H2-KK làm nguồn duy trì đám hơi nguyên tử As, Se, chiếu chùm tia đơn sắc từ đèn catot rỗng của As, Se vào đám hơi nguyên tử, khi đó As, Se sẽ hấp thụ những tia nhất định (As ở bước sóng 193,7 nm và Se ở bước sóng 196 nm là nhậy nhất). Sau đó nhờ bộ phận thu và phân ly phổ hấp thụ ta chọn và đo cường độ vạch phổ phân tích để phục vụ cho việc định lượng nó. 2.2.2. Phép định lượng của phương pháp Sự phụ thuộc của cường độ vạch phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố vào nồng độ của nguyên tố đó trong dung dịch mẫu phân tích được nghiên cứu thấy rằng, trong một khoảng nồng độ C nhất định của nguyên tố trong mẫu phân tích cường độ vạch phổ hấp thụ và nồng độ N của nguyên tố đó trong đám hơi nguyên tử tuân theo định luật Lambe – Bia A = K.N.L (1) Trong đó: A là cường độ hấp thụ của vạch phổ K là hệ số thực nghiệm phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường hấp thụ, bề dày môi trường hấp thụ và hệ số hấp thụ nguyên tử của nguyên tố. L là bề dày lớp hấp thụ (cm) N là nồng độ nguyên tử của nguyên tố trong đám hơi nguyên tử. Nếu gọi C là nồng độ của nguyên tố phân tích có trong mẫu đem đo phổ thì mối quan hệ giữa N và C được biểu diễn N=k.Cb (2) Nuoc.com.vn Page 36 Trong đó b gọi là hằng số bản chất, nó phụ thuộc vào nồng độ C, tính chất hấp thụ phổ của từng nguyên tố và từng vạch phổ của nguyên tố đó. Như vậy ta có phương trình cơ sở của phép định lượng các nguyên tố theo độ hấp thụ của nó là: A=a.Cb (3) a=k.K gọi là hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào tất cả các điều kiện thực nghiệm để hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu. Trong các phép đo ta thường tìm được một giá trị C=Co mà ứng với:  Mọi giá trị CxCo thì giá trị b=1, quan hệ giữa C và D là tuyến tính.  Với mọi giá trị Cx>Co thì 0<b<1, quan hệ giữa C và D là không tuyến tính. Phương trình (3) được gọi là phương trình cơ sở của phép đo định lượng các nguyên tố theo phổ hấp thụ nguyên tử. Đường biểu diễn phương trình này có 2 đoạn, một đoạn thẳng trong vùng CxCo và một đoạn cong Cx>Co. D Co C Hình 1: Quan hệ giữa D và C Nuoc.com.vn Page 37 Khi xác định hàm lượng các chất trong mẫu phân tích theo đồ thị chuẩn, chỉ nên dùng trong khoảng nồng độ tuyến tính (b=1) 2.3. Đánh giá các kết quả phân tích [10, 13, 39] 2.3.1. Giới hạn phát hiện (GHPH hay LOD) và giới hạn định lượng (GHĐL hay LOQ) Giới hạn phát hiện (GHPH) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được một tín hiệu có thể phân biệt được một cách tin cậy với tín hiệu trắng (hay tín hiệu nền). Với ý nghĩa có thể phân biệt một cách tin cậy- đã có nhiều quan điểm khác nhau và do đó cũng có nhiều cách xác định GHPH khác nhau. Phổ biến nhất hiện nay vẫn là cách xác định theo qui tắc 3, theo qui tắc này, GHPH được tính như sau: yp= y0+30 hay yp=y0+3S0 Trong đó yp là GHPH hoặc tín hiệu ứng với GHPH (biết tín hiệu yp sẽ tính được GHPH từ phương trình đường chuẩn y=a+bx do đó GHPG=xp=(yp-a)/b; y0 là tín hiệu mẫu trắng; 0, S0 là độ lệch chuẩn của nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng. Có thể xác định y0 và S0 theo hai cách: Cách 1: Tiến hành n thí nghiệm để xác định nồng độ mẫu trắng, thu được các giá trị y0i (i: 1n). Từ đó tính y0 và S0 theo các công thức sau: y0= ybi/n ;      1/2000 nyyS i Sau đó tính GHPH, việc xác định y0 và So như vậy sẽ tốn nhiều thời gian. Để giảm số lượng thí nghiệm và tính nhanh GHPH, có thể tiến hành theo cách 2. Nuoc.com.vn Page 38 Cách 2: Tiến hành thí nghiệm để thiết lập phương trình đường chuẩn y=a+bx. Từ đó xác định y0 và S0 bằng cách chấp nhận y0 (tín hiệu mẫu trắng) là giá trị của y khi x=0 do đó y0=a và S0=Sy (độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn ):      2/20 nYySS iiy Ở đây yi là các giá trị thực nghiệm của y; Yi là các giá trị tính từ phương trình đường chuẩn của y. Sau đó, tính tín hiệu ứng với GHPP: yp=y0+3S0=a+3Sy. Thay y vào phương trình đường chuẩn, biến đổi sẽ được công thức tính GHPH: GHPH=3Sy/b Giới hạn định lượng (GHĐL) là tín hiệu hay nồng độ thấp nhất trên một đường chuẩn tin cậy và thường người ra chấp nhận là GHĐL=10Sb, nghĩa là GHĐL=10Sy/b 2.3.2. Xử lí số liệu và đánh giá phương pháp phân tích Để đánh giá kết quả đã khảo sát, chúng tôi sẽ vận dụng các phương pháp toán thống kê với một số nội dung sau: * Loại bỏ các giá trị nghi ngờ: Mỗi mẫu đã phân tích n lần với các giá trị sắp xếp từ nhỏ đến lớn hoặc ngược lại: x1, x2, ..,xn, nếu ta nghi ngờ giá trị x1 thì muốn xem có cần loại nó hay không ta dùng tiêu chuẩn Q: n TN xx xxQ   1 21 (4) Nuoc.com.vn Page 39 So sánh Qtn với Q tới hạn với độ tin cậy 95%. Nếu Qtn<Qth thì không được loại bỏ giá trị nghi ngờ. * Xác định hiệu suất thu hồi:    xthuhoi% (5) * Xác định độ lặp lại của kết quả đã phân tích Độ lặp lại được đặc trưng bởi độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối. Độ lệch chuẩn (độ lệch chuẩn tương đối) càng nhỏ thì thí nghiệm có độ lặp lại càng tốt. Giá trị trung bình: n x x i (6) Độ lệch chuẩn tuyệt đối: n xx S i    2)( (7) Độ lệch chuẩn tương đối: 100. x SS x (8) * Độ chính xác của kết quả phân tích Trung bình cộng biểu diễn biểu diễn độ tập trung của các giá trị thực nghiệm nên độ chính xác của tập số liệu kết quả nghiên cứu được đánh giá thông Nuoc.com.vn Page 40 qua giá trị trung bình. Sai khác giữa giá trị thật và giá trị thực càng nhỏ thì độ chính xác của nghiên cứu càng lớn và ngược lại. Để đánh giá sai khác này người ta dùng chuẩn t (chuẩn student), t được tính như sau:     x S nx t  (9) Khi lấy t thực nghiệm (ttn) tính được từ các kết quả phân tích đem so sánh với t lí thuyết (tb) ứng với n-1 bậc tự do và P=0,95, nếu tt<tb thì sai khác giữa kết quả thực nghiệm và giá trị thực là không đáng tin cậy, kết quả thực nghiệm đúng. * Xác định khoảng tin cậy của kết quả phân tích Cận tin cậy : n tSx   (10) Khoảng tin cậy của kết quả phân tích sẽ là   x hay n tSx  Với  là giá trị thực hay giá trị chuẩn t là phân phối chuẩn student. Do đó nếu  càng nhỏ thì  x càng gần giá trị thực 2.4. Trang thiết bị nghiên cứu 2.4.1. Trang thiết bị chính Máy phân tích hấp thụ nguyên tử Shimadzu 6800. - Sơ đồ khối của máy 6800 cũng như một số máy nguyên tử khác, có cấu tạo gồm 4 khối: (1) khối cung cấp nguồn đơn sắc, (2) khối vận chuyển mẫu vào Nuoc.com.vn Page 41 plasma và nguyên tử hoá, (3) khối thu nhận phân li và ghi phổ hấp thụ, (4) khối xử lí hiển thị và in các kết quả phân tích. - Hệ thống tạo hidrua: HVG-1 2.4.2. Trang thiết bị phụ trợ.  Bình khí nén axetylen tính khiết.  Bình khí nén Argon 2.5. Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm 2.5.1. Các dụng cụ thí nghiệm chính  Các ống thuỷ tinh chịu nhiệt có dung tích 30 ml.  Bình định mức thuỷ tinh hoặc polietylen dung tích 5, 10, 25, 50, 100, 250, 1000 ml.  Pipet tự động chuyên dụng 0,1; 0,2…10ml. 2.5.2. Các hoá chất chính Tất cả các loại hoá chất sử dụng đều tinh khiết hoá học hoặc tinh khiết phân tích. Nước cất sử dụng là nước cất hơi đã qua cột trao đổi. 1. Axit clohidric HCl d=11,9 và HCl pha loãng 1:1. 2. Axit nitric HNO3 đặc, d=1,4. 3. Axit pecloric HClO4 70% 4. Dung dịch KI 20% (g/ml): cân 50 g KI vào cốc dung tích 250ml, khuấy cho tan hết rồi lọc qua giấy lọc băng vàng vào bình định mức mầu nâu dung tích 250ml, định mức bằng nước cất đến vạch, lắc đều dung dịch. Bảo quản dung dịch trong bóng tối ở nhiệt độ <200C. Dung dịch này có thể dùng được trong một tuần. Nuoc.com.vn Page 42 5. Dung dịch NaBH4: Để bảo quản dung dịch NaBH4 cần pha nó trong dung dịch NaOH 0,1N. Dung dịch này được chuẩn bị hàng ngày khi sử dụng. 6. Các dung dịch chuẩn của As, Se:  Dung dịch chuẩn As (III)  Dung dịch chuẩn gốc As (III): hoà tan 1,320 g As2O3 vào nước cất chứa 4 g NaOH. Định mức đến 1l. 1ml dung dịch chứa 1mg As (III).  Dung dịch chuẩn As (III) trung gian: hoà tan 10 ml dung dịch chuẩn gốc As (III) vào bình 1l chứa 5ml HCl đặc. 1ml dung dịch chứa 10 g As (III).  Dung dịch chuẩn làm việc: hoà tan 10ml dung dịch chuẩn trung gian vào bình 1 l chứa 5ml HCl đặc. 1ml dung dịch chứa 0,1 g As (III). Dung dịch này chỉ sử dụng được trong ngày.  Dung dịch chuẩn As (V)  Dung dịch chuẩn gốc As (V): hoà tan 1,534 g As2O5 vào nước cất chứa 4 g NaOH. Định mức đến 1l. 1ml dung dịch chứa 1mg As (V).  Dung dịch chuẩn As (V) trung gian: chuẩn bị như với dung dịch As (III). 1ml dung dịch chứa 10 g As (V).  Dung dịch chuẩn làm việc: chuẩn bị như với dung dịch As (III). 1ml dung dịch chứa 0,1 g As (V).  Dung dịch chuẩn Se (IV)  Dung dịch chuẩn gốc Se (IV): hoà tan 2,190 g Na2SeO3 vào nước cất chứa 10 ml HCl đặc. Định mức đến 1l. 1ml dung dịch chứa 1mg (III). Nuoc.com.vn Page 43  Dung dịch chuẩn Se (IV) trung gian: hoà tan 10 ml dung dịch chuẩn gốc Se (IV) vào bình 1l chứa 5ml HCl đặc. 1ml dung dịch chứa 10 g Se (IV).  Dung dịch chuẩn làm việc: hoà tan 10ml dung dịch chuẩn trung gian vào bình 1 l chứa 2ml HNO3 đặc. 1ml dung dịch chứa 0,1 g Se (IV). Dung dịch này chỉ sử dụng được trong ngày.  Dung dịch chuẩn Se (VI)  Dung dịch chuẩn gốc Se(VI): hoà tan 2,393 g Na2SeO4 vào nước cất chứa 10ml HNO3 đặc. Định mức đến 1l. 1ml dung dịch chứa amg Se (VI).  Dung dịch chuẩn Se (IV) trung gian: hoà tan 10 ml dung dịch chuẩn gốc Se (IV) vào bình 1l chứa 5ml HCl đặc. 1ml dung dịch chứa 10 g Se (IV).  Dung dịch chuẩn làm việc: hoà tan 10ml dung dịch chuẩn trung gian vào bình 1 l chứa 2ml HNO3 đặc. 1ml dung dịch chứa 0,1 g Se (IV). Dung dịch này chỉ sử dụng được trong ngày. - Cũng có thể sử dụng dung dịch chuẩn gốc của As, Se 1000ppm của Merk. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện thí nghiệm trên máy AAS 6800 (Shimadzu) Nuoc.com.vn Page 44 Dung dịch chuẩn As (III) 10 ng/ml và Se (IV) 10 ng/ml được pha từ các dung dịch chuẩn mục 2.5.2 được sử dụng để khảo sát, các thí nghiệm đều được thực hiện lặp 5 lần. 3.1.1. Chọn bước sóng thích hợp. Khi ở trạng thái hơi (khí) nguyên tử của nguyên tố chỉ hấp thụ những bức xạ đặc trưng mà nó có thể phát ra trong phổ phát xạ của nó .Theo tài liệu thì bước sóng thích hợp cho As là 193,7nm và Se là 196nm. 3.1.2. Lựa chọn độ rỗng của khe sáng Độ rộng của khe sáng ảnh hưởng đến tín hiệu phổ hấp thụ. Trước hệ chuẩn trực là khe vào của chùm sáng đa sắc, chùm sáng đa sắc này sau khi qua hệ chuẩn trực sẽ vào bộ phận tán sắc. Để vạch phổ đo không bị quấy rối, chen lẫn bởi vạch phổ khác nằm ở hai bên khe sáng phải không được quá rộng, mặt khác nếu độ rộng khe sáng quá hẹp tín hiệu phổ không ổn định, độ lặp lại kém. Chúng tôi khảo sát ở các độ rộng như sau: 0,1 nm, 0,2 nm, 0,5 nm, 1,0 nm và 2,0 nm thấy rằng chọn độ rộng 0,5 nm là hợp lý. 3.1.3. Khảo sát dòng đèn catot rỗng Cường độ dòng điện làm việc của đèn catot rỗng và cường độ vạch phổ hấp thụ có quan hệ chặt chẽ với nhau. Nói chung cường độ vạch phổ tỉ lệ nghịch với cường độ dòng đèn, cũng có một số trường hợp không tuân theo qui luật đó. Đối với mỗi nguyên tố đèn catot rỗng (HCL) có một dòng giới hạn cực đại. Tuy nhiên không nên dùng cường độ cực đại vì khi đó đèn làm việc không ổn định và tuổi thọ của đèn bị giảm. Đèn HCL thường hoạt động tốt trong vùng từ 60% đến 85% Imax. Nếu dùng giới hạn dưới của dòng đốt đèn HCL cho độ nhậy cao, giới hạn trên cho độ ổn định cao. Nuoc.com.vn Page 45 Bảng 1: Sự phụ thuộc phổ hấp thụ vào cường độ dòng đèn Cường độ dòng mA Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) Cường độ dòng mA Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) 16 0,1611 8 0,3491 18 0,1641 9 0,3442 20 0,1592 10 0,3404 22 0,1566 11 0,3395 24 0,1544 12 0,3363 Qua kết quả bảng 1 ta thấy cường độ dòng đèn thích hợp là 20mA đối với Se và 10mA đối với As. 3.1.4. Khảo sát chiều cao ngọn lửa đèn nguyên tử hoá. Để chọn được vùng trung tâm của ngọn lửa nguyên tử hoá tại đó nồng độ hơi nguyên tử là cao và ổn định nhất cần phải chọn chiều cao burner phù hợp. So với phép đo HTNT ngọn lửa thông thường, trong hệ thống hidrua hoá có thêm ống thạch anh đường kính 5mm để chứa khí asin, selenua vì vậy chiều cao burner cần được thay đổi cho phù hợp. Để làm việc này thì điều chỉnh theo tín hiệu trên màn hình đến khi nào là thấp nhất, bằng thực nghiệm chúng tôi đã chọn được chiều cao burner tốt nhất là 16mm. 3.1.5. Khảo sát tốc độ cung cấp khí C2H2 – KK Nguồn nhiệt cung cấp cho việc nung nóng cuvet thạch anh là ngọn lửa của đèn khí (C2H2 – KK). Vì vậy nếu lưu lượng khí axetylen thấp sẽ không đủ nhiệt độ cung cấp cho ống thạch anh tức là không đủ năng lượng cho quá trình hoá hơi và Nuoc.com.vn Page 46 nguyên tử hoá mẫu. Còn nếu lưu lượng khí quá cao, khí cháy không hoàn toàn, sinh ra muội cacbon sẽ bám lên ống thạch anh làm ống chóng hỏng. Mặt khác có thể giảm độ hấp thụ do các phản ứng phụ xảy ra. Khảo sát lưu lượng khí axetylen từ 1,6 lít/phút đến 2,2 lít/phút, tốc độ không khí nén là 6,0 lít/ phút cho máy AA 6800 thu được kết quả sau: Bảng 2 : Sự phụ thuộc độ hấp thụ vào lưu lượng khí axetilen Lưu lượng C2H2 (l/ph) Độ hấp thụ nguyên tử (Se 10 ng/ml) Độ hấp thụ nguyên tử (As 10 ng/ml) 1,6 0,1255 0,2481 1,7 0,1316 0,2745 1,8 0,1373 0,3114 1,9 0,1411 0,3392 2,0 0,1515 0,3407 2,1 0,1484 0,3385 2,2 0,1490 0,3414 Vì vậy chúng tôi chọn lưu lượng khí axetilen là 2 l/ph. 3.2. Khảo sát chọn các điều kiện tạo hợp chất hidrua của Se và As Để tạo hợp chất hidrua của As, Se phải có sự tham gia của NaBH4, axit HCl và dung dịch mẫu có chứa As (III), Se (IV) tại buồng phản ứng. Vì vậy phản ứng tạo hidrua phải xảy ra hoàn toàn hay không phụ thuộc vào tỷ lệ nồng độ các chất tham gia phản ứng này tại buồng phản ứng, và nồng độ ban đầu đem sử dụng, đồng thời quá trình khử As (V) về As (III), Se (VI) về Se (IV) phải xảy ra hoàn Nuoc.com.vn Page 47 toàn định lượng. Vì vậy chúng tôi lần lượt tiến hành các bước khảo sát cho điều kiện tạo hidrua như sau: 3.2.1. Khảo sát tỉ lệ các chất tham gia tại buồng phản ứng Trong bộ tạo hidrua có ba đường dẫn cho ba chất thành phần vào buồng phản ứng, điều khiển tốc độ dung dịch trong ba đường dẫn này bằng vòng quay của motơ bơm nhu động và bộ phận điều chỉnh cho mỗi đường dẫn. Ở đây có hai vít điều chỉnh: Một vít dùng cho đường dẫn mẫu, một vít dùng cho hai đường dẫn NaBH4 và HCl. Tỉ lệ nồng độ các chất trong buồng phản ứng phụ thuộc vào tốc độ dẫn dung dịch trong ba đường dẫn. Tốc độ dẫn dung dịch NaBH4 và HCl có thể điều chỉnh được từ 1,0 ml/ph đến 2,5 ml/ph. Bảng 3 cho ta kết quả khảo sát các yếu tố này. Bảng 3: Sự phụ thuộc của phổ hấp thụ vào tốc độ dẫn dung dịch NaBH4 và HCl trên máy HVG 1. STT Tốc độ dẫn dung dịch NaBH4 và HCl (ml/ph) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se10ng/ml) 1 1,0 0,1923 0,0852 2 1,4 0,2764 0,1284 3 1,6 0,3231 0,1325 4 1,8 0,3472 0,1594 5 2,0 0,3464 0,1562 6 2,2 0,3453 0,1574 Nuoc.com.vn Page 48 7 2,5 0,3367 0,1415 Qua đó với tốc độ dẫn dung dịch NaBH4 và HCl là 1,8 ml/ph – 2,2 ml/ph cho độ hấp thụ cao nhất. Chúng tôi chọn tốc độ phù hợp là 2 ml/ph. Tốc độ hút được khảo sát cho kết quả trong bảng 4. Bảng 4: Sự phụ thuộc của phổ hấp thụ vào tốc độ hút mẫu STT Tốc hút mẫu (ml/ph) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) 1 3 0,2455 0,0632 2 4 0,3064 0,1151 3 5 0,3322 0,1403 4 6 0,3431 0,1522 5 7 0,3478 0,1565 Nhận xét : tốc độ hút mẫu được chọn là 6ml/ph. 3.2.2. Khảo sát chọn tốc độ khí mang Tốc độ khí mang có vai trò quan trọng trong việc dẫn hơi AsH3, SeH2 từ bình phản ứng vào cuvet. Nếu tốc độ Ar nhỏ thì AsH3, SeH2 sẽ phân huỷ một phần trên đường dẫn, nếu tốc độ quá lớn thì Ar lại là tác nhân pha loãng AsH3, SeH2 và gây nhiễu nền của phổ. Để làm rõ vấn đề này, chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khí argon đến độ hấp thụ của nguyên tử As, Se. Tốc độ khí argon được thay đổi từ 50ml/ph đến 90ml/ph. Các kết quả khảo sát được chỉ ra trong bảng 5. Nuoc.com.vn Page 49 Bảng 5: Sự phụ thuộc của phổ hấp thụ vào tốc độ khí argon STT Tôc độ khí Argon (ml/ph) Độ hấp thụ ( As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) 1 50 0,2751 0,1361 2 60 0,3132 0,1342 3 65 0,3364 0,1505 4 70 0,3435 0,1554 5 75 0,3482 0,1581 6 85 0,3361 0,1442 7 90 0,3293 0,1383 Qua kết quả bảng 5 cho thấy rằng tốc độ khí argon là 65-75 ml/ph là ổn định và cao nhất. Nếu dùng lớn hơn thì tốn khí mà lại cho kết quả không tốt. Vậy chọn tốc độ khí argon là 70ml/ph. 3.2.3. Khảo sát nồng độ NaBH4 và HCl Để khảo sát và chọn được các nồng độ tối ưu chúng tôi sử dụng tốc độ dẫn dung dịch mẫu là 6 ml/ph, tốc độ dẫn NaBH4 và HCl là 2 ml/ph. 3.2.3.1. ảnh hưởng của nồng độ NaBH4 đến phổ hấp thụ nguyên tử của As, Se Nồng độ HCl được cố định là 5N trong các thí nghiệm khảo sát này. Nồng độ NaBH4 được khảo sát từ 0,1% đến 1%, tất cả đều được pha trong NaOH 0,1mol/l. Các kết quả khảo sát được chỉ ra như sau: Nuoc.com.vn Page 50 Bảng 6 Ảnh hưởng của nồng độ chất khử NaBH4 STT Nồng độ NaBH4 (%) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 10ng/ml) 1 0,1 0,0522 0,0362 2 0,2 0,1704 0,0491 3 0,3 0,2785 0,0995 4 0,4 0,3233 0,1261 5 0,5 0,3474 0,1462 6 0,6 0,3441 0,1576 7 0,7 0,3435 0,1464 8 0,8 0,3392 0,1392 9 0,9 0,3374 0,1391 10 1 0,3351 0,1285 Kết quả cho thấy khi nồng độ NaBH4 thấp, độ hấp thụ của As, Se có giá trị thấp, khi tăng nồng độ NaBH4 lên thì độ hấp thụ tăng theo, đạt giá trị ổn định nhưng sau đó thấp dần và tín hiệu không ổn định mặc dù nồng độ NaBH4 vẫn tăng. Điều này có thể giải thích như sau: nếu nồng độ NaBH4 nhỏ thì tỉ lệ nồng độ trong buồng phản ứng không thích hợp cho phản ứng tạo xảy ra hoàn toàn, lượng asin, Selenua tạo ra thấp dẫn đến độ hấp thụ thấp. Nếu nồng độ NaBH4 quá cao, khí hidro sinh ra nhiều và nó được dẫn vào buồng nguyên tử hoá làm loãng nồng độ As, Se nguyên tử trong buồng nguyên tử hoá, đồng thời ảnh hưởng đến sự nhiễu nền, vì vậy phổ hấp thụ thấp và không ổn định. Để chọn được nồng độ Nuoc.com.vn Page 51 NaBH4 tối ưu ta phải chọn trong khoảng độ hấp thụ của As, Se có giá trị lớn nhất và ổn định nhất. Chúng tối chọn nồng độ NaBH4 là 0,5% đối với As 0,6% đối với Se . 3.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ của HCl đến độ hấp thụ của As, Se Như trên đã đề cập đến, khí hidro sinh ra trong buồng phản ứng có ảnh hưởng đối với phổ hấp thụ nguyên tử, như vậy nồng độ axit HCl sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến lượng khí hidro sinh ra. Nồng độ HCl dẫn vào bình phản ứng thay đổi từ 1 đến 10 N kết quả thu được như sau: Bảng 7 Ảnh hưởng của nồng độ chất khử HCl tạo hidrua STT Nồng độ HCl (N) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) 1 1 0,1105 0,0571 2 2 0,1922 0,1222 3 3 0,3401 0,1464 4 4 0,3479 0,1567 5 5 0,3486 0,1585 6 6 0,3473 0,1579 7 7 0,3511 0,1633 8 8 0,3555 0,1654 9 9 0,3601 0,1715 10 10 0,3636 0,1791 Nuoc.com.vn Page 52 Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy rằng khi nồng độ HCl 7N có hiện tượng bọt khí sinh ra ở cuối đường phản ứng làm tín hiệu không ổn định và ở nồng độ >8N vừa có bọt khí đồng thời trên ống thạch anh có tiếng nổ lách tách. Như vậy nồng độ HCl qua lớn, khí hidro sinh ra quá nhiều tạo thành bọt khí và trong buồng nguyên tử hoá khí hidro thừa phản ứng với nước gây ra tiếng nổ, hiện tượng này rất không an toàn. Nhưng nếu nồng độ HCl thấp, lượng khí hidro sinh ra không đủ cho phản ứng tạo hidrua nên độ hấp thụ thấp. Từ kết quả bảng 7 ta thấy nồng độ HCl từ 4 đến 6 N là độ hấp thụ ổn định. Nồng độ HCl thích hợp sẽ là 5N 3.2.4. Khảo sát điều kiện khử As (V) về As (III) Để khử As (V) về As (III) chúng tôi sử dụng KI trong môi trường axit HCl. Như vậy ở đây cần khảo sát nồng độ KI và HCl cho hợp lí để độ hấp thụ của As đạt giá trị cao nhất. 3.2.4.1. Khảo sát nồng độ KI cho sự khử Chúng tôi khảo sát nồng độ KI từ 0,6% đến 2,6% thời gian tiến hành trên bếp cách thuỷ là 25 phút. Kết quả trong bảng 8 cho ta chọn được nồng độ KI thích hợp. Bảng 8: Ảnh hưởng của Nồng độ thuốc thử KI đến quá trình khử As (+5) STT Nồng độ KI (%) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) 1 0,6 0,2972 2 1,2 0,3271 3 1,6 0,3473 4 1,8 0,3465 5 2,0 0,3497 Nuoc.com.vn Page 53 6 2,2 0,3481 7 4,0 0,3472 Theo kết quả trong bảng 10, nồng độ KI > 1,6% đã cho độ hấp thụ của As ổn định, tức là với nồng độ này sự khử As (V) về As (III) đã xảy ra hoàn toàn, vì vậy chọn nồng độ KI là 1,8 đã đảm bảo cho quá trình khử. Có tác giả dùng dung dịch KI (10%) + axit ascorbic (5%) theo tỉ lệ 3:5 về thể tích để thực hiện quá trình khử. Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát nhưng thấy rằng khi sử dụng hỗn hợp này độ hấp thụ của As không tăng so với khi dùng dung dịch KI chúng tôi đã chọn mà phép đo lại không ổn định. Vì vậy dùng dung dịch KI nồng độ 1,8 % là hợp lí. 3.2.4.2. Khảo sát thời gian và nhiệt độ khử Để có nhiệt độ ổn định chúng tôi tiến hành khử trên bếp cách thuỷ đang sôi, duy trì mẫu trên bếp trong khoảng thời gian khác nhau rồi lấy ra làm nguội và đem đo độ hấp thụ. Thí nghiệm này tiến hành với điều kiện như sau: Nồng độ HCl: 6N; Nồng độ KI: 1,8%; Nồng độ As (V): 10ng/ml Bảng 9 Ảnh hưởng của thời gian khử As (V) STT Thời gian khử (phút) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) 1 5 0,1442 2 10 0,3001 3 20 0,3413 4 30 0,3472 Nuoc.com.vn Page 54 5 40 0,3485 6 50 0,3474 7 60 0,3451 8 70 0,3462 9 80 0,3482 10 90 0,3472 Kết quả thu được trong bảng 9 cho thấy rằng chỉ cần thời gian khử là 30 phút phản ứng đã xảy ra hoàn toàn (phổ hấp thụ đã bắt đầu ổn định). Vì vậy chúng tôi chọn thời gian khử là 40 phút. Chú ý: KI để lâu sẽ bị oxi hoá thành I2 làm phép đo không ổn định 3.2.5. Khảo sát điều kiện khử Se (VI) về Se (IV) Chỉ Se (IV) mới cho phản ứng tạo khí selenua tốt. Vì vậy cần phải khử Se (VI) về Se (IV) trước khi thực hiện phản ứng tạo selenua. Khảo sát vấn đề này chúng tôi sử dụng dung dịch Se (VI) chuẩn (10ng/ml) để không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu phân tích. Để khử Se (VI) về Se (IV) chúng tôi sử dụng axit HCl. Như vậy ở đây cần khảo sát nồng độ HCl cho hợp lí để độ hấp thụ của Se đạt giá trị cao nhất. Để đảm bảo chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình khử, chúng tôi phải tiến hành khảo sát cả thời gian và nhiệt độ thực hiện quá trình khử. 3.2.5.1. Khảo sát nồng độ HCl cho sự khử Chúng tôi khảo sát nồng độ HCl từ 1N đến 9N thời gian tiến hành trên bếp cách thuỷ là 120 phút. Kết quả cho trong bảng 7 cho ta chọn được nồng độ HCl thích hợp Nuoc.com.vn Page 55 Bảng 10 Ảnh hưởng của nồng độ HCl để khử Se (VI) STT Nồng độ HCl (N) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) 1 1 0,0333 2 2 0,0844 3 3 0,0911 4 4 0,1475 5 5 0,1576 6 6 0,1564 7 7 0,1581 8 8 0,1622 9 9 0,1764 10 10 0,1815 Theo kết quả bảng 8, nồng độ HCl từ 5N cho độ hấp thụ của selen ổn định, tức là với nồng độ này sự khử Se (VI) về Se (IV) đã xảy ra hoàn toàn. Vậy chúng tôi chọn nồng độ HCl để khử Se là 6N 3.2.5.2. Khảo sát thời gian khử Để có nhiệt độ ổn định chúng tôi tiến hành khử trên bếp cách thuỷ đang sôi, duy trì mẫu trên bếp trong khoảng thời gian khác nhau rồi lấy ra làm nguội và đem đo độ hấp thụ. Thí nghiệm này tiến hành với điều kiện như sau: Nồng độ HCl: 6N; Nồng độ Se (VI): 10 ng/ml Bảng 11 Ảnh hưởng của thời gian khử Se (VI) về Se (IV Nuoc.com.vn Page 56 STT Thời gian khử (phút) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) 1 5 0,082 2 10 0,1015 3 20 0.1212 4 30 0.1386 5 40 0.1477 6 50 0,1565 7 60 0,1551 8 70 0,1563 9 80 0,1555 10 90 0,1571 Kết quả thu được trong bảng 9 cho thấy rằng chỉ cần thời gian khử là 50 phút phản ứng đã xảy ra hoàn toàn (phổ hấp thụ đã bắt đầu ổn định). Vì vậy chúng tôi chọn thời gian khử là 60 phút. 3.3. Xây dựng đường chuẩn Trên cơ sở các điều kiện thích hợp đã được chọn cho máy đo phổ, quá trình tạo hidrua và quá trình khử Se (VI) về Se (IV), As (V) về As (III), chúng tôi xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ As trong dung dịch và độ hấp thụ của nó. 3.3.1. Xây dựng đường chuẩn của As Nuoc.com.vn Page 57 Nồng độ (ng/ml) 0 0,5 2,5 5 10 15 20 25 30 ABS 0,0023 0,0378 0,0655 0,1772 0,3493 0,4855 0,6482 0,7012 0,7458 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ As và ABS như sau: As 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 ng/ml AB S   Nhận xét: khoảng nồng độ As tuân theo định luân Lambabe là 0-20 ng/ml 3.3.2. Xây dựng đường chuẩn Se Nồng độ (ng/ml) 0 2 5 10 15 20 30 40 50 ABS 0,0015 0,0361 0,0859 0,1598 0,2371 0,3144 0,4915 0,5510 0,6059 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Se và ABS như sau: Nuoc.com.vn Page 58 Se 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 10 20 30 40 50 ng/ml AB S   Nhận xét: khoảng nồng độ Se tuân theo định luân Lambabe là 0-30 ng/ml 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các nguyên tố trong dung dịch Theo các tài liệu tham khảo, các nguyên tố ảnh hưởng đến phép đo là: As, Se, Cu, Fe, Sb, Bi, Ni ... và với đối tượng mẫu ở đây là mẫu máu, và nước tiểu, chúng tôi sẽ khảo sát ảnh hưởng của các nguyên tố sau: As, Se, Cu, Fe ... 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số nguyên tố trong phép đo As Để khảo sát ảnh hưởng của các nguyên tố đến phép đo phổ của As, chúng tôi sử dụng các dung dịch As chuẩn nồng độ 2 ng/ml và 10 ng/ml, thêm vào đó một lượng chính xác nguyên tố cần khảo sát sao cho nồng độ của nguyên tố thêm trong dung dịch nằm trong khoảng nồng độ mà nó có thể có mặt trong đối tượng Nuoc.com.vn Page 59 mẫu đang khảo sát là máu và nước tiểu (có tính đến hệ số pha loãng của mẫu). Cụ thể như sau: 3.4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của Se lên As Theo tài liệu thì hàm lượng Se trong máu của người bình thường là 80120 ng/ml và trong nước tiểu là 2550 ng/ml, do đó nồng độ Se trong dung dịch khảo sát được thay đổi từ 0 ng/ml đến 16 ng/ml, kết quả thu được như bảng 12 Bảng 12: Ảnh hưởng của Se đến độ hấp thụ của As STT Nồng độ Se trong dung dịch (ng/ml) Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (As 2 ng/ml) 1 0 0,3465 0.0681 2 4 0,3472 0.0699 3 8 0,3484 0.0665 4 12 0,3456 0.0672 5 16 0,3474 0.0681 Nhận xét: Với khoảng nồng độ Se trong dung dịch đo phổ từ 0 đến 16 ng/ml không ảnh hưởng đến độ hấp thụ nguyên tử của As. 3.4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của Fe Để khảo sát ảnh hưởng của Fe trong dung dịch đo phổ, chúng tôi sử dụng các dung dịch chuẩn Fe có nồng độ thay đổi từ 0 ng/ml đến 50 ng/ml. Nuoc.com.vn Page 60 Bảng 13: Ảnh hưởng của Fe đến độ hấp thụ của As STT Nồng độ Fe trong dung dịch (g/ml) Độ hấp thụ As (10 ng/ml) Độ hấp thụ As (2ng/ml) 1 0 0,3420 0,0721 2 10 0,3415 0,0692 3 20 0,3431 0,0723 4 30 0,3443 0,0711 5 40 0,3418 0,0695 6 50 0,3432 0,0712 Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ Fe khảo sát, Fe không ảnh hưởng đến phổ hấp thụ nguyên tử của As. 3.4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của Cu Theo tính chất và hàm lượng Cu có trong máu và nước tiểu, nồng độ Cu dùng để khảo sát ảnh hưởng được thay đổi từ 10 ng/ml đến 20 ng/ml. Kết quả trong bảng 17 cho thấy trong khoảng nồng độ Cu khảo sát, Cu không ảnh hưởng đến phổ hấp thụ nguyên tử của As. Bảng 14: Ảnh hưởng của Cu đến độ hấp thụ của As STT Nồng độ Cu trong dung dịch ng/ml Độ hấp thụ (As 10 ng/ml) Độ hấp thụ (As 2 ng/ml) Nuoc.com.vn Page 61 1 0 0,3462 0,0716 2 10 0,3486 0,0688 3 20 0,3458 0,0691 4 40 0,3454 0,0725 5 80 0,3473 0,0691 6 120 0,3449 0,0689 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số nguyên tố trong phép đo Se 3.4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của As lên Se Dung dịch khảo sát là dung dịch Se (III) 5, 10 ng/ml. Theo tính chất và hàm lượng As có trong máu và nước tiểu, nồng độ As dùng để khảo sát ảnh hưởng được thay đổi từ 10g/l đến 50g/l. Kết quả trong bảng 11 cho thấy trong khoảng nồng độ As khảo sát, As không ảnh hưởng đến phổ hấp thụ nguyên tử của Se. Bảng 15: Ảnh hưởng của As đến độ hấp thụ của Se STT Nồng độ As trong dung dịch (ng/ml) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 5 ng/ml) 1 0 0,1473 0,0792 2 10 0,1462 0,0764 3 20 0,1475 0,0785 4 40 0,1484 0,0791 Nuoc.com.vn Page 62 5 60 0,1461 0,0766 6 100 0,1462 0,0773 3.4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của Fe Dung dịch Se khảo sát là 5 ng/ml và 10 ng/ml Theo tính chất và hàm lượng Fe có trong máu và nước tiểu, nồng độ Fe dùng để khảo sát ảnh hưởng được thay đổi từ 5 g/l đến 160 g/l. Bảng 16: Ảnh hưởng của Fe đến độ hấp thụ của Se STT Nồng độ Fe trong dung dịch (g/ml) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 5 ng/ml) 1 0 0,1585 0,0795 2 5 0,1591 0,0804 3 10 0,1622 0,0772 4 20 0,1615 0,0811 5 30 0,1594 0,0795 6 40 0,1603 0,0814 Kết quả trong bảng 14 cho thấy trong khoảng nồng độ Fe khảo sát, Fe không ảnh hưởng đến phổ hấp thụ nguyên tử của Se. 3.4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của Cu Dung dịch Se khảo sát là 5 ng/ml và 10 ng/ml Nuoc.com.vn Page 63 Theo hàm lượng Cu có trong máu và nước tiểu, nồng độ Cu dùng để khảo sát ảnh hưởng được thay đổi từ 10 ng/ml đến 120ng/ml. Bảng 17: Ảnh hưởng của Cu đến độ hấp thụ của Se STT Nồng độ Cu trong dung dịch (ng/ml) Độ hấp thụ (Se 10 ng/ml) Độ hấp thụ (Se 5 ng/ml) 1 0 0,1515 0,0816 2 10 0,1533 0,0842 3 20 0,1505 0,0811 4 40 0,1533 0,0835 5 80 0,1521 0,0829 6 120 0,1501 0,0811 Kết quả trong bảng 15 cho thấy trong khoảng nồng độ Cu khảo sát, Cu không ảnh hưởng đến phổ hấp thụ nguyên tử của Se. 3.5. Tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn 3.5.1. Các điều kiện phân tích mẫu thật Điều kiện phân tích As: 1 Khí mang Ar ml/phút 70 2 Nồng độ HCl dẫn vào bình phản ứng N 5 Nuoc.com.vn Page 64 3 Tốc độ bơm HCl ml/phút 2,0 4 Nồng độ chất khử NaBH4 % 0,5 5 Tốc độ bơm chất khử NaBH4 ml/phút 2,0 6 Nồng độ KI trong phản ứng khử As % 1,8 7 Thời gian khử As (+5) về As (+3) phút 40 8 Tốc độ hút mẫu ml/phút 6,0 Điều kiện phân tích Se: 1 Khí mang Ar ml/phút 70 2 Nồng độ HCl dẫn vào bình phản ứng N 5 3 Tốc độ bơm HCl ml/phút 2,0 4 Nồng độ chất khử NaBH4 % 0,6 5 Tốc độ bơm chất khử NaBH4 ml/phút 2,0 6 Nồng độ HCl trong quá trình khử N 6 7 Thời gian khử Se phút 60 8 Tốc độ hút mẫu ml/phút 6,0 3.5.2. Lấy mẫu và bảo quản mẫu 3.5.2.1. Mẫu máu Lấy khoảng 5 ml mẫu máu vào ống nghiệm có chứa sẵn chất chống đông (1,5mg EDTA cho 1ml máu ), bảo quản lạnh. 3.5.2.2. Mẫu nước tiểu Nuoc.com.vn Page 65 Nước tiểu được lấy đều đặn trong 24 h, trộn đều, ghi lại thể tích mẫu tổng số. Lấy ra khoảng 50 ml mẫu cho vào bình teflon và bảo quản lạnh. 3.5.3. Xử lí mẫu Xử lí mẫu là việc làm đầu tiên của người làm phân tích. Nếu xử lí mẫu không tốt thì tất nhiên sẽ được kết quả phân tích sai, hoặc nhỏ (làm mất), hoặc lớn (làm nhiễm bẩn thêm). Trong phân tích lượng vết, giai đoạn xử lí mẫu cực kì quan trọng đối với cả quá trình phân tích Để tiến hành nghiên cứu vấn đề này, chúng tôi tham khảo các qui trình phân tích đã có về cách phân huỷ mẫu máu và nước tiểu. Phương pháp phân huỷ mẫu được nhiều tác giả sử dụng thành công, đó là kĩ thuật phân huỷ ướt sử dụng hỗn hợp axit HNO3, H2SO4 và HClO4. Lấy 2 ml mẫu nước tiểu hoặc mẫu máu vào ống phá mẫu 30ml, thêm khoảng 5 ml nước cất, thêm 2 ml HNO3 đặc và 0,5 ml H2SO4 đặc, đun trên bếp cách cát đến sôi nhẹ khoảng 30 phút. Để nguội thêm 0,5 ml HClO4 70%, đun trên bếp cách cát cho tới khi dung dịch không màu và xuất hiện nhiều khói trắng của SO2. Nếu mẫu vẫn còn màu thì lặp lại quá trình trên cho tới khi mẫu không màu thì quá trình phá mẫu coi như hoàn toàn. Để có thể áp dụng qui trình này, chúng tôi tiến hành phân tích một số mẫu thêm chuẩn để tính hiệu suất thu hồi của chúng như sau: thêm vào mẫu thật 62,5 ng As vào mẫu nước tiểu, 25 ng As vào mẫu máu, 62,5 ng Se vào mẫu máu, 25 ng Se vào mẫu nước tiểu. Tiến hành phá mẫu, khử As (V) và Se (VI), định mức 25 ml được dung dịch có nồng độ tăng () so với mẫu thật tương ứng là 5ng/ml As, 2ng/ml As, 5ng/ml Se, 2 ng/ml Se, từ phổ hấp thụ nguyên tử thu được nồng độ As, Se thêm (  x ) tính toán hiếu suất thu hồi theo công thức (5) Nuoc.com.vn Page 66 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi As, Se được chỉ ra trong bảng 18, 19. Bảng 18: Hiệu suất thu hồi As TT Kí hiệu mẫu thật ABS của As trong dung dịch mẫu Nồng độ As trong dung dịch mẫu (ng/ml) Nồng độ A s thêm  (ng/ml) ABS As của dung dịch mẫu sau thêm Nồng độ As (ng/ml) Hiệu suất thu hồi (%) Sau thêm  x Mẫu nước tiểu (kết quả trung bình của 5 thí nghiệm lặp) 1 PL-18- Hoang Đuc Vinh 0,3161 9,6 5 0,4821 14,9 5,3 106,0 2 PL-17- Hoang Xuan Hien 0,3289 10,0 5 0,4797 14,7 4,7 93,0 3 PL-18- Pham Thi Hung 0,2134 6,4 5 0,3674 11,2 4,8 96,0 4 PL-14- Nguyen Trung Tan 0,2519 7,6 5 0,4059 12,4 4,8 96,0 TT Kí hiệu mẫu thật ABS của As trong dung dịch mẫu Nồng độ As trong dung dịch mẫu (ng/ml) Nồng độ A s thêm  (ng/ml) ABS As của dung dịch mẫu sau thêm Nồng độ As (ng/ml) Hiệu suất thu hồi (%) Sau thêm  x Mẫu máu (kết quả trung bình của 4 thí nghiệm lặp) 1 PL-18- Hoang Đuc 0,0689 1,9 2 0,1299 3,8 1,9 95,0 Nuoc.com.vn Page 67 Vinh 2 PL-17- Hoang Xuan Hien 0,0722 2,0 2 0,1351 4,2 2,2 110,0 3 PL-18- Pham Thi Hung 0,0625 1,7 2 0,1235 3,6 1,9 95,0 4 PL-14- Nguyen Trung Tan 0,0625 1,7 2 0,1235 3,6 1,9 95,0 Nhận xét: hiệu suất thu hồi đều đạt từ 93,0% đến 110,0%. Bảng 19: Hiệu suất thu hồi Se TT Kí hiệu mẫu thật ABS của Se trong dung dịch mẫu Nồng độ Se trong dung dịch mẫu (ng/ml) Nồng độ Se thêm  (ng/ml) ABS Se của dung dịch mẫu sau thêm Nồng độ Se (ng/ml) Hiệu suất thu hồi (%) Sau thêm  x Mẫu máu (kết quả trung bình của 4 thí nghiệm lặp) 1 HT -2 - Nguyen Thi Lien 0.1107 6,8 5,0 0,1877 11,6 4,8 96,0 2 HT -2 - Vu Van Tuyen 0,1284 7,9 5,0 0,207 12,8 4,9 98,0 3 HT -6 - Nguyen Hong Canh 0,1437 8,9 5,0 0,2211 13,7 4,8 96,0 4 HT -7 - Tran Minh Phan 0,1495 9,2 5,0 0,2263 14,0 4,8 96,0 Nuoc.com.vn Page 68 TT Kí hiệu mẫu thật ABS của Se trong dung dịch mẫu Nồng độ Se trong dung dịch mẫu (ng/ml) Nồng độ Se thêm  (ng/ml) ABS Se của dung dịch mẫu sau thêm Nồng độ Se (ng/ml) Hiệu suất thu hồi (%) Mẫu nước tiểu (kết quả trung bình của 5 thí nghiệm lặp) 1 HT -2 - Nguyen Thi Lien 0,0375 2,3 2,0 0,0677 4,2 1,9 95,0 2 HT -2 - Vu Van Tuyen 0,0442 2,7 2,0 0,0745 4,6 1,9 95,0 3 HT -6 - Nguyen Hong Canh 0,0579 3,6 2,0 0,0889 5,5 1,9 95,0 4 HT -7 - Tran Minh Phan 0,0415 2,5 2,0 0,0745 4,6 2,1 105,0 Nhận xét: hiệu suất thu hồi đều đạt từ 95,0% đến 105,0% Vậy qui trình phân huỷ mẫu này hoàn toàn có thể áp dụng được cho việc phân tích As và Se trong mẫu máu và nước tiểu. 3.6. Đánh giá phương pháp 3.6.1. Tính toán GHPH và GHĐL Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định GHPH và GHĐL như sau: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn As có nồng độ khác nhau: 0; 0,5; ; 2,5; 5; 10; 15; 20 ng/ml, đem đo độ hấp thụ, thiết lập được phương trình đường chuẩn: y=a+bx=0,0063+0,0322x Bảng 20: Độ hấp thụ theo thực nghiệm và theo phương trình hồi qui x (ng/ml) 0 0,5 2,5 5 10 15 20 yi 0,0034 0,0275 0,0854 0,1725 0,3298 0,4899 0,6482 Nuoc.com.vn Page 69 Y 0,008 0,02405 0,08825 0,1685 0,329 0,4895 0,65 Tính được So=0,0035, vậy giới hạn phát hiện là: GHPH=3*S0/b=3*0,0035/0,0322=0,34ng/ml As GHĐL=10*So/b=10*0,0035/,0322= 1,0 ng/ml As + Tương tự với Se, các nồng độ của dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn: 0; 2; 5; 10; 15; 20; 30 ng/ml, phương trình đường chuẩn là: y =0,0016+0,0162x Bảng 21: Độ hấp thụ theo thực nghiệm và theo phương trình hồi qui x (ng/ml) 0 2 5 10 15 20 30 yi 0,0019 0,0361 0,0859 0,1598 0,2412 0,3215 0,4915 Y 0,0016 0,034 0,0826 0,1636 0,2446 0,3256 0,4876 Tính được So=0,0038, vậy giới hạn phát hiện là: GHPH=3*S0/b=3*0,0038/0,0162=0,70ng/ml Se GHĐL=10*So/b=10*0,0038/,0162= 2,0 ng/ml Se 3.6.2. Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp Để đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi chọn 5 cấp hàm lượng nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn để nghiên cứu, bằng cách Nuoc.com.vn Page 70 thêm dung dịch chuẩn vào mẫu thực, mỗi thí nghiệm làm lặp 4, 5 lần, thu được kết quả như trong bảng 22, 23. Bảng 24: Độ lệch chuẩn tương đối và giá trị t thực nghiệm khi xác định As Câp hàm lượng (ng/ml) Lượn g As thêm (ng) Giá trị xác định As (ng/ml Sx (%) Giá trị t thực nghiệm x1 x2 x3 x4 x5 xTB Nền mẫu máu 12,5 25 11,5 14,1 14,6 13,1 15,7 13,8 11,5 1,8 25 50 27,1 28,3 24,8 23,6 28,7 26,5 8,4 1,5 Nền mẫu nước tiểu 62,5 125 60,6 58,6 59,1 63,5 58,7 60,1 3,4 2,6 125 250 119,9 121,5 125,7 126,1 119,3 122,5 2,6 1,7 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của các thí nghiệm đều nhỏ hơn 12%, giá trị t thực nghiệm lớn nhất là 2,6 Bảng 23: Độ lệch chuẩn tương đối và giá trị t thực nghiệm khi xác định Se Nuoc.com.vn Page 71 Cấp hàm lượng (ng/ml) Lượn g Se thêm (ng) Giá trị xác định Se (ng/ml) Sx (%) Giá trị t thực nghiệm x1 x2 x3 x4 x5 xTB Nền mẫu nước tiểu 25,0 50,0 24,7 23,9 27,8 27,4 27,7 26,3 7,1 1,6 62,5 125,0 61,4 63,1 64,5 61,1 66,9 63,4 3,8 0,8 Nền mẫu máu 80 160,0 82,2 83,8 79,6 77,5 78,2 80,3 3,3 0,3 120 240,0 117,8 116,5 121,2 122,3 120,1 119,6 2,0 0,4 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của các thí nghiệm đều nhỏ hơn 7,1%, giá trị t thực nghiệm lớn nhất là 1,6 Theo chuẩn student, với độ tin cậy p=0,95 ; số bậc tự do là 4 thì tlí thuyết =2,8. Kết luận:  Về độ lặp lai: Độ lệch chuẩn tương đổi của các thí nghiệm đều nhỏ, kết qủa phân tích lặp lại.  Về độ chính xác: Theo chuẩn student, với độ tin cậy p=0,95 ; số bậc tự do là 4 thì tbảng=2,8, các mẫu chuẩn đã phân tích đều cho các giá trị ttính < tlí thuyết nên các kết quả này tin cậy được, hàm lượng  x gần với hàm lượng chuẩn. Nuoc.com.vn Page 72 3.7. Phân tích mẫu thực Ứng dụng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hidrua hoá phân tích Se, As, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu máu và nước tiểu dân cư và bệnh nhân các xã: Hà Thượng – Tân Linh, Mục Linh – Thái Nguyên. Mỗi mẫu được làm lặp hai lần Sau đây là một số kết quả phân tích : Bảng 24: Kết quả phân tích As trong mẫu máu STT Tên mẫu Số lần phân tích Hàm lượng trung bình (ng/ml) Cận tin cậy n tS P=0,95 Khoảng tin cậy n tSx  (ng/ml) 1 HT – 2 - Vũ Văn Tuyên 5 30.1 2.1 30.1 2.1 2 Xóm 12 - Dương Thị Thoa 5 42.7 2.2 42.7 2.2 3 HT – 7 - Vũ Thị Tý 5 35.2 1.8 35.21.8 4 Xóm 12 - Phạm Thị Hằng 5 56.5 3.1 56.53.1 5 HT – 2 – Nguyễn Mạnh Quân 5 36.4 1.8 36.41.8 6 HT – 2- Nguyễn Thị Yừn 5 25.3 3.7 25.33.7 7 HT – 4 - Nguyễn Quốc Bảo 5 45.3 2.5 45.32.5 Nuoc.com.vn Page 73 Bảng 25: Kết quả phân tích As trong mẫu nước tiểu STT Tên mẫu Số lần phân tích Hàm lượng trung bình (ng/ml) Cận tin cậy n tS P=0,95 Khoảng tin cậy n tSx  (ng/ml) 1 HT – 2 - Vũ Văn Tuyên 5 125.7 5.1 125.75.1 2 Xóm 12 – Dương Thị Thoa 5 152.9 5.5 152.95.5 3 HT – 7 – Vũ Thị Tý 5 109.9 7.1 109.97.1 4 Xóm 12 - Phạm Thị Hằng 5 89.4 4.4 89.44.4 5 HT – 2 - Nguyễn Mạnh Quân 5 95.3 7.2 95.37.2 6 HT – 2- Nguyễn Thị Yừn 5 54.8 5.2 54.85.2 7 HT – 4 - Nguyễn Quốc Bảo 5 164.5 5.1 164.55.1 Nuoc.com.vn Page 74 Bảng 26: Kết quả phân tích Se trong mẫu máu STT Tên mẫu Số lần phân tích Hàm lượng trung bình (ng/ml) Cận tin cậy n tS P=0,95 Khoảng tin cậy n tSx  (ng/ml) 1 HT – 3 – Nguyễn Văn Bằng 5 109.9 2.2 109.92.2 2 HT – 7 – Nguyễn Văn Hoan 5 89.4 3.6 89.43.6 3 Dương Kim Duy 5 99.8 7.1 99.87.1 4 HT – 4 - Nguyễn Quốc Bảo 5 85.6 5.1 85.65.1 5 PL – 18 - Hoàng Đức Vinh 5 96.3 2.9 96.32.9 6 PL – 17 - Nguyễn Thị Cừ 5 94.4 3.8 94.43.8 7 PL – 17 - Hoàng Thị Hằng 5 114.6 2.3 114.62.3 Nuoc.com.vn Page 75 Bảng 27: Kết quả phân tích Se trong mẫu nước tiểu STT Tên mẫu Số lần phân tích Hàm lượng trung bình (ng/ml) Cận tin cậy n tS P=0,95 Khoảng tin cậy n tSx  (ng/ml) 1 HT – 3 – Nguyễn Văn Bằng 5 30.1 2.7 30.12.7 2 HT – 7 – Nguyễn Văn Hoan 5 42.7 3.8 42.73.8 3 Dương Kim Duy 5 35.2 3.2 35.23.2 4 HT – 4 - Nguyễn Quốc Bảo 5 56.5 3.4 56.53.4 5 PL – 18 - Hoàng Đức Vinh 5 36.4 2.9 36.42.9 6 PL – 17 - Nguyễn Thị Cừ 5 25.3 2.3 25.32.3 7 PL – 17 - Hoàng Thị Hằng 5 45.3 1.8 45.31.8 Nuoc.com.vn Page 76 KẾT LUẬN Với mục đích đặt ra cho luận văn là xác định hàm lượng As, Se trong mẫu máu và mẫu nước tiểu bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật Hidrua hoá, chúng tôi đã tìm hiểu đối tượng, tham khảo tài liệu và lần lượt tiến hành các bước thí nghiệm khảo sát chọn các điều kiện thích hợp rối phân tích các mẫu thêm chuẩn, mẫu thực. Các kết quả thu được như sau: 1. Chọn được các thông số phù hợp máy đo xác định As, Se. 2. Khảo sát và chọn được các điều kiện thích hợp để tạo hợp chất hidrua của As, Se. 3. Kiểm tra ảnh hưởng của các nguyên tố có mặt trong đối tượng nghiên cứu 4. Tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn, mẵu thực để kiểm tra phương pháp phân tích đã thu được kết quả tốt. 5. Từ đó xây dựng được phương pháp xác định As, Se trong các mẫu máu và nước tiểu. 6. Ứng dụng qui trình để phân tích một số mẫu thật. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nuoc.com.vn Page 77 (1) Phạm Luận , Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử , Giáo trình cơ sở lí thuyết, Hà Nội. (2) Phạm Luận, Giáo trình hướng dẫn về những vấn đề cơ sở của các kỹ thuật xử lí mẫu phân tích . (3) Lê Đức Ngọc (1996) Xử lí số liệu và kế hoạch hoá thực nghiệm. Bài giảng lí thuyết, Đại học Quốc gia Hà nội, tr.15-21. (4) Phân tích định lượng – Tập2, NXB Giáo dục, Hà nội 1977. (5) Vũ Đình Vinh, Hướng dẫn sử dẫn sử dụng các xét nghiệm sinh hoá, NXB Y học 1996. (6) Đại học Khoc học Tự nhiên, Hội thảo Quốc tế- Ô nhiễm Asen: Hiện trạng tác động đến sức khoẻ con người và các giải pháp phòng ngừa. 2000. (7) TCVN 6182/1996- Chất lượng nước, xác định As trong nước. (8) Cotton. F. Wilkinson. G. Cơ sở lí thuyết hoá vô cơ tập 1. Người dịch: Lê Mậu Quyền, Lê Chí Kiên, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, 1984, trang 178. (9) Cotton. F. Wilkinson. G. Cơ sở lí thuyết hoá vô cơ tập 2. Người dịch: Lê Mậu Quyền, Lê Chí Kiên, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, 1984, trang 79. (10) W. Franklin Smyth, Analytical Chemistry of Complex Matrices. (11) Trace elements in human nutrition and health. (12) USA, Standard Methods for The examination of Water and Wastewater Nuoc.com.vn Page 78 (13) Miller J.C, Miller J.N (1998), Statistic for analytical chemistry, JohnWiley & Sons. (14) Inernational Programme on Chemical Safety, Environmental Health Criteria 58, 1986. (15) Paul Moor and John Cobby, Introductory Statistics for Environmentalists. (16) IM. Kolthoff&Phillip J. Elving, Treasise on Analytical Chemistry, 140- 201 (17) W. Franklin Smyth, Analytical Chemistry of Complex Matrixes, 132-135, 1996. (18) G. E. Batley, Analytica Chimica acta, 187, 1986, 109-111. (19) Donald. C. Reamer & Claude Veillon, Analytical Chemistry, 53, 1981, 2166-2169. (20) I.G. Gokmen & E. Abdlgader, Analyst, 119, 1994, 703-707. (21) Iain Harrison, David Little John & Gordon. S. Fell, Analyst, 121, 1996, 189-194. (22) Keli & Sam. F. Y. Li, Analyst, 120, 1995, 361-366. (23) Kristina Ryrzynska, analyst, 120, 1995, 361-366. (24) Solirios Raptis & Wolfhard Wegscheider & Gunter Knapp, Analytical Chemistry, 50, 1980, 1292-1296. (25) Chimica acta, 274, 1993, 219-224. (26) Sonja Arpadjan, Anal.Chem. Vol 122 March, 1997, p.243-246. Nuoc.com.vn Page 79 (27) Atomic Absorption Data book- Unicam Analytical Systems- Philips sientific-Cambridge England, 1988. (28) J.Agtednbos and D.Bax, Mechanisms in hydride generation AAS, Anal.Chem. 323, 1986, 783-787 (29) Arsenic in ground water in six districs of best Bengal, Iidia – The biggest arsenic alamity in the world. Analytical Chemistry, vol.120, March, 1975, p. 643. (30) Determination arsenic in animal tissue using graphite furnace atomic absorption, vol.18, No1, Janualy-February, 1979. (31) Sequential determination of arsenic, selenium, antimony and tellurium in Foods via rapid hydride evolution and atomic absorption spectrometry, Analytical Chemistry, vol.48, No1, January 1976, 120-125. (32) T.Nakahara, Application of hydride generation techniques in atomic absorption, atomic fluorescene and Plasma atomic emission spectroscopy, Japan, 1982. (33) J.E. Oldfield, Professor Emeritus ( Oregon State University, Corvallis (Oregon), USA), Selenium Supplimentation via Fertilizer Amendment, Selenium-Telenium Development Association, Belgium 1998. (34) Asenic, Environment Health Criteria 18, Geneva 1981. (35) Analyst, 120, 1995, 1433-1436. (36) Hisatake Narasaki & Masahiko Ikeda, Analytical Chemistry, 56, 1984, 2059-2063. Nuoc.com.vn Page 80 (37) Gary. D. Chrisrian, Edward. C. Knobock & William A. Purdy, Analytical Chemistry, 35, 1963, 1128-1131. (38) Kuen Y. Chiou &Oliver K. Manuel, Anlytical Chemistry, 56, 1984, 2721 – 2723. (39) Analytical Detection Limit Guidance, Wisconssin Departement of Nature Resourses Labotory Certification Program, April 1996. (40) Crisco division of animal production – Report (91-92) Australia p15, 1992. (41) Guanhong Tao & Elo. H. Hansen, Analyst, 119, 1994, 333-337 (42) Steffen Nielssen, Jens Sloth & Elo Hansen, Analyst, 121, 1996, 31 Nuoc.com.vn Page 81