Đề tài Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

SL B¹ch cÇu 74,17 ± 23, 07 31,76 ± 9,32 25,55 ± 7,16 36,18 ± 10,4 p < 0,005 % Thùc bµo 31,05 ± 5,05 20,69 ± 2,66 18,45 ± 2,39 26,22 ± 3,49 p < 0,01 ChØ sè TBµo 4,23 ± 0,58 4,11 ± 0,32 4,62 ± 0,79 3,97 ± 0,51 p < 0,05 QuÇng DH 16,44 ± 7,73 28,12 ± 12,02 31 ± 10,25 49,6 ±32,27 p > 0,05 Qua b¶ng b¶ng trªn ta thÊy: Chuét t¹i c¸c l« thÝ nghiÖm cã träng l−îng c¬ thÓ, h¹ch, l¸ch vµ tuyÕn øc hÇu nh− kh«ng thay ®æi so víi ®èi chøng. Sè l−îng tÕ bµo tuû cã sù thay ®æi nh−ng kh«ng cã ý nghÜa thèng kª (p>0,05). Sè l−îng b¹ch cÇu t¹i l« thÝ nghiÖm lín h¬n h¼n so víi c¸c l« ®èi chøng. ChØ sè thùc bµo còng nh− % thùc bµo cña l« thÝ nghiÖm so víi c¸c l« ®èi chøng ®Òu cã ý nghÜa thèng kª (p<0,05). Tõ nh÷ng kÕt qu¶ trªn cã thÓ rót ra mét sè kÕt luËn - ChÕ phÈm cã t¸c dông phôc håi sè l−îng tÕ bµo b¹ch cÇu m¸u ngo¹i vi cña ®éng vËt g©y suy gi¶m miÔn dÞch thùc nghiÖm b»ng chiÕu x¹ - ChÕ phÈm cã t¸c dông phôc håi kh¶ n¨ng thùc bµo cña ®¹i thùc bµo æ bông g©y suy gi¶m miÔn dÞch thùc nghiÖm b»ng chiÕu x¹. 42 Quy tr×nh t¸ch chiÕt β- glucan Chñng nÊm men Saccharomyces cerevisiae Ly t©m 5000 vßng/phót, 15 phót Lªn men nh©n sinh khèi 43h, 300C, 200 vßng/phót Ly t©m 5000 vßng/phót, 15 phót T¸ch thµnh tÕ bµo nÊm men β- glucan T¸ch chitin, manprotein, 750C, 18h Ly t©m 4000 vßng/phót,10 phót, 40C 43 Quy tr×nh tinh s¹ch β-glucan β -glucan ChiÕt kiÒm 3%, khuÊy 750C, 2h Ly t©m thu cÆn, 2000 v/p, 10phót, 40C Röa 2 lÇn b»ng cån, 10 phót Ly t©m thu cÆn, 2000v/p trong 10 phót Röa lÇn 3 b»ng dietylete, trong 15 phót Ly t©m thu cÆn, 3000vßng/ phót, trong 10 phót SÊy kh« ch©n kh«ng 44 3.3 NGHI£N CøU C¤NG NGHÖ s¶n xuÊt xylitol 3.3.1. Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt xyloza 3.3.1.1. X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn thñy ph©n nguyªn liÖu B¶ng 3.30. PhÇn tr¨m ®−êng khö cã trong dÞch thuû ph©n trÊu ë c¸c ®iÒu kiÖn I, II, III, IV, V. MÉu §iÒu kiÖn thñy ph©n % ®−êng khö I Axit 0,75%, 60’ 3,29 II Axit 3%, 60’ 3,17 III Axit 3%, 120’ 3,44 IV Axit 3%, 120’, 2 giai ®o¹n - V Axit 75%,120’, 2 giai ®o¹n 3,40 XÕp theo thø tù gi¶m dÇn cña % ®−êng khö ®¹t ®−îc ta sÏ cã ®iÒu kiÖn III cã kÕt qu¶ cao nhÊt, sau ®ã ®Õn V, I vµ II. C¸c ®iÒu kiÖn III, IV, V ®−îc tiÕn hµnh víi thêi gian 120 phót ®Òu cho kÕt qu¶ nång ®é ®−êng khö cao h¬n so víi ®iÒu kiÖn I vµ II chØ tiÕn hµnh víi thêi gian 60 phót, chøng tá thêi gian cã ¶nh h−ëng ®Õn hiÖu suÊt thñy ph©n. 3.3.1.2 Lùa chän nguyªn liÖu thñy ph©n B¶ng 3.31. KÕt qu¶ thñy ph©n c¸c lo¹i nguyªn liÖu kh¸c nhau STT Lo¹i nguyªn liÖu Hµm l−îng ®−êng khö thu ®−îc (%) 1 R¬m 3,32 2 B· mÝa 3,43 3 TrÊu 3,33 4 Lâi ng« 3.75 KÕt qu¶ ë b¶ng 3.31 cho thÊy lâi ng« lµ lo¹i nguyªn liÖu cho hµm l−îng ®−êng khö cao nhÊt khi thñy ph©n b»ng axit. 3.3.1.3 Thñy ph©n nguyªn liÖu ®Ó thu håi xyloza TØ lÖ nguyªn liÖu lµ 70 kg lâi ng« trén víi 300 lÝt axit H2SO4 0.75% trong ®iÒu kiÖn 121°C trong 60 phót. Sau ®ã dÞch thñy ph©n ®−îc chØnh vÒ pH 4.5 b»ng Ca(OH)2, kÕt tña ®−îc lo¹i bá b»ng thiÕt bÞ läc khung b¶n, dÞch thñy ph©n ®−îc c« 45 ®Æc b»ng m¸y c« ch©n kh«ng. KÕt tña xuÊt hiÖn trong qu¸ tr×nh c« ®−îc lo¹i bá mét lÇn n÷a b»ng b−íc läc khung b¶n. DÞch thu ®−îc sau qu¸ tr×nh c« ®Æc vµ läc gi÷ ë 2- 8°C ®Ó phôc vô cho c¸c thÝ nghiÖm lªn men vÒ sau. B¶ng 3.32. Hµm l−îng glucoza vµ xyloza cã trong dÞch thñy ph©n tr−íc vµ sau khi c« ®Æc Glucoza (%) Xyloza (%) Dich thñy ph©n gèc 0,71 3,02 DÞch thñy ph©n c« ®Æc 2,79 11,75 3.3.1.4. Nghiªn cøu c«ng nghÖ thu håi vµ lµm s¹ch xyloza Xö lý dÞch thñy ph©n Qu¸ tr×nh xö lý ®−îc thùc hiÖn theo c¸c b−íc sau: Pha 100ml dung dÞch Ca(OH)2 18.3% sau ®ã bæ sung lÇn l−ît 0ml, 2ml, 3.2ml, 4ml, 5ml dung dÞch trªn vµo 5 èng Falcon chøa s½n 35ml dÞch thñy ph©n ®· c« ®Æc. L¾c ®Òu ®Ó kÕt tña trong 5 giê, tiÕp tôc bæ sung thªm n−íc cÊt vµo c¸c èng trªn sao cho ®ñ 50ml. §em c¸c èng nµy ly t©m 5000 vßng/phót trong 10 phót gi÷ dÞch, sÊy kh« èng råi ®em c©n x¸c ®Þnh khèi l−îng tña trong tõng èng. LÊy 25ml dÞch thu ®−îc cho vµo èng Falcon, bæ sung H3PO4 vµo cho ®Õn khi ®¹t pH= 4.5. L¾c ®Òu ®Ó kÕt tña trong 5 giê råi l¹i ®em ly t©m 5000 vßng/phót trong 10 phót gi÷ dÞch, sÊy kh« èng råi ®em c©n x¸c ®Þnh khèi l−îng tña trong tõng èng. B¶ng 3.33. KÕt qu¶ xö lý dÞch thñy ph©n lâi ng« b»ng Ca(OH)2 vµ H3PO4 KÕt tña b»ng Ca(OH)2 KÕt tña b»ng H3PO4 MÉu VCa(OH)2 (ml) pH m(g) pH m(g) 1 0 4,5 0,05 4,5 0,635 2 2,0 8,5 0,46 4,5 0,798 3 3,2 9,0 0,48 4,5 1,426 4 4,0 9,0 0,56 4,5 2,485 5 5,0 9,5 0,56 4,5 3,044 Sè liÖu b¶ng 3.33 cho thÊy c¸c gèc sulphat ®−îc kÕt tña tèi ®a ë pH 9.0. TiÕp sau ®ã, l−îng Ca d− thõa ®−îc lo¹i bá b»ng c¸ch thªm H3PO4. Dùa vµo kÕt qu¶ trªn chóng t«i ®· ®−a ra quy tr×nh xö lý dÞch thñy ph©n lâi ng« sau khi ®· c« ®Æc nh− sau: DTP c« ®Æc → Läc qua m¸y läc khung b¶n → chØnh vÒ pH 2.0 b»ng H2SO4 98%, ®Ó kÕt tña trong 24h → Läc qua m¸y läc khung b¶n → chØnh vÒ pH 7.0 b»ng 46 Ca(OH)2, ®Ó kÕt tña trong 5h → Läc qua m¸y läc khung b¶n → chØnh vÒ pH 9.0 b»ng Ca(OH)2 tinh khiÕt, ®Ó kÕt tña trong 24h → Läc qua m¸y läc khung b¶n → chØnh vÒ pH 4.5 b»ng H3PO4 ®Ó kÕt tña trong 24h → Läc qua m¸y läc khung b¶n → Thu dÞch vµ b¶o qu¶n ë -20oC. So s¸nh dÞch thñy ph©n §Ó ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng mäc cña c¸c chñng nÊm men trªn m«i tr−êng dÞch thñy ph©n thu ®−îc, còng nh− so s¸nh ®é ®éc cña c¸c dÞch thñy ph©n kh¸c nhau (dÞch thñy ph©n r¬m vµ lâi ng«). Chóng t«i sö dông 30 chñng nÊm men cÊy trªn c¸c m«i tr−êng chøa dÞch thñy ph©n lâi ng« vµ r¬m víi c¸c nång ®é kh¸c nhau (tÝnh theo hµm l−îng ®−êng khö). Sau 1 tuÇn nu«i cÊy ë 28°C, quan s¸t kh¶ n¨ng mäc cña c¸c chñng trªn c¸c m«i tr−êng nµy. B¶ng 3.34. Sinh tr−ëng cña nÊm men trªn c¸c m«i tr−êng chøa dÞch thñy ph©n nång ®é kh¸c nhau M«i tr−êng dÞch thñy ph©n r¬m M«i tr−êng dÞch thñy ph©n lâi ng« STT Chñng 7% 10% 15% x2 (13%) x1 (26%) 1 Xyl 14 +++ - - +++ - 2 Xyl 18 + - - - - 3 Xyl 19 +++ - - +++ - 4 Xyl 2 +++ - - +++ - 5 Xyl 20 + - - +++ - 6 Xyl 23 +++ - - +++ - 7 Xyl 26 - - - +++ - 8 Xyl 30 - - - - - 9 Xyl 36 +++ - - +++ - 10 Xyl 4 + - - +++ - 11 Xyl 40 - - - +++ - 12 Xyl 44 - - - - - 13 Xyl 47 - - - +++ - 14 Xyl 5 - - - +++ - 15 Xyl 52 +++ - - +++ - 47 M«i tr−êng dÞch thñy ph©n r¬m M«i tr−êng dÞch thñy ph©n lâi ng« STT Chñng 7% 10% 15% x2 (13%) x1 (26%) 16 Xyl 63 - - +++ - 17 Xyl 68 - - - + - 18 Xyl 7 + - - +++ - 19 Xyl 74 - - - +++ - 20 Xyl 76 +++ - - - - 21 Xyl 81 +++ - - +++ - 22 Xyl 82 - - - + - 23 Xyl 85 - - - + - 24 Xyl 86 +++ - - +++ - 25 Xyl 88 + - - +++ - 26 Xyl 89 + - - +++ - 27 Xyl 9 +++ - - - - 28 Xyl 91 +++ - - +++ - 29 Xyl 93 - - - - - 30 Xyl 94 +++ + - +++ - Ghi chó: (+++) Sinh tr−ëng tèt, (+) Sinh tr−ëng yÕu, (-) Kh«ng sinh tr−ëng ë nång ®é ®−êng khö lµ 13% th× hÇu hÕt chñng nÊm men ®−îc nu«i cÊy ®Òu sinh tr−ëng kh¸ tèt vµ tån t¹i thµnh khuÈn l¹c riªng biÖt. Nh− vËy kh«ng nh÷ng dÞch thñy ph©n lâi ng« cã thµnh phÇn ®−êng khö cao h¬n dÞch thñy ph©n r¬m vµ ®é ®éc cña dÞch còng Ýt h¬n so víi dÞch thñy ph©n r¬m. V× vËy, viÖc sö dông dÞch thñy ph©n lâi ng« lµm nguån xyloza ®Ó lªn men xylitol lµ triÓn väng h¬n c¶. 3.3.2 Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men xylitol tõ xyloza 3.3.2.1 Ph©n lËp, tuyÓn chän vµ nghiªn cøu ®Æc ®iÓm chóng gièng Sau khi ph©n lËp vµ tuyÓn chän thu ®−îc 47 chñng nÊm men cã kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol mµ chóng t«i ph©n lËp ®−îc cã tíi 28 chñng thuéc vÒ chi Candida (chiÕm h¬n 59%) trong ®ã cã 11 chñng thuéc loµi Candida tropicalis, 12 chñng thuéc loµi Candida pseudolambica, 3 chñng thuéc loµi 48 Candida catenulata, 1 chñng thuéc loµi Candida membranifaciens vµ 1 chñng thuéc loµi Candida natalensis. Chi Pichia lµ chi cã sè l−îng chñng ®øng thø hai víi 14 loµi (chiÕm 30%) trong ®ã cã 6 chñng thuéc loµi Pichia anomala, 1 chñng thuéc loµi Pichia guilliermondii, 2 chñng thuéc loµi Pichia jadinii, 2 chñng thuéc loµi Pichia kluyveri , 2 chñng thuéc loµi Pichia ohmeri vµ 1 chñng thuéc loµi Pichia rabaulensis. C¸c chñng cßn l¹i gåm cã 2 chñng thuéc vÒ loµi Debaryomyces nepalensis, 1 chñng thuéc loµi Trichosporon asahii, 1 chñng thuéc loµi Trichosporon jirovecii vµ mét chñng thuéc vÒ mét loµi míi. Kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cña c¸c chñng nµy ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.35. B¶ng 3.35. HiÖu suÊt chyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cña 24 chñng nÊm men ®−îc ph©n läai b»ng ph−¬ng ph¸p ®äc tr×nh tù vïng D1/D2 cña ARN ribosom26S. STT Tªn loµi HiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol (%) 1 Candida catenulata Xyl-60 25,9 2 Candida membranifaciens Xyl-93 30,1 3 Candida natalensis Xyl-9 24,2 4 Candida pseudolambica Xyl-2 58,2 5 Candida pseudolambica Xyl-58 37,1 6 Candida pseudolambica Xyl-63 70,1 7 Candida pseudolambica Xyl-91 59,9 8 Candida tropicalis Xyl-14 56,6 9 Candida tropicalis Xyl-23 42,3 10 Candida tropicalis Xyl-94 60,4 11 Debaryomyces nepalensis Xyl-30 42,0 12 Debaryomyces nepalensis Xyl-42 30,5 13 Pichia fluxuum Xyl-8 17,2 14 Pichia anomala Xyl-68 50,4 15 Pichia anomala Xyl-69 32,5 16 Pichia guilliermondii Xyl-89 36,7 17 Pichia jadinii Xyl-26 20,4 18 Pichia jadinii Xyl-6 27,2 19 Pichia kluyveri Xyl-80 27,9 20 Pichia ohmeri Xyl-74 32,5 49 STT Tªn loµi HiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol (%) 21 Pichia ohmeri Xyl-86 27,9 22 Pichia rabaulensis Xyl-85 15,6 23 Trichosporon asahii Xyl-25 29,6 24 Trichosporon jirovecii Xyl-32 24,8 Qua sè liÖu vÒ hiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cña 24 chñng nÊm men ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.35 ta thÊy phÇn lín c¸c chñng cã hiÖu suÊt chuyÓn hãa cao thuéc vÒ chi Candida trong ®ã chñng Candida pseudolambica Xyl-63 ®¹t møc cao nhÊt víi hiÖu suÊt 70,1%; chñng Candida tropicalis Xyl-94 ®¹t 60,4. TiÕp ®Õn lµ c¸c chñng thuéc chi Pichia víi hiÖu suÊt chuyÓn hãa dao ®éng tõ 15 ®Õn 50,4%. Hai chñng thuéc vÒ loµi Debaryomyces nepalensis còng cho hiÖu suÊt chuyÓn hãa lªn tíi 42 %. Sè liÖu trong b¶ng 3.35 còng cho thÊy hiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol kh«ng nh÷ng kh¸c nhau gi÷a c¸c loµi kh¸c nhµu mµ cßn kh¸c nhau ë c¶ c¸c chñng thuéc cïng mét loµi. §iÓn h×nh lµ chñng Candida pseudolambica Xyl-63 víi hiÖu suÊt chuyÓn hãa lªn tíi 70,1 % trong khi chñng Candida pseudolambica Xyl-58 chØ ®¹t 37,1 %. Mét ®iÒu còng ®¸ng ®−îc l−u ý lµ mét sè chñng cã tiÒm n¨ng trong s¶n xuÊt xylitol, ch¼ng h¹n nh− chñng Candida tropicalis Xyl-94, l¹i thuéc vÒ c¸c loµi cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh ®èi víi ng−êi. §©y còng lµ mét vÊn ®Ò cÇn c©n nh¾c vµ xem xÐt khi quyÕt ®Þnh øng dông c¸c chñng nµy vµo s¶n xuÊt. 3.3.2.2. Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men 3.3.2.2.1 Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña thµnh phÇn m«i tr−êng ®Õn qu¸ tr×nh lªn men §Ó kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña thµnh phÇn m«i tr−êng ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol, chóng t«i ®· tiÕn hµnh lªn men quy m« b×nh l¾c sö dông m«i tr−êng thö kh¶ n¨ng sinh xylitol cã thµnh phÇn nh− ®· tr×nh bµy trong phÇn ph−¬ng ph¸p. 16 m«i tr−êng kh¸c nhau ®· ®−îc t¹o ra b»ng c¸ch thay ®æi c¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cña m«i tr−êng. Gièng khëi ®éng ®−îc nh©n trªn chÝnh m«i tr−êng ®−îc thö nghiÖm, tØ lÖ tiÕp gièng lµ 10%. Chñng xyl94 ®−îc sö dông trong c¸c thÝ nghiÖm tõ ®©y vÒ sau v× qua sè liÖu kh¶o s¸t cho thÊy trªn m«i tr−êng víi nguån c¸cbon lµ dÞch thñy ph©n th× chñng xyl94 cã kh¼ n¨ng mäc rÊt tèt vµ cã hiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cao. Qóa tr×nh lªn men ®−îc thùc hiÖn ë 28°C, l¾c 120 50 vßng/phót. Sau 4 ngµy, canh tr−êng ®−îc ly t©m, l−îng tÕ bµo ®−îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch do OD ë b−íc sãng 620 nm. Hµm l−îng xylitol t¹o thµnh vµ xyloza cßn l¹i ®−îc x¸c ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.36. B¶ng 3.36. ¶nh h−ëng cña thµnh phÇn m«i tr−êng ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol M«i tr−êng Kho¸ng Cao nÊm men (NH4)2SO4 Vi l−îng OD620 nm Xyloza (%) Xylitol (%) 1 + + + + 12,32 0,15 2,85 2 + + + 12,62 0,17 2,76 3 + + 12,02 0,36 3,36 4 + + + 15,62 0,14 2,30 5 + + 16,42 2,35 0,73 6 + + + 12,5 0,11 2,87 7 + + 14,62 0,11 2,76 8 + 15,94 2,46 0,82 9 + + + 16,7 0,37 2,74 10 + + 16,3 0,49 2,74 11 + 10,02 3,34 0,69 12 + + 18,04 0,99 2,08 13 + 11,4 3,42 0,57 14 + + 9,32 3,48 0,64 15 + 18,92 0,87 2,18 16 10,98 3,56 0,62 Tõ kÕt qu¶ b¶ng trªn ta thÊy, trong 4 thµnh phÇn ®−îc thö nghiÖm (kho¸ng, cao nÊm men, (NH4)2SO4 vµ vi l−îng) th× cao nÊm men cã tÝnh quyÕt ®Þnh ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol ch¼ng h¹n nh− ë c¸c m«i tr−êng sè 1, 2, 4, 7, 9, 10, 12 vµ 13 th× hµm l−îng xylitol trong canh tr−êng thu ®−îc ®Òu lín h¬n 2%. Trong khi ®ã c¸c m«i tr−êng kh«ng cã cao nÊm men nh− m«i tr−êng sè 5, 8, 11, 13, 14 vµ 15 hµm l−îng xylitol trong canh tr−êng thu ®−îc ®Òu nhá h¬n 1%. Ngoµi ra sù cã mÆt cña (NH4)2SO4 còng cã ¶nh h−ëng ®¸ng kÓ ®Õn kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cña nÊm men, ®Æc biÖt lµ trong c¸c m«i tr−êng kh«ng cã cao nÊm men (ch¼ng h¹n nh− ë m«i tr−êng 3, 6). Thµnh phÇn kho¸ng còng cã ¶nh h−ëng ®Õn qu¸ 51 tr×nh lªn men t−¬ng tù nh− (NH4)2SO4. Tõ ®ã, chóng t«i ®−a ra kÕt luËn m«i tr−êng lªn men cÇn cã c¸c thµnh phÇn: kho¸ng, cao nÊm men vµ (NH4)2SO4. Hµm l−îng c¸c thµnh phÇn nµy cã thÓ thay ®æi khi sö dông dÞch thñy ph©n lµm nguån c¸cbon v× b¶n th©n dÞch thñy ph©n ®· cã mét l−îng dinh d−ìng nhÊt ®Þnh. 3.3.2.2.2 Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña nång ®é dÞch thñy ph©n vµ chÕ ®é xö lý ®Õn qu¸ tr×nh lªn men Nh− c¸c kÕt qu¶ ®· chØ ra ë phÇn tr−íc, dÞch thñy ph©n cã tÝnh ®éc víi nÊm men, kh«ng ph¶i ë nång ®é dÞch thñy ph©n nµo nÊm men còng cã thÓ mäc vµ kh«ng ph¶i chñng nÊm men nµo còng cã kh¶ n¨ng mäc trªn m«i tr−êng cã chøa dÞch thñy ph©n nång ®é cao. ViÖc t×m ra nång ®é dÞch thñy ph©n vµ chÕ ®é xö lý khö ®éc thÝch hîp lµ cÇn thiÕt. Theo c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè, dÞch thñy ph©n cã thÓ ®−îc xö lý lo¹i bá c¸c thµnh phÇn ®éc b»ng c¸ch ®iÒu chØnh pH vµ xö lý than ho¹t tÝnh. §Ó kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña nång ®é dÞch thñy ph©n còng nh− chÕ ®é khö ®éc kh¸c nhau ®Õn qu¸ tr×nh lªn men, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm lªn men trong b×nh l¾c sö dông dÞch thñy ph©n sau khi ®· c« ®Æc ë c¸c nång ®é kh¸c nhau (bao gåm 100%; 75% vµ 50%). Song song víi ®ã, c¸c chÕ ®é xö lý kh¸c nhau bao gåm chØnh vÒ pH 6.0 b»ng NaOH vµ xö lý than ho¹t tÝnh 2.5 % ë 60°C trong 1 giê còng ®−îc thö nghiÖm. Qu¸ tr×nh lªn men ®−îc thùc hiÖn ë quy m« b×nh l¾c, nhiÖt ®é lªn men lµ 28 °C, thêi gian lªn men lµ 3 ngµy sö dông chñng xyl 94. Sau khi lªn men, hµm l−îng xyloza vµ xylitol trong canh tr−êng ®−îc x¸c ®Þnh b»ng s¾c ký láng cao ¸p. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.37. B¶ng 3.37. ¶nh h−ëng cña nång ®é dÞch thñy ph©n vµ chÕ ®é xö lý tíi qu¸ tr×nh lªn men Nång ®é sau lªn men (g/l) Nång ®é dÞch thñy ph©n, chÕ ®é xö lý OD 620 nm Xyloza Xylitol DÞch thñy ph©n 100 % 1,328 92,7 0 DÞch thñy ph©n 75 % 9,7 50,31 12,94 DÞch thñy ph©n 5 0% 15,08 10,36 24,97 DÞch thñy ph©n 75 %, chØnh pH vÒ 6.0 b»ng NaOH 14,78 43,47 16,160 DÞch thñy ph©n 50%, chØnh pH vÒ 18,68 2,14 28,21 52 6.0 b»ng NaOH DÞch thñy ph©n 75 %, xö lý than ho¹t tÝnh 7,74 48,59 13,34 DÞch thñy ph©n 50%, xö lý than ho¹t tÝnh 15,08 10,96 25,74 KÕt qu¶ b¶ng 3.37 cho thÊy chñng xyl94 kh«ng cã kh¶ n¨ng lªn men ë nång ®é dÞch thñy ph©n gèc. ë nång ®é dÞch thñy ph©n 75%, qu¸ tr×nh lªn men cã x¶y ra nh−ng yÕu. Nång ®é dÞch thñy ph©n 50% ®−îc coi lµ thÝch hîp cho qu¸ tr×nh lªn men tuy nhiªn ë nång ®é nµy, hµm l−îng xylitol t¹o ra trong canh tr−êng sau khi kÕt thóc qu¸ tr×nh lªn men kh«ng cao. ViÖc ®iÒu chØnh pH vµ xö lý than ho¹t tÝnh cã ¶nh h−ëng tÝch cùc tíi qu¸ tr×nh lªn men. Do viÖc lªn men ë nång ®é xyloza cao sÏ gióp gi¶m chi phÝ cña qu¸ tr×nh lªn men còng nh− qu¸ tr×nh tinh chÕ vÒ sau nªn viÖc sö dông m«i tr−êng cã chøa nång ®é dÞch thñy ph©n 75% ®−îc xem lµ thÝch hîp h¬n c¶. 3.3.2.2.3 Nghiªn cøu ®éng häc cña qu¸ tr×nh lªn men Tõ kÕt qu¶ nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña thµnh phÇn m«i tr−êng vµ nång ®é dÞch thñy ph©n ®Õn qu¸ tr×nh lªn men. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh lªn men quy m« 5 lÝt. M«i tr−êng lªn men cã nång ®é dÞch thñy ph©n 75%, thµnh phÇn kho¸ng ®−îc sö dông nh− ®· tr×nh bµy trong phÇn ph−¬ng ph¸p, cao nÊm men 0,2%, (NH4)2SO4 0,1%. pH cña m«i tr−êng trong qu¸ tr×nh lªn men ®−îc duy tr× ë 6.0 b»ng H3PO4 vµ NaOH. NhiÖt ®é trong qu¸ tr×nh lªn men ®−îc duy tr× ë 28 °C, sôc khÝ 1 vvm, tèc ®é khuÊy 200 vßng/phót. MÉu ®−îc lÊy 24 giê mét lÇn, sù sinh tr−ëng cña tÕ bµo ®−îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch do OD ë b−íc sãng 620 nm. Hµm l−îng glucoza, xyloza vµ xylitol ®−îc ®Þnh l−îng b»ng s¾c ký láng cao ¸p. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.38 53 B¶ng 3.38. §éng häc cña qu¸ tr×nh lªn men xylitol víi nguån xyloza lµ dÞch thñy ph©n r¬m Thêi gian lªn men OD620nm Glucoza (g/l) Xyloza (g/l) Xylitol (g/l) 0 0,86 22,56 81,52 2,33 24 4,632 19,07 76,08 5,57 48 10,08 14,09 64,22 14,50 72 15,46 14,47 42,96 31,48 96 18,32 6,33 13,52 51,67 108 19,9 6,10 5,59 56,87 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian lên men (giờ) Nồ ng độ đư ờn g t ron g d ịch lê n m en (g/ l) 0 5 10 15 20 25 OD 62 0 n m Glucose (g/l) Xylose (g/l) Xylitol (g/l) OD620nm §å thÞ 7: §éng häc cña qu¸ tr×nh lªn men xylitol Nh− vËy, sau 5 ngµy lªn men, gÇn nh− toµn bé l−îng xyloza cã trong m«i tr−êng lªn men ®−îc sö dông hÕt. Trong 24 giê ®Çu, qu¸ tr×nh sinh tr−ëng diÔn ra chËm, l−îng glucose, xyloza ®−îc sö dông vµ hµm l−îng xylitol t¹o thµnh trong canh tr−êng ch−a cao. Sau 24 giê lªn men, qu¸ tr×nh chuyÓn hãa diÔn ra nhanh h¬n vµ nhanh nhÊt vµo kho¶ng tõ 48 ®Õn 96 giê. HiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cña toµn bé qu¸ tr×nh ®¹t gÇn 70%. TÝnh theo tõng thêi ®iÓm th× thêi ®iÓm cã hiÖu suÊt chuyÓn hãa cao nhÊt r¬i vµo kho¶ng thêi gian tõ 48 ®Õn 72 giê víi hiÖu suÊt ®¹t gÇn 80%. Mét ®iÒu ®¸ng chó ý lµ ®éng häc cña qu¸ tr×nh lªn men diÔn ra kh¸ tuyÕn tÝnh, hµm l−îng xyloza ®−îc sö dông cho sinh tr−ëng cña tÕ bµo kh«ng nhiÒu, l−îng xylitol ®−îc tÝch lòy liªn tôc t¨ng theo thêi gian vµ hÇu nh− kh«ng bÞ chuyÓn hãa tiÕp. KÕt qu¶ nµy cã ®−îc lµ nhê cã mét chÕ ®é sôc khÝ phï hîp. ViÖc sôc khÝ Ýt sÏ 54 chØ ¶nh h−ëng tíi thêi gian lªn men chø hÇu nh− kh«ng ¶nh h−ëng tíi hiÖu suÊt cña qu¸ tr×nh chuyÓn hãa. Mét thuËn lîi n÷a lµ chñng gièng ®−îc sö dông trong lªn men (Candida tropicalis) kh«ng cã kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh ethanol do ®ã sÏ gi¶m thiÓu l−îng xyloza bÞ mÊt cho c¸c qu¸ tr×nh sinh tr−ëng kh¸c cña tÕ bµo. Nh− vËy, tõ c¸c kÕt qu¶ trªn chóng t«i ®−a ra s¬ ®å c«ng nghÖ lªn men xylitol Nguyªn liÖu giµu hemicelluloza (lâi ng«) ↓ Thñy ph©n b»ng H2SO4 0,75% ë 1 atm (121°C) trong 1 giê ↓ ChØnh vÒ pH 4,5 b»ng Ca(OH)2 ↓ C« ®Æc b»ng m¸y c« ch©n kh«ng ↓ ChØnh vÒ pH 2,0 b»ng H2SO4 ↓ Lo¹i tña ↓ ChØnh vÒ pH 6.0 b»ng NaOH sau ®ã tiÕn hµnh xö lý than ho¹t tÝnh 2,5 % ↓ Bæ sung dinh d−ìng (cao nÊm men, nguån ni t¬, kho¸ng) sau ®ã tiÕn hµnh lªn men (sôc khÝ 1 vvm, khuÊy 200 vßng/phót) ↓ Ly t©m thu håi dÞch sau lªn men cã chøa xylitol (b¶o qu¶n l¹nh ë 2 - 4 °C cho ®Õn khi tinh chÕ) 3.3.2.2.4 Lªn men thu håi xylitol Tõ kÕt qu¶ thu ®−îc ë phÇn trªn chóng t«i ®· tiÕn hµnh lªn men quy m« lín ®Ó thu håi xylitol. DÞch thñy ph©n tr−íc khi lªn men ®−îc chØnh vÒ pH 6,0 sau ®ã xö lý than ho¹t tÝnh nång ®é 2,5%. DÞch sau khi xö lý ®−îc bæ sung kho¸ng, nguån nit¬ (NH4)2SO4, cao nÊm men víi nång ®é gièng nh− m«i tr−êng lªn men quy m« 5 lÝt ®· tr×nh bµy phÇn trªn. Chñng nÊm men ®−îc sö dông lµ chñng Candida tropicalis xyl94. C¸c ®iÖu kiÖn lªn men bao gåm: sôc khÝ 1 vvm, tèc ®é khuÊy 200 55 vßng/phót, nhiÖt ®é 28 °C, pH cña m«i tr−êng ®−îc gi÷ ë 6.0 b»ng H3PO4 vµ NaOH. Sù tiªu thô xyloza vµ tÝch lòy xylitol trong canh tr−êng ®−îc theo dâi b»ng c¸ch lÊy mÉu ®Þnh kú vµ ph©n tÝch. ThÝ nghiÖm ®−îc dõng khi l−îng xyloza ®· ®−îc sö dông gÇn nh− hÕt. Sau khi lªn men dÞch lªn men ®−îc ly t©m lo¹i bá tÕ bµo, b¶o qu¶n phÇn dÞch lªn men cã chøa xylitol ë 2 ®Õn 4 °C cho ®Õn khi tinh chÕ. 3.3.3 Nghiªn cøu c«ng nghÖ chiÕt t¸ch , lµm s¹ch vµ thu håi xylitol 3.3.3.1 Nghiªn cøu c«ng nghÖ lµm s¹ch dÞch sau lªn men Tr−íc khi kÕt tinh, dÞch lªn men cÇn ®−îc lµm s¹ch, ®Ó lo¹i bá mÇu c¸c s¶n phÈm phô ®−îc sinh ra trong qu¸ tr×nh thñy ph©n nguyªn liÖu ban ®Çu còng nh− trong qu¸ tr×nh lªn men, dÞch lªn men ®−îc xö lý than ho¹t tÝnh ë nång ®é 3 - 4%. §Ó lo¹i bá c¸c thµnh phÇn muèi cã trong dÞch lªn men, chóng t«i ®· tiÕn hµnh xö lý dÞch lªn men b»ng nhùa trao ®æi ion. Xö lý trao ®æi cation sö dông cation exchange resin (Bayer - §øc) vµ trao ®æi anion sö dông anion exchange resin (Bayer - §øc). §Çu tiªn ho¹t hãa nhùa trao ®æi anion b»ng HCl 5% vµ NaOH 5%, cho dÞch lªn men sau khi xö lý than ho¹t tÝnh ch¹y qua cét anion vµ ch¹y qua cét cation. TiÕn hµnh ®o ®é dÉn ®iÖn cña dÞch tr−íc vµ sau khi trao ®æi. Qu¸ tr×nh trao ®æi ®−îc lÆp l¹i cho ®Õn khi ®é dÉn ®iÖn cña dung dÞch b»ng 0. Lóc nµy dÞch lªn men sÏ chØ cßn chøa mét l−îng muèi kh«ng ®¸ng kÓ vµ cã thÓ ®em c« ®Æc ®Ó kÕt tinh xylitol. 3.3.3.2 Nghiªn cøu c«ng nghÖ thu håi xylitol DÞch lªn men sau khi xö lý than ho¹t tÝnh vµ trao ®æi ion ®−îc c« ®Æc vÒ nång ®é kho¶ng 55 - 60 % b»ng m¸y c« ch©n kh«ng. Sau khi c« ®Æc dÞch ®−îc ®em kÕt tinh thu håi xylitol ë -20 °C. Sau khi kÕt tinh, tinh thÓ xylitol ®−îc thu håi b»ng ly t©m, röa s¹ch vµ sÊy kh«. Sau khi sÊy kh« chóng t«i thu ®−îc 22 kg xylitol d¹ng tinh thÕ. Xylitol thµnh phÇm sau khi xÊy kh« ®−îc ph©n tÝch c¶m quan, ®é tinh khiÕt vµ chØ tiªu vi sinh vËt. KÕt qu¶ ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.38. 56 B¶ng 3.38. KÕt qu¶ ph©n tÝch xylitol thµnh phÈm Tªn chØ tiªu §¬n vÞ tÝnh KÕt qu¶ Thµnh phÇn xylitol -- 98,9 % Mµu s¾c, h×nh th¸i -- Tinh thÓ tr¾ng ngµ pH trong n−íc -- 6,5 Vi sinh vËt tæng cfu/g 120 Coliform cfu/g 0 E. coli cfu/g 0 Salmonella cfu/g 0 Nh− vËy tinh thÓ xylitol thu ®−îc cã ®é tinh khiÕt lín h¬n 98%. Vi sinh vËt tæng kh«ng ®¸ng kÓ, kh«ng cã coliform vµ c¸c vi sinh vËt g©y bÖnh (E. coli, Salmonella). Qui tr×nh c«ng nghÖ tinh s¹ch xylitol DÞch lªn men cã chøa xylitol ↓ Xö lý than ho¹t tÝnh (3 - 4%) ↓ Xö lý trao ®æi anion ↓ Xö lý trao ®æi cation ↓ C« ®Æc b»ng m¸y c« ch©n kh«ng ®Õn nång ®é ®−êng ≥ 55% ↓ KÕt tinh ë -20°C ↓ Ly t©m thu håi tinh thÓ ↓ Röa tinh thÓ vµ sÊy kh« ↓ Xylitol thµnh phÈm 57 3.3.4. øng dông chÕ phÈm xylitol Nh»m kh¶o s¸t kh¶ n¨ng chÊp nhËn s¶n phÈm cña ®Ò tµi bëi thÞ tr−êng trong n−íc chóng t«i tiÕn hµnh øng dông thö nghiÖm xylitol vµo mét sè s¶n phÈm thùc phÈm (b¸nh, kÑo) vµ kem ®¸nh r¨ng. C¸c s¶n phÈm thö nghiÖm bao gåm: KÑo cao su vµ kÑo cøng: ViÖc øng dông thö nghiÖm xylitol trong s¶n xuÊt kÑo cao su vµ kÑo cøng t¹i nhµ m¸y b¸nh kÑo H¶i Hµ - Kotobuki (C«ng ty liªn doanh TNHH H¶i Hµ - Kotobuki). S¶n phÈm kÑo cao su chøa xylitol lµ s¶n phÈm ®· ®−îc s¶n xuÊt nhiÒu trªn thÕ giíi. HiÖn nay, theo chóng t«i ®−îc biÕt hiÖn ch−a cã c«ng ty nµo cña ViÖt Nam s¶n xuÊt s¶n phÈm b¸nh kÑo chøa xylitol vµ d¹ng s¶n phÈm nµy ®−îc nhËp tõ n−íc ngoµi th«ng qua kªnh ph©n phèi cña Happydent vµ mét sè c«ng ty kh¸c. Kh¶ n¨ng ®−a xylitol vµo b¸nh kÑo nhËn ®−îc sù quan t©m cña H¶i Hµ – Kotobuki. Nh÷ng kÕt qu¶ thö nghiÖm ban ®Çu sö dông xylitol trong kÑo cao su kh¸ l¹c quan. S¶n phÈm cã nh÷ng ®Æc ®iÓm sau: - VÞ ngät m¸t vµ nhÑ nhµng - Cã c¶m gi¸c l¹nh khi ngËm - Kh«ng cã d− vÞ chua sau khi ngËm Chóng t«i cã thÓ thay thÕ toµn bé l−îng ®−êng trong kÑo cao su b»ng xylitol. Víi s¶n phÈm kÑo cøng xylitol chØ cã thÓ thay thÕ mét phÇn l−îng ®−êng trong kÑo. Trong tr−êng hîp thay toµn bé ®−êng b»ng xylitol s¶n phÈm kh«ng ®¹t ®−îc ®é cøng cÇn thiÕt. B¸nh dõa, b¸nh gato: ViÖc øng dông thö nghiÖm xylitol trong hai s¶n phÈm nµy ®−îc thùc hiÖn t¹i x−ëng s¶n xuÊt kinh doanh b¸nh ngät quy m« gia ®×nh. Thö nghiÖm cho thÊy xylitol cã thÓ thay thÕ toµn bé l−îng ®−êng trong b¸nh ngät. S¶n phÈm cã vÞ ngät m¸t vµ dÔ dµng ®−îc chÊp nhËn. Thuèc ®¸nh r¨ng: ViÖc thö nghiÖm øng dông xylitol trong thuèc ®¸nh r¨ng ®−îc thùc hiÖn ë quy m« phßng thÝ nghiÖm. Xylitol ®−îc bæ sung trùc tiÕp vµo kem ®¸nh r¨ng th−¬ng phÈm. Víi nång ®é xylitol 10% thuèc ®¸nh r¨ng cã vÞ ngät dÔ chÞu. Theo nh÷ng c«ng bè cña n−íc ngoµi, viÖc bæ sung xylitol vµo thuèc ®¸nh r¨ng sÏ cã t¸c dông øc 58 chÕ sù ph¸t triÓn cña vi sinh vËt g©y s©u r¨ng vµ do vËy cã t¸c dông b¶o vÖ tÝch cùc. 3.4. −íc tÝnh gi¸ thµnh s¶n phÈm 4.4.1 ¦íc tÝnh gi¸ thµnh s¶n phÈm β – glucan STT Nguyªn liÖu Sè l−îng §¬n gi¸( ®ång) Thµnh tiÒn(®ång) 1 M«i tr−êng hasen 30 lÝt 50.000 1.500.000 2 §iÖn 70kW 2.000 200.000 3 N−íc 2 khèi 3.000 6.000 4 Nh©n c«ng 5 c«ng 50.000 250.000 5 Lä thñy tinh + nh·n 200 lä 20.000 4.000.000 6 SÊy ch©n kh«ng 2.000.000 7 Hãa chÊt kh¸c 200.000 8 Kh©u hao thiÕt bÞ 800.000 9 Chi kh¸c 200.000 Tæng 9.156.000 VËy gi¸ thµnh 100 g β – glucan/ 200 lä lµ: 9.165.000 ®ång 4.4.2. ¦íc tÝnh gi¸ thµnh s¶n phÈm maltooligosaccarit giµu maltotrioza bét ( 100 kg s¶n phÈm) STT Nguyªn vËt liÖu Khèi l−îng §¬n gi¸(®ång) Thµnh tiÒn(®ång 1 Bét s¾n 120 kg 2500®/kg 300.000 2 Enzim dÞch hãa 0,1% 160.000®/kg 16.000 3 Enzim ®−êng hãa 1% 400.000®/kg 400.000 4 §iÖn, h¬i 30kW 2.000 60.000 5 N−íc 2m3 3.000 6.000 6 Nh©n c«ng 4 c«ng 25.000 100.000 Tæng céng 882.000 VËy −íc tÝnh gi¸ thµnh 1 kg s¶n phÈm maltooligosacarit lµ 8.820 ®/kg, so s¸nh víi s¶n phÈm cïng lo¹i nhËp ngo¹i chØ b»ng 1/3. 59 4.4.3 ¦íc tÝnh gi¸ thµnh s¶n phÈm xylitol STT Nguyªn liÖu Sè l−îng §¬n gi¸(®ång) Thµnh tiÒn(®ång) 1 Lâi ng« 1tÊn 200.000 200.000 2 H2SO4 35Kg 3.000 105.000 3 Ca(OH)2 24Kg 1.500 36.000 4 Cao nÊm men 2,25Kg 500.000 1.125.000 5 Nhùa trao ®æi ion 75LÝt 20.000 1.500.000 6 HCl 25LÝt 3.500 87.500 7 NaOH 10Kg 12.000 120.000 8 C¸c hãa chÊt kh¸c 1 500.000 500.000 9 Than 85Kg 1.200 102.000 10 §iÖn 10KW 2.500 25.000 11 N−íc 10m3 3.000 30.000 12 C«ng lao ®éng 30ngày c«ng 30.000 900.000 Tæng gi¸ thµnh cho mét tÊn nguyªn liÖu 4.730.500 Gi¸ thµnh 1 kg xylitol 67.578 60 4. KÕT LUËN Trong thêi gian nghiªn cøu ®Ò tµi ®· thu ®−îc nh÷ng kÕt qu¶ sau: 1. Maltooligosacarit - §· lùa chän ®−îc ph−¬ng ph¸p xö lý nguyªn liÖu: röa l¹i bét 3 lÇn víi tØ lÖ n−íc dïng lµ 1:5 . - §· lùa chän ®−îc enzim vµ c¸c ®iÒu kiÖn c«ng nghÖ thÝch hîp cho qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ tinh bét thµnh maltooligosacarit giµu maltotrioza: + Qu¸ tr×nh dÞch ho¸: Nång ®é tinh bét: 25%, nång ®é enzim alpha - amylaza: 0,1% so víi tinh bét, pH = 6,5- 7,0, nhiÖt ®é: 950C, thêi gian: 30 phót. + Qu¸ tr×nh ®−êng ho¸: Nång ®é dÞch thuû ph©n: 22 0 Bx, DE dÞch ho¸: 20, nång ®é enzim pullulanaza: 1%, thêi gian: 15 giê, nhiÖt ®é: 550C, pH = 6,5. - §· nghiªn cøu n©ng cao hµm l−îng maltotrioza trong thµnh phÇn s¶n phÈm maltooligosacarit b»ng enzim AMT t¨ng thªm gÇn 50% so víi sö dông enzim pulullanaza - §· nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn lµm s¹ch dÞch thuû ph©n b»ng than ho¹t tÝnh: Thêi gian tÈy mµu: 30 phót, nhiÖt ®é: 800c, tû lÖ than ho¹t tÝnh: 1,5% so víi tinh bét, nång ®é chÊt kh«: 20- 250Bx. - §· x©y dùng ®−îc quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt maltooligosacarit - §· s¶n xuÊt thö nghiÖm trªn quy m« pilot 100 kg/mÎ, s¶n phÈm s¶n xuÊt ra ®¹t chÊt l−îng DE=38,5 víi c¸c thµnh phÇn : Glucoza 7,15mg/ml, maltoza 39,52mg/ml, maltotrioza 54,5 mg/ml, maltopentan 72,31 mg/ml, maltohexan 47,23 mg/ml, c¸c oligo kh¸c: 9,3 mg/ml. - §· s¶n xuÊt thö trªn quy m« c«ng nghiÖp c«ng suÊt 2.500kg bét/mÎ t¹i C«ng ty Minh d−¬ng. S¶n phÈm thu ®−îc ®em øng dông cho s¶n xuÊt b¸nh kem t¹i c«ng ty b¸nh kÑo H¶i hµ, s¶n xuÊt ®å uèng s÷a ng«, kem, bét cacao hoµ tan t¹i ViÖn c¬ ®iÖn, C«ng ty kem B¨ng Kú L©n, C«ng ty ChÕ biÕn cµphª cacao Hoµng Anh ®¹t kÕt qu¶ tèt, thay thÕ ®−îc ®−êng kÝnh, gi÷ ®−îc mµu t−¬i cña s¶n phÈm, ®é æn ®Þnh (kh¶ n¨ng ®Þnh h×nh, ®é huyÒn phï…) tèt h¬n dïng ®−êng kÝnh. 61 2. β- glucan - §· ph©n lËp vµ chän ®−îc m«i tr−êng thÝch hîp cho sù ph¸t triÓn cña c¸c chñng nÊm men. - §· t¹o ®−îc chñng S.cerevisiae ®ét biÕn tõ chñng hoang d¹i ph©n lËp ®−îc tõ b· men bia . - §· x©y dùng c«ng nghÖ t¸ch chiÕt β-glucan tõ thµnh tÕ bµo nÊm men S.cerevisiae : ● S¶n phÈm β- glucan tõ chñng nÊm men S.cerevisiae 1 chØ cã mét lo¹i m¹ch 1,6 β- glucan. ● S¶n phÈm β -glucan tõ chñng nÊm men S.cerevisiae 3 cã hai lo¹i m¹ch 1,6 β- glucan vµ 1,3 β- glucan, tõ chñng S.cerevisiae 1 cã trªn 80% hexoza vµ 0,99% protein, tõ chñng S.cerevisiae 2 vµ S.cerevisiae 3 cã hµm l−îng protein kho¶ng 1,2% vµ h¬n 50% hexoza. - ChÕ phÈm cã t¸c dông phôc håi sè l−îng tÕ bµo b¹ch cÇu m¸u ngo¹i vi vµ kh¶ n¨ng thùc bµo cña ®¹i thùc bµo æ bông cña ®éng vËt g©y suy gi¶m miÔn dÞch thùc nghiÖm b»ng chiÕu x¹. - ChÕ phÈm beta glucan tõ chñng S.cerevisiae 1 cã t¸c dông tèt ®èi víi hÖ thèng miÔn dÞch kh«ng ®Æc hiÖu ë nång ®é nghiªn cøu. - §· ký ®−îc mét hîp ®ång hîp t¸c øng dông chÕ phÈm β – glucan phôc vô cho y d−îc víi ViÖn qu©n y viÖn 103 vµ mét hîp ®ång hîp t¸c s¶n xuÊt vµ chuyÓn giao c«ng nghÖ víi trung t©m c«ng nghÖ hãa d−îc vµ hãa sinh h÷u c¬. 3. Xylitol - §· tuyÓn chän ®−îc 47 chñng nÊm men cã kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol tõ 23 mÉu ®Êt vµ hoa qu¶. Trong ®ã cã 9 chñng cã hiÖu xuÊt chuyÓn hãa lín h¬n 45%, hiÖu suÊt cao nhÊt ®¹t ®−îc lµ 70,1%. - §· tiÕn hµnh ph©n nhãm c¸c chñng cã kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol theo ®Æc ®iÓm h×nh th¸i, kü thuËt fingerpriting vµ ®Þnh tªn c¸c chñng ®¹i diÖn cho mçi nhãm b»ng ph−¬ng ph¸p ®äc tr×nh tù vïng D1/D2 cña ARN ribosom 26S. 62 - §· t×m ra ®−îc nguyªn liÖu thÝch hîp cho qu¸ tr×nh s¶n xuÊt xylitol tõ phÕ th¶i n«ng nghiÖp lµ lâi ng« víi −u ®iÓm thµnh phÇn xyloza cao, Ýt ®èi víi tÕ bµo nÊm men trong qu¸ tr×nh lªn men. §· ®−a ra quy tr×nh thñy ph©n nguyªn liÖu vµ xö lý nguyªn liÖu sau khi thñy ph©n ®Ó t¹o dÞch chøa xyloza sö dông trong lªn men. - §· ®−a ra ®−îc ®iÒu kiÖn len men xylitol thÝch hîp víi nguån xyloza lµ dÞch thñy ph©n lâi ng«. §· tiÕn hµnh lªn men xylitol quy m« thö nghiÖm vµ quy m« lín ®Ó t¹o dÞch chøa xylitol. HiÖu suÊt chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol cho toµn bé qu¸ tr×nh ®¹t ®−îc lµ 70%, hiÖu suÊt t¹i thêi ®iÓm cao nhÊt ®¹t gÇn 80%. Hµm l−îng xylitol trong dÞch sau lªn men ®¹t 56 g/lÝt. - §· ®−a ra quy tr×nh tinh chÕ xylitol tõ dÞch lªn men. KÕt qu¶ ®· thu ®−îc 22 kg xylitol thµnh phÇm d¹ng tinh thÓ víi ®é tinh khiÕt lín h¬n 98%. - §· øng dông chÕ phÈm xylitol vµo s¶n xuÊt kÑo cao su, kÑo cøng, b¸nh gato vµ thuèc ®¸nh r¨ng. KiÕn nghÞ: §Ò nghÞ Héi ®ång Khoa häc c«ng nghÖ cÊp Nhµ n−íc, Bé khoa häc c«ng nghÖ, Bé chñ qu¶n, Bé chñ tr× ®Ò tµi : - Cho phÐp c¸c chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh ®−îc chuyÓn giao c«ng nghÖ cho s¶n xuÊt c¸c s¶n phÈm nµo ®· hoµn thiÖn c«ng nghÖ, ®· ®−îc ký hîp ®ång hîp t¸c nghiªn cøu vµ chuyÓn giao c«ng nghÖ - T¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi ®Ó chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh tiÕp tôc hoµn thiÖn c«ng nghÖ, x¸c ®Þnh hiÖu qu¶ kinh tÕ, tiÕp cËn s¶n xuÊt, x©y dùng vµ thùc hiÖn c¸c Dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm vµ chuyÓn giao c«ng nghÖ cho s¶n xuÊt. 63 Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng ViÖt: 1. KiÒu H÷u ¶nh ( 1999), Gi¸o tr×nh vi sinh vËt häc c«ng nghiªp, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc kü thuËt, Hµ néi 2. Lª Ngäc Tó, La V¨n Chø, §Æng ThÞ Thu, Ph¹m Quèc Th¨ng, NguyÔn ThÞ ThÞnh, Bïi §øc Hîi, L−u DuÈn, Lª Do·n Biªn (1997), Ho¸ sinh häc c«ng nghiÖp, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kÜ thuËt, Hµ néi. 3. Lª Ngäc Tó, La V¨n Chø, Ph¹m ThÞ Ch©u, NguyÔn L©n Dòng(1982), Enzim vi sinh vËt, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc kü thuËt, Hµ néi 4. Lª ngäc Tó, L−u DuÈn, §Æng ThÞ Thu, Lª ThÞ Cóc, L©m Xu©n Thanh, Ph¹m Thu Thuû (2000), BiÕn h×nh sinh häc c¸c s¶n phÈm tõ h¹t, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kÜ thuËt, Hµ néi. 5. NguyÔn V¨n HiÖu, §inh c«ng TuÊt (1971), Enzim trong c«ng nghiÖp thùc phÈm, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kÜ thuËt, Hµ néi. 6. NguyÔn V¨n Mïi (1982), Thùc hµnh ho¸ sinh häc, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kÜ thuËt, Hµ néi. 7. Ph¹m VÜnh ViÔn (1982), Hoa MÇu, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kÜ thuËt, Hµ néi. 8. Tæng côc thèng kª (2003), Niªn gi¸m thèng kª 2003, Nhµ xuÊt b¶n Hµ néi. 64 TiÕng Anh: 9. Adam, P.R. & Priest, F.G. (1977), Federation of European Microbiological Societies, 1, pp.269. 10. Affleck R. P. (2000), Recovery of Xylitol from Fermentation of Model Hemicellulose Hydrolysates Using Membrane Technology, Blacksburg - Virginia. 11. Alexander, R.J. (1992), “Maltodextrins: production, properties and applications”, Starch Hydrolysis Products, VCH Publishers, New York, pp.233- 276. 12. Allam A.M., Kalie N.A., Dabbous M.K. (1976), “Purifcation of Aspergillus niger alpha- amylaza”, Bacterial, 131 (6), pp.510-511. Apajalahti J. (2001), Yeast strains for the production of xylitol, U.S. patent 6,271,007. 13. Aranda-Barradas J. S., Delia M. L., Riba J. P. (2002), “Kinetic study and modelling of the xylitol production using Candida parapsilosis in oxygen-limited culture conditions”, Bioprocess Engineering, 22, pp. 219-225. 14. Arst, H.N., (1981), Symposiun ß the Society for General Microbiology,31, pp.131. 15. Babincova M, Bacova Z, Machova E, Kogan G. (2002), Antioxidant properties of carboxymethyl glucan. J Med Food. 5(2): 79-83 16. Badger P.C. (2002), Ethanol from cellulose : A general review - Trends in new crops and new uses, ASHS Press- Alexandria. 17. Banks,W.& Greenwood, C.T. & Khan, K.M.(1970), Carbonhydrate Research, 12, pp.79. 18. Banks,W.& Greenwood, C.T.(1957), Starch and its components, Edinburgh University, (173), pp.9. 19. Barker, S.A & Somers, P. J.(1970), Carbonhydrate Research, 14, pp. 257- 289. 20. Barker, S.A (1980), Economic Microbiology: Microbial Enzymes and Bioconversion, 5, Academic Press, London, pp.331. 65 21. Bender, H.Wallenfels, K.(1961), Biochemistry , 334, pp. 79-95 22. Bender.H et.al (1985), “Studies on production of maltooligosaccharide by pullulanase from K. pneumoniae”, Cacbonhydrade reasearch, 135, pp.291- 302. 23. Brock, Peter William. (1988), "Process for separating maltose from mixture of maltose with glucoza or other saccharides", European Patent application 1 260 003. 24. C. H. Ha; K. H. Lim; Y. T. Kim; S. T. Lim; C. W. Kim; H. I. Chang (2002), Analysis of alkali- soluble glucan produced by S. cerevisiae wild- type and mutants. Appl Microbiol biotechnol., 58: 370-377. 25. Chiaplin.M.F, and Kennedy J. F. (1986), Cacbonhydrade analysis: A Practical Approach, IRL Press Oxford- Washington DC. 26. Clark, D. S., Estell D.A. (1992), Enzyme Engineering XI, Academy of Sciences, New York. 27. Cletus P.K., Jack W.F. (1998), The Yeasts, A Taxonomic Study, Elsevier, USA. 28. Davis F.T., Cohen D.L., Whitaker D. (1980), “The production of alpha- amylaza in bath and chemostat culture by Bacillus steathermophylus“, Automic van Hen Wechock”, (4), pp.390. 29. Dey. G., Palit. S., et al . ( 2002), “ Purification and characterization of maltooligosacchride – forming amylaza from Bacillus circulans GRS313” , Journal of Inductrial Microbiology & Biotechnology, 28, pp. 193- 200. 30. Donnelly, B.J., Fruin, J.C.& Scallet, B. L.(1973), Cereal Chemistry, pp.512- 519. 31. Do-Youn Lee, In-Hye Ji, Hyo-Ihl Chang, and Chan-Wha Kim (2002), High- level TNF- α Secretion and Macrophage Activity with soluble β_ Glucans from S.cerevisiae. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66 (2); 233_238. 66 32. Duedahl. L., Olesen K. L., Larsen and Zimmermann. W. (2000), “Detection of maltooligosacchride- forming bacterial amylases by performance anion- exchange chromatography”, The Society for appplied Microbiology, pp 312- 316. 33. Elizabeth M. Osman. (1967), “Starch in the food industry”, Starch chemistry and technology, (2),pp 163-210. 34. Engstad CS, Engstad RE, Olsen JO, Osterud B. (2002), The effect of soluble beta- 1,3- glucan and lipopolysaccharide on cytokine production and coagulation activation in whole blood. Int Immunopharmacol., 2 (11): 1585-97 35. Felipe M., Vitolo M., Mancilha I. M., Silva S.S. (1997), “Environmental Parameters Affecting Xylitol Production From Sugarcane Bagasse Hemicellulosic Hydrolyzate by Candida guilliermondii”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 18, pp. 251-254. 36. Fiona Duffner, Costanzo Bertoldo, Jens T. Andersen, Karen Wagner, and Garabed Antranikian (2000), “A New Thermoactive Pullulanase from Desulfurococcus mucosus: Cloning, Sequencing, Purification, and Characterization of the Recombinant Enzyme after Expression in Bacillus subtilis 37. Gurgel P. V., Mancilha I. M., Pecanha R. P. and Siqueria J. F. M. (1995), “Xylitol recovery from fermented sugarcane bagasse hydrolyzate”, Bioresource Technology, 52, pp. 219-223. 38. Hannes Melasniemi, Vantaa, Matti. (1990), “amylase of a new type”, United States Patent 4,971,906. 39. Harald MEISSNER and Wolfgang LIEBL (1998),“ Thermotoga maritima maltosyltransferase, a novel type of maltodextrin glycosyltransferase acting on starch and malto- oligosaccharides”, Biochemistry Journal, 250, pp. 1050- 1058. 40. Heikkila H., Puuppo O., Tylli M., Nikander H., Nygren J., Lindroos M., Eroma O. (1999), “Method for Producing Xylitol”, U.S. patent 5,998,607. 41. Horitsu H., Yahashi Y., Takamizawa K., Kawai K., Suzuki T., Watanabe N. (1992), “Production of Xylitol from D-Xylose by Candida tropicalis: Optimization of Production Rate”, Biotechnology and Bioengineering, 40, pp. 1085-1091. 42. . Review of Betaglucan. htm 43. Betahistory. htm 67 44. htm 45. Hunter Jr KW, RA Gault, MD Berner (2002), Preparation of microparticulate β- glucan from S. cerevisiae for use in immune potentiation. Lett appl microbiol 35: 267-271 46. Jamas S, CK Rha, AJ Sinskey (1991), Glucan composition and process for preparation thereof. US Patent N 5037972 47. Jamas S, DD Easson, GR Ostroff (1994), Method for producing neutral glucans for pharmaceutical application. US Patent N 5322841 48. Johansson B., Christensson C., Hobley T., Hahn-hagerdal B. (2001). “Xylulokinase overexpression in two strains of Sachharomyces cerevisiae also expressing xylose reductase and xylitol dehydrogenase and its effect on fermentation of xylose and lignocellulosic hydrolysate”, Applied and Environmental Microbiology, pp. 4248-4255. 49. Joseph J. Zupancic, Bensenville, III. (1982), “Separation of saccharides”, United States Patent 4,429,122 50. Kainuma, K., Lobaysahi, S. Harado. T. (1978), Cacbonhydrade reasearch, pp.345- 357. 51. Kainuma, K., Wako, K., Kobayashi, S., Nogami, A. & Suzuki, S. (1975), Biochimistry and Biophysical. Acta 41, pp.333-346. 52. Kainuma,K.& Suzuki,S.(1971), Proceeding of the International Symposium on Conversion and Manufacture of Food stuffs by Microoganisms, Kyoto, Japan, pp.95-9. 53. Kim S. Y., Oh D. K., Choi J. H. and Kim S. E. (1997), “Fermentation process for preparing xylitol using mutant cells”, U.S. patent 5,686,277. 54. Kirk- otherman. Encyclopedia of chemical Technology, 4, p. 543- 715. Kobayashi, Shiro.(1991), “Method for the preparation of malto- oligosaccharide”, European Patent Application 0530421A1. 68 56. Kubota, Michio & Sakai, Shuzo (1988), “Maltotetraose – forming amylase” European Patent Application 0289138. 57. Lane, J.H., Eynon, L. (1923), “Determination of reducing sugars by means of Fehling's solution with methylene blue as internal indicator”, Cacbonhydrade analysis, pp. 32-36. 58. Lee JN, Lee DY, Ji IH, Kim GE, Kim HN, Sohn J, Kim S, Kim CW. (2001), Purification of soluble beta- glucan with immune- enhancing activity from the cell wall of yeast. Biosci Biotechnol Biochem., 65 (4): 837-41 59. Lee W. J., Ryu Y. W. and Seo J. H. (2000), “Characterization of two- substrate fermentation processes for xylitol production using recombinant Saccharomyces cerevisiae containing xylose reductase gene”, Process Biochemistry, 35, pp. 1199–1203. 60. Leleu J., Duflot P., Caboche J. (1992), “Process for Manufacturing Xylitol and Xylitol-Rich Products”, U.S. patent 5,096,820. 61. Lichtenthaler F. W. (2002), “Unsaturated O- and N-Heterocycles from Carbohydrate Feedstocks”, Account of Chemical Research, 35, pp. 728-737. 62. Lodder J. (1997), The Yeasts, A Taxonomic Study, North Holland Publishing Co. Amsterdam. 63. Mai TT, Igarashi K, Hirunuma R, Takasaki S, Yasue M, Enomoto S, Kimura S, Nguyen CV. (2002), Iron absorption in rats inceased by yeast glucan. Biosci Biotechnol Biochem, 66 (8): 1744-7 64. Mohamed El- Sherbeini and Joseph A. Clemas (1995), Cloning and characterization of GNS 1: a S. cerevisiae Gene Involved in Synthesis of 1, 3-β_ Glucan In Vitro. Journal of Bacteriology, p. 3227-3234. 65. Mussatto S. I., Santos J. C. and Roberto I. C. (2004), “Effect of pH and activated charcoal adsorption on hemicellulosic hydrolysate detoxification for xylitol production”, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 79, pp. 590-596. 66. Mussatto S.I. and Roberto I.C. (2003), “Xylitol production from high xylose concentration: evaluation of the fermentation in bioreactor under different stirring rates”, Journal of Applied Microbiology, 95, pp. 331–337. 69 67. Mussatto S.I., Santos J. C., Roberto I. C. (2004), “Effect of pH and activated charcoal adsorption on hemicellulosic hydrolysate detoxification for xylitol production”, Chem Technol Biotechnol, 79, pp. 590-596. 68. Nakakuki,T., Monma, M., Azuma, K., Kobayashi, S.( 1982) ,Japan Society Starch Science, 29, pp.179-187. 69. Nakamura, N., Watanable, K.& Horikoshi,K.(1975), Biochimica et Biophysica Acta, 397, 188. 70. Nathalie Dallies, Jean Francois and Veronique Paquet (1998), A new method for Quantitative Determination of Polysaccharides in the Yeast Cell wall. Application to the cell wall Defective Mutants of S. cerevisiae. Yeast 14. 1297- 1306. 71. Nichols, J.C., Tai, P-C & Murphu, J.R.(1980), Journal of bacteriology, pp.144-518. 72. Nobre A., Duarte L. C., Roseiro J. C., Girio F. M. (2002), “A physiological and enzymeatic study of Debaryomyces hansenii growth on xylose and oxygen- limited chemostats”, Applied Micorobiology and Biotechnoogyl, 59, pp. 509-516. 73. Novo enzim at work (1989), pp. 12-13. 74. Novo Nordish Promozyme, enzymes process Division. 75. Novo Nordish Termamyl 120L, Product sheet, enzyme - bisiness 76. Okada Shigetaka et.al (1988), “Maltotrriose- Rich maltooligosaccharide Mixture” Handbook of Amylases and related enzymes, Pergamon press, pp. 210- 213. 77. Ooi B.G., Le T. T. B., Markuszewski B.M. (2002), “The effects of glucose on the yeast conversion of xylose into xylitol by C.Guilliermondii and C. Tropicalis”, Electronic journal of Environmental. 2, pp. 1579-4377. 78. Orskov, I.(1984) "Genus Klebsiella." Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1. pp. 461-465. 79. Parajã J. C., Dominiguez H., Dominguez J. M. (1996), “Study of charcoal adsorption for improving the production of xylitol from wood hydrolysates”, Bioprocess Engineering, 16, pp. 39-34. 70 80. Peter N. Lipke and Rafael Ovalle (1998), Cell wall Architecture in Yeast: New structure and New Challenges. Journal of Bacteriology, p. 3735_3740 81. R.B. Evan and O. B. Wurzburg. (1967), “Production and use of starch dextrins”, Starch chemistry and technology, 2, pp 254-276. 82. Roberto I. C., Mancilha I.M., Sato. S. (1999), “Influence of kla on bioconversion of rice straw hemicellulose hydrolysate to xylitol”, Bioprocess Engineering, 21, pp. 505-508. 83. Rosa S. M. A., Felipe M. G. A., Silva S. S., Vitolo M. (1998), “Xylose Reductase Production by Candida guilliermondii”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 70, pp.127-135. 84. Russell L. Blaylock, MD (2002), Yeast β 1,3_ Glucan and its Use against Anthrax Infection and in the treatment of Cancer. JANA vol.5, No.2 85. Saha B. C. (2003), “Hemicellulose bioconversion” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 30, pp. 279 - 291. 86. Saha, B.C., Mathupala, S.P.,& Zeikus, J.G.(1988) Biochemistry Journal ,252,pp.343-348. 87. Sakano, Y., Sano, M. & kobayashi, T. (1985), Agriculture Biology Chemistry, 49. pp.3041-3043. 88. Sandra A. F., Heizir F. C. (2001), “Xylitol production by Candida parasilosis under Fed-Batch culture”, Brazilian archives of biology and technology, 44, pp. 125-128. 89. Sano, A., Teno, N., ( 1992), “Process for producing maltooligosaccharide derivative” European Patent 051 808 A1. 90. Schenck, F.W. (1992), “Starch hydrolysis products, an introduction and history” Starch Hydrolysis Products: Worldwide Technology, Production, and Applications, VCH Publishers, New York, pp.1-22. 91. Shinke, Ryu & Nanmori, Takashi (1989), “Thermostable amylase and use thereof” European Patent Application 035737A2. 92. Silva C. J. S. M., Roberto I. C. (2001), “Improvement of xylitol production by Candida guilliermondii FTI 20037 previously adapted to rice straw hemicellulosic hydrolysate”, Letters in Applied Microbiology , 32, pp. 248-252. 71 93. Silva S. S., Roberto I. C., Felipe M. G. A., Mancilha I. M. (1996), “Batch Fermentation of Xylose for Xylitol Production in Stirred Tank Bioreactor”, Process Biochemistry, 31, pp. 549-553. 94. Silva S.S., Santos J.C., Carvalho W., Aracava K.K., Vitolo M. (2003), “Use of a fluidized bed reactor operated in semi-continuous mode for xylose-to-xylitol conversion by Candida guilliermondii immobilized on porous glass”, Process Biochemistry, 38, pp. 903 - 907. 95. Sorenson WG, Shahan T, Simpson J. (1998), Cell wall preparations from environmental yeasts: effect on alveolar macrophage function in vitro. Ann Agric Environ Med., 5 (1): 65-71 96. Suphantharika M. Khunrae P, Thanardkid P, Verduyn C (2003), Preparation of spent brewer’s yeast beta_ glucan with a potential application as an immunostimulant for black tiger shrimp, Penaeus monodon. Bioresour Technol., 88(1): 55-60 97. Taherzadeh M. J. (1999), Ethanol from Lignocellulose: Physiological Effects of Inhibitors and Fermentation Strategies, Gteborg - Sweden. 98. Takamizawa K., Uchida S., Hatsu M., Suzuki T. and Kaqai K. (2000), “Development of a xylitol biosensor composed of xylitol dehydrogenase and diaphorase”, canadian journal of microbiology, 46, pp. 350-357. 99. Tapiainen T., Kontiokari T., Sammalkivi L., Ikheimo I., Koskela M. and Uhari M. (2001), "Effect of Xylitol on Growth of Streptococcus pneumoniae in the Presence of Fructose and Sorbitol”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45, pp. 166-169. 100. Tapiainen T., Sormunen R., Kaijalainen T., Kontiokari T., Ikaheimo I. and Uhari M. (2004), “Ultrastructure of Streptococcus pneumoniae after exposure to xylitol”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 54, pp. 225-228. 101. Thestrup H. N., Hagerdal B. H. (1995), “Xylitol formation and reduction equivalent generation during anaerobic xylose conversion with glucose as cosubtrate in recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing the xyl1 gene”, Applied and environmental microbiology, 61, pp. 2043-2045. 102. Toshio Miyake, Takashi Shibuya, Shuzo Sakai. ( 1983), “Process for producing high- purity maltose, UK Patent application 2106912 72 103. Uchida, R., Nasu, A., Iwai, Y., Someya, T. (2000),” Malto-oligosaccharide derivatives and uses thereof”, European Patent 00902014.0 104. Ueda, S., Nanri,N.(1967), Application of Microbiology, 15, pp.492- 496 Ueda, S., Yagisawa, M. & Sato,Y. (1971) , Fermentation Technology, 49, pp. 552- 558. 105. Uhari M., Kontiokari T., Koskela M. and Niemela M. (1996), “Xylitol chewing gum in prevention of acute otitis media: double blind randomised trial” British Medical Journal, 313, pp. 1180-1184. 106. Uhari M., Tapiainen T., Kontiokari T. (2000), “ Xylitol in preventing acute otitis media”, Vaccine, 19, pp. 144-147. 107. US Patent No 6.020.324 108. US Patent No WO0024270 109. Van G. M., and Beynum J. A. (1989), Starch conversion technology, pp. 33- 58 110. Vandeska E., Amartey S., Kuzmanova S., Jeffries T. W. (1996), “Fed-Batch Culture for Xylitol Production by Candida Boidinii”, Process Biochemistry, 31, pp. 265-270. 111. Vandeska E., Kuzmanov S. And Jeffries T. W. (1995), “Xylitol formation and key enzyme activities in Candida boidinii under different ozygen transfer rate”, Journal of fermentsation and bioengineering, 80, pp. 513-516. 112. Vourinen T. (1996), “Production of Xylitol”, U.S. patent 5,563,303. 123. Walker, G.T. (1968), Biochemical Journal, 108, pp.33 114. Whistler, R. L., Pashall, E. F., ( 1967), Starch : Chemistry and technology, Academic press, New York and London. 115. Yahashi Y., Horitsu H., Kawai K., Suzuki T., Takamizawa K. (1996), “Production of Xylitol From D-Xylose by Candida tropicalis: The Effect of D- Glucose Feeding”, Journal of fermentsation and bioengineering, 81, pp. 148-152. 116. Yamamoto Takehiko et.al (1988), “ Pullulanases in several Microorganisms and plan” Handbook of Amylases and related enzymes: Their sources, isolation methods, properties and applications, Pergamon press, pp. 131-159. 73 117. Yamamoto Takehiko, Kitahata Sumio, Chiba Seiya, Noshi minamiura, Yamane Kunio, et.al (1995), Enzyme chemistry and moleccular biology of amylasae and related enzymes, CRC Press, Inc 118. Yamamoto Takehiko, Kitahata Sumio, Okada Shigetaka, Noshi minamiura, et.al (1988), Handbook of Amylases and related enzymes: Their sources, isolation methods, properties and applications, Pergamon press. 119. Yuong_ Jeck Kim, Eun_ Hee Kim, Chaejoon Cheong, David L. Williams, Chan- Wha Kim, Seung- Taik Lim (2000), Structural characterization of β-D-(1-3,1- 6)- linked Glucans using NMR spectroscopy. Carbohydrate Research 328: 331- 341. 120. Yutaka Higashimura, Kazuhiro Emura, Noriko Kuze.(2000),” method for inhibiting fading of a natural pigment using nigerooligosaccharide or maltooligosaccharide with or without an antioxidant”, United States Patent 6,572,906B1