Đề tài Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân gíông vô tính cây lựu (Punica granatum. L)

ph¸p nh©n gièng nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn. Tuy nhiªn, mét sè c©y trång, nÕu nh©n gièng b»ng h¹t cã thÓ cho nh÷ng c¸ thÓ con kh«ng hoµn toµn gièng bè mÑ chóng c¶ vÒ h×nh th¸i lÉn thµnh phÇn ho¸ häc (Carson, 1964). §Æc biÖt, ®èi víi c©y thuèc, sù kh«ng ®ång nhÊt vÒ di truyÒn dÉn ®Õn hËu qu¶ lµ nguyªn liÖu kh«ng æn ®Þnh vÒ mÆt chÊt l­îng qua c¸c thÕ hÖ, g©y khã kh¨n cho viÖc ®­a nguyªn liÖu vµo d©y chuyÒn s¶n xuÊt c«ng nghiÖp v× hµm l­îng ho¹t chÊt cña nguyªn liÖu thay ®æi thÊt th­êng. 2.2.2. Nh©n gièng v« tÝnh Ph­¬ng ph¸p nµy sö dông kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c c¬ quan dinh d­ìng kh¸c nhau nh­ th©n, rÔ, l¸, m« hay tÕ bµo. Nh©n gièng v« tÝnh bao gåm nh©n gièng v« tÝnh truúªn thèng (chiÕt, ghÐp, gi©m) vµ nh©n gièng v« tÝnh in vitro. Nh©n gièng v« tÝnh t¹o ra c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn do duy tr× ®­îc c¸c tÝnh tr¹ng cña c©y mÑ (Petrop, 1989). Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng cã tÇm quan träng sèng cßn ®èi víi c©y d­îc liÖu. VÝ dô : C¸c loµi Dioscorea, nguån nguyªn liÖu sè mét cña c«ng nghiÖp steroid (Ph¹m Kim M·n, 1992), trång b»ng cñ bao giê còng cho hµm l­îng diosgenin æn ®Þnh h¬n trång b»ng h¹t (Bammin, Randhava, 1975; Gupta et al, 1979).[19]. §Ó duy tr× hµm l­îng diosgenin cao cña c¸c dßng ®· ®­îc chän läc, ng­êi ta qui ®Þnh chØ dïng ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh (Asolka, Chadha, 1979).[18] Sù ph©n ly vÒ h×nh th¸i còng nh­ thµnh phÇn ho¸ häc khi nh©n gièng b»ng h¹t th­êng dÉn ®Õn sù tho¸i ho¸ gièng ®· ®­îc nhiÒu t¸c gi¶ ®Ò cËp ®Õn trong nghiªn cøu nhiÒu c©y kh¸c nh­ h­íng d­¬ng (Stotsnova, 1973), thiªn tróc qu×, thanh cao hoa vµng (NguyÔn Gia ChÊn vµ cs, 1991)[3], long n·o (Ph¹m V¨n KhiÓn, 1992).[6] Nh­ vËy gi¸ trÞ to lín nhÊt cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh lµ duy tr× ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quÝ hiÕm qua c¸c thÕ hÖ vµ v× vËy t¹o ra kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp. Nh©n gièng v« tÝnh cßn cã t¸c dông rót ng¾n thêi gian tõ khi trång tíi khi thu ho¹ch t¹o ®iÒu kiÖn t¨ng vô, t¨ng s¶n phÈm vµ dÉn ®Õn t¨ng hiÖu qu¶ kinh tÕ. §Ó thu ®­îc n¨ng suÊt nh­ nhau, c¸c loµi Dioscorea nÕu trång b»ng h¹t sÏ ph¶i kÐo dµi thêi gian sinh tr­ëng Ýt nhÊt 6 th¸ng so víi trång b»ng cñ (Husain et al, 1979; Martin, Gaskins, 1969; Ph¹m V¨n HiÓn vµ ctv, 1988). §èi v¬Ý mÝa dß, Starin (1977) ®· kÕt luËn lµ trång b»ng h¹t kh«ng kinh tÕ. NhiÒu c©y thuèc kh¸c nÕu nh©n gièng b»ng h¹t còng sÏ ph¶i kÐo dµi thêi gian sinh tr­ëng tõ 1 ®Õn nhiªï n¨m so v¬Ý nh©n gièng v« tÝnh nh­ b¹ch th­îc, b¸n h¹, ®an s©m, kim ng©n... Tuy nhiªn, nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p v« tÝnh truyÒn thèng còng cã nh­îc ®iÓm nhÊt ®Þnh, ®Æc biÖt lµ sù l©y nhiÔm bÖnh qua nguyªn liÖu gièng th­êng phæ biÕn vµ phøc t¹p. Sù l©y nhiÔm vµ tÝch tô c¸c ký sinh trïng ®Æc hiÖu, nhÊt lµ virus, lµm gi¶m n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng c©y trång. ThiÖt h¹i do hiÖn t­îng nµy g©y ra cã thÓ thÊy rÊt râ ë khoai t©y (Vò TriÖu M©n vµ cs, 1986; Van de Zaag, 1983)[10], b¹c hµ (Muschiatxe, 1985), lóa m×, ®¹i m¹ch vµ nhiÒu c©y kh¸c. HÖ sè nh©n gièng cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh th«ng th­êng rÊt thÊp. ThÝ dô cña Dioscorea floribunda khi nh©n b»ng cñ lµ 8 – 10c©y/ n¨m (Bammi, Radha, 1975), cña cam th¶o lµ 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980)[35]. HÖ sè nh©n gièng cña b¹c hµ piperota khi nh©n gièng b»ng th©n ngÇm trung b×nh lµ 2 – 3 (Foldesi, Havas, 1979), cña b¹c hµ arvensis lµ 6 – 7 (ViÖn d­îc liÖu, 1976)[7]. Thªm vµo ®ã, nguyªn liÖu cñ gièng lµ m« t­¬i, cã khèi l­îng lín, viÖc vËn chuyÓn vµ b¶o qu¶n th­êng gÆp nhiÒu khã kh¨n. ViÖc sö dông chÝnh c¸c bé phËn lµm thuèc ®Ó lµm nguyªn liÖu gièng g©y nhiÒu l·ng phÝ, tèn kÐm. C¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng truyÒn thèng gåm cã: ChiÕt: lµ ph­¬ng ph¸p t¹o ra c¸ thÓ míi, th­êng lµ trªn th©n c©y, tr­íc khi t¸ch khái c©y mÑ. ¦u ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ cµnh chiÕt ®­îc c¸ thÓ mÑ cung cÊp n­íc vµ dinh d­ìng, ®Æc biÖt lµ cacbohydrat, protein, phytohormon tr­íc khi cã thÓ tù nu«i sèng m×nh. D©m: lµ sù t¹o ra c©y con tõ mét l¸t c¾t th©n, l¸, rÔ, hoÆc tõ 1 l¸, cñ, rÔ nguyªn, sau khi ®· t¸ch ra khái c©y mÑ. ph­¬ng ph¸p d©m th­êng cã hÖ sè nh©n cao h¬n ph­¬ng ph¸p chiÕt vµ ghÐp, nh­ng cÇn ®¶m b¶o (nh©n t¹o) c¸c ®iÒu kiÖn néi t¹i vµ ngo¹i c¶nh thÝch hîp cho qu¸ tr×nh ra rÔ vµ t¸i sinh mÇm. GhÐp: lµ sù liªn kÕt gi÷a hai bé phËn : cµnh ghÐp vµ gèc ghÐp cña hai c¸ thÓ kh¸c nhau (th­êng ¸p dông ®èi víi c©y th©n gç). C©y ghÐp th­êng cã ­u thÕ cña c¶ gèc ghÐp vµ cµnh ghÐp. H¹n chÕ cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ chØ thùc hiÖn ®­îc trong ph¹m vi c¸c c©y th©n gç cã sinh tr­ëng thø cÊp (c©y h¹t trÇn vµ c©y hai l¸ mÇm), c©y mét l¸ mÇm hÇu nh­ kh«ng ghÐp ®­îc. ThËm chÝ c¸c c©y nµy ph¶i rÊt gÇn nhau vÒ mÆt ph©n lo¹i th× tû lÖ thµnh c«ng míi cao. Ngoµi ra viÖc lùa chän ®­îc gèc ghÐp phï hîp kh«ng ph¶i lµ dÔ vµ thêi gian tån t¹i c©y gièng trong v­ßn ­¬m l©u. Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ®· bæ sung cho c¸c kü thuËt nh©n gièng truyÒn thèng nhiÒu kü thuËt tiÕn bé, kh¾c phôc ®­îc nh÷ng h¹n chÕ cña c¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng nãi trªn . 2.2.3. Nh©n gièng v« tÝnh in vitro Lµ ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m« , tÕ bµo trªn m«i tr­êng dinh d­âng nh©n t¹o trong ®iÒu kiÖn v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y con. C¬ së lý luËn cña nu«i cÊy in vitro C¬ së lý luËn cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy m«, tÕ bµo in vitro lµ häc thuyÕt vÒ tÝnh toµn n¨ng (totipotence) cña tÕ bµo. Theo Haberland.G (1902), nhµ thùc vËt häc ng­êi §øc, tÊt c¶ c¸c tÕ bµo cña c©y ®Òu mang toµn bé l­îng th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ, khi gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp, mçi tÕ bµo ®ã ®Òu cã kh¶ n¨ng t¸i sinh vµ ph¸t triÓn thµnh c¸ thÓ hoµn chØnh. Thùc tÕ ®· chøng minh ®­îc kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. Hµng tr¨m loµi c©y trång ®· ®­îc nh©n gièng trªn qui m« th­¬ng m¹i b»ng c¸ch nu«i cÊy trong m«i tr­êng nh©n t¹o v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y víi hÖ sè nh©n gièng v« cïng lín (Murashige, 1930)[30]. Morel (1966)[28] lµ ng­êi ®Çu tiªn ®· thµnh c«ng trong viÖc t¸i sinh vµ nh©n nhanh gièng lan quÝ Cymbidium b»ng ph­¬ng ph¸p nµy. Trong mét thêi gian ng¾n ng­êi ta cã thÓ thu ®­îc hµng triÖu c¸ thÓ, nhê vËy mµ hoa Cymbidium vèn ®¾t tiÒn ®· cã gi¸ thµnh h¹ h¬n vµ ®¸p øng ®­îc nhu cÇu tiªu dïng cña nhiÒu ng­êi. ë Th¸i Lan 90% lan th­¬ng m¹i ®­îc nh©n b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. Thµnh c«ng ®èi víi hä Orchidaceae kh«ng nh÷ng chØ lµ b»ng chøng mµ cßn më ®­êng cho viÖc øng dông kü thuËt nµy ®èi víi c¸c loµi c©y kh¸c nh­ c©y ¨n qu¶, c©y l­¬ng thùc, c©y l©m nghiÖp, c©y thuèc, c©y c¶nh.... Cóc ë NhËt B¶n, Trung Quèc, Mü, ®Æc biÖt ë Hµ Lan sö dông ph­¬ng ph¸p nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao tõ 410-1010/n¨m (NguyÔn Xu©n Linh, 1988). C¸c lÜnh vùc øng dông kh¸c cña ph­¬ng ph¸p nµy còng mang l¹i nhiÒu kÕt qu¶ trong viÖc c¶i t¹o vµ phôc tr¸ng gièng c©y trång. Qóa tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i trong nu«i cÊy in vitro thùc vËt thùc chÊt lµ kÕt qu¶ cña c¸c qóa tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸. TÊt c¶ c¸c tÕ bµo trong c¸c c¬ quan kh¸c nhau cña c¬ thÓ thùc vËt tr­ëng thµnh ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù chuyÓn tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸ ®Ó ®¶m nhiÖm c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau ®­îc gäi lµ sù ph©n ho¸ tÕ bµo . Cßn qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ th× ng­îc l¹i víi qóa tr×nh ph©n ho¸, cã nghÜa lµ tÕ bµo ®· ph©n ho¸ thµnh m« chøc n¨ng kh«ng hoµn toµn mÊt ®i kh¶ n¨ng ph©n chia mµ ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp, chóng cã thÓ trë vÒ d¹ng ph«i sinh vµ t¸i ph©n chia. C¸c qóa tr×nh trªn cã thÓ tãm t¾t nh­ sau: Ph©n ho¸ tÕ bµo TÕ bµo d·n TÕ bµo ph«i sinh TÕ bµo chuyªn ho¸ Ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo VÝ dô : khi nu«i cÊy m¶nh l¸ hay ®èt th©n c©y thuèc l¸, ë ®iÒu kiÖn m«i tr­êng thÝch hîp c¸c tÕ bµo ®· ph©n ho¸ cña l¸, ®èt th©n sÏ ph¶n ph©n ho¸, ph©n chia trë l¹i thµnh m« sÑo kh«ng cßn lµ tÕ bµo cã chøc n¨ng nh­ tÕ bµo l¸, ®èt th©n n÷a. NÕu chuyÓn sang m«i tr­êng kh¸c th× tuú theo thµnh phÇn m«i tr­êng mµ c¸c tÕ bµo m« sÑo cã thÓ ph©n ho¸ theo c¸c h­íng kh¸c nhau (h×nh thµnh rÔ, chåi hay t¹o c©y hoµn chØnh...) ¦u, nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro cã kh¶ n¨ng kh¾c phôc ®­îc nhiÒu trë ng¹i mµ nh÷ng ph­¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c th­êng gÆp. Cô thÓ lµ: T¹o c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn, b¶o tån ®­îc c¸c tÝnh tr¹ng ®· chän läc. T¹o ®­îc dßng thuÇn cña c¸c c©y t¹p giao. §iÒu nµy cã ý nghÜa rÊt lín víi c©y thuèc nãi chung, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c c©y trång ®Ó chiÕt lÊy ho¹t chÊt. T¹o ®­îc c©y cã genotip míi( ®a béi, ®¬n béi). B¶o qu¶n vµ l­u gi÷ tËp ®oµn gen. Phôc tr¸ng gièng th«ng qua kü thuËt cÊy ®Ønh sinh tr­ëng vµ c¶i t¹o gièng b»ng kü thuËt gen. Cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt quanh n¨m. Cã thÓ nh©n nhanh nhiÒu c©y kh«ng kÕt h¹t trong nh÷ng ®iÒu kiÖn sinh th¸i nhÊt ®Þnh hoÆc h¹t nÈy mÇm kÐm. HÖ sè nh©n gièng cùc kú cao (th­êng ®¹t ®­îc ë c¸c loµi c©y kh¸c nhau trong ph¹m vi tõ 36 – 1012/ n¨m), rót ng¾n thêi gian ®­a mét gièng míi vµo s¶n xuÊt ®¹i trµ. NÕu xÐt vÒ ph­¬ng diÖn hÖ sè nh©n th× nh©n gièng in vitro lµ ph­¬ng ph¸p kh«ng g× cã thÓ s¸nh kÞp, kÓ c¶ ph­¬ng ph¸p nh©n gièng b»ng h¹t. ChØ tÝnh riªng lÜnh vùc true - to – type, nu«i cÊy in vitro cã thÓ coi lµ mét cuéc ®¹i c¸ch m¹ng vÒ hÖ sè nh©n. ThÝ dô: sö dông chåi n¸ch ®Ó nh©n cã thÓ t¹o ra hµng chôc v¹n c©y D.floribunda trong vßng mét n¨m (Chaturvedi, Sinha, 1979; Ph¹m V¨n HiÓn vµ cs, 1988)[5] hay 26 v¹n c©y cam th¶o trong 5 th¸ng (Shah, Dalal, 1980)[35] tõ mét l¸t c¾t ban ®Çu mµ th«ng th­êng 1 c©y D.floribunda chØ t¹o ra 8 – 10 c©y trong mét n¨m, vµ cam th¶o chØ cho 5 – 7 c©y nÕu nh©n gièng b»ng cµnh. Tõ mét cñ gièng khoai t©y trong thêi gian 8 th¸ng, ng­êi ta thu ®­îc 2000 cñ ®ång nhÊt di truyÒn, trång ®­îc trªn mét vïng 40ha, cã nghÜa lµ tèc ®é nh©n gièng >100 000 so víi sinh s¶n h÷u tÝnh (Senez, 1987). ë ViÖt nam, Mai ThÞ T©n vµ céng sù ®· ®¹t ®­îc hÖ sã nh©n 532 trong vßng 1 n¨m ®èi víi khoai t©y b»ng ph­¬ng ph¸p nµy[12]. §Æc biÖt, c©y cä dÇu th­êng ph¶i mÊt 10 – 15 n¨m míi cho thu ho¹ch, viÖc chän, t¹o vµ nh©n nhanh ®­îc mét gièng míi rÊt khã kh¨n. B»ng ph­¬ng ph¸p nh©n nhanh in vitro, ng­êi ta cã thÓ cung cÊp ®­îc 500 000 c©y con gièng hÖt nhau trong vßng mét n¨m (Starisky, 1970)[36]. Whitehead vµ Giles (1977) dù tÝnh hµng n¨m cã hÓ thu ®­îc 106 c©y gièng khi nu«i cÊy chåi cña Popolus nigra, P.yannanensis vµ con lai cña Popolus. Nh­îc ®iÓm chÝnh cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro lµ ®ßi hái trang thiÕt bÞ ®¾t tiÒn vµ kü thuËt cao nªn chØ cã hiÖu qu¶ ®èi víi nh÷ng c©y cã gi¸ trÞ cao hoÆc khã nh©n giång b»ng c¸c ph­¬ng ph¸p kh¸c (Nickell, 1973)[33]. Ngoµi ra, ph­¬ng ph¸p nµy cßn cã nh÷ng bÊt lîi sau: MÆc dï sè l­îng c©y gièng thu ®­îc cã thÓ rÊt cao, nh­ng c©y con cã kÝch th­íc nhá, ®ßi hái ph¶i cã chÕ ®é ch¨m sãc ®Æc biÖt ë giai ®o¹n sau èng nghiÖm. C©y cã thÓ cã nh÷ng ®Æc tÝnh kh«ng mong muèn. Kh¶ n¨ng t¹o ®ét biÕn cã thÓ t¨ng. Kh¶ n¨ng t¸i sinh cã thÓ bÞ mÊt ®i do cÊy truyÒn callus hay huyÒn phï tÕ bµo nhiÒu lÇn. C©y gièng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh ®ång lo¹t. Tuy vËy ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ngµy cµng ®­îc sö dông réng r·i ®Ó phôc vô nh÷ng môc ®Ých sau: Duy tr× vµ nh©n nhanh c¸c kiÓu gen quÝ hiÕm lµm vËt liÖu cho c«ng t¸c chän gièng. Nh©n nhanh vµ duy tr× c¸c c¸ thÓ ®Çu dßng tèt ®Ó cung cÊp h¹t gièng c¸c lo¹i c©y trång kh¸c nhau nh­ c©y l­¬ng thùc cã cñ, c©y rau, c©y hoa, c©y c¶nh vµ c©y d­îc liÖu thuéc nhãm c©y th©n th¶o. Nh©n nhanh vµ kinh tÕ c¸c kiÓu gen quÝ cña gièng c©y l©m nghiÖp vµ gèc ghÐp trong nghÒ trång c©y ¨n qu¶, c©y c¶nh thuéc nhãm c©y thÉn gç, Nh©n nhanh ë ®iÒu kiÖn v« trïng vµ c¸ch ly t¸i nhiÔm kÕt hîp víi lµm s¹ch virus. B¶o qu¶n vµ l­u gi÷ c¸c tËp ®oµn gièng nh©n gièng v« tÝnh vµ c¸c loµi giao phÊn trong ng©n hµng gen. Kü thuËt nu«i cÊy in vitro Cã thÓ chia thµnh c¸c b­íc sau: Lùa chän ®èi t­îng (c©y trång, gièng, bé phËn c©y) thÝch hîp. Nguyªn liÖu sö dông cho nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc vËt cã thÓ lµ bÊt cø bé phËn nµo cña c©y: c¸c ®o¹n cña rÔ, th©n, c¸c phÇn cña l¸ (cuèng l¸, phiÕn l¸...), c¸c cÊu tróc cña ph«i nh­ l¸ mÇm, trô trªn, trô d­íi l¸ mÇm, h¹t phÊn, no·n.. thËm chÝ c¶ mÈu th©n ngÇm hay c¬ quan dù tr÷ d­íi mÆt ®Êt (cñ, c¨n hµnh..) còng ®­îc dïng cho nu«i cÊy. Khö trïng mÉu vµ tiÕn hµnh nu«i cÊy Nguyªn liÖu ®Ó nu«i cÊy in vitro ®­îc lùa chän tõ nh÷ng c¸ thÓ ­u tó cña loµi, khoÎ vµ s¹ch bÖnh virus, nh­ng Ýt hay nhiÒu ®Òu cã nhiÔm vi sinh vËt vµ nÊm tuú thuéc vµo sù tiÕp xóc cña chóng víi m«i tr­êng xung quanh. Cã mét sè bé phËn nh­ ph«i trong h¹t, m« trong qu¶, ®ßng lóa non ... Ýt bÞ nhiÔm vi sinh vËt h¬n c¸c bé phËn kh¸c cña c©y, ng­îc l¹i c¸c bé phËn n»m d­íi mÆt ®Êt nh­ rÔ, cñ, th©n ngÇm, cã l­îng vi khuÈn vµ nÊm rÊt cao. Ph­¬ng ph¸p th«ng dông nhÊt hiÖn nay ®Ó lo¹i bá hÖ vi sinh vËt khái vËt liÖu cÊy lµ sö dông c¸c ho¸ chÊt cã ho¹t tÝnh diÖt khuÈn vµ nÊm. T¸c nh©n khö trïng, ngoµi t¸c dông diÖt vi sinh vËt cßn ¶nh h­ëng ®Õn m« cÊy, v× vËy viÖc lùa chän lo¹i ho¸ chÊt ph¶i c¨n cø vµo møc ®é nhiÔm khuÈn vµ ®é mÉn c¶m cña tõng mÉu. Trong sè c¸c ho¸ chÊt hay ®­îc sö dông ®Ó khö trïng th× canxi hypoclorit vµ natri hypoclorit lµ hay ®­îc sö dông h¬n c¶ v× ®Æc tÝnh cña chóng: cã ®éc tÝnh thÊp ®èi víi m« ®­îc xö lý, kh«ng g©y øc chÕ sinh tr­ëng vµ hiÖu qu¶ diÖt khuÈn tèt. Nång ®é cña canxi hypoclorit vµ natri hypoclorit hay ®­îc sö dông lµ 5 – 15% vµ 0,5 – 2% trong thêi gian tõ 15 – 30 phót. X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn nu«i cÊy(m«i tr­êng dinh d­ìng, nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng) ®Ó ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t triÓn m« nu«i cÊy theo ®Þnh h­íng. Thµnh c«ng cña ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro phô thuéc rÊt nhiÒu vµo ®iÒu kiÖn nu«i cÊy. Nhu cÇu dinh d­ìng cho sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn tèi ­u cña c¸c loµi lµ kh«ng gièng nhau, ngay c¶ gi÷a c¸c bé phËn trong cïng mét c¬ thÓ còng Ýt nhiÒu cã sù kh¸c nhau (Murashige vµ Skoog, 1962). Sù lùa chän m«i tr­êng nu«i cÊy, bao gåm c¶ chÊt l­îng vµ sè l­îng ho¸ chÊt sö dông ®ãng vai trß quyÕt ®Þnh ®èi víi b¶n th©n sù ph©n ho¸ vµ chiÒu h­íng ph©n ho¸ cña tÕ bµo. Cho ®Õn nay ®· cã nhiÒu lo¹i m«i tr­êng dinh d­ìng ®­îc t×m ra: M«i tr­êng Murashige vµ Skoog (1962), m«i tr­êng Linsmainer vµ Skoog (1963), m«i tr­êng Gamborg (1968), m«i tr­êng Knop (1974)... §©y lµ nh÷ng m«i tr­êng c¬ b¶n vµ sÏ ®­îc c¶i tiÕn thµnh nhiÒu lo¹i m«i tr­êng kh¸c nhau cho phï hîp víi mçi ®èi t­îng nghiªn cøu vµ môc ®Ých thÝ nghiÖm. Trong sè ®ã m«i tr­êng MS (Murashige vµ Skoog, 1962) ®­îc ®¸nh gi¸ lµ phï hîp nhÊt cho ®a sè c¸c loµi thùc vËt vµ chÝnh Murashige (1974) ®· dïng m«i tr­êng nµy ®Ó nu«i cÊy nhiÒu lo¹i c©y trång. Thµnh phÇn chñ yÕu cña tÊt c¶ c¸c lo¹i m«i tr­êng gåm nh÷ng nhãm chÊt sau: muèi kho¸ng ®a l­îng vµ vi l­îng (muèi chloride, nitrat, sulphat, phosphat vµ iodid cña Ca, Mg, K, Na, Fe, Mn, Zn vµ B), vitamin, nguån cacbon, yÕu tè sinh tr­ëng h÷u c¬ (axit amin, pepton), hormon sinh tr­ëng. §­êng lµ mét thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong bÊt cø m«i tr­êng nu«i cÊy nµo. Nã ®­îc sö dông lµm nguån cacbon cung cÊp n¨ng l­îng chñ yÕu trong m«i tr­êng nu«i cÊy nhiÒu loµi thùc vËt (Hu et al., 1979). M« vµ tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy in vitro sèng chñ yÕu theo ph­¬ng thøc dÞ d­ìng, mÆc dï ë mét sè tr­êng hîp chóng cã thÓ sèng b¸n dÞ d­ìng nhê ¸nh s¸ng nh©n t¹o vµ lôc l¹p cã kh¶ n¨ng quang hîp. H¬n n÷a, ®­êng cßn ®ãng vai trß thÈm thÊu chÝnh cña m«i tr­êng. Vitamin cã vai trß xóc t¸c c¸c qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt diÔn ra trong tÕ bµo. HÇu hÕt c¸c m« nu«i cÊy ®Òu cã kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c vitamin cÇn thiÕt nh­ng kh«ng ®Çy ®ñ vÒ sè l­îng, v× vËy ®Ó ®¹t ®­îc sù sinh tr­ëng tèi ­u ng­êi ta th­êng bæ sung mét sè vitamin nh­: thiamin(B1), axit nicotinic(PP), vitamin B5, piridoxin(B6). Trong ®ã B1 ®­îc coi lµ thiÕt yÕu ®èi víi sù sinh tr­ëng cña tÕ bµo thùc vËt (Weavaer R.J.,1972; Bhojwani vµ Razdan, 1983)[22]. Ngoµi ra cßn cã thÓ sö dông vitamin C vµ c¸c chÊt chèng oxy ho¸ kh¸c. Nång ®é sö dông vitamin th­êng tõ 0,1 – 1mg/l. §iÒu khiÓn t¸i sinh c©y hoµn chØnh tõ m« nu«i cÊy C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng thùc vËt (phytohormon) lµ thµnh phÇn quan träng bËc nhÊt trong m«i tr­êng nu«i cÊy. Dùa vµo nh÷ng chÊt nµy, c¸c nhµ nghiªn cøu cã thÓ chñ ®éng ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña thùc vËt in vitro. Cã hai nhãm chÊt ®­îc sö dông réng r·i lµ auxin vµ cytokinin. Nhãm auxin gåm mét sè hîp chÊt cã chøa nh©n idol trong ph©n tö. Trong nu«i cÊy in vitro, auxin thóc ®Èy sinh tr­ëng cña mÉu do ho¹t ho¸ sù ph©n chia vµ gi·n në cña tÕ bµo, kÝch thÝch c¸c qu¸ tr×nh tæng hîp vµ trao ®æi chÊt, tham gia ®iÒu chØnh sù ph©n ho¸ cña rÔ, chåi...(Bhojwani and Razdan,1983)[32]. C¸c auxin ®Òu cã hiÖu qu¶ sinh lý ë nång ®é thÊp, th­êng ®­îc sö dông víi nång ®é tõ 10-1 – 10-6M tuú theo tõng chÊt, môc dÝch vµ ®èi t­îng nghiªn cøu.Auxin ®­îc thªm vµo m«i tr­êng nu«i cÊy sÏ kÕt hîp víi auxin néi sinh ®Ó ®iÒu khiÓn chiÒu h­íng vµ c­êng ®é c¸c qu¸ tr×nh sinh tr­ëng. Hµm l­îng auxin thÊp sÏ kÝch thÝch sù ph©n ho¸ rÔ, ng­îc l¹i ë hµm l­îng cao sÏ ph¸t ®éng sù t¹o m« sÑo. C¸c auxin th­êng ®­îc sö dông trong nu«i cÊy m« lµ IBA (idol butiric acid), NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (idol acetic acid). Cytokinin lµ nhãm phytohormon dÉn xuÊt cña adenin, cã vai trß sinh lý t­¬ng tù nhau. Cytokinin liªn quan chÆt chÏ víi ph©n bµo, duy tr× sù trÎ ho¸ c¸c c¬ quan, lµm gi¶m ­u thÕ ngän, kÝch thÝch sù ph©n ho¸ chåi tõ m« sÑo nu«i cÊy... Nång ®é cytokinin cao k×m h·m sù h×nh thµnh vµ ph¸t triÓn cña rÔ (Narayanaswamy S., 1994). C¸c cytokinin dïng trong nu«i cÊy lµ kinetin, 2iP (6- (g,g dimethylallylamino) purin,) BAP(benzylaminopurin) víi nång ®é 10-4- 10-7 M. NhiÒu t¸c gi¶ ®· tæng kÕt r»ng sù biÖt ho¸ c¬ quan thùc vËt in vitro lµ kÕt qu¶ t¸c ®éng qua l¹i gi÷a hai nhãm auxin vµ cytokinin. C©n b»ng tû lÖ auxin/ cytokinin nÕu nghiªng vÒ phÝa auxin sÏ kÝch thÝch sù h×nh thµnh rÔ, ng­îc l¹i nÕu c©n b»ng nµy nghiªng vÒ phÝa cytokinin sÏ thóc ®Èy sù t¹o chåi. ë tû lÖ trung gian m« sÑo ®­îc h×nh thµnh. §©y lµ nguyªn t¾c chung ®Ó ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña m« nu«i cÊy. C¸c m« kh¸c nhau cã ph¶n øng kh«ng gièng nhau. V× vËy víi tõng lo¹i m« vµ tõng giai ®o¹n sinh tr­ëng kh¸c nhau th× t×m ®­îc tæ hîp nång ®é auxin-cytokinin thÝch hîp lµ rÊt quan träng. §­a nh÷ng c©y t¸i sinh ®­îc trë l¹i ®iÒu kiÖn tù nhiªn. §©y lµ giai ®o¹n quan träng bao gåm viÖc huÊn luþªn c©y in vitro thÝch nghi víi ®iÒu kiÖn thay ®æi nhiÖt ®é, ®é Èm, sù mÊt n­íc, s©u bÖnh vµ chuyÓn tõ tr¹ng th¸i dÞ d­ìng sang tù d­ìng hoµn toµn. Qóa tr×nh thÝch nghi ë ®©y ®­îc hiÓu lµ qu¸ tr×nh thay ®æi ®Æc ®iÓm sinh lý vµ gi¶i phÉu cña c©y in vitro. Thêi gian tèi thiÓu cho sù thÝch nghi lµ 2-3 tuÇn. C¸c ®­êng h­íng nh©n gièng v« tÝnh in vitro Trong nh©n gièng in vitro, c©y con cã thÓ ®­îc t¸i sinh tõ c¸c ®iÓm sinh tr­ëng cã s½n trong c¸c bé phËn (ph«i, ®Ønh chåi, chåi n¸ch) hoÆc tõ nh÷ng m« cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh ®iÓm sinh tr­ëng phô. Cã hai ph­¬ng thøc t¸i sinh c©y con: T¸i sinh trùc tiÕp tõ ®Ønh sinh tr­ëng, ph«i, ngän chåi, hay chåi n¸ch. T¸i sinh c©y gi¸n tiÕp th«ng qua giai ®o¹n h×nh thµnh m« sÑo. T¸i sinh trùc tiÕp (direct regenerarion) tõ mÉu nu«i cÊy lµ qu¸ tr×nh ph¸t ®éng nh÷ng ®iÓm sinh tr­ëng ®· tån t¹i s½n trong m« nu«i cÊy ph©n chia vµ t¸i sinh thµnh c©y. C¸c ®iÓm sinh tr­ëng nµy bao gåm c¸c tÕ bµo ph«i sinh chøa 2n nhiÔm s¾c thÓ ®Æc tr­ng cho loµi. C©y con t¹o ra theo con ®­êng nµy hoµn toµn ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn vµ duy tr× ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng cña c©y mÑ (Hu and Xang, 1983). McCown vµ Amos (1979) chØ ph¸t hiÖn ra 1 tr­êng hîp bÊt th­êng trong sè hµng tr¨m ngh×n chåi cña c©y phong ®­îc t¸i sinh b»ng c¸ch nµy.T¸i sinh trùc tiÕp còng cã thÓ xuÊt ph¸t tõ nh÷ng tÕ bµo kh«ng n»m trong ®iÓm sinh tr­ëng. Trong tr­êng hîp nµy, c¸c tÕ bµo b×nh th­êng ph©n chia nh­ng kh«ng h×nh thµnh m« sÑo mµ t¹o nªn nh÷ng ®iÓm sinh tr­ëng phô (adventitious meristemoid), sau ®ã c¸c ®iÎm sinh tr­ëng phô nµy tiÕp tôc t¸i sinh thµnh c©y con. X¸c suÊt xuÊt hiÖn c¸c biÕn dÞ, thËm chÝ c¶ ®ét biÕn th­êng cao h¬n tr­êng hîp ®· nãi trªn. Trong ®­êng h­íng t¸i sinh gi¸n tiÕp, mÉu nu«i cÊy kh«ng t¸i sinh thµnh c©y ngay mµ ph¸t triÓn thµnh khèi m« sÑo (callus). Cã thÓ thÊy ngay lµ hÖ sè nh©n cña con ®­êng nµy v« cïng lín. Tõ mét khèi m« sÑo cã thÓ t¹o ra khèi l­îng lín c©y gièng trong mét thêi gian ng¾n th«ng qua kü thuËt t¹o ph«i soma hoÆc chÕ ra h¹t gièng nh©n t¹o (Redenborgh et al, 1986). V× vËy, trong nh©n gièng in vitro, ®Ó nh©n nhanh nh÷ng c¸ thÓ ®· chän läc ng­êi ta th­êng t¸i sinh c©y theo ®­êng h­íng trùc tiÕp, cßn môc tiªu cña t¸i sinh gi¸n tiÕp lµ t¹o ra nhiÒu biÕn dÞ ®Ó phôc vô cho viÖc chän läc vµ c¶i t¹o gièng c©y trång. Qui tr×nh nh©n gièng in vitro. Theo Debergh (1991) th× qui tr×nh nh©n gièng ®­îc chia lµm 5 giai ®o¹n : LÊy mÉu vµ xö lý mÉu. §©y lµ giai ®o¹n quan träng quyÕt ®Þnh qu¸ tr×nh vi nh©n gièng. Kh¶ n¨ng nhiÔm bÖnh cña mÉu phô thuéc vµo c¸ch lÊy mÉu, xö lý mÉu vµ ®iÒu kiÖn khö trïng. Mçi c©y ®Òu cã ng­ìng nhiÖt ®é vµ ®é Èm phï hîp khi b¶o qu¶n vµ xö lý mÉu.Víi c©y cËn nhiÖt ®íi vµ nhiÖt ®íi th× nhiÖt ®é 25°C, Èm ®é 75% lµ ®iÒu kiÖn gi÷ mÉu thÝch hîp, tû lÖ nhiÔm bÖnh thÊp (Deborgh vµ Zimmerman, 1991). T¸i sinh mÉu nu«i cÊy. Môc ®Ých cña giai ®o¹n nµy lµ t¸i sinh c¸c c¬ quan tõ mÉu nu«i cÊy. MÉu th­êng lµ chåi ®Ønh, chåi n¸ch hay l¸t c¾t ®èt th©n tuú thuéc ®èi t­îng vµ môc ®Ých nghiªn cøu, tÕ bµo ph«i th­êng cã triÓn väng nhÊt råi ®Õn tÕ bµo ®Ønh sinh tr­ëng ®ang ho¹t ®éng (®Ønh ngän, ®Çu rÔ), sau ®ã lµ tÕ bµo ë tr¹ng th¸i ngñ nghØ (chåi n¸ch). Nh©n nhanh chåi. §©y lµ giai ®o¹n ®¸nh gi¸ tÝnh ­u viÖt hay kh«ng cña ph­¬ng ph¸p vi nh©n gièng (liªn quan ®Õn hÖ sè nh©n chåi). M«i tr­êng ë giai ®o¹n nµy ®­îc bæ xung thªm hormon sinh tr­ëng (cytokinin, auxin), t¨ng thêi gian chiÕu s¸ng lªn 16 giê/ngµy, c­êng ®é ¸nh s¸ng tèi thiÓu lµ 1000 lux. ¸nh s¸ng tÝm lµ thµnh phÇn kÝch thÝch ph©n ho¸ m¹nh (Weiss vµ Jaffe, 1969), nhiÖt ®é thÝch hîp tõ 20 – 30°C. T¸i sinh rÔ. Khi chåi ®¹t ®Õn mét kÝch th­íc nhÊt ®Þnh, mÉu ®­îc chuyÓn sang m«i tr­êng t¹o rÔ. M«i tr­êng nµy th­êng ®­îc bæ sung auxin (IBA, NAA, 2,4-D), ë liÒu l­îng thÝch hîp. Tuy nhiªn ë mét sè c©y nh­ chuèi th× sù h×nh thµnh rÔ tèt h¬n ë m«i tr­êng kh«ng cã chÊt sinh tr­ëng (Bhojwani vµ Razdan, 1983). §­a c©y in vitro ra ®Êt. ë giai ®o¹n nµy, c©y chuyÓn tõ tr¹ng th¸i dÞ d­ìng sang tù d­ìng. V× vËy, cÇn ph¶i huÊn luyÖn cho c©y thÝch nghi víi sù biÕn ®æi cña m«i tr­êng, ®ång thêi thay ®æi nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh lý vµ gi¶i phÉu cña c©y con. øng dông nu«i cÊy in vitro trong nh©n gièng c©y thuèc Cho ®Õn nay, nhiÒu c©y d­îc liÖu vÉn lµ nguån cung cÊp chñ yÕu cho ngµnh c«ng nghiÖp d­îc. Tuy nhiªn, s¶n l­îng cña chóng th­êng kh«ng æn ®Þnh, ®ã lµ do hËu qu¶ cña mét sè yÕu tè nh­ : ®iÒu kiÖn tù nhiªn kh«ng thuËn lîi, khã kh¨n kü thuËt vµ kinh tÕ trong c«ng t¸c trång trät, chi phÝ lao ®éng ngµy cµng t¨ng... NhiÒu c©y cã nguy c¬ tuyÖt chñng, h¹t Ýt vµ cã søc n¶y mÇm kÐm, mÊt nhiÒu n¨m míi cã qu¶, c©y kh«ng s¹ch bÖnh...nÕu nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p truyÒn thèng sÏ kh«ng ®¸p øng yªu cÇu. Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro ®­îc sö dông réng r·i ®· kh¾c phôc ®­îc nh÷ng khã kh¨n trªn, nh©n nhanh mét sè gièng c©y d­îc liÖu nh»m cung cÊp nh÷ng nguyªn liÖu cã chÊt l­îng æn ®Þnh ®Ó ®­a vµo s¶n xuÊt. Bajaj et al (1986) ®· thèng kª 148 c©y thuèc thuéc 108 chi kh¸c nhau ®· ®­îc nh©n nhanh b»ng ph­¬ng ph¸p nµy. Trong sè nµy cã c¸c c©y nh­ Dioscorea deltoidea, Coluria geoides, Thymus vulgaris, Bergenia crassifolia... Tãm l¹i, ph­¬ng ph¸p nh©n gièng in vitro víi c¸c ­u thÕ vÒ hÖ sè nh©n gièng cùc kú lín, tiÒm n¨ng c«ng nghiÖp ho¸ cao vµ tÝnh kh¶ thi réng, ®· thùc sù trë thµnh c«ng cô cÇn thiÕt trong c«ng t¸c gièng c©y trång. PhÇn iii Néi dung vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 3.1. Nguyªn liÖu Nguyªn liÖu sö dông trong c¸c thÝ nghiÖm lµ c©y gièng ®ang l­u gi÷ t¹i v­ên gièng cña Trung t©m trång vµ chÕ biÕn c©y thuèc Hµ néi - ViÖn D­îc LiÖu – Bé Y tÕ. 3.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 3.2.1. Ph­¬ng ph¸p lÊy mÉu - MÉu nu«i cÊy lµ nh÷ng ®Ønh chåi vµ chåi ngñ n»m ë n¸ch l¸, ®­îc khö trïng ®Ó t¹o nguyªn liÖu cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. - MÉu d©m cµnh lµ nh÷ng ®o¹n cµnh b¸nh tÎ cã chiÒu dµi 4-5cm, cã Ýt nhÊt mét chåi ngñ. 3.2.2. Ph­¬ng ph¸p in vitro MÉu ®­îc xö lý khö trïng b»ng hãa chÊt vµ ®­a vµo nu«i cÊy trong nh÷ng ®iÒu kiÖn sau: + M«i tr­êng nu«i cÊy: Lµ m«i tr­êng Murashige Skoog (1962) cã c¶i tiÕn, ®­îc hÊp d­íi ¸p suÊt 0,8 kg/ cm2 trong 40 phót. + §iÒu kiÖn nu«i cÊy: - NhiÖt ®é phßng nu«i: 25oC ±2 - C­êng ®é ¸nh s¸ng: 2000 lux §é Èm: 70% Thêi gian chiÕu s¸ng: 14 giê s¸ng / 10 giê tèi. C¸c dông cô, buång cÊy ®­îc v« trïng. Dông cô thñy tinh ®­îc röa s¹ch b»ng xµ phßng vµ sÊy kh«. 3.2.3. Ph­¬ng ph¸p thÝ nghiÖm C¸c thÝ nghiÖm ®­îc bè trÝ kiÓu ngÉu nhiªn ®Çy ®ñ, mçi c«ng thøc nh¾c l¹i 3 lÇn. 3.3 Néi dung nghiªn cøu 3.3.1. Nghiªn cøu nh©n nhanh in vitro 3.3.1.1. Nghiªn cøu thêi gian khö trïng mÉu ThÝ nghiÖm 1: CT 1.1: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,07% trong 5 phót CT 1.2: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,07 % trong 8 phót CT 1.3: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,07 % trong 10 phót CT 1.4: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,07% trong 15 phót CT 1.5: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,1% trong 5 phót CT 1.6: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,1 % trong 8 phót CT 1.7: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,1 % trong 10 phót CT 1.8: Khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,1 % trong 15 phót 3.3.1.2. Nghiªn cøu nh©n nhanh in vitro + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng Kinetin vµ BAP tíi hÖ sè nh©n in vitro. M«i tr­êng nu«i cÊy ®­îc bæ sung Kin vµ BAP ë c¸c nång ®é kh¸c nhau tõ 0,1; 0,5;1,0 mg/l. ThÝ nghiÖm 2 CT 2.1: MS (®èi chøng) CT 2.2: MS + 0,1 mg/l Kin CT 2.3: MS + 0,5 mg/l Kin CT 2.4: MS + 1,0 mg/l Kin CT 2.5: MS + 0,1 mg/l BAP CT 2.6: MS + 0,5 mg/l BAP CT 2.7: MS + 1,0 mg/l BAP + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña IBA ®Õn hÖ sè nh©n chåi. M«i tr­êng nu«i cÊy cã bæ sung 1mg/l Kin (MB)víi IBA ë c¸c nång ®é kh¸c nhau tõ  0,1 ; 0,2 ; 0,5 mg/l. ThÝ nghiÖm 3 CT 3.1: MB CT 3.2: MB + 0,1mg/lIBA CT 3.3: MB + 0,2mg/lIBA CT 3.4: MB + 0,5mg/lIBA + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña IBA tíi sù ra rÔ in vitro. Bæ sung IBA ë c¸c nång ®é kh¸c nhau tõ 0,2; 0,5; 1,0 mg/l vµo m«i tr­êng MS c¬ b¶n. ThÝ nghiÖm 4 CT 4.0: MS ( §èi chøng ) CT 4.1: MS + 0,2mg/lIBA CT 4.2: MS + 0,5mg/lIBA CT 4.3: MS + 1,0mg/liba 3.3.2. Nghiªn cøu nh©n gièng v« tÝnh in vivo + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña IBA, NAA, IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m: C¸c cµnh d©m cã kÝch th­íc tõ 4,5-5cm ®­îc xö lý víi c¸c chÊt thuéc nhãm auxin nång ®é 50ppm theo c¸c c«ng thøc sau: ThÝ nghiÖm 5 CT 5.0: §èi chøng CT 5.1. xö lý b»ng IBA CT 5.2: xö lý b»ng NAA CT 5.3: xö lý b»ng IAA + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m.  ThÝ nghiÖm 6 CT 6.0: §èi chøng CT 6.1. xö lý b»ng IBA nång ®é 20ppm CT 6.2: xö lý b»ng IBA nång ®é 30ppm CT 6.3: xö lý b»ng IBA nång ®é 50ppm CT 6.4: xö lý b»ng IBA nång ®é 100ppm + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña thêi gian xö lý IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m. ThÝ nghiÖm 7 CT 7.0: §èi chøng CT 7.1: xö lý b»ng IBA trong 5 phót CT 7.2: xö lý b»ng IBA trong 10 phót CT 7.3: xö lý b»ng IBA trong 15 phót CT 7.4: xö lý b»ng IBA trong 20 phót + Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña chÕ phÈm V©n §µi Tè tíi sù ph¸t triÓn cña c©y d©m cµnh. ThÝ nghiÖm 8 CT 8.0: §èi chøng CT 8.1. phun V§T nång ®é 1000ppm CT 8.2: phun V§T nång ®é 2500ppm CT 8.3: phun V§T nång ®é 5000ppm 3.4. C¸c chØ tiªu ®¸nh gi¸ vµ ph­¬ng ph¸p xö lý sè liÖu: * ChØ tiªu ®¸nh gi¸: Tû lÖ mÉu sèng(%) =(Tæng sè mÉu sèng/ Tæng sè mÉu)x100 Tû lÖ mÉu chÕt(%) =(Tæng sè mÉu chÕt / Tæng sè mÉu)x100 Tû lÖ mÉu nhiÔm(%) =(Tæng sè mÉu nhiÔm / Tæng sè mÉu)x100 Tû lÖ chåi/mÉu= (Tæng sè chåi t¹o thµnh/tæng sè mÉu cÊy) x100 Tû lÖ ra rÔ=(Tæng sè chåi ra rÔ/tæng sè mÉu cÊy) x100 Sè rÔ /c©y= Tæng sè rÔ/tæng sè c©y ChiÒu cao/chåi=Tæng chiÒu cao/ tæng sè chåi. *Ph­¬ng ph¸p xö lý sè liÖu: Sè liÖu thu ®­îc trong thÝ nghiÖm ®­îc xö lý theo ph­¬ng ph¸p thèng kª sinh häc phÇn mÒm Excel. C«ng thøc tÝnh : Trong ®ã: : Gi¸ trÞ trung b×nh cña quan tr¾c Xi : Gi¸ trÞ riªng lÎ cña c¸c ®¹i l­îng nghiªn cøu (i = 1 - k). Ni: TÇn sè t­¬ng øng cña Xi Sni = n d2: Ph­¬ng sai. d: §é lÖch chuÈn. PhÇn IV kÕt qu¶ vµ th¶o luËn 4.1. Khö trïng mÉu Toµn bé qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro lu«n lu«n ®­îc tiÕn hµnh trong ®iÒu kiÖn v« trïng. V× vËy, ®iÒu kiÖn v« trïng lµ mét trong nh÷ng yÕu tè quan träng nhÊt, quyÕt ®Þnh sù thµnh b¹i cña nu«i cÊy in vitro. Nguyªn liÖu ®Ó nu«i cÊy in vitro ®­îc lùa chän tõ nh÷ng c¸ thÓ ­u tó cña loµi, kháe m¹nh vµ s¹ch bÖnh, nh­ng Ýt nhiÒu cã nhiÔm vi sinh vËt vµ nÊm tïy thuéc vµ sù tiÕp xóc cña chóng víi m«i tr­êng xung quanh. ViÖc khö trïng mÉu tr­íc khi ®­a vµo nu«i cÊy lµ rÊt cÇn thiÕt vµ quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña c¶ qu¸ tr×nh nµy. Ph­¬ng ph¸p th«ng dông nhÊt hiÖn nay ®Ó lo¹i bá hÖ vi sinh vËt khái vËt liÖu cÊy lµ sö dông c¸c hãa chÊt cã ho¹t tÝnh diÖt nÊm vµ khuÈn. ChÊt khö trïng cÇn ®¶m b¶o diÖt nÊm, vi khuÈn..., nh­ng l¹i ph¶i Ýt ®éc hoÆc kh«ng g©y h¹i ®èi víi m·u cÊy. ChÊt khö trïng hiÖu qu¶ th«ng dông hiÖn nay lµ HgCl2. Kh¶ n¨ng tiªu diÖt nÊm phô thuéc vµo nång ®é vµ thêi gian xö lý. ë thÝ nghiÖm nµy, chóng t«i sö dông HgCl2 ®Ó khö trïng mÉu víi nång ®é 0,07 vµ 0,1% trong c¸c kho¶ng thêi gian 5 ; 8 ;10 ; 15 phót. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 1 vµ b¶ng 2. B¶ng 1 : Khö trïng mÉu b»ng HgCl2 nång ®é 0,07% Hãa chÊt Thêi gian xö lý (Phót) TØ lÖ nhiÔm (%) TØ lÖ chÕt (%) TØ lÖ sèng (%) HgCl2 0,07% 5 40,25 9,71 50,04 8 32,15 15,27 52,58 10 19,41 20,22 60,37 15 6,07 28,74 65,19 BiÓu ®å 1 : Khö trïng mÉu b»ng HgCl2 nång ®é 0,07% Thêi gian (phót) % B¶ng 2 : Khö trïng mÉu b»ng HgCl2 ë nång ®é 0,1 % Hãa chÊt Thêi gian xö lý (Phót) TØ lÖ nhiÔm (%) TØ lÖ chÕt (%) TØ lÖ sèng (%) HgCl2 0,1% 5 20,41 26,52 53,07 8 10,27 28,35 61,38 10 4 31,2 64,8 15 - 42,25 57,75 BiÓu ®å 2 : Khö trïng mÉu b»ng HgCl2 ë nång ®é 0,1 % Thêi gian (phót) % Nh×n vµo sè liÖu ë b¶ng 1, 2 ta thÊy tØ lÖ mÉu nhiÔm gi¶m dÇn khi t¨ng thêi gian xö lý tõ 5-15 phót, ng­îc l¹i tØ lÖ mÉu chÕt l¹i t¨ng lªn. Tuy nhiªn ®Ó ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ cña viÖc khö trïng mÉu, ng­êi ta dùa vµo tØ lÖ mÉu sèng, kh«ng nhiÔm. ë b¶ng 1, tØ lÖ mÉu sèng cao nhÊt (65,19%)khi khö trïng trong 15 phót, ë b¶ng 2 thêi gian xö lý 10 phót cho kÕt qu¶ tèt nhÊt(64,8%). Nh­ vËy thêi gian khö trïng mÉu ¶nh h­ëng nhiÒu tíi kÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh nµy. Ngoµi ra nång ®é hãa chÊt ®Ó khö trïng còng cã ¶nh h­ëng ®¸ng kÓ tíi tØ lÖ mÉu sèng. ë nång ®é 0,1 % HgCl2 mÉu nhiÔm Ýt h¬n nh­ng l¹i bÞ chÕt nhiÒu dÉn ®Õn tØ lÖ mÉu sèng t­¬ng ®­¬ng víi khi khö trïng b»ng HgCl2 0,07%, tØ lÖ sèng 65%. Cã thÓ kÕt luËn, thêi gian vµ nång ®é cña hãa chÊt HgCl2 ®Ó khö trïng lùu thÝch hîp nhÊt lµ xö lý mÉu 15 phót trong dung dÞch HgCl2 0,07%, hay 10 phót trong dung dÞch HgCl2 0,1%.( biÓu ®å 2) MÉu khö trïng ®­îc ®­a vµo m«i tr­êng khëi ®éng t¹o nguyªn liÖu ban ®Çu cho c¸c thÝ nghiÖm sau nµy. 4.2. Nghiªn cøu nh©n nhanh in vitro 4.2.1. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña Kin vµ BAP tíi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c©y lùu in vitro ë giai ®o¹n ®Çu, c¸c chåi ®­îc ®­a vµo m«i tr­êng khëi ®éng chØ ph¸t triÓn thµnh mét chåi tõ mét mÉu. V× vËy víi môc ®Ých t¨ng hÖ sè nh©n chóng t«i ®· bæ sung vµo m«i tr­êng nu«i cÊy c¸c chÊt thuéc nhãm cytokinin lµ BAP vµ Kinetin ë c¸c nång ®é sau : 0,1; 0,5; 1,0mg/l. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3 B¶ng 3: ¶nh h­ëng cña kinetin vµ BAP ®Õn tíi sinh tr­ëng của cây in vitro sau cÊy 60 ngµy ChØ tiªu theo dâi CT TØ lÖ chåi/c©y ChiÒucao TB/c©y Sè cÆp l¸ trung b×nh/mÉu 1. MS 2,12 ± 0,43 3,12 ± 0,23 3,12 ± 0,76 2. MS + 0,1 mg/l Kin 3,41 ± 0,21 2,75 ± 0,35 2,95 ± 0,69 3. MS + 0,5 mg/l Kin 4,52 ± 0,48 2,58 ± 0,52 2,7 ± 0,75 4.MS + 1,0 mg/l Kin 7,43 ± 0,62 2,45 ± 0,12 2,42 ± 0,87 5. MS + 0,1 mg/l Kin 2,34 ± 0,12 2,55 ± 0,45 2,25 ± 0,69 6. MS + 0,5 mg/l Kin 3,75 ± 0,28 2,38 ± 0,27 2,3 ± 0,25 7.MS + 1,0 mg/l Kin 6,63 ± 0,52 2,15 ± 0,29 2,12 ± 0,76 BiÓu ®å 3: ¶nh h­ëng cña kinetin vµ BAP ®Õn tíi sinh tr­ëng của cây in vitro sau cÊy 60 ngµy Nh×n vµo kÕt qu¶ b¶ng 3 vµ biÓu ®å 3 ta thÊy tû lÖ chåi t¨ng dÇn lªn theo h­íng t¨ng nång ®é Kin vµ BAP, cao nhÊt ë c«ng thøc sè 4;7 víi tû lÖ 7,43 vµ 6,63 thÊp nhÊt ë c«ng thøc kh«ng bæ sung chÊt sinh tr­ëng 2,12(®èi chøng) Ng­îc l¹i víi tû lÖ ra chåi, chiÒu cao c©y vµ sè cÆp l¸ trung b×nh ë c¸c c«ng thøc tû lÖ nghÞch víi h­íng t¨ng nång ®é Kin, BAP. §iÒu nµy cho thÊy, khi bæ sung cytokinin vµo m«i tr­êng nu«i cÊy c©n b»ng hoocmon sinh tr­ëng nghiªng vÒ phÝa t¹o chåi, lµm mÊt ­u thÕ ngän, kÝch thÝch h×nh thµnh chåi. ¶nh 2 : ¶nh h­ëng cña kinetin vµ BAP ®Õn tíi sinh tr­ëng 1 §èi chøng ; 2 Kinetin ; 3 BAP Tuy nhiªn, hÖ sè nh©n gièng ë c«ng thøc nµy ch­a cao, v× vËy chóng t«i tiÕp tôc nghiªn cøu thµnh phÇn m«i tr­êng thÝch hîp cho giai ®o¹n nh©n nhanh nµy. 4.2.2. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña IBA tíi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c©y lùu in vitro Trong nu«i cÊy in vitro c¸c chÊt thuéc nhãm auxin còng ®ãng vai trß quan träng, auxin ®­îc bæ sung vµo m«i tr­êng nu«i cÊy sÏ kÕt hîp víi auxin néi sinh ®Ó ®iÒu khiÓn chiÒu h­íng vµ c­êng ®é c¸c qu¸ tr×nh sinh tr­ëng. V× vËy, chóng t«i ®· bæ sung IBA vµo m«i tr­êng t¹o chåi víi hµm l­îng 0,2 ; 0,3 ; 0,5 . C¸c kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 4 : B¶ng 4 : ¶nh h­ëng cña IBA tíi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c©y lùu TT chØ tiªu thµnh phÇn Tû lÖ chåi ChiÒu cao Tr¹ng th¸i 1 MB 7,35 ± 0,64 2,45± 0,37 ++ 2 MB+0,1mg/lIBA 8,76 ± 0,37 2,14 ±0,41 +++ 3 MB+0,3mg/lIBA 15,54 ± 0,74 2,10± 0,54 +++ 4 MB+0,5mg/lIBA 20,35 ± 0,51 1,89±0,25 ++ BiÓu ®å 4 : ¶nh h­ëng cña IBA tíi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c©y lùu Chó thÝch : +++ - c©y xanh ®Ëm ++ - c©y xanh nh¹t Sè liÖu ë b¶ng 4 cho thÊy : ë c¸c c«ng thøc cã bæ sung thªm IBA sè l­îng chåi t¨ng ®¸ng kÓ, cao nhÊt ë m«i tr­êng cã bæ sung 0,5 mg/l IBA (tû lÖ chåi lµ 20,35±0,51) vµ thÊp nhÊt ë m«i tr­êng cã bæ sung 0,1 mg/l IBA(tû lÖ chåi lµ 8,76±0,37). Nh­ vËy, khi bæ sung IBA c©n b»ng tû lÖ c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng cytokinin/auxin trong c©y ®· ®­îc thiÕt lËp nghiªng vÒ h­íng kÝch thÝch t¹o chåi, IBA ®· kÝch thÝch t¹o chåi bÊt ®Þnh nªn khi bæ sung cïng víi kinetin chåi ®· ph¸t sinh nhiÒu h¬n. NÕu chØ dùa vµo sè l­îng chåi/ mÉu, th× tõ kÕt qu¶ so s¸nh trªn cho thÊy ë m«i tr­êng dinh d­ìng víi 1mg/l Kin vµ 0,5 mg/l IBA cho tèc ®é nh©n nhanh nhÊt. Song, viÖc lùa chän m«i tr­êng nµo lµ thÝch hîp nhÊt cßn tuú thuéc vµo c¸c ®Æc ®iÓm cña chåi ph¸t triÓn trong m«i tr­êng ®ã hoÆc tÝnh kinh tÕ trong s¶n xuÊt. C¸c chåi trong m«i tr­êng m«i tr­êng 0,5mg/lIBA nhiÒu nh­ng c©y vµng, nhá, søc sèng kÐm. ë m«i tr­êng cã bæ sung 0,3 mg/l IBA vµ 1mg/l Kin sè l­îng chåi thÊp h¬n nh­ng chÊt l­îng chåi l¹i h¬n h¼n. ¶nh 3 : ¶nh h­ëng cña IBA tíi sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c©y lùu 1.MS+1mg/lKin ;2.MS+1mg/lKin +0,1mg/lIBA ; 3.MS+1mg/lKin +0,3mg/lIBA. 4.MS+1mg/lKin + 0,5mg/l IBA(tõ tr©iqua ph¶i) V× vËy, trong khu«n khæ c¸c thÝ nghiÖm nµy cã thÓ kÕt luËn r»ng m«i tr­êng thÝch hîp nhÊt ë giai ®o¹n nh©n nhanh lµ m«i tr­êng cã bæ sung 1mg/l Kin vµ 0,3mg/l IBA. 4.2.3. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña IBA tíi sù ra rÔ in vitro C©y ë m«i tr­êng t¹o chåi ®­îc chuyÓn sang m«i tr­êng kh«ng cã chÊt sinh tr­ëng ®Ó t¹o c©y hoµn chØnh. Sau khi ®¹t ®ù¬c kÝch th­íc nhÊt ®Þnh, chóng t«i vµo m«i tr­êng cã bæ sung IBA víi c¸c nång ®é kh¸c nhau tõ 0,2; 0,5; 1,0 mg/l. B¶ng5 : ¶nh h­ëng cña IBA tíi sù ra rÔ in vitro TT chØ tiªu thµnh phÇn Tû lÖ ra rÔ Sau 30 ngµy Sè rÔ TB Dµi rÔ TB Tr¹ng th¸i 1 MS ---- ---- ---- ++ 2 MS + 0,2mg/lIBA 50,6 ± 0,78 2,05 ± 0,54 2,98 ± 0,63 ++ 3 MS + 0,5mg/lIBA 94,45 ± 0,97 2,69 ± 0,75 3,75 ± 0,75 +++ 4 MS + 1,0mg/lIBA 96,32 ± 0,52 4,01 ± 0.18 3,61 ± 0,95 ++ Theo kÕt qu¶ ë b¶ng 5 chóng t«i nhËn thÊy, IBA râ rµng cã t¸c ®éng tíi qu¸ tr×nh ra rÔ cña c©y in vitro. Tû lÖ ra rÔ t¨ng theo chiÒu t¨ng cña nång ®é, nh­ng kh«ng chªnh lÖch nhiÒu ë m«i tr­êng cã bæ sung 0,5mg/l vµ 1,0mg/lIBA. Sè l­îng rÔ m«i tr­êng cã bæ sung 1,0mg/l lµ cao nhÊt, tuy nhiªn tr¹ng th¸i c©y ë m«i tr­êng nµy kh«ng tèt b»ng c©y trong m«i tr­êng chØ bæ sung 0,5 mg/l IBA. Qua nhËn xÐt trªn, chóng t«i ®· sö dông m«i tr­êng cã bæ sung 0,5 mg/l IBA ë giai ®o¹n ra rÔ ®Ó t¹o c©y hoµn chØnh. C©y con cã chiÒu cao tõ 3,5-4cm, cã tõ 2 ®Õn 3 rÔ ®­îc ®­a ra ngoµi bÇu vµ trång ra ®Êt lµm nguyªn liÖu gièng. V× thêi gian thùc tËp cã giíi h¹n nªn viÖc ®­a c©y ra ®Êt ch­a thùc hiÖn ®­îc. ¶nh4 : ¶nh h­ëng cña IBA tíi sù ra rÔ in vitro 1.MS. ; 2. MS + 0,2mg/l IBA ; 3. MS + 0,5mg/lIBA ; 4.MS + 1.0mg/lIBA (tõ tr¸i qua ph¶i) 4.3. Nghiªn cøu NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO §èi víi c¸c c©y d­îc liÖu, nh©n gièng v« tÝnh cã ý nghÜa to lín v× chóng duy tr× ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quÝ hiÕm qua c¸c thÕ hÖ, t¹o ra kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp. Bªn c¹nh viÖc nghiªn cøu nh©n nhanh in vitro, chóng t«i cßn tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm nh©n gièng v« tÝnh in vivo ®Ó gãp phÇn phôc vô s¶n xuÊt ®¹i trµ. 4.3.1. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña c¸c auxin tíi sù ra rÔ của cành dâm RÔ bÊt ®Þnh ®­îc h×nh thµnh tõ c¸c c¬ quan dinh d­ìng nh­ l¸, cµnh, th©n… Giai ®o¹n h×nh thµnh rÔ bÊt ®Þnh ë cµnh d©m th­êng ®ßi hái mét hµm l­îng auxin rÊt cao ®Ó khëi x­íng sù ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo m¹nh mÏ. V× vËy chóng t«i ®· tiÕn hµnh thÝ nghiÖm th¨m dß ¶nh h­ëng cña c¸c auxin tíi qu¸ tr×nh nµy : Cµnh d©m cã kÝch th­íc tõ 4,5 ®Õn 5cm, cã tõ 1 ®Õn 2 cÆp m¾t ngñ ®­îc xö lý trong dung dÞch IBA, NAA, IAA cã nång ®é 50ppm. KÕt qu¶ thÓ hiÖn ë b¶ng 6 B¶ng 6: ¶nh h­ëng cña c¸c auxin tíi sù ra rÔ của cành dâm TT ChØ tiªu Thµnh phÇn Tû lÖ ra rÔ sau 15 ngµy(%) Tû lÖ ra rÔ sau 30 ngµy Tû lÖ ra rÔ sau 40 ngµy 1 §C 0 12,6 50,1 2 IBA 5,34 35,4 95,2 3 NAA 0 15,6 82,5 4 IAA 0 10,5 71,3 BiÓu ®å 5 : ¶nh h­ëng cña c¸c auxin tíi sù ra rÔ in vivo Qua b¶ng 6 vµ biÓu ®å 5, ta cã thÓ rót ra nhËn xÐt sau : + C¸c chÊt trong nhãm auxin ®Òu cã t¸c dông kÝch thÝch ra rÔ cña cµnh d©m. M¹nh nhÊt ë c«ng thøc ®­îc xö lý víi IBA vµ thÊp nhÊt ë c«ng thøc ®­îc xö lý víi IAA. + Thêi gian h×nh thµnh rÔ ë c«ng thøc xö lý víi IBA lµ nhanh nhÊt 5,34%(sau 15 ngµy ®· xuÊt hiÖn rÔ) ¶nh 5 : ¶nh h­ëng cña c¸c auxin tíi sù ra rÔ in vivo 1.1BA; 2NAA; 3,IAA (tõ tr¸i qua ph¶() ViÖc lùa chän IBA ®Ó xö lý ra rÔ cµnh d©m lµ thÝch hîp h¬n c¶. Nh­ng nång ®é vµ thêi gian xö lý lµ bao nhiªu th× thÝch hîp cho cµnh d©m? §Ó tr¶ lêi c©u hái nµy chóng t«i ®· lµm c¸c thÝ nghiÖm sau ®©y: 4.3.2. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m Hµm l­îng chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng ®ãng vai trß quan träng trong viÖc ®iÒu khiÓn sù h×nh thµnh rÔ bÊt ®Þnh ë cµnh chiÕt. Qóa tr×nh h×nh thµnh rÔ bao gåm 3 giai ®o¹n : giai ®o¹n t¸i ph©n chia cña m« ph©n sinh bªn, t¹o mÇm rÔ ; giai ®o¹n xuÊt hiÖn mµm rÔ vµ giai ®o¹n sinh tr­ëng , kÐo dµi rÔ. ViÖc x¸c ®Þnh nång ®é auxin thÝch hîp, t¹o c©n b»ng hoocmon theo h­íng t¹o rÔ lµ rÊt quan träng. Chóng t«i ®· xö lý cµnh d©m víi IBA theo c¸c nång ®é tõ 20ppm ®Õn 100ppm. D­íi ®©y lµ kÕt qu¶ thu ®­îc B¶ng 7 : ¶nh h­ëng cña nång ®é IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m: TT ChØ tiªu Thµnh phÇn Tû lÖ ra rÔ Sè rÔ/c©y(c¸i) Dµi rÔ (cm) 1 §C 49,98 3,13± 0,75 2,27 ±0,53 2 20 71,32 7,18 ±0,69 2,35 ±0,24 3 30 75,25 10,25 ±0,54 2,45 ±0,71 4 50 95,37 13,76 ±0,87 2,26 ±0,38 5 100 86,23 15,43 ±0,63 2,01 ±0,45 BiÓu ®å 6 : ¶nh h­ëng cña nång ®é IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m Nh­ ®· thÊy ë b¶ng 7 vµ biÓu ®å 6, nång ®é IBA cã ¶nh h­ëng râ rÖt tíi tû lÖ ra rÔ cña cµnh d©m. Tû lÖ nµy t¨ng dÇn theo chiÒu t¨ng cña nång ®é chÊt xö lý, cao nhÊt(95,37%) ë nång ®é 50ppm, vµ thÊp nhÊt (71,32%)ë nång ®é 20ppm. Nh­ng khi t¨ng nång ®é chÊt xö lý lªn tíi 100ppm th× tû lÖ ra rÔ l¹i gi¶m ®i(86,23). §iÒu nµy chøng tá nång ®é auxin cao qu¸ ®· g©y øc chÕ sù sinh tr­ëng cña rÔ, v× vËy tû lÖ ra rÔ gi¶m ®i. ¶nh 6: ¶nh h­ëng cña nång ®é IBA tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m 1.nång ®é 20ppm; 2.nång ®é 30ppm; 3.nång ®é 50ppm; 4.nång ®é 100ppm; §C (tõ tr¸i qua ph¶i) 4.3.3. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña thêi gian xö lý IBA tíi sù ra rÔ cµnh d©m Thêi gian xö lý cµnh d©m víi chÊt sinh tr­ëng còng lµ mét trong nh÷ng yÕu tè cÇn thiÕt ®èi víi sù h×nh thµnh rÔ cña cµnh d©m. Chóng t«i ®· theo dâi kÕt qu¶ xö lý cµnh d©m trong thêi gian 5; 10; 15; 20 phót. B¶ng 8: ¶nh h­ëng cña thêi gian xö lý IBA tíi sù ra rÔ cµnh d©m TT ChØ tiªu Thµnh phÇn Tû lÖ ra rÔ sau 40 ngµy Sè rÔ/c©y(c¸i) Dµi rÔ (cm) 1 §C 69,98 3,13±0,56 2,27±0,36 2 Xö lý 5 phót 75,32 5,18±0,75 2,25±0,47 3 Xö lý 10 phót 87,25 11,25±0,84 2,65±0,51 4 Xö lý 15 phót 95,37 14,0±0,52 2,26±0,57 5 Xö lý 20 phót 56,23 11,43±0,71 1,91±0,42 BiÓu ®è 7: ¶nh h­ëng cña thêi gian xö lý IBA tíi sù ra rÔ cµnh d©m C¸c kÕt qu¶ ë b¶ng 8 vµ biÓu ®å 7 cho thÊy : thêi gian xö lý IBA ®· ¶nh h­ëng tíi tû lÖ ra rÔ cña cµnh d©m. Thêi gian xö lý cho tû lÖ ra rÔ cao nhÊt(95,37), sè rÔ nhiÒu nhÊt(14,0 ± 0,52) lµ 15 phót sau ®ã lµ 10 phót(tû lÖ ra rÔ 87,25 ; sè rÔ 11,25 ± 0,84). §iÒu nµy cã thÓ hiÓu r»ng, khi xö lý cµnh d©m víi IBA hµm l­îng auxin ngo¹i sinh vừa đủ ®· kÕt hîp víi auxin néi sinh g©y ra c¶m øng t¹o rÔ. Ng­îc l¹i khi xö lý IBA trong thêi gian 20 phót hµm l­îng auxin ngo¹i sinh bæ sung ®· v­ît qu¸ ng­ìng kÝch thÝch t¹o rÔ, ¶nh h­ëng tíi sù sinh tr­ëng cña rÔ, biÓu hiÖn ë chiÒu dµi rÔ gi¶m(1,91±0,42), sè rÔ Ýt h¬n(11,43±0,71) so víi c«ng thøc4, dÉn tíi gi¶m tû lÖ ra rÔ(56,23). Tóm lại, thời gian thích hợp nhất để xử lý cành dâm là 15 phút. ¶nh7 : ¶nh h­ëng cña thêi gian xö lý IBA tíi sù ra rÔ cµnh d©m 1.xö lý trong 5 phót; 2.xö lý trong 10 phót; 3.xö lý trong 15 phót; 4.xö lý trong 20 phót; §C (tõ tr¸i qua ph¶i) 4.3.4. Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña chÕ phÈm V©n §µi Tè tíi sù sinh trưởng cña cµnh d©m ViÖc øng dông nh÷ng thµnh tùu khoa häc kü thuËt trong trång trät lµm t¨ng n¨ng suÊt c©y trång, n©ng cao hiÖu qu¶ kinh tÕ cña c©y dù¬c liÖu rÊt ®­îc quan t©m. Mét trong 10 thµnh tùu to lín vµ cã ý nghÜa nhÊt cña trung quèc trong n«ng nghiÖp lµ nghiªn cøu s¶n xuÊt ra chÕ phÈm V©n §µi Tè. ChÕ phÈm nµy ®· ®­îc thÕ giíi c«ng nhËn lµ lo¹i kÝch thÝch tè ®iÒu tiÕt sinh tr­ëng thùc vËt míi nhÊt (lo¹i thø 6).[22] §©y lµ mét lo¹i kÝch thÝch tè cã nguån gèc tù nhiªn, ®­îc chiÕt suÊt tõ thùc vËt, cã 3 ­u ®iÓm chÝnh lµ: tÝnh hiÖu qu¶, tÝnh phæ biÕn vµ tÝnh kh«ng ®éc h¹i, ®iÒu nµy cã ý nghÜa v« cïng quan träng ®èi víi nh÷ng c©y d­îc liÖu v× chóng trùc tiÕp ¶nh h­ëng lªn søc khoÎ cña con ng­êi. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh thÝ nghÖm ®èi víi c©y d©m cµnh nh»m n©ng cao chÊt l­îng c©y gièng. Cµnh d©m ®­îc phun chÕ phÈm V©n §µi Tè víi nång ®é 1, 2.5 vµ 5 g/l. KÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng sau : B¶ng 9 : ¶nh h­ëng cña chÕ phÈm V©n §µi Tè tíi sù ph¸t triÓn cña cµnh d©m : ChØ tiªu C«ng thøc ChiÒu cao (cm) Sè cÆp l¸ (c¸i) Réng l¸ (cm) Dµi l¸ (cm) 1.§C 14,18±0,35 9,31±0,41 1,23±0,53 4,96±0,45 2. 1g/l 14,55±0,67 11,32±0,13 1,39±0,12 5, 26±0,39 3. 2,5g/l 16,03±0,59 12,05±0,42 1,51±0,45 5, 42±0,58 4. 5g/l 17,37±0,72 12,91±0,51 1,54±0,37 5,59±0,61 BiÓu ®å 8 : ¶nh h­ëng cña chÕ phÈm V©n §µi Tè tíi sù ph¸t triÓn cña cµnh d©m Theo kÕt qu¶ ë b¶ng9 vµ biÓu ®å7 ta thÊy c¸c chØ tiªu sinh tr­ëng cña c©y d©m cµnh ë c¸c c«ng thøc cã phun chÕ phÈm ®Òu t¨ng h¬n so víi c©y kh«ng ®­îc phun. ChiÒu cao c©y, chiÒu dµi l¸ vµ réng l¸ ®¹t chØ sè cao nhÊt ë c«ng thøc sè 4(17,37±0,72cm; 5,59±0,61cm vµ 1,54±0,37 cm). ë c¸c c«ng thøc cã phun chÕ phÈm V©n §µI Tè chiÒu cao c©y , réng vµ dµi l¸ t¨ng dÇn theo h­íng t¨ng cña nång ®é. Tuy nhiªn, ë c«ng thøc sè 3 vµ 4 mÆc dï nång ®é t¨ng gÊp ®«i nh­ng c¸c chØ sè vÒ sù ph¸t triÓn cña c©y kh«ng chªnh lÖch nhiÒu. Do vËy, c«ng thøc sè 3 cã ­u thÕ h¬n vÒ lîi Ých kinh tÕ gãp phÇn gi¶m chi phÝ cho ng­êi s¶n xuÊt. ¶nh 8: ¶nh h­ëng cña chÕ phÈm V©n §µi Tè tíi sù ph¸t triÓn cña cµnh d©m. Quy trình nhân giống vô tính cây lựu có thể tóm tắt theo sơ đồ sau : MÉu Khö trïng mÉu MÉu t¸i sinh invitro Nh©n nhanh T¹o rÔ §­a c©y ra ngoµi 0,07% hoÆc 0,1% HgCl2 trong 15' (hay 10') Ms + 1mg/l Kin + 0,3 mg/l IBA Ms + 0,5 mg/l IBA invitro D©m cµnh Xö lý b»ng IBA nång ®é 50 ppm trong 15 phót C©y gièng Phun V§T 2,5mg/l PhÇn v KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ KÕt luËn KÕt qu¶ nghiªn cøu cho phÐp rót ra mét sè kÕt luËn sau: 1. MÉu lùu ®­îc khö trïng tèt nhÊt b»ng dung dÞch HgCl2 0,07% trong thêi gian 15 phót hoÆc trong dung dÞch HgCl2 0,1% trong thêi gian 10 phót, ë c¸c nång ®é nµy tû lÖ sèng ®¹t cao nhÊt(65%). 2. So víi BAP, Kinetin cã ¶nh h­ëng m¹nh h¬n tíi sù h×nh thµnh chåi. 3. ë giai ®o¹n nh©n nhanh, m«i tr­êng MS + 1mg/l Kin +0,3mg/l IBA lµ thÝch hîp nhÊt cho viÖc t¨ng hÖ sè nh©n. 4. M«i tr­êng MS + 0,5 mg/l IBA cã t¸c dông kÝch thÝch t¹o rÔ m¹nh nhÊt. 5. M«i tr­êng thÝch hîp nhÊt trong giai ®o¹n t¹o rÔ lµ m«i tr­êng MS c¬ b¶n cã bæ sung 0,5 mg/l IBA. 6. C¸c chÊt trong nhãm auxin ®Òu cã ¶nh h­ëng tíi sù ra rÔ cña cµnh d©m, m¹nh nhÊt lµ IBA, sau ®ã lµ NAA vµ yÕu nhÊt lµ IAA. 7. 50ppm lµ nång ®é IBA thÝch hîp nhÊt ®Ó xö lý kÝch thÝch ra rÔ cµnh d©m. 8. Thêi gian tèi ­u cho viÖc xö lý cµnh d©m lµ 15 phót. 9. ChÕ phÈm V©n ®µi tè ë c¸c nång ®é kh¸c nhau ®Òu kÝch thÝch sù ph¸t triÓn cña cµnh d©m. Sö dông nång ®é 2.5g/l chÕ phÈm nµy phun cho c©y d©m cµnh lµ thÝch hîp nhÊt.  5.2. §Ò nghÞ 1. CÇn tiÕp tôc nghiªn cøu giai ®o¹n ®­a c©y in vitro ra ngoµi ®Ó hoµn thiÖn qui tr×nh nh©n gièng in vitro. 2. TiÕp tôc nghiªn cøu t¸i sinh c©y theo con ®­êng gi¸n tiÕp ®Ó t¹o nguyªn liÖu chän läc nh÷ng gièng cã chÊt l­îng theo yªu cÇu s¶n xuÊt. 3. Nghiªn cøu 1 sè tè ¶nh h­ëng cña chÕ phÈm V©n §µi Tè tíi søc sèng cña c©y in vitro vµ c©y sau khi ra ngoµi v­ên ­¬m. 4. Trång c©y ra ruéng, so s¸nh sù sinh tr­ëng vµ ph¸t triÓn cña c©y in vitro ®Ó ®¸nh gi¸ vµ chän läc. Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng ViÖt T¹ Nh­ Thôc Anh(2002), “Nghiªn cøu c«ng nghÖ nh©n nhanh c©y trinh n÷ hoµng cung (Crinum latifolium L)”, LuËn v¨n th¹c sÜ, Tr­êng §¹i häc khoa häc tù nhiªn- §¹i häc quècgia Hµ Néi. C©y thuèc vµ ®éng vËt lµm thuèc ë ViÖt Nam, NXB Khoa häc vµ kü thuËt (2004). NguyÔn Gia ChÊn, NguyÔn V¨n ThuËn, Bïi ThÞ B»ng(1992),“Kh¶o s¸t mét sè ®Æc ®iÓm sinh ho¸ häc cña c©y thanh cao(Artemisa annua L)”, Th«ng b¸o d­îc liÖu, sè 24(3+4), tr 6-8. Gopalo and Skriptsinsky, 1971, CNSHTV trong c¶i tiÕn gièng c©y trång (1997, tr79). Ph¹m V¨n HiÓn, NguyÔn V¨n ThuËn, Ph¹m Kim M·n (1988), “KÕt qu¶ b­íc ®Çu nghiªn cøu di thùc c©y Dioscorea floribunda”, T¹p chÝ d­îc häc, sè 1, tr 8-10. Ph¹m V¨n KhiÓn(1992), “Nghiªn cøu tinh dÇu c©y long n·o(Cinnamomum camphora Nees et Ebern) gãp phÇn ®Þnh h­íng trång vµ qui ho¹ch c©y long n·o.” Tãm t¾t luËn ¸n phã tiÕn sÜ, tr­êng §¹i häc d­îc, Hµ Néi. Kü thuËt trång vµ chÕ biÕn d­îc liÖu, NXB n«ng nghiÖp 1979. NguyÔn Xu©n Linh vµ céng t¸c viªn(1998), “øng dông kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt trong nh©n gièng c©y hoa”, Hoa vµ kü thuËt trång hoa, NXB N«ng NghiÖp, Hµ Néi. Ph¹m Kim M·n (1992),”Nghiªn cøu saponin vµ sapoginin trong mét sè c©y thuèc ëViÖt nam”, luËn v¨n PTS khoa y d­îc, ViÖn d­îc liÖu, Hµ néi. Vò TriÖu M©n vµ céng t¸c viªn (1986), Nghiªn cøu bÖnh virus h¹i khoai t©y ë miÒn B¾c ViÖt Nam, tuyÓn tËp c«ng tr×nh nghiªn cøu khoa häc kü thuËt N«ng nghiÖp, Tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp I, Hµ Néi. Chu V¨n MÉn(2001),øng dông tin häc trong sinh häc, nxb §¹i häc quèc gia Hµ Néi, tr.118-126. Petrop D. Ph(1984),Di truyÒn häc vµ c¬ së chän gièng, NXB N«ng NghiÖp, Hµ néi-NXB Mir Mai thÞ T©n, NguyÔn Quang Th¹ch,Hoµng Minh TÊn vµ céng sù(1993), “Phôc tr¸ng khoai t©y Th­êng tÝn b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy ®Ønh sinh tr­ëng”, KÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc, NXB N«ng nghiÖp, Hµ néi, tr90-95. Hoµng Minh TÊn, NguyÔn Quang Th¹ch(1993), ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng ®èi víi c©y trång,NXB N«ng NghiÖp, Hµ Néi, tr45-49. Hoµng Kh¸nh Toµn(2003), “Hoa lùu lµm thuèc”, T¹p chÝ C©y thuèc quÝ, sè 7, tr34-35 Vò V¨n Vô(1999), Sinh lý thùc vËt øng dông, NXB Gi¸o dôc, Hµ Néi. §µm Phó Xu©n(2005), “Nghiªn cøu øng dông chÊt kÝch ho¹t gen thùc vËt trªn mét sè ®èi t­îng c©y trång”, kho¸ luËn tèt nghiÖp, Tr­êng ®¹i häc N«ng NghiÖp 1 , Hµ Néi. TiÕng Anh Asolkar L,V, Chadha Y.R.(1979), Diogenin and other steroid drug precursors, Publication and information directorate, CSIR.New.Delhi Bammi R.K, Randhava G.S.(1979), Dioscorea Improvement project- Status Report. IJHR. Bangalore. Bajaj P.S. (1997), High – tech and micropagation, Publ. Springer, Berlin. Bhojwani S.S. (1980), “Factor affecting in vitro stage of micropagation”, Plant physiol., 65(suppl.),90.(Abst.) Bhojwani S.S and Razdan M.K. (1983), Plant tissue culture – Theory and Practice, Elsevier Academic Publ., Amsterdam. Debergh P.C. and Zimmerman P.H.(1991), Microprogation Techniques and Application.Kenwer Academi Publ. Hartmann H.T., Kester D.E., Davies F.T., Geneve R.L. (1997), “Plant propagation: principles and practices”, 6th ed, Prentice Hall, In., New Jersey Hora JJ, Maydew ER, Lansky EP, Dwivedi C.,” Chemopreventive effects of pomegranate seed oil on skin tumor development in CD1 mice.”J Med Food. 2003 Fall;6(3):157-61. Husain A. et al(1979), Saponin bearing species of Yams and their cultication in India, Farm Bull. N 14. CIMAP. Lucknow, India, 22pp Karssen C.M. (1992), Progress in plant growth regulatin : Proceeding of 14th international conferece in plant growth substances. Amsterdam, 1991, Kluver Academic Publ., Dordrecht. Morel and Martin C.R(1952), Acad Sci Pari 235, 1324-1325 Murashige T., Skoog F.(1962), “A rivised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue cultures”, Physiol. Plant., 15, 473-497. Murashige T. (1974), “Plant propagation through tissue culture”, Ann. Rev. Plant Physiol., 25,135-166. Murashige T. (1980), “ Plant Growth Substances & Commercial Uses of Tissue Culture”, In: Plant Growth Substances 1979, ed. by F. Skoog, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Narayanaswamy S. (1994), Plant Cell and Tissue culture,Mc Graw-Hill Publishing Company limited, New Delhi. Nikell L.G. (1973), Test-tube Approaches to Bypass Sex, Hawaiian Planter’s Record, 58, pp 293-314. Pierik R.L.M. (1989), In vitro Culture of Higher Plant, Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht. Shad R.R, Dalal K.C(1980), propagation of liquorice by axillary bud cultures, In Plant tissue culture. Genetic Manipulation and somatic Hybridisation of plant cell. Eds. P.S.Rao, M.R. Heble and M.S. Chadha. Bhadha Atomic Research Centre, Bombay. Starisky G.(1970), “Tissue culture of oil palm(Elaeis guineensis Jacq as tool for its vegetative propagation Euphytica)”, 288-292pp Yamahara Joji (2002), Antidiabetic, esp@cenet databaes- Wordwide