Mục lục
Mở đầu 1
1. Chương 1. Tổng quan 4
1.1. Giới thiệu về carotenoit và òưcaroten 4
1.1.1. Khái quát về carotenoit và òưcaroten. 4
1.1.2. Tính chất, chức năng và ứng dụng của òưcaroten. 6
1.1.2.1. Tính chất của òưcaroten.6
1.1.2.2. Chức năng và ứng dụng của òưcaroten. 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của òưcaroten. 10
1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng òưcaroten trên thế giới. 10
1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng òưcaroten ở Việt Nam. 11
1.1.4. Giới thiệu về nấm sợi Blakeslea trispora. 11
1.1.4.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Blakeslea trispora. 11
1.1.4.2. Đặc điểm hình thái và sinh sản loài Blakeslea trispora. 15
1.1.4.3. Quá trình tổng hợp òưcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 21
1.1.5. ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp òưcaroten của Blakeslea trispora 21
1.1.6. Vi nang và các phương pháp tạo vi nang. 25
1.1.6.1. Giới thiệu về công nghệ vi nang hoá và vi nang. 25
1.1.6.2. Các phương pháp tạo vi nang. 27
1.2. giớI thiệu về chất hoạt động bề mặt sinh học glycolipit mannosylerythritol lipit (MELs ). 32
1.2.1. Phân loại chất bề mặt sinh học có nguồn gốc vi sinh. 32
1.2.1.1. Glycolipit. 33
1.2.1.2 Lipopeptit và lipoprotein. 36
1.2.1. 3. Axit béo, photpholipit và lipit trung tính. 36
1.2.1.4. Chất bề mặt sinh học polymer. 36
1.2.1.5. Chất bề mặt sinh học dạng hạt. 37
1.2.2. Quá trình sinh tổng hợp chuyển hoá tạo glycolipit. 37
1.2.2.1. Các cơ chế vi sinh vật sản xuất glycolipit. 37
1.2.2.1.1. Phương pháp tổng hợp sinh học (Biosynthetic). 37
1.2.2.1.2. Phương pháp chuyển hoá sinh học (Biotransformation). 38
1.2.2.2. Một số quá trình sản xuất glycolipit. 38
1.2.3. Những ứng dụng của các chất sinh học hoạt động bề mặt. 40
1.2.3.1. Khả năng xử lý dầu tràn trên biển. 41
1.2.3.2. Khả năng cải tạo đất. 41
1.2.3.3. Khả năng cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại. 42
1.2.3.4. Khả năng làm sạch dầu trong các thiết bị lưu trữ. 42
1.2.3.5. Những nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. 42
1.2.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng MELs trên thế giới và ở Việt Nam. 44
1.3. giới thiệu về dẫn xuất của axít amin SưadenosylưLưmethionine (SAM) 45
1.3.1. Giới thiệu về SAM ư Tính chất và công dụng. 45
1.3.1.1. Tính chất của SAM. 47
1.3.1.2. Những ứng dụng chính của SAM. 49
1.3.1.2.1. SAM ư chất chống trầm cảm tự nhiên. 49
1.3.1.2.2 SAM là chất siêu dinh dưỡng của gan. 52
1.3.2. Các phương pháp tổng hợp SAM. 58
1.3.2.1. Tổng hợp SAM bằng con đường hóa học. 58
1.3.2.2. Tổng hợp SAM bằng con đường enzyme. 58
1.3.2.3 Tổng hợp SAM bằng vi sinh vật. 59
1.3.3. Tổng hợp SAM từ nấm men, các yếu tố ảnh hưởng. 60
1.3.3.1. Đặc điểm chung về nấm men Saccharomyces. 60
1.3.3.2. ứng dụng của nấm men S. cerevisiae. 62
1.3.3.3. Sinh tổng hợp SAM từ nấm men Saccharomyces. 63
1.3.4. Thu hồi và tạo sản phẩm SAM từ nấm men. 66
1.3.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM. 68
1.3.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM trên thế giới. 68
1.3.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM ở Việt Nam. 69
2. Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 71
2.1. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy. 71
2.1.1 Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp òưcaroten. 71
2.1.2 Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp MELs. 72
2.1.3 Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp SAM. 73
2.1.4. Tổng hợp các thông tin về các chủng giống vi sinh vật nhập ngoại. 75
2.2 Phương pháp nghiên cứu. 76
2.2.1. Các phương pháp xử lý dịch lên men, tách chiết sinh khối nấm sợi,
phân tích và tạo sản phẩm chất màu òưcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 76
2.2.2 Các phương pháp thu nhận, tách chiết, phân tích và tạo sản phẩm MELs từ nấm men Pseudozyma. 77
2.2.3. Các phương pháp thu nhận, tách chiết, phân tích và tạo sản phẩm
chứa SAM từ nấm men Saccharomyces. 77
2.2.3.1. Phương pháp trích ly SAM bằng dung môi. 77
2.2.3.2 Phương pháp làm sạch SAM. 78
2.2.3.3. Phương pháp đông khô. 79
2.3. Phương pháp phân tích. 80
2.3.1. Phương pháp quang phổ. 80
2.3.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng. 82
2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 83
2.3.4 Phương pháp xử lý đột biến nấm sợi Blakeslea trispora tổng hợp òưcaroten. 84
2.3.5 Phương pháp phân tích thành phần vệ sinh an toàn thực phẩm các sản phẩm, bán sản phẩm òưcaroten, MELs và SAM. 87
2.4. Các phương pháp tạo sản phẩm. 87
2.4.1. Phương pháp tạo sản phẩm bột màu òưcaroten bằng công nghệ vi nang hoá. 87
2.4.2. Phương pháp tạo sản phẩm chứa hoạt chất sinh học SAM. 89
2.5. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm. 90
2.5.1. Các thiết bị trích ly, phân tích, tinh sạch. 90
1.5.2. Các thiết bị lên men. 90
2.5.3. Các thiết bị thu hồi, tạo sản phẩm 91
3. Chương 3. Kết quả và bàn luận 92
3.1. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất màu òưcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 92
3.1.1. Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp òưcaroten của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora. 92
3.1.1.1. Khảo sát khả năng phát triển và sinh tổng hợp òưcaroten từ các chủng nấm sợi B. trispora trên môi trường nhân giống và lên men 92 cơ bản.
3.1.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp òưcaroten của các chủng B. trispora. 99
3.1.2.1.1. ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự tổng hợp òưcaroten của các chủng B. trispora. 99
3.1.1.2.2. ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tổng hợp òưcaroten của các chủng B. trispora. 104
3.1.1.3. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp òưcaroten của các chủng B. trispora. 107
3.1.1.3.1. Nghiên cứu bổ sung một số chất đặc biệt như chất hoạt động bề mặt, tiền chất có cấu trúc vòng ò. 107
3.1.1.3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp òưcaroten của chủng B. trispora WH 2 bằng phương pháp xử lý đột biến. 108
3.1.1.4. Kết quả nuôi cấy các chủng nấm sợi B. trispora trên môi trường và điều kiện nuôi cấy chọn lọc quy mô phòng thí nghiệm. 111
3.1.2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm
sợi giàu òưcaroten. 113
3.1.2.1. Kết quả lên men trên các thiết bị dung tích 14 lít tại Phòng thí nghiệm. 113
3.1.2.2. Kết quả lên men trên thiết bị dung tích 500 và 1500 lít tại Xưởng thực nghiệm. 114
3.1.3. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích và tạo sản phẩm bột màu thực phẩm òưcaroten từ nấm sợi
Blakeslea trispora quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm. 115
3.1.3.1. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết òưcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 115
3.1.3.2. Tinh sạch dịch chiết òưcaroten. 117
3.1.3.3. Thu hồi dung dịch đậm đặc và tạo sản phẩm òưcaroten tan trong dầu. 119
3.1.3.4. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ để tạo sản phẩm bột màu thực phẩm òưcaroten từ nấm sợi B. trispora quy mô phòng thí nghiệm và xưởng TN.
120 3.1.3.4.1. Tạo vi nang bằng phương pháp bốc hơi dung môi. 120
3.1.3.4.2. Tạo vi nang bằng phương pháp tách pha đông tụ. 122
3.1.3.4.3. Tạo bột òưcaroten bằng công nghệ vi nang hoá : nhũ hoá ư sấy phun. 127
3.1.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm bột màu òưcaroten từ
nấm sợi Blakeslea trispora quy mô xưởng thực nghiệm trên các hệ thống thiết bị lên men dung tích 500 và 1500 lít. 131
3.1.5. Kiểm tra, phân tích các chỉ tiêu, chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm òưcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora.134
3.1.6. Nghiên cứu ứng dụng chất màu òưcaroten từ nấm sợi Blakeslea trispora trong chế biến, sản xuất một số loại bánh, bánh kem, kẹo quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 137
3.1.6.1. Quy trình sản xuất kẹo mềm. 137
3.1.6.2. Quy trình sản xuất bánh quy kẹp kem. 138
3.1.7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và ứng dụng sản phẩm bột màu òưcaroten từ vi sinh vật. Đăng ký, giới thiệu, chào bán công nghệ và sản phẩm. 140
3.2. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất nhũ tương hoá và hoạt động bề mặt glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs).143
3.2.1. Khảo sát lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính của các chủng giống nâm men sinh tổng hợp chuyển hóa glycolipids
mannosylerythritol lipids (MELs). 143
3.2.1.1. Chọn lọc chủng giống nấm men sinh chuyển hóa MELs. 143
3.2.1.2. Xác định đặc tính sinh lý sinh hoá của chủng nấm men lựa chọn. 146
3.2.1.3. Nghiên cứu điều kiện nâng cao hoạt tính các chủng giống nấm men sinh tổng hợp glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs).149
3.2.2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men quy mô phòng
thí nghiệm và xưởng thực nghiệm để sinh chuyển hóa MELs. 151
3.2.2.1. Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men sinh chuyển hóa MELs quy mô máy lắc. 151
3.2.2.2. Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men tổng hợp MELs quy mô 14 lít. 156
3.2.2.3. Xác định điều kiện công nghệ thích hợp lên men tổng hợp MELs quy mô 500 lít. 158
3.2.3. Tìm các điều kiện công nghệ, thiết bị thích hợp quy mô phòng thí 159 nghiệm để tách chiết, tinh sạch, phân tích MELs.
3.2.3.1. Xác định điều kiện tách chiết ư Lựa chọn dung môi thích hợp. 159
3.2.3.2. Xác định điều kiện tinh sạch. 159
3.2.3.3. Xác định các phưong pháp phân tích MELs. 162
3.2.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất MELs từ vi sinh vật quy mô xưởng thực nghiệm trên các hệ thổng xưởng thực nghiệm . 164
3.2.5. Kiểm tra phân tích các chỉ tiêu chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm MELs. 167
3.2.6. Nghiên cứu ứng dụng MELs từ nấm men trong chế biến sản xuất
một số bánh, bánh kem quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 169
3.2.7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và
ứng dụng các sản phẩm MELs trong chế biến một số mặt hàng thực phẩm. 169
3.3. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Sưadenosyl L – methionil (SAM) từ nấm men Saccharomyces cerevisiae. 171
3.3.1. Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp Sư
adenosyl L – methionil (SAM) của các chủng nấm men Saccharomyces.
171
3.3.1.1. Khảo sát khả năng tổng hợp SAM của một số chủng nấm men
Saccharomyces. 171
3.3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện
nuôi cấy nấm men Saccharomyces tổng hợp SAM trong điều kiện phòng thí nghiệm.
173
3.3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường. 173
3.3.1.2.2. Khảo sát chế độ thông khí trong nuôi cấy nấm men tổng hợp SAM. 174
3.3.2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô
phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm men chứa SAM. 175
3.3.2.1. Nghiên cứu động học quá trình phát triển tổng hợp SAM của nấm
men Saccharomyces trên qui mô máy lắc và thiết bị lên men 14 lít. 175
3.3.2.2. Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men 14 lít. 180
3.3.2.3. Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men 80 lít tại Xưởng thực
nghiệm.
181 3.3.2.4. Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men tổng hợp SAM từ nấm
men S. cerevisiae tại Xưởng thực nghiệm trên các thiết bị lên men 500 và 1500 lít. 182
3.3.3. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích
và tạo các sản phẩm chứa SAM từ nấm men quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm. 183
3.3.3.1. Khảo sát các điều kiện tách chiết SAM từ nấm men Saccharomyces. 183
3.3.3.2. Khảo sát các điều kiện tinh sạch và phân tích SAM. 187
3.3.3.3. Nghiên cứu thu hồi và tạo sản phẩm SAM từ nấm men Saccharomyces. 193
3.3.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm chứa SAM từ nấm
men S. cerevisiae quy mô xưởng thực nghiệm trên các hệ thống thiết bị lên men dung tích 500 và 1500 lít. 198
3.3.5. Phân tích, kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của các sản phẩm chứa SAM. 200
3.3.6. Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm chứa SAM từ nấm men S.
cerevisiae trong chế biến, sản xuất một số loại bánh kẹp kem quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 201
3.3.7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và
ứng dụng các sản phẩm SAM từ vi sinh vật trong chế biến một số mặt hàng thực phẩm. 202
Kết luận và kiến nghị 205
Tổng quát hoá và đánh giá kết quả thu được 207
Lời cám ơn 210
Tài liệu tham khảo 211
Phụ lục
386 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2040 | Lượt tải: 3
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất một số chế phẩm sinh học dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ch hµm l−îng beta-caroten b»ng ph−¬ng ph¸p ®o
c−êng ®é mµu ë b−íc sãng 450 nm hoÆc b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng
(TLC) hay s¾c ký láng cao ¸p (HPLC).
2.3.3. Xö lý gièng bµng c¸ch chiÕu tia tö ngo¹i
Gièng B. trispora WH2 sau khi ®· ph¸t triÓn ®Çy ®ñ trªn m«i tr−êng
PDA ®−îc dïng xö lý gièng b»ng c¸ch chiÕu tia tö ngo¹i, thêi gian chiÕu
t−¬ng øng lµ 30, 60, 90 phót. CÊy l¹i gièng trªn m«i tr−êng PDA, CM17-1,
CM 17-1 cã bæ sung kh¸ng sinh vµ m«i tr−êng minimal agar. Bµo tö ph¸t triÓn
trªn m«i tr−êng PDA sau 3-5 ngµy sÏ ®−îc sö dông cho lªn men. Sinh khèi
thu nhËn ®−îc dïng ®Ó t¸ch chiÕt, tinh s¹ch, ph©n tÝch hµm l−îng beta-caroten
b»ng ph−¬ng ph¸p ®o c−êng ®é mµu ë b−íc sãng 450 nm hoÆc b»ng ph−¬ng
ph¸p s¾c ký líp máng (TLC) hay s¾c ký láng cao ¸p (HPLC).
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
48
2.4. H×nh thøc lªn men
ThÝ nghiÖm lªn men ®−îc thùc hiÖn trªn qui m« m¸y l¾c (b×nh tam gi¸c
250, 500 ml, vµ 1000 ml trªn m¸y l¾c c«ng nghiÖp, b×nh thñy tinh dung tÝch
2000, 5000 ml vµ thiÕt bÞ lªn men Draft Tube dung tÝch tæng 14 lÝt víi dung
tÝch lµm viÖc 10 lÝt trong ®iÒu kiÖn lªn men ch×m cã sôc khÝ v« trïng.
2.5. C¸c th«ng sè lªn men
C¸c thÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh trong c¸c ®iÒu kiÖn lªn men ë d¶i nhiÖt
®é kho¶ng tõ 25- 300C, víi c¸c chÕ ®é l¾c, chÕ ®é tho¸ng khÝ kh¸c nhau, thÓ
tÝch lªn men kh¸c nhau t−¬ng øng víi c¸c h×nh thøc lªn men kh¸c nhau vµ ë
d¶i pH ban ®Çu cña m«i tr−êng trong kho¶ng tõ 5-11.
2.6. Ph−¬ng ph¸p ®Õm sè l−îng tÕ bµo vi sinh vËt
- Bæ sung 25-30 ml n−íc cÊt ®· thanh trïng vµo b×nh chøa gièng sau khi ®·
ph¸t triÓn ®Çy ®ñ trªn m«i tr−êng PDA hoÆc PSA;
- N¹o nhÑ bÒ mÆt th¹ch b»ng que cÊy chuyªn dông;
- Hót 1 ml dung dÞch huyÒn phï vµo èng eppendoft ®· v« trïng;
- Soi kÝnh hiÓn vi ®Ó x¸c ®Þnh sè l−îng bµo tö c«ng thøc:
X = 2.5 x a x f x105
Trong ®ã: X: sè bµo tö cã trong 1 ml canh tr−êng (bµo tö /1 ml)
a: sè bµo tö trung b×nh trong 1 « vu«ng to gåm 16 « vu«ng con
f: hÖ sè pha lo·ng
2.7. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm Èm
X¸c ®Þnh hµm Èm cña sinh khèi thu nhËn sau lªn men b»ng thiÕt bÞ ®o
hµm Èm chuyªn dông.
2.8. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt vµ ph©n tÝch hµm l−îng beta-caroten tõ sinh
khèi nÊm sîi B. trispora
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
49
2.8.1. Ph©n tÝch hµm l−îng beta-caroten ( )
a. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt beta caroten tõ sinh khèi
- C©n chÝnh x¸c 0.1 gram sinh khèi sau lªn men cho vµo èng Hatch lo¹i 10 ml;
- C©n 3 gram bi thuû tinh ®Ó ph¸ vì tÕ bµo b»ng ph−¬ng ph¸p nghiÒn c¬ häc.
- Vortex ë tèc ®é tèi ®a trong 5 phót.
- Bæ sung 4 ml ethanol tuyÖt ®èi. TiÕp tôc vortex 20 gi©y
- Bæ sung 4 ml dung dÞch B cã chøa 1 mg BHT/1ml n-hexan
- Vortex 5 phót. Bæ sung 1 ml n−íc cÊt. Trén ®Òu nhÑ nhµng
- Ly t©m ë tèc ®é 2000 vßng/phót, 2 phót ®Ó t¸ch pha
- Hót líp dÞch phÝa trªn cã chøa beta-caroten
- TÊt c¶ c¸c b−íc ®Òu thùc hiÖn trong tèi. Mçi mÉu ph©n tÝch lÆp l¹i hai lÇn.
- X¸c ®Þnh hµm l−îng beta-caroten b»ng ph−¬ng ph¸p so mµu quang phæ ë
b−íc sãng 450 nm, hoÆc ph©n tÝch b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng hoÆc
ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p (HPLC). Hµm l−îng beta-caroten cã trong
mÉu lµ sè trung b×nh céng cña Ýt nhÊt hai lÇn ph©n tÝch.
b. Ph©n tÝch hµm l−îng beta-caroten b»ng ph−¬ng ph¸p so mµu
Hµm l−îng beta-caroten cã trong sinh khèi ®−îc tÝnh theo c«ng thøc sau:
A450 x V x 100 x d
X (mg/l) = x W1
A1cm
1% x W2
Trong ®ã: X (mg/l): Hµm l−îng beta-caroten
A450: C−êng ®é mµu hÊp phô cùc ®¹i ë b−íc sãng 450 nm
V: ThÓ tÝch dung dÞch chiÕt b»ng dung m«i (ml)
d: §é pha lo·ng cña dung dÞch cÇn ®o
A1cm
1%: HÖ sè hÊp phô cña lo¹i dung m«i dïng ®Ó chiÕt beta-caroten
W1: Sè gram sinh khèi kh« trong 1 lÝt m«i tr−êng
W2: Sè gram sinh khèi ®em ph©n tÝch
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
50
c. Ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng (TLC)
Nguyªn t¾c: Dùa trªn kh¶ n¨ng vµ tèc ®é di chuyÓn cña c¸c carotenoit trong
dung m«i trªn tÊm silicagel trong b×nh s¾c ký.
Ph−¬ng ph¸p:
- TÊm silicagel sau khi ®· ho¹t hãa ë 1050C trong 15 phót ®−îc sö dông ®Ó
cho ch¹y s¾c ký;
- Hót kho¶ng 5-10 ul dung dÞch mÉu cÇn ph©n tÝch vµ load lªn tÊm s¾c ký, mçi
mÉu c¸ch nhau Ýt nhÊt tõ 1-1,5 cm lµ ®−îc;
- Dïng m¸y sÊy ®Ó sÊy kh« mÉu ®· load;
- Load song song víi mÉu cÇn x¸c ®Þnh lµ mÉu beta-caroten chuÈn (5 ul);
- §Æt tÊm s¾c ký vµo trong dung m«i ®· chuÈn bÞ s½n lµ dung dÞch methanol
5% trong dung dÞch Toluen, thêi gian kho¶ng 20 – 30 phót, ®Ëy chÆt n¾p b×nh
s¾c ký;
- LÊy tÊm s¾c ký ra, lµm kh« trong ®iÒu kiÖn th−êng, quan s¸t, ph©n tÝch vµ
chôp ¶nh l−u d÷ liÖu.
2.8.2. T¸ch chiÕt vµ thu håi beta-caroten tõ sinh khèi nÊm sîi B. trssipora
trªn qui m« lín
Nguyªn t¾c: Sinh khèi sau lªn men ®−îc dïng ®Ó ph¸ vì tÕ bµo b»ng biÖn
ph¸p c¬ häc, sau ®ã ®−îc chiÕt b»ng dung m«i thÝch hîp.
Ph−¬ng ph¸p
- C©n 100-1000 gram sinh khèi cho vµo b×nh thñy tinh vµ hÊp thanh trïng ë
chÕ ®é 1210C trong 15 phót;
- Ly t©m ë tèc ®é 5000 g trong 20 phót;
- Bæ sung dung dÞch cån tuyÖt ®èi, theo tû lÖ 1 mÉu : 50 ethanol tuyÖt ®èi ë
300C trong 2 giê trªn m¸y l¾c trßn tèc ®é 300 vßng/phót;
- Dïng pipet thñy tinh lo¹i 20 ml hót líp dÞch mµu vµng s¸ng ë phÝa trªn;
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
51
- ChiÕt thªm mét vµi lÇn cho ®Õn khi kh«ng cßn mµu vµng s¸ng trong sinh
khèi n÷a.
2.8.3. KiÓm tra ®éc tè nÊm mèc Aflatoxin trong sinh khèi nÊm sîi B.
trispora b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p HPLC
C¸c ®iÒu kiÖn s¾c ký
- Cét RP 18 250 x 4,6 mm, 5 ul
- Pha ®éng: Methanol – dH2O (1V- 1V)
- Detector: Fluoresen (huúnh quang)
- Tèc ®é dßng: 1 ml/phót
- MÉu ph©n tÝch: tiªm 20 ul
ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn
- Aflatoxin B1 – G1: nång ®é 0,1 ug/ml trong Methanol/dH2O (5/5)
- Aflatoxin B2 - G2 nång ®é 0,03 ug/ml trong Methanol/dH2O (5/5)
ChuÈn bÞ dung dÞch mÉu kiÓm tra
- Sinh khèi nÊm sîi B. trispora sau lªn men ®−îc sÊy ë ®iÒu kiÖn 400C trong
24 giê ®−îc sö dông ®Ó ph©n tÝch ®éc tè;
- C©n 3 gram mÉu thö;
- Bæ sung 25 ml hçn hîp dung dÞch Methanol/dH2O theo tû lÖ thÓ tÝch 3/7;
- L¾c trong 30 phót, sau ®ã ly t©m ë tèc ®é vßng phót trong phót;
- Hót 3 ml dung dÞch mÉu cho ch¹y qua cét SPE C18 ®· ho¹t ho¸ b»ng hçn
hîp dung dÞch Methanol/dH2O;
- Röa b»ng 10 ml dung dÞch n – Hexan;
- Röa gi¶i b»ng 2 ml hçn hîp dung dÞch Aceton -Methylen chloride cã tû lÖ
thÓ tÝch 5/95;
- C« mÉu b»ng m¸y c« ch©n kh«ng;
- Hoµ tan cÆn trong 2 ml dung dÞch pha ®éng lµ Methanol/dH2O cã tû lÖ thÓ
tÝch lµ 1/1.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
52
Ch−¬ng 3: KÕt qu¶ vµ bµn luËn
3.1 . Nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy ®Õn kh¶
n¨ng t¹o sinh khèi vµ hµm l−îng beta-caroten khi nu«i cÊy riªng rÏ
c¸c chñng nÊm sîi B. trispora trªn qui m« m¸y l¾c vµ thiÕt bÞ lªn men
Draft Tube 14 lÝt.
Trong sè 6 chñng nÊm sîi B. trispora ®· kh¶o s¸t cã xuÊt sø tõ Bé s−u
tËp gièng Quèc gia NhËt b¶n vµ tõ ViÖn Vi rus häc Wuhan, Trung quèc, nhãm
nghiªn cøu ®· lùa chän ra ®−îc ba chñng cã tiÒm n¨ng cao, ®ã lµ B. trispora
WH1 mang tÝnh (+), WH2 mang tÝnh c¸i (-), vµ NBRC 5989 mang tÝnh c¸i (+).
H×nh : ¶nh chôp bµo tö bµo tö chÝn vµ ®ang ph¸t t¸n ra ngoµi m«i
tr−êng (a), bµo tö tù do cña chñng nÊm sîi B. trispora WH2, vµ bµo tö
sau nu«i cÊy 2 ngµy trªn m«i tr−êng th¹ch (c)
(a) (b)
(c)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
53
Nh− chóng ta ®· biÕt, hµm l−îng sinh khèi kh« vµ l−îng beta-caroten
®−îc chi phèi vµ ¶nh h−ëng chÆt chÏ bëi 4 yÕu tè chÝnh, ®ã lµ kh¶ n¨ng chiÕu
s¸ng, sù ho¹t ho¸ gièng, sù kÝch thÝch bëi c¸c chÊt ho¸ häc vµ thµnh phÇn m«i
tr−êng thÝch hîp.
C¸c chñng gièng nÊm sîi B. trispora sau 3 ngµy ph¸t triÓn ®Çy ®ñ trªn
m«i tr−êng th¹ch (PDA hoÆc PSA) ë 280C ®−îc sö dông cho c¸c nghiªn cøu
vÒ lªn men cho nu«i cÊy riªng rÏ tõng chñng hay phèi hai chñng cã giíi tÝnh
®èi lËp trªn c¸c qui m« m¸y l¾c vµ thiÕt bÞ lªn men 14 lÝt, ®ång thêi còng ®−îc
dïng cho c¸c thÝ nghiÖm vÒ xö lý ®ét biÕn (®èi víi chñng B. trisporra WH2 cã
giíi tÝnh c¸i (-)).
Hai chØ tiªu chÝnh ®Ó ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë c¸c
chñng nÊm sîi khi nu«i cÊy riªng rÏ tõng chñng hay khi phèi hai chñng cã
giíi tÝnh ®èi lµ hµm l−îng sinh khèi kh« (g/lÝt m«i tr−êng) vµ hµm l−îng beta-
caroten (mg/lÝt m«i tr−êng).
3.1.1. ¶nh h−ëng cña nguån thøc ¨n cacbon ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten cña chñng B. trispora
§Ó ®¸nh gi¸ vµ x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng ®ång ho¸ nguån dinh d−ìng cacbon
thÝch hîp cho qu¸ tr×nh lªn men cña c¸c chñng nÊm sîi B. trisporra, c¸c thÝ
nghiÖm ®−îc thùc hiÖn trªn qui m« m¸y l¾c sö dông c¸c nguån cacbon kh¸c
nhau nh− glucose, galactose, lactose, saccharose, bét ng« hoÆc sö dông hçn
hîp c¸c lo¹i ®−êng ®¬n ë trªn.
Trong sè c¸c nguån cacbon ®−îc sö dông cho nghiªn cøu, ®−êng
glucose ®−îc sö dông víi nång ®é lµ 50 (g/l) cho hµm l−îng sinh khèi kh«
còng nh− hµm l−îng beta-caroten cao nhÊt. §Æc biÖt víi chñng WH2, hµm
l−îng sinh khèi kh« ®¹t 42,2 (g/l) vµ hµm l−îng beta-caroten ®¹t 592,5 (mg/l).
Kh¶o s¸t còng cho thÊy hçn hîp hai lo¹i ®−êng glucose vµ lactose víi nång ®é
t−¬ng øng lµ 30 – 20 (g/l) hoÆc chØ dïng lactose còng cho hµm l−îng sinh
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
54
khèi vµ beta-caroten t−¬ng ®−¬ng víi viÖc dïng hçn hîp hai lo¹i ®−êng
glucose vµ lactose. Víi nguån cacbon lµ ®−êng saccharose, hay bét ng«, nÊm
sîi kh«ng cã kh¶ n¨ng ®ång ho¸ hoÆc ®ång ho¸ rÊt kÐm nªn cho hµm l−îng
sinh khèi vµ beta-caroten rÊt thÊp. ThÝ nghiÖm ®−îc thùc hiÖn trong b×nh thuû
tinh Duran dung tÝch 500 ml víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 75 ml trªn qui m«
m¸y l¾c ë tèc ®é 250 vßng/phót, nhiÖt ®é lªn men ®−îc kiÓm so¸t ë 280C víi
pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lµ 7,0.
B¶ng 3 : ¶nh h−ëng cña nguån dinh d−ìng cacbon ®Õn kh¶ n¨ng
tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
Hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten (mg/l)
STT
Nguån cacbon
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 Glucose 44.1 42.2 28.7 178.0 592.5 87.7
2 Glucose+galactose 30.8 32.4 22.33 63.6 62.9 59.6
3 Glucose+lactose 32.4 30.1 19.7 101,2 172.2 60.3
4 Lactose 29.4 28.5 22.5 78.5 72.2 60.7
5 Saccharose - - - - - 11.2
6 Galactose 28.5 29.4 20.1 50.7 42.6 39.0
6 Bét ng« 20.3 22.4 16.2 24.5 25.5 12.4
3.1.2. ¶nh h−ëng cña nguån dinh d−ìng nit¬ ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten ë chñng nÊm sîi B. trispora
Kh¶ n¨ng ®ång ho¸ cña nÊm sîi B. trispora sö dông nguån dinh d−ìng
nit¬ phô thuéc vµo tõng chñng. Trong sè c¸c nguån ni t¬ ®−îc sö dông cho
nghiªn cøu (nh− cao ng«, pepton, cao nÊm men, casein thuû ph©n b»ng axit,
L-asparagin, mét sè lo¹i muèi v« c¬ nh− NaNO3, NH4(SO4)2), cao ng« lµ ®èi
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
55
t−îng ®−îc tËp trung nghiªn cøu nhiÒu nhÊt. Sö dông nguån dinh d−ìng lµ cao
ng« ë nång ®é 50 (g/lÝt) cho hµm l−îng sinh khèi kh« ë hai chñng WH1 vµ
WH2 lµ 44,1 vµ 42,2 (g/lÝt) vµ beta-caroten t−¬ng øng lµ 178 vµ 592 mg/l.
Nguyªn nh©n lµm t¨ng hµm l−îng sinh khèi vµ beta-caroten sö dông cao ng«
cã thÓ lµ do trong thµnh phÇn cña cao ng« ngoµi c¸c axit amin, nã cßn chøa
c¸c vitamin, axit lactic, mét l−îng nhá ®−êng khö vµ c¸c polysacharid lµ
nh÷ng chÊt cÇn thiÕt cho sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo sîi nÊm. Tuy nhiªn chñng B.
trispora NBRC 5989 xem ra −a thÝch nguån dinh d−ìng lµ L-asparagin h¬n c¶
víi hµm l−îng sinh khèi kh« ®¹t 28,7 gram trªn 1 lÝt m«i tr−êng lªn men vµ
hµm l−îng beta-caroten t−¬ng øng ®¹t 87,7 (mg/lÝt).
Qua b¶ng ta thÊy viÖc sö dông pepton víi nång ®é 10 (g/lÝt), còng cã
thÓ ®−îc sö dông lµm nguån dinh d−ìng nit¬ cho qu¸ tr×nh lªn men, hµm
l−îng sinh khèi vµ beta-caroten ®¹t ®−îc còng t−¬ng tù nh− khi sö dông
nguån dinh d−ìng lµ cao ng«.
Ngoµi ra, b¶ng còng cho ta thÊy, c¸c chñng nÊm sîi còng cã kh¶ n¨ng
sö dông c¸c nguån nit¬ kh¸c nh− casein thuû ph©n, cao nÊm men nh−ng cho
hµm l−îng beta-caroten kh«ng cao. Roukas vµ céng sù ( ) cho r»ng cã thÓ sö
dông kÕt hîp c¸c nguån dinh d−ìng trong lªn men qui m« x−ëng thùc nghiÖm
®Ó lµm t¨ng hiÖu qu¶ tæng hîp beta-caroten cao nhÊt.
§Æc biÖt, trong sè c¸c nguån dinh d−ìng nit¬ th× nguån dinh d−ìng v«
c¬ cho hiÖu qu¶ tæng hîp beta-caroten kÐm hoÆc kh«ng cã hiÖu qu¶. §èi víi
(NH4)2SO4 ,nguyªn nh©n kh«ng ph¶i lµ do b¶n th©n gèc NH4
+ mµ lµ do ®é chua
sinh lý do c¸c muèi amon t¹o ra. Sau khi B. trispora ®ång ho¸ gèc NH4
+,
trong m«i tr−êng sÏ tÝch luü c¸c anion v« c¬ (SO4-2, HP04-2, CI-...) vµ v× thÕ
lµm h¹ thÊp rÊt nhiÒu pH cña m«i tr−êng xuèng. Ng−îc l¹i víi c¸c muèi
amon, muèi nitrat lµ nh÷ng muèi cã tÝnh kiÒm sinh lý. Sau khi tÕ bµo sîi nÊm
®ång ho¸ gèc NO3-, trong m«i tr−êng sÏ tÝch luü c¸c cation (Na+, K+...) vµ do
®ã lµm t¨ng râ rÖt pH cña m«i tr−êng.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
56
ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh víi chØ mét nguån cacbon lµ glucose nång
®é 50 (g/l) víi c¸c nguån nit¬ kh¸c nhau víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 75 ml
(trong b×nh tam gi¸c dung tÝch 500 ml), chÕ ®é l¾c vµ nhiÖt ®é ®−îc kiÓm so¸t
t−¬ng øng lµ 250 vßng/phót, 280C vµ ë pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lµ 7,0.
B¶ng 4: ¶nh h−ëng cña nguån dinh d−ìng nit¬ ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
Hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten (mg/l)
STT
Nguån nit¬
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 L-asparagine 24,1 22,2 28.7 65,8 69,2 87,7
2 Pepton 43,9 42,6 28,5 169,6 598,4 91,1
3 Cao ng« 44.1 42.2 14.8 178,0 592,0 41,7
4 Cao nÊm men 37,3 33,7 24,6 143,1 213,5 87,7
5 Casein thuû ph©n 20,6 23,1 11,5 102,0 104,4 10,5
6 Bét nÊm men 19,2 20,2 15,0 137,5 97,4 29,0
7 NaNO3 9,1 11,3 7,5 67,8 88,3 22,1
8 (NH4)2SO4 - - - - - -
3.1.3. ¶nh h−ëng cña thµnh phÇn lipid ®Õn ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten cña c¸c chñng B. trispora
C¸c thÝ nghiÖm kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña nguån lipit ®Õn kh¶ n¨ng t¹o
sinh khèi vµ t¨ng hµm l−îng beta-caroten lªn cao ®−îc thùc hiÖn víi sù cã mÆt
cña chÊt chèng oxy ho¸ BHT ë nång ®é 5 mg/lÝt m«i tr−êng lªn men. B¶ng
cho thÊy trong sè c¸c nguån lipid ®−îc sö dông cho nghiªn cøu (dÇu ®Ëu
t−¬ng, dÇu oliu, dÇu h−íng d−¬ng, hay kÕt hîp gi÷a dÇu ®Ëu t−¬ng vµ oliu),
dÇu h−íng d−¬ng cho hµm l−îng beta-caroten cao ( 690,2 mg/lÝt víi chñng B.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
57
trispora WH2). Ngoµi ra, hçn hîp hai lo¹i dÇu ®©u t−îng vµ oliu còng cho
hµm l−îng bet caroten cao. B¶ng liÖt kª c¸c nguån lipid ®−îc sö dông cho
lªn men ë c¸c ®iÒu kiÖn kh«ng ®æi (nhiÖt ®é lªn men (280C), pH m«i tr−êng
ban ®Çu 7,0, l¾c ë tèc ®é 250 vßng/phót rªn qui m« m¸y l¾c).
B¶ng 5: ¶nh h−ëng cña nguån lipid ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë c¸c chñng B. trispora
Hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten (mg/l)
STT
Thµnh phÇn lipid
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 DÇu ®©ô t−¬ng 44,1 42,2 28,7 178,0 592,0 87,7
2 DÇu Oliu 44 48,0 30,1 178,0 617,3 90,2
3 DÇu ®Ëu
t−¬ng+dÇu oliu
44 49,9 29,5 178,0 630,1 88,4
4 DÇu h−íng d−¬ng 48 54 - 190,7 690,2 -
3.1.4. ¶nh h−ëng cña pH ban ®Çu cña m«i tr−êng ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë c¸c chñng B. trispora
Nhãm nghiªn cøu còng ®· tiÕn hµnh kh¶o s¸t pH ban ®Çu cña m«i
tr−êng lªn men dÞch thÓ cã ¶nh h−ëng nh− thÕ nµo ®Õn hµm l−îng sinh khèi
kh« (g/lÝt m«i tr−êng) vµ hµm l−îng beta-caroten (mg/lÝt m«i tr−êng). ThÝ
nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh víi d¶i pH tõ 5 ®Õn 11. KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy ë
pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lªn men lµ 7,0 cho hµm l−îng sinh khèi cao nhÊt
(43,6 g/lÝt) ë chñng B. trisporra WH1, vµ ë pH 8,0 víi chñng B. trisporra WH2
(42,2 g/lÝt). Tuy nhiªn víi B. trispora NBRC 5989 l¹i cho hµm l−îng sinh khèi
kh« cao nhÊt t¹i pH 6,0 vµ cho hµm l−îng beta-caroten t−¬ng øng lµ 80,3.
Cµng n©ng cao pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lªn, hµm l−îng sinh khèi
kh« thu nhËn ®−îc cµng gi¶m ®i, tuy nhiªn hµm l−îng beta-caroten ngµy cµng
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
58
n©ng cao víi hai chñng B. trisporra WH1 vµ WH2 t−¬ng øng lµ 740 vµ 1150
mg/lÝt , vµ chñng B. trispora NBRC 5989 ®¹t 150,2 mg/lÝt t¹i pH ban ®Çu lµ 10
chø kh«ng ph¶i lµ 11.
B¶ng 6: ¶nh h−ëng cña pH ban ®Çu cña m«i tr−êng ®Õn kh¶ n¨ng
tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trisporra
Hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten (mg/l)
STT
pH ban ®Çu
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 5 20,2 21,2 17,8 69,3 180,8 58,5
2 5,5 28,2 30,1 25,0 115,8 321,1 82,1
3 6 42,0 42,0 33,1 125,0 476,5 80,3
4 7 44,1 42,2 28,7 178,0 592,0 87,7
5 8 43,6 38,5 28,2 185,0 605,9 92,3
6 9 22,5 25,9 26,7 534,8 819,6 147,9
7 10 23,1 26,5 24,2 545,7 834,7 150,2
8 11 23,0 22,3 19,8 740,3 1150,0 80,3
H×nh 19 (a, b) biÓu diÔn trªn ®å thÞ vÒ mèi liªn hÖ chÆt chÏ gi÷a hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l) vµ hµm l−¬ng beta-caroten (mg/l) vµ c¸c gi¸ trÞ pH ban
®Çu cña m«i tr−êng.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
59
H×nh 19: Mèi liªn hÖ gi÷a hµm l−îng sinh khèi kh« (a), hµm l−îng
beta-caroten (b) víi c¸c gi¸ trÞ pH ban ®Çu cña m«i tr−êng
(a)
(b)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
5 5,5 6 7 8 9 10 11
WH1
WH2
NBRC 5989
H
àm
lư
ợn
g
be
ta
-c
ar
ot
en
(m
g/
l)
pH
0
10
20
30
40
50
5 5,5 6 7 8 9 10 11
WH1
WH2
NBRC 5989Si
nh
k
hố
i k
hô
(g
/l)
pH
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
60
H×nh 20: ¶nh chôp lªn men trªn b×nh tam gi¸c 500 ml
víi c¸c gi¸ trÞ pH kh¸c nhau ë chñng B. trispora WH2
3.1.5. ¶nh h−ëng cña thêi gian lªn men ®Õn hµm l−îng beta-caroten ë c¸c
chñng B. trispora
Thêi gian lªn men cã ¶nh h−ëng lín ®Õn kh¶ n¨ng t¹o sinh khèi vµ kh¶
n¨ng thu nhËn hµm l−îng beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora. Kim
vµ céng sù ( ) ®· thùc hiÖn qu¸ tr×nh lªn men trong kho¶ng thêi gian tõ 5
®Õn 7 ngµy. Tuy nhiªn, mét sè chñng s¶n xuÊt c«ng nghiÖp tiÒm n¨ng cã thÓ
®−îc lªn men trªn qui m« lín víi chØ kho¶ng 2 ®Õn 3 ngµy (Roukas vµ céng
sù).
C¨n cø vµo c¸c giai ®o¹n ph¸t triÓn cña tÕ bµo nÊm sîi, nhãm ®Ò tµi ®·
thùc hiÖn c¸c nghiªn cøu kh¶o s¸t thêi gian nu«i cÊy trªn m«i tr−êng dÞch thÓ
cã ¶nh h−ëng nh− thÕ nµo ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten khi nu«i cÊy
riªng rÏ c¸c chñng B. trispora trªn qui m« m¸y l¾c. ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn
hµnh ë c¸c ®iÒu kiÖn tiªu chuÈn vÒ nhiÖt ®é lªn men (280C), c¸c thµnh phÇn
dinh d−ìng cabon vµ nit¬ x¸c ®Þnh trong c¸c nghiªn cøu tr−íc, ®−îc l¾c trªn
m¸y l¾c trßn tèc ®é 250 vßng/phót, vµ pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lªn men lµ
11 ¸p dông víi WH1 vµ WH2, vµ 10 cho chñng NBRC 5989. B¶ng cho ta thÊy
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
61
hµm l−îng beta-caroten phô thuéc chÆt chÏ vµo thêi gian nu«i cÊy cña c¸c
chñng nÊm sîi B. trispora.
Víi c¸c chñng B. trispora WH1 vµ WH2, thêi ®iÓm ®Ó cã thÓ kÕt thóc
lªn men ®−îc x¸c ®Þnh lµ kho¶ng 72 giê (3 ngµy), víi hµm l−îng sinh khèi
kh« ®¹t 23,0 vµ 22,3 gram/lÝt m«i tr−êng vµ hµm l−îng beta-caroten t−¬ng øng
lµ 740,3 vµ 1150 mg/lÝt m«i tr−êng. Tuy nhiªn víi chñng B. trispora NBRC
5989 chØ cã thÓ kÕt thóc lªn men sau kho¶ng 96 giê, cho hµm l−îng sinh khèi
kh« lµ 20,1 gram trªn 1 lÝt m«i tr−êng vµ hµm l−îng beta-caroten ®¹t 177,9
gram/lÝt.
B¶ng 7 : ¶nh h−ëng cña thêi gian nu«i cÊy ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
Hµm l−îng sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten (mg/l)
STT
Thêi gian lªn men
(h) WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 24 20,1 19,0 18,8 28,6 27,5 11,9
2 36 22,5 19,2 20,1 87,0 128,6 34,8
3 48 22,5 20,0 20,6 125,2 584,0 87,7
4 64 23,0 22,0 20,0 452,5 790,0 115,1
5 72 23,0 22,3 20,2 740,3 1150,0 150,2
6 84 23,0 20,0 21,0 737,8 1150,0 168,9
7 96 18,0 18,0 20,1 465,6 743,7 177,9
H×nh 21 biÓu diÔn trªn biÓu ®å h×nh cét cho thÊy ¶nh h−ëng cña thêi gian nu«i
cÊy ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta carten ë nÊm sîi B. trispora
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
62
H×nh 21: Mèi liªn quan gi÷a thêi gian nu«i cÊy vµ hµm l−îng
beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
3.1.9. ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é nu«i cÊy ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten ë c¸c chñng B. trispora
NhiÖt ®é nu«i cÊy lµ mét trong sè c¸c yÕu tè lµm t¨ng tæng hîp beta-
caroten lªn cao. ViÖc kiÓm so¸t vµ khèng chÕ nhiÖt ®é trong qu¸ tr×nh lªn men
cã vai trß tÝch cùc trong viÖc t¹o sinh khèi vµ n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten. C¸c thÝ nghiÖm ®−îc thùc hiÖn ë d¶i nhiÖt ®é tõ 220C ®Õn 300C
d−íi c¸c ®iÒu kiÖn vÒ chÕ ®é l¾c lµ 25 vßng/phót, nguån dinh d−ìng
cacbon/nit¬ ®· x¸c ®Þnh lµ glucose 50 g/l vµ cao ng« 50 g/l (còng cã thÓ thay
cao ng« b»ng pepton 10 g/l cho c¶ 3 chñng) vµ pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lµ
11 cho WH1 vµ WH2, vµ 10 cho chñng NBRC 5989.
0
200
400
600
800
1000
1200
48 64 72 84 96
WH1
WH2
NBRC 5989
H
àm
lư
ợn
g
be
ta
-c
ar
ot
en
(m
g/
l)
Thời gian nuôi cấy (h)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
63
B¶ng 7: ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é lªn men ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
H×nh th¸i vµ hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Beta-caroten (mg/l)
STT
NhiÖt ®é lªn men
(oC) WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 22 20,5 19,5 15,9 28,6 27,5 87,7
2 24 22,7 22,2 18,5 290,1 790,0 56,9
3 26 23,6 22,6 18,6 750,0 1142 170,7
4 28 23,0 22,3 20,1 740,3 1150 177,9
5 30 23,3 22,1 20,2 745,0 786,3 117,9
3.1.7. ¶nh h−ëng cña tû lÖ tiÕp gièng vµ h×nh thøc tiÕp gièng ®Õn kh¶ n¨ng
tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng B. trispora
Qua c¸c nghiªn cøu vÒ lªn men trong m«i tr−êng dÞch thÓ trªn qui m«
m¸y l¾c víi c¸c ®iÒu kiÖn x¸c ®Þnh vÒ nhiÖt ®é lªn men (280C), c¸c thµnh phÇn
chÝnh cña m«i tr−êng (C/N cã tû lÖ lµ 50/50 g/l), chÕ ®é l¾c (250 vßng/phót)
vµ ®iÒu kiÖn vÒ pH ban ®Çu cña m«i tr−êng, tû lÖ tiÕp gièng vµ h×nh thøc tiÕp
gièng ®Òu cã ¶nh h−ëng nhiÒu ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten. C¸c thÝ
nghiÖm kh¶o s¸t cho thÊy víi l−îng gièng tiÕp tõ 2-3 x107 (bµo tö/ml dÞch
huyÒn phï) víi hai chñng B. trispora WH1 vµ WH2 cho hµm l−îng beta-
caroten cao h¬n h¼n so víi l−îng gièng tiÕp lµ 1 x 107 (bµo tö/ ml). §èi víi
chñng B. trispora NBRC 5989, gièng lu«n lu«n ®−îc tiÕp lµ gièng cÊp 1,
nghÜa lµ gièng ph¶i ®−îc nu«i cÊy tr−íc 24 giê trong m«i tr−êng lªn men c¬
b¶n, sau ®ã ®−îc tiÕp vµo m«i tr−êng lªn men víi c¸c nång ®é kh¸c nhau. C¸c
thÝ nghiÖm ®Òu d−îc tiÕn hµnh víi b×nh lªn men lµ b×nh tam gi¸c dung tÝch
500 ml víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 75 ml.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
64
B¶ng 8: ¶nh h−ëng cña tû lÖ tiÕp gièng vµ h×nh thøc tiÕp gièng
®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
STT
Chñng gièng
H×nh thøc
tiÕp gièng
Tû lÖ tiÕp
gièng
Sinh khèi
kh« (g/l)
Hµm l−îng
beta-
caroten
(mg/l)
1x107 22,1 295,4
2 x107 22,0 290,1
1
WH1
Bµo tö
3 x107 23,0 740,3
1 x107 20,0 295,9
2 x107 22,5 790,0
2
WH2
Bµo tö
3 x107 22,3 1150
5% 24,0 115,1
7.5% 20,1 177,9
3
NBRC 5989
Gièng cÊp 1
10% 25,0 170,6
3.1.8. ¶nh h−ëng cña chÕ ®é l¾c ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë c¸c
chñng B. trispora
§Ó kh¼ng ®Þnh chÕ ®é l¾c nµo lµ thÝch hîp nhÊt cho qu¸ tr×nh lªn men,
nhãm ®Ò tµi ®· thùc hiÖn lªn men trªn qui m« m¸y l¾c trßn víi 3 tèc ®é l¾c
kh¸c nhau lµ 200, 250 vµ 300 vßng/phót víi pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lµ 11
(®èi víi hai chñng WH1 vµ WH2) vµ 10 víi chñng NBRC 5989, c¸c thµnh
phÇn kh¸c cña m«i tr−êng ®−îc gi÷ nguyªn.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
65
B¶ng 9: ¶nh h−ëng cña chÕ ®é l¾c ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
H×nh th¸i vµ hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Beta-caroten (mg/l)
STT
ChÕ ®é l¾c
(vßng/phót) WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 200 22,6 22,0 22,7 530,5 765,9 120,7
2 250 23,0 22,3 20,1 740,3 1150 177,9
3 300 23,1 23,0 21,6 743,2 1153 159,9
Nh− vËy lùa chän chÕ ®é l¾c lµ 250 vßng/phót trªn m¸y l¾c trßn lµ thÝch
hîp nhÊt ¸p dông cho c¶ ba chñng B. trispora WH1, WH2 vµ NBRC 5989
3.1.9. ¶nh h−ëng cña chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt Span 20 ®Õn h×nh th¸i sinh
khèi vµ hµm l−îng beta-caroten ë chñng nÊm sîi B. trispora
Theo Kim vµ céng sù ( ), trong sè c¸c chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt nh− Span
20, 40, Tween 20 vµ Triton X 100 v.v…, Span 20 ®−îc sö dông chñ yÕu víi
vai trß lµ chÊt cã kh¶ n¨ng chèng vãn côc cña hÖ sîi khi lªn men trªn m«I
tr−êng dÞch thÓ. Sù vãn côc cña sinh khèi lµ do c¸c tÕ bµo sîi nÊm ph¸t triÓn
ch»ng chÞt vµ ®an xen nhau, do ®ã g©y ¶nh h−ëng ®Õn kh¶ n¨ng tiªu thu oxy
cña tÕ bµo do vËy lµm gi¶m ®¸ng kÓ kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten cña tÕ
bµo sîi nÊm. Sö dông Span 20 víi c¸c nång ®é kh¸c nhau ®· gióp cho tÕ bµo
sîi nÊm trë nªn ph©n t¸n, ng¾n h¬n vµ do ®ã n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten. Trong sè ba chñng nghiªn cøu, hai chñng B. trispora WH1 vµ
WH2 cã ¶nh h−ëng tÝch cùc bëi viÖc bæ sung vµo m«i tr−êng 1% Span 20, cßn
®èi víi chñng NBRC 5989 cho hÖ sîi ph©n t¸n vµ hµm l−îng beta-caroten cao
(235,8 mg/l) t¹i nång ®é 0,6% Span 20.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
66
B¶ng 10: ¶nh h−ëng cña chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt Span 20 ®Õn kh¶ n¨ng
tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
H×nh th¸i vµ hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Beta-caroten (mg/l)
Span 20
(%)
H×nh th¸i sinh
khèi sau lªn men
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
0,00 Vãn côc 23,0 22,3 20,1 740,3 1150 177,9
0.01 Vãn côc 23,0 23,1 21,2 740,3 1176 182,5
0.10 H¬i ph©n t¸n 24,0 24,8 22,0 772,5 1280 218,2
0.20 H¬i ph©n t¸n 24,6 23,7 22,4 792,1 1223 197,0
0.40 Ph©n t¸n 24,8 24,2 22,5 798,6 1249 198,0
0.60 Ph©n t¸n 25,0 25,6 26,8 805,0 1320 235,8
0.80 Ph©n t¸n 27,0 27,1 24,0 869,4 1398 211,2
1.00 Ph©n t¸n 27,7 27,6 23,2 891,9 1424 204,2
1.20 Ph©n t¸n 24,0 23,9 20,3 772,8 1233 178,6
H×nh 22: Lªn men trªn qui m« m¸y l¾c kh«ng (a) vµ cã (b)
bæ sung Span 20 ë nång ®é 1% víi c¸c gi¸ trÞ pH ban ®Çu kh¸c nhau
(a) (b)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
67
3.1.10. ¶nh h−ëng cña h×nh thøc lªn men ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten ë c¸c chñng B. trispora
§Ó so s¸nh qui m« lªn men nµo cho hµm l−îng sinh khèi vµ hiÖu suÊt
tæng hîp beta-caroten cao nhÊt, c¸c thÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh víi c¸c h×nh
thøc (lo¹i b×nh lªn men) vµ thÓ tÝch dÞch lªn men t−¬ng øng. Tr−íc ®ã c¸c thÝ
nghiÖm lùa chän thÓ tÝch dÞch lªn men trªn c¸c qui m« kh¸c nhau còng ®·
®−îc thùc hiÖn vµ x¸c ®Þnh (sè liÖu kh«ng c«ng bè ë ®©y).
Qua b¶ng 11 ta thÊy ®èi víi qui m« lªn men trªn m¸y l¾c, lo¹i b×nh tam
gi¸c dung tÝch 1000 ml víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 300 ml, l¾c ë chÕ ®é 150
vßng/phót trªn m¸y l¾c c«ng nghiÖp cho hiÖu qu¶ tæng hîp beta-caroten cao
nhÊt, tiÕp ®ã lµ b×nh tam gi¸c dung tÝch 500 ml víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 75
ml còng cho hµm l−îng beta-caroten cao. §Æc biÖt khi tiÕn hµnh lªn men trªn
thiÕt bÞ lªn men Draft Tube cã dung tÝch tæng 14 lÝt vµ dung tÝch lµm viÖc lµ
10 lÝt cho hµm l−îng sinh khèi kh« rÊt cao, 69,9 g/l, vµ hµm l−îng beta-
caroten ®¹t 1978 mg/l m«i tr−êng ®èi víi chñng B. trispora WH2.
B¶ng 11: ¶nh h−ëng cña h×nh thøc lªn men ®Õn kh¶ n¨ng
tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng B. trispora
H×nh th¸i vµ hµm l−îng
sinh khèi kh« (g/l)
Beta-caroten (µg/l)
Stt
H×nh thøc vµ thÓ tÝch
dÞch lªn men
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 B×nh 250 ml (50 ml) 12,5 12,8 11,7 28,6 27,5 24,9
2 B×nh 500 ml (75ml) 27,7 27,6 26,8 891,9 1424 235,8
3 B×nh1000 ml (300 ml) 44,5 45,0 (-) 987,8 1659 (-)
4 B×nh 2000 ml (400ml) 31,5 31,3 28,5 1021 1540 322,1
5 B×nh 5000 ml
(2500ml)
32 32,2 (-) 1015 1554 (-)
6 ThiÕt bÞ lªn men 14 lÝt
(10 lÝt) *
(-) 69,9 (-) (-) 1978 (-)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
68
Ghi chó:
(-) : ThÝ nghiÖm kh«ng ®−îc thùc hiÖn
* : ThÝ nghiÖm ®−îc thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn lªn men ë nhiÖt ®é 280C, cã
bæ sung chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt víi nång ®é 0,8%, nguån nit¬ bæ sung bao
gåm cao ng«, peton, cao nÊm men, bét nÊm men c«ng nghiÖp, vµ nguån
cacbon lµ ®−êng glucose c«ng nghiÖp, pH ban ®Çu cña m«i tr−êng lµ 11,0.
H×nh 23: Lªn men chñng B. trispora WH2 trªn b×nh tam gi¸c
1000 ml trªn m¸y l¾c c«ng nghiÖp New Brunswick
3.1.11. Kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña c¸c tiÒn chÊt ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten ë c¸c chñng B. trispora
B¶ng 12 cho ta thÊy c¸c tiÒn chÊt cã ¶nh h−ëng nh− thÕ nµo ®Õn hµm
l−îng beta-caroten ë c¸c chñng WH1, WH2 vµ NBRC 5989. ThÝ nghiÖm ®−îc
tiÕn hµnh ®èi víi b×nh tam gi¸c 500 ml qui m« m¸y l¾c, pH ban ®Çu cña m«i
tr−ßng lµ 11 víi hai chñng WH1 vµ WH2 vµ pH 10 víi chñng NBRC 5989,
nhiÖt ®é nu«i cÊy lµ 280C. ViÖc kh¶o s¸t nång ®é chÊt kÝch thÝch ®−îc bæ sung
vµo m«i tr−êng lªn men lµ bao nhiªu vµ t¹i thêi ®iÓm nµo lµ thÝch hîp nhÊt ®·
®−îcnghiªn cøu. KÕt qu¶ kh¶o s¸t s¬ bé cho thÊy thêi ®iÓm thÝch hîp ®Ó tiÕp
tiÒn chÊt lµ tõ 40 giê lªn men trë ®i
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
69
Beta ionone cã ¶nh h−ëng râ rÖt ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë
chñng B. trispora WH2 (2325 mg/l), tiÕp ®Õn lµ isoniazid (2026 mg/l). §èi víi
chñng WH1, hµm l−îng beta-caroten ®¹t cao nhÊt ( 1031 mg/l) khi bæ sung
hçn hîp hai tiÒn chÊt lµ kerosen vµ isoniazid. Riªng víi NBRC 5989, hµm
l−äng beta-caroten t¨ng cao h¬n so víi ®èi chøng (796,7 mg/l) khi bæ sung
mét tiÒn chÊt duy nhÊt lµ 4% kerosen.
B¶ng 12: Kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña c¸c tiÒn chÊt ®Õn kh¶ n¨ng
tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng B. trispora
Sinh khèi kh« (g/l) Beta-caroten (mg/l)
STT
TiÒn chÊt
WH1 WH2 5989 WH1 WH2 5989
1 §èi chøng 23,0 22,3 20,1 740,3 1150 117,9
2 Axit nicotinic 23,3 24,0 20,2 538,9 790,0 (-)
3 0,05% Isoniazid 22,6 24,0 21,3 720,0 1025 158,9
4 0,075% Isoniazid 22,9 23,2 21,1 901,3 2026 588,0
5 0,05% Beta ionone 22,7 22,8 22,0 824,7 1086 612,0
6 0,075%Beta ionone 24,0 24,1 22,0 825,6 2325 565,0
7 1% Kerosen 24,0 24,2 21,8 740,9 1398 359,8
8 2% Kerosen 23,8 24,2 20,0 814,6 1420 567,6
9 4% Kerosen 24,0 24,5 20,5 995,2 1922 796,7
10 4% Kerosen +
0,075% Beta
ionone
23,9 23,7 22,8 1012 1852 785,4
11 4% Kerosen +
0,075% isoniazid
22,7 24,1 19,5 1031 1731 726,4
Ghi chó: (-) ThÝ nghiÖm kh«ng ®−îc thùc hiÖn
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
70
H×nh 24 : KÕt qu¶ kiÓm tra HPLC dÞch chiÕt beta-caroten t¸ch chiÕt tõ
sinh khèi nÊm sîi cña chñng B. trispora NBRC 5989
3.2. Nghiªn cøu n©ng cao kh¶ n¨ng sinh tæng hîp beta-caroten cña
chñng B. trispora WH2 b»ng ph−¬ng ph¸p xö lý ®ét biÕn
V¬Ý môc ®Ých lµ c¶i thiÖn vµ n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten
cña chñng nÊm sîi, nhãm nghiªn cøu ®· thùc hiÖn c¸c thÝ nghiÖm vÒ xö lý
chñng B. trispora WH2 lµ chñng mang giíi tÝnh c¸i (-) b»ng ho¸ chÊt ®ét biÕn
EMS, kÕt hîp xö lý b»ng ho¸ chÊt kÕt hîp chiÕu tia tö ngo¹i, vµ chØ chiÕu tia
tö ngo¹i. KÕt qu¶ nghiªn cøu s¬ bé cho thÊy chÊt EMS cã kh¶ n¨ng n©ng cao
kh¶ n¨ng sinh tæng hîp beta-caroten ë chñng c¸i B. trispora WH2.
3.2.1. Xö lý gièng b»ng biÖn ph¸p chiÕu tia tö ngo¹i
B»ng c¸ch chiÕu tia tö ngo¹i trùc tiÕp vµo gièng B. trispora WH2 víi c¸c thêi
gian chiÕu kh¸c nhau nh− 30, 60 vµ 90 phót, víi c−êng ®é chiÕu s¸ng lµ klux ®Ó
kiÓm tra xem liÖu viÖc chiÕu tia UV cã ¶nh h−ëng g× ®Õn hµm l−îng beta-caroten
kh«ng. Sè liÖu lªn men cho thÊy viÖc chiÕu tia tö ngo¹i ®· kh«ng cã t¸c dông lµm
n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë tÕ bµo nÊm sîi WH2.
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16
m
A
U
-5
0
5
10
15
2.
09
1
B
et
ac
ro
te
ne
6
.9
65
9.
26
9
12
.5
23
1: 455 nm, 8 nm
Beta09
Enz.1.8.05009
Name
Retention Time
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
71
B¶ng 13: ¶nh h−ëng cña thêi gian chiÕu tia tö ngo¹i ®Õn
kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë chñng nÊm sîi B. trispora WH2
STT
Thêi gian chiÕu tia tö ngo¹i
(phót)
Hµm l−îng
sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten
(mg/l)
1 30 22,9 2330
2 60 23,7 2217
3 90 24,0 2340
4 §èi chøng (kh«ng chiÕu tia) 23,7 2325
3.2.2. Xö lý ®ét biÕn chñng B. trisporra WH2 b»ng ho¸ chÊt ®ét biÕn EMS
KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, víi l−îng ho¸ chÊt ®ét biÕn EMS ®−îc
®−a vµo dung dung dÞch huyÒn phï cña chñng B. trispora WH2 t¨ng dÇn tõ 30,
60, 90, 100, 150 vµ 200 ul/1ml dung dÞch gièng huyÒn phï (t−¬ng ®−¬ng víi 1
x 107 bµo tö), hµm l−îng beta-caroten ®¹t cùc ®¹i víi nång ®é ho¸ chÊt EMS
®−a vµo lµ 200 ul. Tû lÖ sèng sãt cña bµo tö sau xö lý lµ 10%. §Æc biÖt h×nh
th¸i ngoµi cña bµo tö cã sù thay ®æi, tõ d¹ng bÇu dôc sang d¹ng cã khuynh
h−íng h¬i trßn. B»ng ph−¬ng ph¸p chôp c¾t líp, nhãm nghiªn cøu ®· x¸c ®Þnh
®−îc kÝch th−íc trung b×nh cña bµo tö sau xö lý ®ét biÕn, kho¶ng 5,5-5,7 ul so
víi kÝch th−íc cña tÕ bµo tr−íc khi xö lý lµ 6,5 ®Õn 6,7 um
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
72
H×nh 24: ¶nh chôp bµo tö B. trispora WH2 tr−íc (a) vµ sau khi xö lý (b)
b»ng ho¸ chÊt EMS trªn kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö víi vËt kÝnh 100X
(a) (b)
H×nh 25: KÕt qu¶ chôp c¾t líp bµo tö chñng B. trispora WH2 (a) vµ MTH2 (b)
(a) (b)
§Æc biÖt khi cÊy chñng ®· xö lý ®ét biÕn trªn c¸c m«i tr−êng PDA,
CM17-1 vµ CM17-1 cã bæ sung c¸c chÊt kh¸ng sinh nh− Lovastatin, Nystatin
vµ Acetoacetanilde víi c¸c nång ®é t−¬ng øng lµ 30, 0,8, vµ 60 ug/1 ml m«i
tr−êng. Sau 7 ngµy nu«i ë nhiÖt ®é 280C trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã chiÕu s¸ng,
bµo tö ph¸t triÓn tèt trªn m«i tr−êng PDA, ph¸t triÓn b×nh th−êng trªn m«i
tr−êng CM17-1 vµ m«i tr−êng chän läc (m«i tr−êng CM17-1 cã bæ sung c¸c
chÊt kh¸ng sinh nh− Lovastatin, Nystatin vµ Acetoacetanilde). Nh− chóng ta
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
73
®· biÕt Lovastatin lµ chÊt kh¸ng sinh thuéc nhãm c¸c chÊt kh¸ng cholesterol
cao, trong tÕ bµo vi sinh vËt th× nã cã vai trß lµm gi¶m hµm l−îng c¸c sterol vÝ
dô nh− ergosterol. Do ®ã sinh tæng hîp beta-caroten tu©n theo chu tr×nh
mevalonat ë tÕ bµo nÊm sîi kh«ng bÞ ¶nh h−ëng bëi qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ tõ
farnesyl pyrophosphat thµnh c¸c sterol, do vËy lµm t¨ng hµm l−îng beta-
caroten cao. C¸c tÕ bµo ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng vµ kh¸ng ®−îc víi
lovastatin, khi ®ã enim HMG-CoA reductase (hydroxy – methyl – glutaryl –
CoA reductase) ®−îc biÕn ®æi vµ kh«ng bÞ øc chÕ bëi c¸c sterol. Còng nh− vËy
acetoacetnide lµ chÊt øc chÕ sinh tæng hîp isoprenoit (bao gåm c¶ sinh tæng
hîp sterol). Tr¸i l¹i, nystatin lµ chÊt cã t¸c dông kÝch thÝch tæng hîp acetyl-
CoA nªn Ýt nhiÒu ®Òu cã ¶nh h−ëng tÝch cùc ®Õn kh¶ n¨ng sinh tæng hîp beta-
caroten ë tÕ bµo sîi nÊm.
H×nh 26 : ¶nh chôp chñng B. trispora WH2 tr−íc (a) vµ sau khi xö lý (b) b»ng
ho¸ chÊt ®ét biÕn trªn m«i tr−êng minimal agar vµ trªn m«i tr−ßng CM17-1
(c), CM17-1 cã bæ sung nystatin (d), lovastatin (e) vµ acetoacetanilde (f)
(a) (b)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
74
(c) (d)
(e) (f)
B»ng c¸ch cÊy l¹i tõ m«i tr−êng CM 17-1 cã bæ sung kh¸ng sinh
lovastatin sang m«i tr−êng ho¹t ho¸ gièng PDA, bµo tö ph¸t triÓn tèt trªn m«i
tr−êng ®−îc dïng ®Ó lªn men trªn qui m« m¸y l¾c. KÕt qu¶ lªn men chñng xö
lý ®ét biÕn (®−îc ®Æt tªn lµ B. trispora MTH2) cho thÊy hµm l−îng sinh khèi
kh« hÇu nh− kh«ng cã thay ®æi ®¸ng kÓ nµo, tuy nhiªn hµm l−îng beta-
caroten t¨ng lªn rÊt cao (4717 mg/l), gÊp kho¶ng 2,02 lÇn so víi ®èi chøng,
víi l−îng EMS bæ sung lµ 200 ul cho 1 x 107 bµo tö. Xö lý gièng b»ng EMS
víi liÒu l−îng thÊp kh«ng cã t¸c dông n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten ë chñng WH2.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
75
B¶ng 14: KÕt qña lªn men chñng xö lý ®ét biÕn chñng B. trispora
WH2 b»ng ho¸ chÊt ®ét biÕn EMS
STT
Nång ®é EMS
(ul/1ml dung dÞch gièng
huyÒn phï)
Hµm l−îng
sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten
(mg/l)
1 §èi chøng 24,1 2325
2 30 22,0 1153
3 60 23,0 1129
4 90 23,1 1320
5 100 23,0 3659
6 150 22,2 3122
7 200 24,0 4717
Nhãm nghiªn cøu ®· sö dông chñng ®ét biÕn cho c¸c thÝ nghiÖm lªn
men tiÕp theo cã bæ sung c¸c tiÒn chÊt t¹i thêi ®iÓm 48 giê sau khi tiÕp gièng.
KÕt qu¶ ph©n tÝch cho thÊy víi viÖc bæ sung riªng rÏ c¸c tiÒn chÊt (0,075%
Isoniazid 1M; 0,075% beta ionone; 4% kerosen) vµo m«i tr−êng lªn men ®·
lµm t¨ng hµm l−îng beta-caroten t−¬ng øng ë chñng ®ét biÕn lªn kho¶ng 1,26
lÇn so víi ®èi chøng. Tr¸i víi dù ®o¸n ban ®Çu, khi bæ sung phèi hîp c¸c chÊt
nh− kerosen + beta ionone, kerosen + isoniazid, hµm l−îng beta-caroten hÇu
nh− kh«ng thay ®æi so víi ®èi chøng. B¶ng cho thÊy kÕt qu¶ nghiªn cøu s¬
bé vÒ viÖc bæ sung c¸c tiÒn chÊt vµo m«i tr−êng lªn men t¹i thêi ®iÓm 48 giê
sau tiÕp gèng.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
76
B¶ng 15: KÕt qu¶ kh¶o s¸t bæ sung c¸c tiÒn chÊt vµo m«i tr−êng
lªn men cña chñng B. trispora MTH2
STT Tªn tiÒn chÊt Hµm l−îng
sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten
(mg/l)
1 §èi chøng 24,0 4717
2 Isoniazid 23,9 5895
3 Beta ionone 24,3 5938
4 Kerosen 23,5 5950
5 Kerosen + Beta ionone 24,6 4840
6 Kerosen + isoniazid 23,8 4713
3.2.3. KÕt hîp xö lý gièng WH2 (-) b»ng EMS vµ chiÕu tia tö ngo¹i
Sau khi gièng WH2 ®−îc xö lý b»ng EMS ®−îc tiÕp tôc xö lý b»ng c¸ch
chiÕu tia tö ngo¹i víi c−êng ®é chiÕu s¸ng lµ klux c¸c thêi gian chiÕu kh¸c
nhau lµ 30, 60 vµ 90 phót. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy viÖc chiÕu tia tö
ngo¹i vµo gièng sau khi ®· xö lý b»ng ho¸ chÊt EMS kh«ng cã t¸c dông lµm
n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë chñng ®ét biÕn B. trispora MTH2.
B¶ng 16: KÕt hîp xö lý gièng b»ng ho¸ chÊt EMS vµ chiÕu tia tö ngo¹i
STT Thêi gian xö lý gièng
(phót)
Hµm l−îng
sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten
(mg/l)
1 30 24,0 5858
2 60 23,9 5863
3 90 24,2 5798
4 §èi chóng (kh«ng chiÕu tia) 24,3 4717
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
77
B¶ng 17 cho thÊy kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten ë chñng B. trispora
WH2 ®· xö lý gièng b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c nhau nh− dïng tia tö ngo¹i,
xö lý b»ng ho¸ chÊt EMS, vµ kÕt hîp xö lý b»ng ho¸ chÊt EMS vµ chiÕu tia tö
ngo¹i
B¶ng 17: Tæng hîp c¸c ph−¬ng ph¸p xö lý gièng B. trispora WH2
STT
Ph−¬ng ph¸p xö lý gièng
Hµm l−îng
sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten
(mg/l)
1 §èi chøng (kh«ng xö lý) 24,1 2325
2 ChiÕu tia tö ngo¹i 23,7 2340
3 KÕt hîp xö lý b»ng EMS vµ
chiÕu tia tö ngo¹i
24,0 5864
4 Xö lý b»ng ho¸ chÊt EMS 24,0 4717
Nh− vËy, viÖc xö lý b»ng ho¸ chÊt EMS ë chñng B. trispora WH2 cã
kh¶ n¨ng n©ng cao hiÖu suÊt tæng hîp beta-caroten lªn gÊp 2,02 lÇn so víi ®èi
chøng. KÕt hîp c¸c biÖn ph¸p xö lý b»ng EMS vµ chiÕu tia lµm t¨ng hµm
l−îng beta-caroten thu nhËn sau lªn men gÊp 2,52 lÇn so víi ®èi chóng. BiÖn
ph¸p xö lý gièng chØ b»ng chiÕu tia tö ngo¹i víi c−êng ®é chiÕu s¸ng lµ klux
vµ thêi gian chiÕu s¸ng lµ 30, 60, 90 phót kh«ng cã t¸c dông n©ng cao hµm
l−îng beta-caroten
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
78
H×nh 27: So s¸nh hµm l−îng beta-caroten (mg/l) thu nhËn tõ sinh khèi
chñng B. trispora WH2 víi c¸c ph−¬ng ph¸p xö lý gièng
3.3. KÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ kh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten trong m«i
tr−êng lªn men sö dông c¸c chñng gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp B.
trispora WH1, NBRC 5989, WH2 vµ chñng ®ét biÕn TMH2
§Ó kiÓm tra c¸c chñng gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp cã kh¶ n¨ng giao phèi
víi nhau hay kh«ng, nhãm nghiªn cøu ®· tiÕn hµnh cÊy hai chñng cã giíi tÝnh
®èi lËp trªn m« tr−êng minimal agar.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Đối chứng EMS EMS+UV UV
H
àm
lư
ợn
g
be
ta
-c
ar
ot
en
(m
g/
l)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
79
H×nh 28: KiÓm tra sù phèi gièng cña hai chñngcã giíi tÝnh ®èi lËp
B trispora WH1 vµ WH2 trªn m«i tr−êng Minimal agar
C¸c thÝ nghiÖm kh¶o s¸t kkh¶ n¨ng tæng hîp beta-caroten khi nu«i cÊy
phèi hîp hai chñng gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp víi c¸c tû lÖ phèi vµ h×nh thøc
tiÕp gièng còng ®· ®−îc thùc hiÖn, d−íi c¸c ®iÒu kiÖn x¸c ®Þnh (nguån dinh
d−ìng glucose/cao ng« lµ 50/50 g/l, kh«ng bæ sung tiÒn chÊt, 1% Span 20 víi
cÆp WH1- WH2, WH1- MTH2, 0,6% Span 20 cÆp phèi NBRC 5989 – WH2, pH
m«i tr−êng ban ®Çu lµ 11, nhiÖt ®é lªn men kiÓm so¸t ë 280C, l¾c ë 250
vßng/phót trªn m¸y l¾c trßn, b×nh tam gi¸c 500 ml víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ
75 ml). Nghiªn cøu ®−îc thùc hiÖn víi c¸c tû lÖ gièng phèi gi÷a hai chñng ®ùc
(+) vµ c¸i (-) lµ 1 -1; 1-2; 1-5, 1 – 10. Gièng ®−îc tiÕp d−íi d¹ng bµo tö huyÒn
phï (WH1, WH2 vµ MTH2) hay gièng cÊp 1 (NBRC 5989).
KÕt qu¶ nghiªn cøu s¬ bé cho thÊy hµm l−îng sinh khèi khi phèi hai
gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp t¨ng cao gÊp kho¶ng 1,2 – 1,5 lÇn so víi khi nu«i
cÊy riªng rÏ tõng chñng. §ång thêi hµm l−îng beta-caroten t¨ng lªn cao khi
phèi hai gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp víi tû lÖ tiÕp gièng lµ 1-2 cho WH1 - WH2,
®¹t 4026 mg/l m«i tr−êng, vµ tû lÖ 1-5 ¸p dông cho cÆp MMTH2 - WH1, ®¹t
5095 mg/lÝt m«i tr−êng. §èi víi cÆp NBRC 5989 – WH2 cho hµm l−îng sinh
khèi kh« cao (trung b×nh 42,6 g/l) nh−ng hiÖu qu¶ tæng hîp beta-caroten
kh«ng cao. B¶ng cho thÊy tû lÖ phèi gièng cã ¶nh h−ëng nh− thÕ nµo ®Õn hµm
l−îng beta-caroten.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
80
B¶ng 18: ¶nh h−ëng cña tû lÖ phèi gièng ®Õn kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten khi phèi c¸c gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp
B. trispora WH1, WH2, MTH2 vµ NBRC 5989
STT
CÆp gièng phèi
Tû lÖ
tiÕp gièng
(v/v)
Hµm l−îng
sinh khèi kh«
(g/l)
Hµm l−îng
beta-caroten
(mg/l)
1 – 1 32,9 2338
1 – 2 33,0 4026
1
WH1 - WH2
1 – 5 34,8 3987
1 – 1 36,3 1187
1 - 2 36,0 1259
2
NBRRC 5989 – WH2
1 - 5 37,0 1263
1 -1 33,4 4250
1 - 2 33,0 4986
3
WH1 – TMH2
1 - 5 35,1 5095
H×nh 29: KÕt qu¶ kiÓm tra beta-caroten b»ng HPLC cña chuÈn t¸ch
chiÕt tõ cµ rèt (a) vµ cña mÉu phèi hai chñng B. trispora WH1 – WH2 (b)
(a) (b)
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
m
A
U
0
5
10
6
.6
9
9
7.
1
04
B
e
ta
cr
o
te
n
e
1: 455 nm, 8 nm
betacaten05
bata.28.3005
Retention Time
Name
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
m
A
U
0
5
10
15
7
.1
0
4
B
et
ac
ro
te
n
e
1: 455 nm, 8 nm
betacaten02
bata.28.3002
Retention Time
Name
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
81
§Æc biÖt, khi tiÕn hµnh lªn men trªn b×nh 2000 ml khi phèi hai chñng
WH1 vµ WH2 víi tû lÖ tiÕp gièng lµ 1 – 2, víi chÕ ®é l¾c 150 vßng/phót vµ
kÌm theo cã sôc khÝ v« trïng, thêi gian lªn men lµ 70 giê víi cho hµm l−îng
beta-caroten t¨ng cao 4876 mg/l.
TiÕp nèi c¸c nghiªn cøu trªn, thÝ nghiÖm lªn men ®−îc thùc hiÖn trªn
qui m« thiÕt bÞ lªn men Draft tube 14 lÝt víi dung tÝch lµm viÖc 10 lÝt sö dông
cho cÆp gièng WH1 – MTH2. C¸c th«ng sè lªn men nh− nhiÖt ®é duy tr× ë 270,
pH, tèc ®é khuÊy ®−îc duy tr× æn ®Þnh nhê c¸c ®Çu dß cã g¾n víi hÖ thèng
m¸y tÝnh. Nguån dinh d−ìng lµ glucose, bét nÊm men, pepton, bét cao ng«
c«ng nghiÖp. Qu¸ tr×nh lªn men khæng bæ sung Span 20, víi nång ®é dÇu
h−íng d−¬ng lµ 2,7%. Thêi gian lªn men lµ 64 giê. KÕt qu¶ thu ®−îc l−îng
sinh khèi kh« ®¹t 84 g/lÝt m«i tr−êng vµ hµm l−îng beta-caroten ®¹t 4117
mg/lÝt m«i tr−êng.
H×nh 30: ¶nh chôp lªn men trªn thiÕt bÞ lªn men Draft Tube (a)
vµ thu håi sinh khèi (b) cña chñng phèi B. trispora WH1 – MTH2
(a) (b)
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
82
3.4. Nghiªn cøu c¸c ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt beta-caroten tõ sinh khèi
nÊm sîi thu nhËn sau lªn men
a. T¸ch chiÕt beta-caroten qui m« phßng thÝ nghiÖm
Sinh khèi thu nhËn sau lªn men trªn qui m« m¸y l¾c ®−îc läc kü vµ röa
b»ng n−íc cÊt ba lÇn, sau ®ã sÊy kh« ë 400C trong 24 giê cã thÓ dïng ®Ó chiÕt
b»ng c¸c dung m«i thÝch hîp cho ph©n tÝch hµm l−îng beta-caroten.
H×nh 31: Thu håi sinh khèi sau lªn men (a) vµ t¸ch chiÕt beta-
caroten (b) ë chñng B. trispora WH2 trªn qui m« phßng thÝ nghiÖm
(a) (b)
KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy, t¸ch chiÕt b»ng dung m«i n – hexan cho
hiÖu qu¶ chiÕt rót cao h¬n tõ 1,28 ®Õn 1,52 lÇn so víi t¸ch chiÕt b»ng hçn hîp
n – hexan/aceton víi tû lÖ lµ 6/4, do vËy l−îng beta-caroten thu nhËn ®−îc
thÊp h¬n kho¶ng 35 % so víi chiÕt b»ng n-hexan. B¶ng 19 cho ta thÊy kh¶
n¨ng chiÕt beta-caroten víi c¸c dung m«i kh¸c nhau.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
83
B¶ng 19: Kh¶ n¨ng t¸ch chiÕt beta-caroten tõ sinh khèi nÊm sîi
B. trispora trong c¸c dung m«i kh¸c nhau
N - hexan N - hexan/aceton
Tªn mÉu V chiÕt
(ml/1g sinh
khèi)
Beta-caroten
(mg/L)
V chiÕt (ml/1
gam sinh
khèi)
Beta-
caroten
(mg/L)
WH1 35 825,6 23 542,5
WH2 35 2325 28 1527,8
NBRC 5989 35 796,7 23 523,5
MTH2 38 4717 30 3723
b. T¸ch chiÕt beta-caroten trªn qui m« x−ëng thùc nghiÖm
Sinh khèi sau lªn men trªn qui m« lín ®−îc t¸ch chiÕt theo ph−¬ng
ph¸p cña cã c¶i tiÕn. Qui tr×nh t¸ch chiÕt ®−îc thÓ hiÖn ë s¬ ®å 1.
3. 4. KiÓm tra ®éc tè nÊm mèc aflatoxin cã trong sinh khèi thu nhËn tõ
qu¸ tr×nh lªn men
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
84
S¬ ®å 1: Qui tr×nh c«ng nghÖ t¸ch chiÕt beta-caroten tõ
sinh khèi thu nhËn tõ qu¸ tr×nh lªn men ch×m qui m« b×nh lªn men 14 lÝt
Sinh khèi nÊm sîi B.trispora
sau lªn men
HÊp ë 1210C trong 15 phót
NghiÒn c¬ häc
Bæ sung ethanol tû lÖ 1/50
Trén ®Òu ë 300C, 3 giê
DÞch beta-caroten
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
85
Ch−¬ng 4: KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ
4.1. KÕt luËn
Sau mét thêi gian nghiªn cøu, nhãm nghiªn cøu ®· nhËn ®−îc c¸c kÕt qu¶
nh− sau:
1. §· tiÕn hµnh kh¶o s¸t lªn men vµ t¸ch chiÕt beta-caroten thu nhËn tõ
sinh khèi nÊm sîi c¸c chñng B. trispora WH1, WH2, NBRC 5989 trªn
qui m« m¸y l¾c sö dông nguån dinh d−ìng thÝch hîp cho qu¸ tr×nh lªn
men. Nguån cacbon thÝch hîp ®−îc sö dông lµ glucose (50 g/l), nguån
nit¬ thÝch hîp lµ cao ng« (50g/l) hoÆc pepton (10g/l), lªn men ë nhiÖt
®é 27-280C trong b×nh tam gi¸c 500 ml víi thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 75
ml, chÕ ®é l¾c 250 vßng/phót trªn m¸y l¾c trßn, pH ban ®Çu cña m«i
tr−êng lµ 11 ¸p dông cho c¸c chñng WH1, WH2 vµ 10 cho chñng NBRC
5989. Hµm l−îng beta-caroten cho hµm l−îng cao nhÊt khi nu«i cÊy
riªng rÏ c¸c chñng B. trispora WH2 (1150 mg/l), tiÕp ®ã lµ WH1 (740,3
mg/l) vµ cuèi cïng lµ NBRC 5989 (177,9 mg/l). §Æc biÖt khi lªn men
trªn m¸y l¾c c«ng nghiÖp víi c¸c thµnh phÇn dinh d−ìng ®−îc duy tr×
nh− trªn trong b×nh tam gi¸c 1 lÝt vµ thÓ tÝch dÞch lªn men lµ 300 ml,
chÕ ®é l¾c 150 vßng/phót cho hµm l−îng sinh khèi kh« t¨ng ë c¸c
chñng WH1 (44,5 g/l) vµ WH2 (45 g/l) vµ hµm l−îng beta-caroten t−¬ng
øng ®¹t 987,8 vµ 1659 mg/lÝt m«i tr−êng;
2. ViÖc bæ sung chÊt ho¹t ®éng bÒ mÆt Span víi nång ®é 1% ¸p dông cho
chñng WH1, WH2 vµ 0,6% víi chñng NBRC 5989 cã ¶nh h−ëng tÝch
cùc ®Õn h×nh th¸i cña sinh khèi, tõ d¹ng vãn côc sang dang ph©n t¸n,
®Æc biÖt hµm l−îng beta-caroten t¨ng ®¸ng kÓ khi nu«i cÊy riªng rÏ c¸c
chñng WH1, WH2, NBRC 5989 t−¬ng øng lµ 891,9; 1424; vµ 235,8
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
86
mg/l m«i tr−êng, trung b×nh t¨ng tõ 1,2 ®Õn 1,3 lÇn so víi ®èi chøng
(kh«ng bæ sung Span 20);
3. Bæ sung c¸c chÊt kÝch thÝch vµo m«i tr−êng lªn men t¹i thêi ®iÓm 48
giê sau khi tiÕp gièng cã ¶nh h−ëng lín ®Ón kh¶ n¨ng tæng hîp beta-
caroten ë c¶ ba chñng nÊm sîi víi Isonia id ë nång ®é 0,0075%, beta
ionone nång ®é 0,0075% vµ kerosen 4% hay bæ sung hçn hîp c¸c chÊt
trªn (4%kerosen+0,0075% ; 4% kerosen +0,0075% ) ®Òu cã t¸c dông
lµm t¨ng hµm l−îng beta-caroten. Bæ sung hçn hîp 4% kerosen vµ
0,0075% Isonia id cho hµm l−îng beta-caroten ë chñng B. trispora
WH1 lµ 1031 mg/l (t¨ng 1,4 lÇn so víi ®èi chóng). Víi chñng WH2, víi
nång ®é beta ionone ®−îc bæ sung lµ 0,0075% cho hµm l−îng beta-
caroten lµ 2325 mg/l (t¨ng 2 lÇn so víi ®èi chøng). Riªng víi NBRC
5989 khi bæ sung kerosen 4% vµo m«i tr−êng lªn men cho hµm l−îng
beta-caroten t¨ng lªn 4,48 lÇn so víi ®èi chøng (796,7 mg/l);
4. §· tiÕn hµnh lªn men trªn thiÕt bÞ lªn men Draft tube ë chñng B.
trispora WH2 sö dông hçn hîp nguån dinh d−ìng cacbon vµ nit¬ c«ng
nghiÖp, víi c¸c chÕ ®é khÝ, giã, chÕ ®é khu©ý duy tr× æn ®Þnh, cho hµm
l−îng sinh khèi kh« vµ hµm l−îng beta-caroten t¨ng rÊt cao, 69,9 g/l vµ
1979 mg/l m«i tr−êng;
5. ViÖc xö lý gièng b»ng ho¸ chÊt ®ét biÕn EMS, kÕt hîp xö lý b»ng ho¸
chÊt vµ chiÕu tia tö ngo¹i cã t¸c dông lµm n©ng cao kh¶ n¨ng tæng hîp
beta-caroten ë chñng B. trispora WH2 (4717, 5864 mg/lÝt m«i tr−êng).
Bæ sung riªng rÏ c¸c tiÒn chÊt vµ m«i tr−êng lªn men ë chñng ®ét biÕn
B. trispora MTH2 ®Òu cã t¸c dông lµm t¨ng cao hµm l−îng beta-
caroten. ChiÕu tia tö ngo¹i víi c−êng ®é chiÕu s¸ng lµ klux kh«ng cã
t¸c dông lµm t¨ng hµm l−îng beta-caroten ë chñng WH2;
6. §· tiÕn hµnh thùc hiÖn phèi c¸c chñng gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp vµ x¸c
®Þnh tû lÖ phèi lµ 1/2 víi cÆp WH1/WH2vµ 1/5 cho cÆp WH1/MTH2 cho
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
87
hµm l−îng sinh khèi kh« t¨ng cao gÊp tõ 1,4 ®Õn 1,6 lÇn so víi khi nu«i
cÊy riªng rÏ tõng chñng, hµm l−îng beta-caroten t−¬ng øng lµ 4026 vµ
5075 mg/l m«i tr−êng. TiÕn hµnh lªn men trªn thiÕt bÞ lªn men Draft
tube cÆp gièng phèilµ WH1/MTH2 thu ®−îc hµm l−îng sinh khèi kh« vµ
hµm l−îng beta-caroten t−¬ng øng lµ84 g/l vµ 4117 mg/lÝt m¬i tr−êng;
7. §· thùc hiÖn c¸c nghiªn cøu vÒ t¸ch chiÕt beta-caroten tõ sinh khèi thu
nhËn sau lªn men trªn qui m« m¸y l¾c vµ thiÕt bÞ lªn men. T¸ch chiÕt
b»ng dung dÞch n-hexan cã bæ sung chÊt chèng oxy ho¸ cho hiÖu suÊt
t¸ch chiÕt cao h¬n so víi viÖc t¸ch chiÕt b»ng hçn hîp n-hexan/aceton
tû lÖ 6/4 tõ 1,28 ®Õn 1,52 lÇn;
8. §· tiÕn hµnh kiÓm tra ®éc tè nÊm mèc aflatoxin B1, B2, G1, G2 b»ng
ph−¬ng ph¸p søc ký láng cao ¸p (HPLC). S¾c ký ®å cho thÊy víi khèi
l−îng mÉu ph©n tÝch lµ gam, giíi h¹n cho phÐp sù cã mÆt cña aflatoxin
®−îc x¸c ®Þnh lµ ®−îc chÊp nhËn.
NguyÔn Thanh Hµ LuËn v¨n Th¹c sü Khoa häc
88
4.2. §Ò xuÊt
1. TiÕp tôc nghiªn cøu c¸c thÝ nghiÖm bæ sung c¸c tiÒn chÊt cã t¸c dông
kÝch thÝch sinh tæng hîp bet caroten ë c¸c chñng nÊm sîi B. trispora
WH1, WH2, NBRC 5989 vµ chñng ®ét biÕn MTH2 khi nu«i cÊy riªng
rÏ vµ phèi hîp c¸c chñng cã giíi tÝnh ®èi lËp.
2. KiÓm tra gen m· ho¸ sinh tæng hîp beta-caroten ë c¸c chñng nghiªn
cøu vµ chñng ®ét biÕn b»ng kü thuËt lai ph©n tö Southern
hybridisation.
3. TiÕp tôc xö lý ®ét biÕn chñng MTH2 b»ng ho¸ chÊt ®ét biÕn NNTG.
4. Nghiªn cøu c¸c thÝ nghiÖm lªn men trªn qui m« x−ëng thùc nghiÖm
nh− 500 lÝt vµ 1500 lÝt sö dông c¸c s¶n phÈm phô cña c«ng nghiÖp chÕ
biÕn thùc phÈm lµm nguån cung cÊp dinh d−ìng cho qu¸ tr×nh lªn
men. TiÕp tôc x©y dùng qui tr×nh c«ng nghÖ vÒ t¸ch chiÕt beta-caroten
tõ sinh khèi nÊm sîi thu nhËn tõ qu¸ tr×nh lªn men ch×m cã sùc khÝ v«
trïng qui m« x−ëng thùc nghiÖm.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 5748.pdf
