Đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính hoắc hương (Pogostemon cablin) bằng phương pháp in vitro

Më ®Çu §Æt vÊn ®Ò Ho¾c h­¬ng cã tªn khoa häc lµ Pogostemon cablin (Blaco) Benth. Cßn gäi lµ qu¶ng ho¾c h­¬ng, thæ ho¾c h­¬ng. Thuéc hä hoa m«i Lamiaceae (Labiatae). Ho¾c h­¬ng lµ mét vÞ thuèc lµm m¹nh d¹ dµy gióp sù tiªu ho¸ vµ ruét, dïng trong nh÷ng tr­êng hîp ¨n kh«ng ngon, s«i bông, ®au bông ®i ngoµi, h«i miÖng. Cßn dïng lµm thuèc ch÷a c¶m m¹o, nhøc ®Çu, m×nh mÈy ®au ®ín, triÖu chøng c¶m cóm. Ho¾c h­¬ng chñ yÕu ®­îc trång b»ng cµnh nh­ng nh÷ng n¨m gÇn ®©y do thêi tiÕt, khÝ hËu ë miÒn B¾c n­íc ta kh«ng æn ®Þnh. Qu¸ tr×nh l­u gi÷ gièng qua mïa hÌ gÆp rÊt nhiÒu khã kh¨n, cã n¨m bÞ mÊt gièng nªn mét yªu cÇu cÊp thiÕt ®Æt ra lµ cÇn cã mét biÖn ph¸p gi÷ gièng qua mïa hÌ ®Ó ®¶m b¶o nguån c©y gièng æn ®Þnh. Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt cã thÓ ®¸p øng ®­îc yªu cÇu nµy vµ v× vËy chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi: “Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh nh©n gièng v« tÝnh ho¾c h­¬ng (Pogostemon cablin) b»ng ph­¬ng ph¸p in vitro”. Môc ®Ých - yªu cÇu cña ®Ò tµi * Môc ®Ých: - Nghiªn cøu t¹o vËt liÖu khëi ®Çu in vitro c©y ho¾c h­¬ng - Nghiªn cøu quy tr×nh kü thuËt nh©n nhanh in vitro c©y ho¾c h­¬ng * Yªu cÇu : Quy tr×nh nh©n gièng ph¶i t¹o ra hÖ sè nh©n gièng cao, c©y con khoÎ vµ ®ång nhÊt di truyÒn. ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi * ý nghÜa khoa häc : Ph¸t hiÖn ®­îc quy luËt t¸c dông cña c¸c yÕu tè m«i tr­êng dinh d­ìng ®èi víi qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña ho¾c h­¬ng ®Ó øng dông vµo viÖc t¹o c©y gièng cã chÊt l­îng cao. * ý nghÜa thùc tiÔn : Cung cÊp mét ph­¬ng ph¸p nh©n gièng ho¾c h­¬ng míi, t¹o ra c©y gièng cã chÊt l­îng cao, n©ng cao hiÖu qu¶ kinh tÕ cña kh©u trång trät vµ gãp phÇn thóc ®Èy s¶n xuÊt ho¾c h­¬ng trë thµnh c©y trång cã tÝnh chÊt hµng ho¸ míi phôc vô cho viÖc phßng chèng bÖnh tËt cña céng ®ång vµ xuÊt khÈu. PhÇn i Tæng quan tµi liÖu 1.1. Giíi thiÖu kh¸i qu¸t vÒ c©y ho¾c h­¬ng Ho¾c h­¬ng cßn gäi lµ qu¶ng ho¾c h­¬ng, thæ ho¾c h­¬ng. Tªn khoa häc: Pogostemon cablin (Blaco) Benth. Thuéc hä hoa m«i Lamiaceae (Labiatea). 1.1.1. §Æc ®iÓm thùc vËt häc Ho¾c h­¬ng lµ mét c©y cá sèng l©u n¨m, th©n cã ph©n nh¸nh, cao chõng 30cm ®Õn 60cm. Trªn th©n cã l«ng, l¸ cã mïi th¬m. L¸ cã cuèng ng¾n, phiÕn l¸ h×nh trøng hay h×nh thuèn, dµi chõng 5-10cm, réng 2,5 – 7cm, mÐp cã r¨ng c­a to, mÆt d­íi nhiÒu l«ng h¬n. Hoa mµu hång tÝm nh¹t mäc thµnh b«ng ë kÏ l¸ hay ®Çu cµnh. Tuy nhiªn c©y trång ë ViÖt Nam hÇu nh­ kh«ng thÊy cã hoa vµ kÕt qu¶ [3,4]. Ngoµi loµi ho¾c h­¬ng kÓ trªn, ng­êi ta cßn dïng loµi ho¾c h­¬ng Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) O.Kuntze, cïng hä. §ã lµ mét lo¹i cá sèng hµng n¨m, cao chõng 40-100cm. L¸ h×nh trøng dµi 2-8cm, réng 1-5cm, ®Çu l¸ nhän phÝa cuèng h¬i h×nh tim, cuèng dµi 1-4cm, mÐp cã r¨ng c­a th«, to. Hoa mäc thµnh vßng quanh th©n ë ®Çu cµnh hay kÏ l¸. C¸nh hoa mµu tÝm hay mµu tr¾ng. Mïa hoa th¸ng 6-7, mïa qu¶ th¸ng 10-11. C©y nµy còng cã mäc ë n­íc ta nh­ng Ýt phæ biÕn h¬n loµi trªn. 1.1.2. Ph©n bè, thu h¸i vµ chÕ biÕn C©y ho¾c h­¬ng ®­îc trång nhiÒu n¬i ë miÒn B¾c n­íc ta, chñ yÕu lÊy l¸ vµ cµnh lµm thuèc. NhiÒu nhÊt t¹i vïng Kim S¬n (Hµ Nam), H­ng Yªn. T¹i Trung t©m nghiªn cøu Trång vµ chÕ biÕn c©y thuèc Hµ Néi cã trång l­u gi÷ gièng. Th­êng trång b»ng gi©m cµnh, v× c©y kh«ng cã hoa qu¶ [2]. T¹i c¸c n­íc kh¸c t¹i vïng nhiÖt ®íi Ch©u ¸ vµ Ch©u Phi, ho¾c h­¬ng ®­îc trång rÊt quy m« ®Ó lÊy l¸ cÊt tinh dÇu. Nh÷ng n­íc s¶n xuÊt ho¾c h­¬ng nhiÒu nhÊt hiÖn nay lµ Ên §é, Malaixia, Philippin, Mangat, In®«nªxia. Hµng n¨m t¹i Malaixia thu ho¹ch chõng 500 tÊn l¸ kh« ho¾c h­¬ng ®Ó cÊt tinh dÇu, ch­a kÓ cßn s¶n xuÊt chõng 700-1000 tÊn l¸ ®Ó xuÊt c¶ng n÷a. T¹i Mangat, vµo n¨m 1925 ®· s¶n xuÊt chõng h¬n 5 tÊn l¸ kh« ®Ó cÊt tinh dÇu, ch­a kÓ sè l¸ dïng ®Ó cÊt tinh dÇu tiªu thô trong néi ®Þa. HiÖu suÊt thu ho¹ch mçi hecta hµng n¨m chõng 500 kg l¸ kh« [10]. 1.1.3. Thµnh phÇn ho¸ häc Trong l¸ ho¾c h­¬ng kh« cã chøa 0,5 – 0,6 % tinh dÇu. Thµnh phÇn chñ yÕu cña tinh dÇu ho¾c h­¬ng lµ cån Patchouli C15H26O, cßn gäi lµ long n·o Patchouli, chÊt an®ªhit xinamic, an®ªhit benzoic, eugenola, ca®inen C15H24 sesquitecpen vµ azulen [10]. Long n·o Patchouli lµ mét r­îu bËc ba, kÕt tinh d­íi d¹ng tinh thÓ h×nh lôc l¨ng, cã khi kÕt tinh ngay trong tinh dÇu. Trong tinh dÇu cÊt tõ l¸ c©y mäc ë Hµ Néi (NguyÔn Xu©n Dòng vµ céng sù J.Ess. Oil Res. 2,99 – 100, March-april, 1989) ®· thÊy cån Patchouli chiÕm 32-38%. Ngoµi ra cßn 10 thµnh phÇn kh¸c ®­îc ph¸t hiÖn trong ®ã cã a-bunesine vµ a-guaiene [10]. Cã thÓ cÊt tinh dÇu ho¾c h­¬ng b»ng l¸ t­¬i, nh­ng tØ lÖ thÊp, th­êng tinh dÇu chØ xuÊt hiÖn trong l¸ kh« hoÆc l¸ ®Ó thµnh ®èng cho h¬i lªn men vµ kh« dÇn [4,10]. 1.1.4. C«ng dông vµ liÒu dïng * C«ng dông: - Trong y häc nh©n d©n, ho¾c h­¬ng lµ mét vÞ thuèc lµm m¹nh d¹ dµy gióp sù tiªu ho¸ vµ ruét, dïng trong nh÷ng tr­êng hîp ¨n kh«ng ngon, s«i bông, ®au bông ®i ngoµi, h«i miÖng. Cßn dïng lµm thuèc ch÷a c¶m m¹o, nhøc ®Çu, m×nh mÈy ®©u ®ín, triÖu chøng c¶m cóm. Ngµy dïng 6-12 gam d­íi d¹ng thuèc s¾c hay thuèc bét, dïng riªng hay phèi hîp víi vÞ thuèc kh¸c [3]. - Trong kü nghÖ n­íc hoa , ho¾c h­¬ng lµ mét nguyªn liÖu quý v× tinh dÇu ho¾c h­¬ng (Oil of Patchouli) lµ mét tinh dÇu th¬m vµ ®Þnh h­¬ng cao cÊp. * §¬n thuèc cã ho¾c h­¬ng - Ho¾c h­¬ng chÝnh khÝ hay kiÖn t× chi t¶ t¸n: Ho¾c h­¬ng 15 gam, t« diÖp (l¸ tÝa t«) 10 gam, th­¬ng truËt 8 gam, cam th¶o 3 gam, trÇm b× 5 gam, ®¹i t¸o 4 qu¶, hËu ph¸c 3 gam, phôc linh 6 gam. TÊt c¶ t¸n thµnh bét chia thµnh gãi 8 – 10 gam. Ch÷a ¨n uèng kh«ng tiªu, ®au bông ®i ngoµi. Ng­êi lín ngµy uèng 2-5 gãi (tèi ®a), c¸ch mét giê uèng 1 gãi. TrÎ con d­íi 1 tuæi kh«ng nªn uèng. TrÎ con tõ 2-3 tuæi mçi lÇn dïng 1/3 gãi, 8-10 tuæi dïng mçi lÇn 1/2 gãi [4]. - §¬n thuèc ch÷a ¨n uèng kh«ng tiªu, hay s«i bông. Ho¾c h­¬ng 12 gam, th¹ch x­¬ng bå 12 gam, hoa c©y ®¹i 12 gam, vá b­ëi ®µo ®èt ch¸y 6 gam. TÊt c¶ t¸n nhá. Tr­íc b÷a ¨n 20 phót uèng víi n­íc nãng, mçi lÇn 2 gam. Ngµy uèng 3 lÇn [4]. 1.2. Ph­¬ng thøc nh©n gièng c©y trång Nh©n gièng lµ qu¸ tr×nh t¹o ra vµ ph¸t triÓn cã thÓ míi. Cã 2 ph­¬ng ph¸p nh©n gièng chÝnh: Ph­¬ng ph¸p h÷u tÝnh – dïng h¹t vµ ph­¬ng ph¸p v« tÝnh – dùa vµo kh¶ n¨ng t¸i sinh cña mét bé phËn nµo ®ã cña c©y nh­ l¸, th©n, rÔ, m« hoÆc tÕ bµo. 1.2.1. Nh©n gièng h÷u tÝnh (b»ng h¹t) Ph­¬ng ph¸p nh©n gièng nµy cho hÖ sè nh©n gièng cao, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn. Tuy nhiªn, mét sè c©y trång nÕu nh©n gièng b»ng h¹t cã thÓ cho nh÷ng c¸ thÓ con kh«ng hoµn toµn gièng bè mÑ chóng c¶ vÒ h×nh th¸i lÉn thµnh phÇn ho¸ häc (Carlson, 1964)[14]. §Æc biÖt, ®èi víi c©y thuèc, sù kh«ng ®ång nhÊt vÒ di truyÒn dÉn ®Õn hËu qu¶ lµ nguyªn liÖu kh«ng æn ®Þnh vÒ mÆt chÊt l­îng qua c¸c thÕ hÖ, g©y khã kh¨n cho viÖc ®­a nguyªn liÖu vµo d©y truyÒn s¶n xuÊt c«ng nghiÖp v× hµm l­îng ho¹t chÊt cña nguyªn liÖu thay ®æi thÊt th­êng. VÝ dô: ë c©y tinh dÇu viÖc nh©n gièng b»ng h¹t dÉn ®Õn sù ph©n ly kh«ng nh÷ng vÒ hµm l­îng mµ cßn c¶ vÒ sè l­îng c¸c thµnh phÇn ho¹t chÊt. Theo Nilov (1963) c©y lavanda khi nh©n gièng b»ng h¹t, cã sù ph©n ly rÊt lín vÒ hµm l­îng vµ thµnh phÇn tinh dÇu. Hµm l­îng tinh dÇu cña c©y con thay ®æi tõ 0,5 -11,3% hµm l­îng lynalylacetat tõ 11-87%. Trong nh÷ng n¨m sau, nhiÒu t¸c gi¶ ®· ®i ®Õn kÕt luËn lµ kh«ng nªn nh©n gièng lavanda b»ng h¹t (Luzina 1983; Nicolaev, 1955) [1]. 1.2.2. Nh©n gièng v« tÝnh Ph­¬ng ph¸p nµy sö dông kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c c¬ quan dinh d­ìng kh¸c nhau nh­ th©n, rÔ, l¸, m« hay tÕ bµo. Nh©n gièng v« tÝnh bao gåm nh©n gièng v« tÝnh truyÒn thèng (chiÕt, ghÐp, gi©m) vµ nh©n gièng v« tÝnh in vitro. Nh©n gièng v« tÝnh t¹o ra c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn do duy tr× ®­îc c¸c tÝnh tr¹ng cña c©y mÑ [11,12]. GÝa trÞ to lín nhÊt cña ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh lµ duy tr× ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng quý hiÕm qua c¸c thÕ hÖ vµ v× vËy t¹o ra kh¶ n¨ng s¶n xuÊt nguyªn liÖu cã tiªu chuÈn æn ®Þnh cho c«ng nghiÖp. Nh©n gièng v« tÝnh cßn cã t¸c dông rót ng¾n thêi gian tõ khi trång ®Õn khi thu ho¹ch, t¹o ®iÒu kiÖn t¨ng vô, t¨ng s¶n phÈm vµ dÉn ®Õn t¨ng hiÖu qu¶ kinh tÕ. Tuy nhiªn, nh©n gièng b»ng ph­¬ng ph¸p v« tÝnh truyÒn thèng còng cã nh÷ng nh­îc ®iÓm nhÊt ®Þnh, ®Æc biÖt lµ sù l©y nhiÔm bÖnh qua nguyªn liÖu gièng th­êng phæ biÕn vµ phøc t¹p. Sù l©y nhiÔm vµ tÝch tô c¸c ký sinh trïng ®Æc hiÖu, nhÊt lµ virut, lµm gi¶m n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng c©y trång. ThiÖt h¹i do hiÖn t­îng nµy g©y ra cã thÓ thÊy rÊt râ ë khoai t©y (Vò TriÖu M©n [5], Van de zaag, (1983)[17], vµ nhiÒu c©y kh¸c. 1.2.3. Nh©n nhanh v« tÝnh in vitro Lµ kü thuËt nu«i cÊy m« - tÕ bµo trªn m«i tr­êng dinh d­ìng nh©n t¹o v« trïng ®Ó t¸i sinh chóng thµnh c¬ thÓ míi. 1.2.3.1. C¬ së lý luËn cña nu«i cÊy in vitro Nu«i cÊy m« - tÕ bµo thùc vËt ®· h×nh thµnh mét thÕ kû tr­íc mµ c¬ së cña nã lµ gi¶ thuyÕt vÒ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo do nhµ thùc vËt vËt häc ng­êi §øc Haberland G ®Ò x­íng (1902). Theo «ng mçi tÕ bµo ®Òu mang toµn bé l­îng th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ, vµ cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thµnh 1 c¬ thÓ hoµn chØnh khi gÆp ®iÒu kiÖn thuËn lîi. Thùc tÕ ®· chøng minh kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. Hµng tr¨m loµi c©y trång ®· ®­îc nh©n gièng trªn quy m« th­¬ng m¹i b»ng c¸ch nu«i cÊy trong m«i tr­êng nh©n t¹o v« trïng vµ t¸i sinh chóng thµnh c©y víi hÖ sè nh©n gièng v« cïng lín (Murashige, 1980) [16]. Qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i trong nu«i cÊy in vitro thùc vËt thùc chÊt lµ kÕt qu¶ cña c¸c qu¸ tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸. TÊt c¶ c¸c tÕ bµo trong c¸c c¬ quan kh¸c nhau cña c¬ thÓ thùc vËt tr­ëng thµnh ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù chuyÓn ho¸ tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸ ®¶m nhiÖm c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau ®­îc gäi lµ sù ph©n ho¸ tÕ bµo. Cßn qu¸ tr×nh ph¶n ph©n ho¸ th× ng­îc l¹i, cã nghÜa lµ tÕ bµo ®· ph©n ho¸ thµnh m« chøc n¨ng kh«ng hoµn toµn mÊt ®i kh¶ n¨ng ph©n chia mµ ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp, chóng cã thÓ trë vÒ d¹ng ph«i sinh vµ t¸i ph©n chia. 1.2.3.2. C¸c ph­¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh in vitro Ngµy nay, ng­êi ta sö dông 2 ph­¬ng thøc nh©n gièng chñ yÕu lµ nu«i cÊy m« ph©n sinh vµ nu«i cÊy m« sÑo. * Nu«i cÊy m« ph©n sinh M« ph©n sinh bao gåm ®Ønh chåi, ®Ønh cµnh, ®Ønh rÔ §Æc ®iÓm cña m« ph©n sinh lµ chøa c¸c tÕ bµo trÎ, ph©n chia m¹nh, l¹i kh«ng bÞ virót x©m nhËp. V× vËy, m« ph©n sinh lµ m« duy nhÊt cña c©y s¹ch virut [11]. §Ó nu«i cÊy m« ph©n sinh, cã thÓ dïng m«i tr­êng White, Murashige vµ Skoog (1962), Gamborg cã bæ sung thªm vitamin, ®­êng, c¸c phytohoocmon. Nu«i cÊy m« ph©n sinh ®­îc sö dông trong c¸c tr­êng hîp: - T¹o ra nh÷ng gièng c©y s¹ch virót tõ nh÷ng gièng bÞ bÖnh (phôc tr¸ng gièng) - Nh©n gièng in vitro. - Nghiªn cøu qu¸ tr×nh h×nh thµnh c¬ quan. * Nu«i cÊy m« sÑo M« sÑo lµ khèi tÕ bµo ph¸t sinh v« tæ chøc vµ cã h×nh d¹ng kh«ng nhÊt ®Þnh víi mµu vµng, tr¾ng hoÆc h¬i xanh. M« sÑo ®­îc h×nh thµnh tõ c¸c m« ®Ønh sinh tr­ëng hay nhu m« vµ nu«i cÊy trªn m«i tr­êng giµu Auxin. Nguyªn liÖu ®Ó t¹o m« sÑo lµ c¸c phÇn non cña c©y, ®­îc ®­a vµo nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr­êng MS, Gamborg vµ cÇn thiÕt thªm c¸c chÊt thuéc nhãm Auxin [3]. Nu«i cÊy m« sÑo ®­îc øng dông trong nhiÒu tr­êng hîp: - Nh©n gièng in vitro ë nh÷ng loµi thùc vËt mµ ph­¬ng ph¸p nh©n gièng b»ng nu«i cÊy ®Ønh sinh tr­ëng Ýt cã hiÖu qu¶ hoÆc kh«ng thùc hiÖn ®­îc. - Lµm nguyªn liÖu cho nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n, thu nhËn c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc - Lµm nguyªn liÖu cho chän dßng tÕ bµo : ®ét biÕn, chän dßng chÞu mÆn - Nghiªn cøu qu¸ tr×nh h×nh thµnh c¬ quan. 1.2.3.3. ¶nh h­ëng cña mÉu nu«i cÊy MÉu dïng trong nu«i cÊy m« - tÕ bµo thùc vËt cã thÓ lµ bÊt cø m«, c¬ quan nµo cña c©y nh­: Chåi bªn, phiÕn l¸, cuèng l¸ C¸c cÊu tróc ph«i nh­ l¸ mÇm, c¸c c¬ quan t­¬ng tù nh­ cñ, c¨n hµnh. KiÓu gen lµ yÕu tè quyÕt ®Þnh tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n sinh tr­ëng trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro. Bªn c¹nh ®ã, kÝch th­íc, nguån gèc vµ tuæi sinh lý cña mÉu nu«i cÊy còng cã ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng t¸i sinh cña m«. Chåi ®Ønh cã kh¶ n¨ng sinh tr­ëng tèt h¬n c¸c m« cã nguån gèc tõ chåi n¸ch [8]. M« lÊy tõ c©y non cã kh¶ n¨ng t¸i sinh cao h¬n c¸c m« lÊy tõ c©y tr­ëng thµnh [7,11]. 1.2.3. 4. ¶nh h­ëng cña m«i tr­êng nu«i cÊy Thµnh c«ng cña nu«i cÊy m« - tÕ bµo phô thuéc rÊt nhiÒu vµo sù lùa chän m«i tr­êng dinh d­ìng, bao gåm c¶ sè l­îng vµ chÊt l­îng ho¸ chÊt sö dông. Nhu cÇu dinh d­ìng cho sinh tr­ëng tèi ­u cña c¸c loµi th­êng rÊt kh¸c nhau, ngay c¶ gi÷a c¸c bé phËn trong cïng mét c¬ thÓ còng cã Ýt nhiÒu sai kh¸c (Murashige and Skoog, 1962)[15]. Cho ®Õn nay hµng tr¨m lo¹i m«i tr­êng dinh d­ìng nh©n t¹o ®· ®­îc x©y dùng vµ thö nghiÖm cã kÕt qu¶ nh­ m«i tr­êng MS (Murashige and Skook, 1962), m«i tr­êng Gamborg (1968), m«i tr­êng Vacxin and Went trong ®ã m«i tr­êng MS ®­îc ®¸nh gi¸ phï hîp nhÊt víi nhiÒu lo¹i thùc vËt. * C¸c chÊt v« c¬ chøa nit¬: §­îc bæ sung vµo m«i tr­êng d­íi d¹ng 2 d¹ng: nitrat (NO3-) vµ amon (NH4+) lµm nguån nit¬. HÇu hÕt c¸c m«i tr­êng ®Òu cã l­îng nitrat nhiÒu h¬n amon vµ th­êng dïng ë nång ®é 25mM nitrat víi 2 – 20mM amon [11]. * Carbon vµ nguån n¨ng l­îng: V× c¸c m« nu«i cÊy kh«ng hoµn toµn tù d­ìng nªn viÖc bæ sung ®­êng lµ cÇn thiÕt [8]. Nguån cacbon ®­îc sö dông nhiÒu trong nu«i cÊy m« tÕ bµo lµ saccharose. Glucose vµ c¸c lo¹i ®­êng kh¸c th­êng nghÌo hi®ratcarbon ®èi víi c©y [8]. * Vitamin: HÇu hÕt c¸c tÕ bµo nu«i cÊy ®Òu cã kh¶ n¨ng tæng hîp tÊt c¶ c¸c lo¹i vitamin cÇn thiÕt nh­ng kh«ng ®Çy ®ñ vÒ sè l­îng. §Ó m« cã søc sinh tr­ëng tèt nhÊt ph¶i bæ sung thªm vµo m«i tr­êng mét hay nhiÒu lo¹i vitamin. Trong ®ã, thiamin (Vitamin B1) ®­îc sö dông réng r·i nhÊt. C¸c vitamin kh¸c, ®Æc biÖt lµ nicotinic acid (Vitamin B3), Pyridoxine (Vitamin B6) vµ canxipantothenate (Vitamin B5), biotin còng ®­îc dïng ®Ó n©ng cao søc sinh tr­ëng [7]. * ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng: HiÖu qu¶ t¸c ®éng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng phô thuéc vµo nång ®é sö dông vµ ho¹t tÝnh vèn cã cña nã, ®ång thêi phô thuéc vµo b¶n chÊt cña mÉu nu«i cÊy. ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng lµ thµnh phÇn quan träng bËc nhÊt cña m«i tr­êng nu«i cÊy, tõ nh÷ng chÊt nµy ng­êi ta cã thÓ chñ ®éng ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i cña thùc vËt in vitro. C¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng gåm 2 nhãm chÝnh lµ Auxin vµ Cytokinin: - Auxin kÝch thÝch h×nh thµnh m« sÑo, rÔ bÊt ®Þnh vµ sù gi·n tÕ bµo; chóng ®­îc sö dông víi nång ®é 10-1 – 10-6M tïy theo tõng chÊt (2.4 – D, IAA, NAA, IBA) [7]. - Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, 2iP) nh÷ng hoocmon nµy liªn quan ®Õn sù ph©n chia tÕ bµo, ph©n ho¸ chåi tõ m« sÑo hoÆc tõ c¬ quan [18]. Cytokinin sö dông víi nång ®é 10-7 – 10-4M. Tû lÖ Auxin/Cytokinin quyÕt ®Þnh sù ph©n ho¸ m« theo h­íng t¹o rÔ, chåi hay m« sÑo. * ChÊt dinh d­ìng h÷u c¬: Mét sè hçn hîp dinh d­ìng phøc t¹p gåm nh÷ng chÊt kh«ng x¸c ®Þnh nh­ n­íc dõa, cèt dõa cµ chua, chuèi, khoai t©y còng ®­îc sö dông ®Ó lµm t¨ng sù ph¸t triÓn cña callus hay c¬ quan cña c©y. * Agar: §èi víi nu«i c©y tÜnh, nÕu sö dông m«i tr­êng láng, m« cã thÓ bÞ ch×m vµ sÏ chÕt v× thiÕu oxy. §Ó kh¾c phôc hiÖn t­îng nµy, m«i tr­êng nu«i cÊy ®­îc lµm ®Æc b»ng agar, mét lo¹i tinh bét ®­îc chÕ tõ rong biÓn vµ m« ®­îc cÊy trªn bÒ mÆt cña m«i tr­êng, agar ®­îc sö dông víi nång ®é tõ 0,6 ®Õn 1%. * §é pH: §é pH cña m«i tr­êng ®­îc ®iÒu chØnh tõ 5,5 ®Õn 6,5 tr­íc khi khö trïng. Nh×n chung, nÕu pH cao sÏ lµm m«i tr­êng bÞ cøng vµ nÕu <5 th× agar khã ®«ng. 1.2.3.5. ¶nh h­ëng cña ®iÒu kiÖn nu«i cÊy * NhiÖt ®é: NhiÖt ®é trong c¸c phßng nu«i cÊy in vitro th­êng ®­îc duy tr× ë 25 ± 20C. ë nhiÖt ®é nµy, ®a sè thùc vËt nu«i cÊy ®Òu sinh tr­ëng, ph¸t triÓn tèt. * ¸nh s¸ng: ¸nh s¸ng cã ¶nh h­ëng m¹nh ®Õn qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i m« nu«i cÊy. Sù ph¸t sinh h×nh th¸i m« nu«i cÊy phô thuéc nhiÒu vµo chu kú, c­êng ®é, thµnh phÇn quang phæ ¸nh s¸ng (Read, 1990, Dooley, 1991). C­êng ®é ¸nh s¸ng tõ 2000 ®Õn 2500 lux ®­îc sö dông phæ biÕn cho nu«i cÊy nhiÒu lo¹i m« [11]. 1.2.3.6. Quy tr×nh nh©n gièng in vitro HiÖn nay nh©n gièng in vitro ®· ®­îc ¸p dông cho rÊt nhiÒu lo¹i thùc vËt. Murashige (1974) ®· chia quy tr×nh nh©n gièng in vitro thµnh 4 giai ®o¹n [1]. * Giai ®o¹n 1: Nu«i cÊy khëi ®Çu (t¸i sinh chåi, côm chåi) §­a mÉu vËt tõ bªn ngoµi vµo nu«i cÊy ph¶i ®¶m b¶o yªu cÇu: tØ lÖ nhiÔm thÊp, tØ lÖ sèng cao, tèc ®é sinh tr­ëng nhanh. KÕt qu¶ nµy phô thuéc nhiÒu vµo c¸ch lÊy mÉu vµ ph­¬ng ph¸p khö trïng mÉu cÊy. * Giai ®o¹n 2: Nh©n nhanh chåi, côm chåi trong ®iÒu kiÖn in vitro Môc ®Ých cña giai ®o¹n nµy lµ t¸i sinh mét c¸ch ®Þnh h­íng c¸c m« nu«i cÊy. Qu¸ tr×nh nµy ®­îc ®iÒu khiÓn chñ yÕu dùa vµo tû lÖ Auxin/Cytokinin ngo¹i sinh ®­îc ®­a vµo m«i tr­êng nu«i cÊy. Môc tiªu quan träng nhÊt cña giai ®o¹n nµy lµ x¸c ®Þnh ph­¬ng thøc nh©n nhanh b»ng m«i tr­êng dinh d­ìng vµ ®iÒu kiÖn khÝ hËu tèi thÝch. * Giai ®o¹n 3: T¹o c©y con hoµn chØnh §©y lµ giai ®o¹n quan träng, môc tiªu chÝnh cña giai ®o¹n nµy lµ t¹o rÔ. Tuy nhiªn, cã nh÷ng loµi kh«ng tr¶i qua giai ®o¹n nµy v× rÔ ®­îc h×nh thµnh ®ång thêi víi qu¸ tr×nh nh©n chåi. * Giai ®o¹n 4: HuÊn luyÖn c©y con, chuyÓn c©y ra v­ên ­¬m §©y lµ giai ®o¹n chuyÓn c©y con in vitro tõ tr¹ng th¸i sèng dÞ d­ìng sang tr¹ng th¸i sèng hoµn toµn tù d­ìng. Thêi gian tèi thiÓu cho sù thÝch nghi lµ 2 – 3 tuÇn. Trong thêi gian nµy ph¶i ®¶m b¶o ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh (nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng, ®é Èm, gi¸ thÓ) phï hîp ®Ó c©y con ®¹t tØ lÖ sèng cao trong v­ên ­¬m còng nh­ trong ruéng s¶n xuÊt. Hoa RÔ Ph«i Th©n §Ønh sinh tr­ëng L¸ Bao phÊn VËt liÖu v« trïng M« MÇm TÕ bµo Chåi Côm chåi C©y hoµn chØnh V­ên ­¬m §­a c©y ra bÇu ®Êt T¹o rÔ Nh©n nhanh T¸i sinh chåi T¹o m« sÑo Khö trïng H×nh 1: S¬ ®å quy tr×nh nh©n gièng thùc vËt in vitro 1.2.3.7. Nghiªn cøu nh©n gièng ho¾c h­¬ng Nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ho¾c h­¬ng ®­îc khai th¸c liªn tôc vµ th­êng xuyªn, nhu cÇu ®èi víi d­îc liÖu ho¾c h­¬ng ngµy cµng t¨ng do nhiÒu t¸c dông ch÷a bÖnh cña nã. Do ®ã, tr÷ l­îng cña c©y gi¶m sót nghiªm träng, viÖc cung cÊp nguyªn liÖu víi sè l­îng lín cã chÊt l­îng æn ®Þnh ®Ó s¶n xuÊt thuèc ®ang trë thµnh nhu cÇu bøc thiÕt. Tr­íc ®©y, ho¾c h­¬ng chñ yÕu ®­îc trång b»ng ph­¬ng ph¸p gi©m cµnh truyÒn thèng. Tuy nhiªn, ch­a cã c«ng tr×nh nµo c«ng bè vÒ kü thuËt nh©n gièng v« tÝnh in vitro ®èi víi c©y thuèc nµy. V× vËy chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®Ò tµi nµy víi môc ®Ých nghiªn cøu x©y dùng mét quy tr×nh nh©n gièng in vitro t¹o c©y con phôc vô cho viÖc s¶n xuÊt nguyªn liÖu ho¾c h­¬ng lµm thuèc. * Quy tr×nh nh©n gièng ph¶i ®¶m b¶o c¸c yªu cÇu : - B¶o toµn ®­îc nh÷ng ®Æc tÝnh di truyÒn cña gièng ho¾c h­¬ng. - §¹t hÖ sè nh©n gièng cao ®Ó ®­a ra ngoµi s¶n xuÊt. - Cã thÓ phôc vô cho viÖc nh©n nhanh c¸c loµi ho¾c h­¬ng cã chÊt l­îng cao. PhÇn ii §èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. §èi t­îng nghiªn cøu Nguån vËt liÖu khëi ®Çu lµ gièng ho¾c h­¬ng ®­îc lÊy tõ v­ên l­u gi÷ gièng c©y thuèc cña ViÖn d­îc liÖu. C¸c chåi ®­îc sö dông lµm vËt liÖu khëi ®Çu cho thÝ nghiÖm t¹o vËt liÖu khëi ®Çu c©y gièng b»ng ph­¬ng ph¸p in vitro. M«i tr­êng dinh d­ìng lµ m«i tr­êng MS – 1962, c¸c chÊt phô gia nh­: C¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr­ëng, th¹ch, ®­êng saccharose, than ho¹t tÝnh, n­íc dõa. ¶nh 1 : C©y ho¾c h­¬ng ngoµi tù nhiªn 2.2. Néi dung nghiªn cøu * Giai ®o¹n khö trïng mÉu: ThÝ nghiÖm 1: ¶nh h­ëng cña HgCl2 0,07% ë c¸c thêi gian kh¸c nhau tíi tû lÖ mÉu sèng cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1 : HgCl2 0,07 % trong 7 phót C«ng thøc 2 : HgCl2 0,07 % trong 10 phót C«ng thøc 3 : HgCl2 0,07 % trong 15 phót ThÝ nghiÖm 2: ¶nh h­ëng cña HgCl2 0,1% ë c¸c thêi gian kh¸c nhau tíi tû lÖ mÉu sèng cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1 : HgCl2 0,1% trong 7 phót C«ng thøc 2 : HgCl2 0,1 % trong 10 phót C«ng thøc 3 : HgCl2 0,1% trong 15 phót * Giao ®o¹n t¹o côm chåi: ThÝ nghiÖm 3: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña BAP tíi kh¶ n¨ng t¹o côm chåi cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1 : MS (®èi chøng) C«ng thøc 2 : MS + 0,5 mg/l BAP C«ng thøc 3 : MS + 1,0 mg/l BAP C«ng thøc 4 : MS + 1,5 mg/l BAP C«ng thøc 5 : MS + 2,0 mg/l BAP ThÝ nghiÖm 4: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña Kinetin tíi kh¶ n¨ng t¹o côm chåi cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1: MS (®èi chøng) C«ng thøc 2 : MS + 0,5 mg/l Kintetin C«ng thøc 3 : MS + 1,0 mg/l Kintetin C«ng thøc 4 : MS + 1,5 mg/l Kintetin C«ng thøc 5 : MS + 2,0 mg/l Kintetin * Giai ®o¹n nh©n nhanh ThÝ nghiÖm 5: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña tæ hîp BAP vµ a- NAA tíi kh¶ n¨ng nh©n nhanh cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1: MS (®èi chøng) C«ng thøc 2 : MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA C«ng thøc 3 : MS + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA C«ng thøc 4 : MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA C«ng thøc 5 : MS + 2,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l a- NAA ThÝ nghiÖm 6: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng tíi kh¶ n¨ng nh©n nhanh cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1: MS + 10g ®­êng C«ng thøc 2 : MS + 20g ®­êng C«ng thøc 3 : MS + 30g ®­êng C«ng thøc 4 : MS + 40g ®­êng * Giai ®o¹n ra rÔ: ThÝ nghiÖm 7: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña a- NAA tíi kh¶ n¨ng ra rÔ cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1: M«i tr­êng MS ( ®èi chøng) C«ng thøc 2: M«i tr­êng MS + 0,5 mg/l a- NAA C«ng thøc 3: M«i tr­êng MS + 1,0 mg/l a- NAA C«ng thøc 4: M«i tr­êng MS + 1,5 mg/l a- NAA C«ng thøc 5: M«i tr­êng MS + 2,0 mg/l a- NAA ThÝ nghiÖm 8: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña IBA tíi kh¶ n¨ng ra rÔ cña c©y ho¾c h­¬ng. C«ng thøc 1: M«i tr­êng MS (®èi chøng) C«ng thøc 2: M«i tr­êng MS + 0,5 mg/l IBA C«ng thøc 3: M«i tr­êng MS + 1,0 mg/l IBA C«ng thøc 4: M«i tr­êng MS + 1,5 mg/l IBA C«ng thøc 5: M«i tr­êng MS + 2,0 mg/l IBA * Giai ®o¹n v­ên ­¬m ThÝ nghiÖm 9: Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña gi¸ thÓ ra c©y tíi tû lÖ sèng cña c©y ho¾c h­¬ng STT Gi¸ thÓ C¸t §Êt C¸t + §Êt (tØ lÖ 1:1) 2.3. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.3.1. Ph­¬ng ph¸p lÊy mÉu MÉu cÊy lµ chåi ®Ønh vµ chåi n¸ch ®­îc röa b»ng n­íc xµ phßng lo·ng cho s¹ch bôi bÈn bªn ngoµi. Röa l¹i b»ng n­íc cÊt nhiÒu lÇn sau ®ã khö trïng b»ng HgCl2 ë c¸c nång ®é vµ thêi gian kh¸c nhau. Mçi c«ng thøc bè trÝ 50 mÉu, ba lÇn nh¾c l¹i. * M«i tr­êng nu«i cÊy - M«i tr­êng c¬ b¶n MS – 1962 cã c¶i tiÕn. - M«i tr­êng cã bæ sung c¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr­ëng víi c¸c tæ hîp ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. - §é pH cña m«i tr­êng ®­îc ®iÒu chØnh tíi 5,8 råi ®­îc khö trïng h¬i ë nhiÖt ®é 1210C trong thêi gian 25 phót. * §iÒu kiÖn nu«i cÊy - C¸c dông cô ®­îc sö dông trong nu«i cÊy: dao, kÐo, panh cÊy ®­îc v« trïng b»ng ngän löa ®Ìn cån. - Tñ cÊy ®­îc v« trïng b»ng ®Ìn tö ngo¹i 15 – 20 phót sau ®ã ®­îc lau s¹ch b»ng cån 700C. - Phßng nu«i nh©n t¹o cã quang chu kú 14 giê s¸ng/10 giê tèi. - C­êng ®é ¸nh s¸ng = 2000 lux - NhiÖt ®é phßng nu«i: 25 ± 20C 2.3.2. Bè trÝ thÝ nghiÖm C¸c thÝ nghiÖm trong phßng ®­îc bè trÝ trong c¸c èng nghiÖm vµ c¸c b×nh tam gi¸c cã dung tÝch 250 ml. Mçi c«ng thøc nh¾c l¹i 3 lÇn, mçi lÇn nh¾c l¹i theo dâi 10 c©y. 2.3.2.1. C¸c chØ tiªu theo dâi. Tæng mÉu chÕt sau cÊy Tû lÖ mÉu chÕt (%) = x 100 Tæng sè mÉu cÊy Tæng sè mÉu nhiÔm Tû lÖ mÉu nhiÔm (%) = x 100 Tæng sè mÉu cÊy Tæng sè mÉu sèng Tû lÖ mÉu sèng(%) = x 100 Tæng sè mÉu cÊy Tæng sè mÉu t¸i sinh Tû lÖ mÉu t¸i sinh (%) = x 100 Tæng sè mÉu cÊy Tæng sè chåi Sè chåi TB/mÉu cÊy) = Tæng sè c©y theo dâi 2.4. Ph­¬ng ph¸p sö lý sè liÖu KÕt qu¶ nghiªn cøu ®­îc sö lý theo ph­¬ng ph¸p thèng kª sinh häc trªn phÇn mÒm Excel [6]. PhÇn iii KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn 3.1. Giai ®o¹n t¹o vËt liÖu khëi ®Çu Khö trïng lµ kh©u b¾t buéc trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro. Do ®ã, ngoµi viÖc lùa chän gièng s¹ch bÖnh tr­íc khi ®­a vµo nu«i cÊy mÉu ph¶i ®­îc khö trïng b»ng ho¸ chÊt víi thêi gian thÝch hîp ®Ó lo¹i bá nÊm vµ vi khuÈn nh­ng kh«ng lµm chÕt mÉu. §Æc biÖt, ho¸ chÊt khö trïng cã ®éc tÝnh cao, dÔ g©y chÕt h¹i c¶ mÉu nu«i cÊy nÕu kh«ng x¸c ®Þnh ®­îc ng­ìng thêi gian chÞu ®ùng. Trong thÝ nghiÖm nµy, chóng t«i sö dông thÝ nghiÖm víi ho¸ chÊt khö trïng lµ: clorua thuû ng©n (HgCl2) ë c¸c nång ®é 0,07% vµ 0,1% trong c¸c thêi gian kh¸c nhau. ThÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh nh­ sau: MÉu ho¾c h­¬ng ®­îc röa b»ng xµ phßng vµ x¶ s¹ch d­íi vßi n­íc ch¶y. TiÕp theo, tr¸ng mÉu nhiÒu lÇn b»ng n­íc cÊt, nhóng qua cån 70% trong vµi gi©y råi khö trïng víi clorua thuû ng©n (HgCl2) cã nång ®é vµ thêi gian kh¸c nhau. Sau thêi gian xö lý, mÉu ®­îc tr¸ng l¹i b»ng n­íc cÊt v« trïng nhiÒu lÇn vµ ®­a vµo m«i tr­êng nu«i cÊy. KÕt qu¶ theo dâi ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng: B¶ng 1: ¶nh h­ëng cña nång ®é HgCl2 vµ thêi gian khö trïng ®èi víi tû lÖ sèng cña c©y ho¾c h­¬ng. ChÊt khö trïng Thêi gian khö trïng(phót) Sè mÉu TN(mÉu) Sè mÉu bÞ nhiÔm(mÉu) TØ lÖ nhiÔm(%) Sè mÉu sèng(mÉu) TØ lÖ mÉu sèng (%) HgCl2 0,07% 7 50 43 86 7 14 10 50 33 66 8 16 15 50 5 10 40 80 HgCl2 0,1% 7 50 38 76 11 22 10 50 4 8 42 84 15 50 0 0 5 10 14 86 16 66 80 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 7 10 15 Tû lÖ sèng(%) Tû lÖ nhiÔm(%) Thêi gian khö trïng (phót) Tû lÖ (%) BiÓu ®å 1: ¶nh h­ëng cña HgCl2 (0,07%) vµ thêi gian khö trïng ®èi víi c©y ho¾c h­¬ng. Thêi gian khö trïng (phót) Tû lÖ (%) 22 76 84 8 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 7 10 15 Tû lÖ sèng(%) Tû lÖ nhiÔm (%) BiÓu ®å 2: ¶nh h­ëng cña HgCl2 (0,1%) vµ thêi gian khö trïng ®èi víi c©y ho¾c h­¬ng. Qua b¶ng 1 vµ biÓu ®å 1, 2 chóng t«i thÊy r»ng: - Khi khö trïng mÉu ho¾c h­¬ng b»ng (HgCl2) ë nång ®é 0,07% víi c¸c thêi gian khö trïng kh¸c nhau kÕt qu¶ cho thÊy, thêi gian khö trïng 15 phót lµ tèt h¬n c¶ mÆc dï kÕt qu¶ khö trïng chØ ®¹t tû lÖ sèng lµ 80%. - §èi víi HgCl2 nång ®é 0,1%, thêi gian khö trïng lµ 7 phót th× tû lÖ nhiÔm cßn cao (76%), ng­îc l¹i thêi gian khö trïng cao (15 phót) th× g©y chÕt mÉu. V× vËy, chóng t«i thÊy thêi gian khö trïng lµ 10 phót lµ thêi gian khö trïng tèi ­u nhÊt, v× cã tû lÖ mÉu nhiÔm thÊp (8%) vµ tû lÖ mÉu sèng cao nhÊt (84%). Tãm l¹i, sö dông HgCl2 0,07% trong thêi gian 15 phót hoÆc HgCl2 0,1% trong thêi gian 10 phót lµ thêi gian khö trïng tèi ­u nhÊt. 3.2. Giai ®o¹n t¹o côm chåi ë giai ®o¹n nµy, mÉu t¸i sinh cã thÓ ph¶n øng víi c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh tr­ëng kh¸c nhau. Do vËy muèn cã tèc ®é nh©n tèi ®a, ph¶i t×m ®­îc m«i tr­êng tèi ­u cho chóng. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu vÊn ®Ò nµy trªn c¸c m«i tr­êng dinh d­ìng gåm kho¸ng, vitamin, ®­êng, th¹ch theo m«i tr­êng MS cã bæ sung chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr­ëng lµ BAP, kinetin. 3.2.1. ¶nh h­ëng cña BAP tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng MÉu cÊy lµ c¸c chåi ®¬n, c¸c thÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh trªn nÒn m«i tr­êng MS (®/c) cã bæ sung BAP víi nång ®é tõ 0,5 – 2,0 mg/l BAP. C¸c kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng: B¶ng 2: ¶nh h­ëng cña BAP tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng STT C«ng thøc m«i tr­êng Sè chåi/mÉu cÊy Tr¹ng th¸i chåi 20 ngµy 40 ngµy 1 MS (®èi chøng) 3,5 ± 0,35 5,0 ± 0,42 + 2 MS + 0,5 mg/l BAP 4,2 ± 0,54 6,7 ± 0,36 + 3 MS + 1,0 mg/l BAP 11,4 ± 0,48 14,3 ± 0,47 ++ 4 MS + 1,5 mg/l BAP 17,1 ± 0,45 19,0 ± 0,46 + + mäng n­íc 5 MS + 2,0 mg/l BAP 17,3 ± 0,41 20,0 ± 0,39 + + mäng n­íc Ghi chó: +: Chåi yÕu + +: Chåi khoÎ 3,5 5 4,2 6,7 11,4 14,3 17,1 19 17,3 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 2 3 4 5 20 ngµy 40 ngµy C«ng thøc m«i tr­êng ChØ tiªu theo dâi BiÓu ®å 3: ¶nh h­ëng cña BAP tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng ¶nh 2: ¶nh h­ëng cña BAP tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng Sè liÖu ë b¶ng 2 cho ta thÊy: Tuú thuéc vµo nång ®é chÊt §TST bæ sung vµo m«i tr­êng nu«i cÊy, c©y ho¾c h­¬ng in vitro cho hÖ sè nh©n gièng kh¸ cao. Trªn m«i tr­êng kh«ng bæ sung chÊt ®iÒu tiÕt sinh tr­ëng sè chåi/mÉu ®¹t 5,0 chåi ( ë giai ®o¹n 40 ngµy sau cÊy). §èi víi c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm, ë giai ®o¹n 20 ngµy sau cÊy sè chåi/mÉu cÊy dao ®éng tõ 4,2 - 17,3 chåi. §Õn giai ®o¹n 40 ngµy sau cÊy sè chåi/mÉu ®¹t cao nhÊt lµ 20,0 chåi ( ë c«ng thøc 5), nh­ng ë c«ng thøc nµy c©y ho¾c h­¬ng rÊt mäng n­íc. Nh­ vËy, ®Ó cã ®­îc hiÖu qu¶ nh©n gièng tèt nhÊt sö dông m«i tr­êng MS cã bæ sung 1,0 mg/l BAP lµm m«i tr­êng nh©n nhanh c©y ho¾c h­¬ng vµ ®Ó kh¾c phôc hiÖn t­îng mäng n­íc cÇn tiÕp tôc tiÕn hµnh thÝ nghiÖm cã bæ xung thªm a- NAA. 3.2.2. ¶nh h­ëng cña kinetin tíi sù t¹o chåi cña c©y ho¾c h­¬ng Kinetin lµ mét Cytokinin th«ng dông, cã nguån gèc tù nhiªn, t¸c dông kÝch thÝch m¹nh ®Õn sù sinh tr­ëng cña c©y trång nªn th­êng ®­îc dïng trong nu«i cÊy m«. Chóng t«i ®· nghiªn cøu sù t¸c ®éng cña kinetin víi nång ®é tõ 0,5 ®Õn 2,0 mg/l ®Õn sù sinh tr­ëng, ph¸t sinh chåi. ThÝ nghiÖm gåm 5 c«ng thøc, mçi c«ng thøc nh¾c l¹i 3 lÇn vµ mçi lÇn nh¾c l¹i theo dâi 10 mÉu. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®­îc tr×nh bµy nh­ sau: B¶ng 3: ¶nh h­ëng cña kinetin tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng. STT C«ng thøc m«i tr­êng Sè chåi/mÉu cÊy Tr¹ng th¸i chåi 20 ngµy 40 ngµy 1 MS (®èi chøng) 3,5 ± 0,56 5,0 ± 0,45 + 2 MS + 0,5 mg/l kinetin 3,7 ± 0,45 4,6 ± 0,56 + 3 MS + 1,0 mg/lkinetin 9,1 ± 0,46 11,5 ± 0,43 ++ 4 MS + 1,5 mg/l kinetin 15,5 ± 0,56 16,8 ± 0,42 + + mäng n­íc 5 MS + 2,0 mg/l kinetin 16,0 ± 0,49 17,5 ± 0,45 + + mäng n­íc Ghi chó: + : Chåi yÕu ++: Chåi khoÎ 3.5 5 3.7 4.6 9.1 11.5 15.5 16.8 16 17.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 2 3 4 5 20 ngµy 40 ngµy C«ng thøc m«i tr­êng ChØ tiªu theo dâi BiÓu ®å 4: ¶nh h­ëng cña kinetin tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng. T­¬ng tù nh­ BAP, kinetin còng cã t¸c dông theo chiÒu t¨ng dÇn nh­ng t¸c dông cña kinetin yÕu h¬n cña BAP. Tèi ­u h¬n c¶ lµ m«i tr­êng MS cã bæ sung 1,0 mg/l kinetin, ë c«ng thøc 5( MS + 2mg/l ) sè chåi/ mÉu ®¹t 17,5 chåi (giai ®o¹n 40 ngµy sau cÊy) vÉn g©y hiÖn t­îng mäng n­íc. Tãm l¹i: Qua 2 thÝ nghiÖm bè trÝ ¶nh h­ëng cña cytokinin ®Õn nh©n chåi ho¾c h­¬ng trªn c¸c d¶i nång ®é BAP vµ kinetin kh¸c nhau, chóng t«i s¬ bé kÕt luËn r»ng: dïng m«i tr­êng MS cã bæ xung 1 mg/l BAP lµm m«i tr­êng nh©n nhanh c©y ho¾c h­¬ng lµ tèt nhÊt. Tuy nhiªn, t¸c dông cña BAP m¹nh h¬n kinetin nªn chóng t«i ®· sö dông BAP trong qu¸ tr×nh nh©n nhanh in vitro. Vµ ®Ó kh¾c phôc hiÖn t­îng mäng n­íc, chóng t«i bè trÝ thÝ nghiÖm tæ hîp BAP vµ a- NAA. 3.3. Giai ®o¹n nh©n nhanh ¶nh 3: ¶nh chåi ho¾c h­¬ng ë giai ®o¹n t¹o côm chåi ë giai ®o¹n t¹o côm chåi, chåi ho¾c h­¬ng bÞ mäng n­íc. V× vËy cÇn bæ sung thªm Auxin ®Ó c©n b»ng dinh d­ìng ®­îc thiÕt lËp 3.3.1. ¶nh h­ëng cña BAP vµ a- NAA tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng Th«ng th­êng, chóng ta kh«ng biÕt râ nång ®é Cytokenin vµ Auxin néi sinh trong c©y. Khi t¨ng nång ®é BAP, sè chåi mÉu t¨ng nh­ng søc sèng cña chåi yÕu h¬n. Bæ xung a- NAA vµo m«i tr­êng lµm cho c¸n c©n ®iÒu tiÕt sinh tr­ëng c©n b»ng trë l¹i, gióp c©y sinh tr­ëng tèt h¬n. C¸c kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng sau: B¶ng 4: ¶nh h­ëng cña BAP vµ a- NAA tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng. STT C«ng thøc m«i tr­êng Sè chåi/mÉu cÊy Tr¹ng th¸i chåi 20 ngµy 40 ngµy 1 MS (®èi chøng) 3,5 ± 0,47 5,0 ± 0,51 + 2 MS + 0,5mg/l BAP+0,2mg/l a- NAA 4,0 ± 0,52 5,7 ± 0,46 + + 3 MS+1,0 mg/l BAP + 0,2mg/l a-NAA 10,1 ± 0,35 13,3 ± 0,34 + + 4 MS+1,5 mg/l BAP + 0,2mg/l a-NAA 13,4 ± 0,045 14,5 ± 0,56 + + + 5 MS+2,0 mg/lBAP+ 0,2mg/l a-NAA 16,1 ± 0,45 20,2 ± 0,45 + + + Ghi chó: + : Chåi yÕu + + : Chåi mËp + + + : Chåi mËp, l¸ xanh ®Ëm 3.5 5 4 5.7 10.1 13.3 13.4 14.5 16.1 20.2 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 20 ngµy 40 ngµy C«ng thøc m«i tr­êng ChØ tiªu theo dâi BiÓu ®å 5: ¶nh h­ëng cña BAP vµ a - NAA tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng. ¶nh 4: ¶nh h­ëng cña BAP vµ a - NAA tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng. Trong thÝ nghiÖm nµy, viÖc bæ sung thªm a- NAA ®· cã t¸c dông râ rÖt tíi tr¹ng th¸i c©y, kh¾c phôc hiÖn t­îng mäng n­íc, chåi mËp, l¸ xanh ®Ëm h¬n. ë c¶ hai giai ®o¹n theo dâi, tèi ­u nhÊt lµ m«i tr­êng m«i MS + 2 mg/l BAP + 0,2mg/l a- NAA, cho sè chåi/ mÉu cÊy gÊp 4 lÇn so víi ®èi chøng (MS). Nh­ vËy, trong khu«n khæ luËn v¨n nµy, cã thÓ s¬ bé kÕt luËn m«i tr­êng MS + 2,0mg/l BAP + 0,2mg/l a- NAA cho hÖ sè nh©n gièng c©y ho¾c h­¬ng cao nhÊt. 3.3.5. ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng M« thùc vËt lµ c¬ quan dÞ d­ìng trong ®iÒu kiÖn in vitro. V× vËy ®­êng lµ thµnh phÇn thiÕt yÕu trong m«i tr­êng nu«i cÊy. Lo¹i ®­êng hay ®­îc sö dông lµ sacclarose, v× trong m«i tr­êng dinh d­ìng, ®­êng nhanh chãng bÞ thuû ph©n thµnh fructose vµ glucose nhê enzyme invertase ë thµnh tÕ bµo hoÆc c¸c enzim ngo¹i bµo. §©y lµ nh÷ng ®­êng ®¬n ®­îc thùc vËt chuyÓn ho¸ dÔ dµng ®Ó cung cÊp n¨ng l­îng cho c¸c ho¹t ®éng sèng. §Ó nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy in vitro c©y ho¾c h­¬ng, chóng t«i bè trÝ thÝ nghiÖm theo c¸c c«ng thøc: 10 – 20 – 30 – 40g ®­êng (nÒn m«i tr­êng lµ MS + 1,0mg/l BAP + 0,2mg/l a- NAA). Mçi c«ng thøc cÊy 10 b×nh, 3 lÇn nh¾c l¹i, mçi lÇn nh¾c l¹i theo dâi 10 c©y. C¸c kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy nh­ sau: B¶ng 5: ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng (ë c¸c giai ®o¹n kh¸c nhau) STT C«ng thøc m«i tr­êng Sè chåi/mÉu cÊy Tr¹ng th¸i chåi 20 ngµy 40 ngµy 1 MS +10g/l ®­êng 5,5 ± 0,45 7,7 ± 0,32 + 2 MS + 20 g/l ®­êng 7,0 ± 0,36 9,7 ± 0,54 + + 3 MS + 30 g/l ®­êng 7,3 ± 0,54 9,9 ± 0,42 + + 4 MS + 40 g/l ®­êng 5,9 ± 0,51 8,8 ± 0,37 + Ghi chó: + : Chåi yÕu + +: Chåi mËp 5.5 7.7 7 9.7 7.3 9.9 5.9 8.8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 20 ngµy 40 ngµy C«ng thøc m«i tr­êng ChØ tiªu theo dâi BiÓu ®å 6: ¶nh h­ëng cña nång ®é ®­êng tíi sù t¹o chåi c©y ho¾c h­¬ng (ë c¸c giai ®o¹n kh¸c nhau) Nh×n vµo biÓu ®å 6 cã thÓ thÊy, ®­êng biÓu diÔn chiÒu cao chåi t¨ng nhanh tõ møc 20 – 30g/l ®­êng. Sau ®ã t¨ng kh«ng ®¸ng kÓ ë c«ng thøc cã bæ sung 40g/l ®­êng. Tuy nhiªn sù kh¸c nhau vÒ sè chåi ë c¸c nång ®é ®­êng l¹i rÊt râ rÖt. Trong ®ã, møc ®­êng 30 g/l cho tû lÖ chåi ph¸t sinh cao nhÊt. MÆt kh¸c, ®Ó gi¶m chi phÝ trong nu«i cÊy m« vµ gãp phÇn h¹ gi¸ thµnh c©y gièng, nªn sö dông m«i tr­êng MS cã bæ xung 20g/l ®­êng lµ c«ng thøc m«i tr­êng cã hiÖu qu¶ ®èi víi sù ph¸t sinh chåi. 3.4. Giai ®o¹n ra rÔ, t¹o c©y hoµn chØnh Sau giai ®o¹n nh©n nhanh chåi, khi chóng ta cã ®ñ sè l­îng chåi cÇn thiÕt, th× giai ®o¹n tiÕp theo ph¶i t¹o rÔ cho chåi, tøc lµ t¹o c©y con hoµn chØnh ®Ó chóng cã thÓ sèng, ph¸t triÓn ë ®iÒu kiÖn tù nhiªn bªn ngoµi. Trong nu«i cÊy in vitro, auxin ®ãng vai trß ®iÒu khiÓn sù h×nh thµnh rÔ ë hÇu hÕt c¸c loµi thùc vËt. Mét sè c©y cã thÓ ra rÔ ngay trong m«i tr­êng MS. V× vËy, chóng t«i bè trÝ thÝ nghiÖm cã bæ sung a NAA, IBA ë c¸c nång ®é kh¸c nhau trªn nÒn m«i tr­êng dinh d­ìng c¬ b¶n (MS) vµ 0,5g/l than ho¹t tÝnh. 3.4.1. ¶nh h­ëng cña a - NAA ®èi víi qóa tr×nh t¹o rÔ c©y ho¾c h­¬ng. C¸c thÝ nghiÖm bè trÝ víi thang nång ®é lµ 0mg/l; 0,5mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l vµ 2,0 mg/l a - NAA. C¸c kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng d­íi ®©y: B¶ng 6: ¶nh h­ëng cña a - NAA ®èi víi qóa tr×nh t¹o rÔ c©y ho¾c h­¬ng (kÕt qu¶ theo dâi 30 ngµy sau khi cÊy) STT C«ng thøc m«i tr­êng Tû lÖ ra rÔ (%) Sè rÔ/ mÉu (ChiÕc) ChiÒu dµi rÔ (cm) Tr¹ng th¸i rÔ 1 MS (®/c) 27,06 1,53 ± 0,45 1,70 ± 0,26 + 2 MS + 0,5 mg/l a - NAA 68,25 2,57 ± 0,23 3,15 ± 0,46 ++ 3 MS + 1,0 mg/l a - NAA 95,35 5,10 ± 0,53 3,47 ± 0,15 ++ 4 MS +1,5 mg/l a - NAA 84,26 4,46 ± 0,25 3,20 ± 0,64 + 5 MS + 2,0 mg/l a - NAA 55,42 4,13 ± 0,41 3,00 ± 0,47 + Ghi chó: +: RÔ m¶nh ++: RÔ mËp BiÓu ®å 7: ¶nh h­ëng cña a - NAA tíi tû lÖ ra rÔ c©y ho¾c h­¬ng ( kÕt qu¶ theo dâi 30 ngµy sau khi cÊy) ¶nh 5: ¶nh h­ëng cña a - NAA ®èi víi qóa tr×nh t¹o rÔ c©y ho¾c h­¬ng (kÕt qu¶ theo dâi 30 ngµy sau khi cÊy) Tû lÖ ra rÔ lµ mét trong nh÷ng chØ tiªu quan träng ®¸nh gi¸ qu¸ tr×nh t¹o c©y con hoµn chØnh trong èng nghiÖm. Tû lÖ nµy cµng cao chøng tá hiÖu qu¶ cña quy tr×nh c«ng nghÖ nh©n gièng in vitro cµng lín. C¸c kÕt qu¶ ë b¶ng 6 chØ ra r»ng, trªn m«i tr­êng MS, tû lÖ ra rÔ rÊt thÊp ®¹t 27,06%. Tû lÖ ra rÔ cao nhÊt ë m«i tr­êng cã bæ sung 1,0 mg/l a - NAA, sau ®ã gi¶m dÇn khi nång ®é a - NAA lªn tíi 1,5 mg/l vµ 2,0 mg/l. §iÒu cã nghÜa lµ khi bæ sung nång ®é a - NAA qu¸ cao sÏ øc chÕ qóa tr×nh ra rÔ cña c©y. ë c«ng thøc 3 (MS + 1,0 mg/l a - NAA), tû lÖ ra rÔ ®¹t 95,35% vµ ë c«ng thøc nµy, ngoµi tû lÖ ra rÔ cao cßn cã sè rÔ/c©y nhiÒu (5,1 rÔ/c©y). §©y còng lµ mét trong nh÷ng chØ tiªu quan träng v× nã ¶nh h­ëng trùc tiÕp ®Õn sinh tr­ëng cña c©y ë giai ®o¹n sau èng nghiÖm. Trong khu«n khæ thÝ nghiÖm nµy, cã thÓ nãi r»ng m«i tr­êng cã bæ sung 1,0 mg/l a - NAA lµ m«i tr­êng tèt nhÊt cho qóa tr×nh ra rÔ, t¹o c©y hoµn chØnh. 3.4.2. ¶nh h­ëng cña IBA ®èi víi qóa tr×nh t¹o rÔ c©y ho¾c h­¬ng Trong thùc tÕ c¶ IBA vµ a - NAA ®Òu cã t¸c dông t¹o c©y hoµn chØnh nh­ng IBA cã t¸c dông m¹nh h¬n. VËy víi c©y ho¾c h­¬ng th× kh¶ n¨ng t¹o rÔ cña IBA ra sao? Chóng t«i ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu t­¬ng tù nh­ a - NAA. B¶ng 7: ¶nh h­ëng cña IBA ®èi víi qu¸ tr×nh t¹o rÔ c©y ho¾c h­¬ng (kÕt qu¶ theo dâi 30 ngµy sau khi cÊy) STT C«ng thøc m«i tr­êng Tû lÖ ra rÔ (%) Sè rÔ/ mÉu (ChiÕc) ChiÒu dµi rÔ(cm) Tr¹ng th¸i rÔ 1 MS + 0,1 mg/l IBA 29,00 1,90 ± 0,24 1,70 ± 0,41 + 2 MS + 0, 5 mg/l IBA 82,10 3,20 ± 0,54 3,50 ± 0,32 ++ 3 MS + 1,0 mg/l IBA 96,70 5,21 ± 0,63 4,90 ± 0,37 ++ 4 MS +1,5 mg/l IBA 87,30 4,89 ± 0,37 4,20 ± 0,56 + 5 MS+ 2,0 mg/l IBA 75,00 3,92 ± 0,35 3,80 ± 0,62 + Ghi chó: +: RÔ m¶nh + +: RÔ mËp BiÓu ®å 8: ¶nh h­ëng cña IBA tíi tû lÖ ra rÔ c©y ho¾c h­¬ng (kÕt qu¶ theo dâi 30 ngµy sau khi cÊy) T­¬ng tù nh­ a - NAA, khi bæ sung mét l­îng IBA vµo m«i tr­êng lµm cho c©n b»ng phyto hoocmon ®­îc thiÕt lËp nghiªng vÒ phÝa kÝch thÝch sù ra rÔ. C©y ho¾c h­¬ng ra rÔ m¹nh nh­ng l­îng Auxin bæ sung qu¸ cao øc chÕ sù ra rÔ cña c©y. ë c¸c c«ng thøc thÝ nghiÖm, tû lÖ ra rÔ giao ®éng tõ 29,00 – 96,70%. ë c«ng thøc 2 vµ c«ng thøc 3 c©y ho¾c h­¬ng cã bé rÔ khoÎ, mËp. ë c¸c c«ng thøc 4, c«ng thøc 5, kh¶ n¨ng h×nh thµnh bé rÔ cña c©y tuy vÉn kh¶ quan h¬n c«ng thøc 1 nh­ng chÊt l­îng bé rÔ m¶nh, yÕu vµ l¹i ph¶i chi phÝ nhiÒu ho¸ chÊt kÝch thÝch sinh tr­ëng. Tãm l¹i: Dïng m«i tr­êng MS cã bæ sung 1,0 mg/l a - NAA hoÆc 1,0mg/l IBA lµ tèt nhÊt cho qóa tr×nh t¹o rÔ in vitro trong phßng thÝ nghiÖm. 3.5. ChuyÓn c©y ra bÇu C©y con cña ho¾c h­¬ng sau khi cã ®ñ th©n, rÔ, l¸ ®­îc ®­a ra khái phßng nu«i, më nót b×nh vµ ®Ó 3-5 ngµy cho c©y quen víi ®iÒu kiÖn tù nhiªn. Sau ®ã, chóng ®­îc lÊy ra khái b×nh, röa s¹ch m«i tr­êng, trång vµo gi¸ thÓ trÊu hun ®· ®­îc röa s¹ch, ®Æt trong lång nylon tù t¹o vµ phun mï víi tÇn suÊt 15 phót/ 2 giê. ThÝ nghiÖm ®­îc tiÕn hµnh trªn c¸c nÒn gi¸ thÓ nh­ sau: 1. C¸t 2. §Êt phï sa 3. C¸t + ®Êt phï sa (tû lÖ 1:1) §Æt c©y trong nhµ kÝnh, nhµ l­íi cã hÖ thèng phun n­íc, quan s¸t ®o ®Õm tû lÖ sèng chÕt ë thêi ®iÓm 30 ngµy. C¸c kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy nh­ sau: B¶ng 8: ¶nh h­ëng cña c¸c gi¸ thÓ ra c©y tíi tû lÖ sèng cña c©y ho¾c h­¬ng invitro STT Gi¸ thÓ ra c©y Tû lÖ sèng (%) Tû lÖ chÕt (%) Tr¹ng th¸i c©y 1 C¸t 75,9 24,1 + + 2 §Êt 56,3 43,7 + 3 C¸t + ®Êt 80,7 19,3 + + BiÓu ®å 9: ¶nh h­ëng cña c¸c gi¸ thÓ ra c©y tíi tû lÖ sèng cña c©y ho¾c h­¬ng in vitro Sè liÖu b¶ng trªn cho thÊy: còng nh­ c©y ho¾c h­¬ng ngoµi tù nhiªn, c©y ho¾c h­¬ng in vitro khi ®­a ra ngoµi v­ên ­¬m còng thÝch hîp trªn nÒn gi¸ thÓ c¸t + ®Êt (tû lÖ 1:1). ë gi¸ thÓ nµy, tû lÖ sèng cña c©y ®¹t 80,7%; trªn nÒn gi¸ thÓ c¸t tû lÖ sèng ®¹t 75,9%. C©y sinh tr­ëng kÐm nhÊt ë gi¸ thÓ ®Êt ( 56,3%), mÆc dï so víi nhiÒu c©y trång kh¸c th× tû lÖ nµy vÉn lµ cao. Nh­ vËy, gi¸ thÓ ra c©y ho¾c h­¬ng in vitro b»ng hçn hîp c¸t + ®Êt (tû lÖ 1:1) lµ thÝch hîp cho viÖc ra c©y. Tuy nhiªn, muèn cã tû lÖ sèng cao h¬n cÇn chó ý ch¨m sãc b¶o vÖ c©y cÈn thËn, nhÊt lµ kh©u t­íi n­íc. S¬ ®å quy tr×nh nh©n nhanh in vitro c©y ho¾c h­¬ng §o¹n th©n Chåi Khö trïng mÉu (b»ng dung dÞch HgCl2 (0,07%) trong 15 phót hoÆc HgCl2 (0,1%) trong 10 phót) Côm chåi Ra rÔ, t¹o c©y hoµn chØnh T¹o rÔ (MS +1 mg/l a - NAA) Nh©n nhanh chåi (MS + 2 mg/mlBAP + 0,2mg/mla - NAA+ 20g/l ®­êng V­ên ­¬m Gi¸ thÓ c¸t + ®Êt (tû lÖ 1:1) phÇn iv kÕt luËn, tån t¹i vµ ®Ò nghÞ 4.1. KÕt luËn: 1. MÉu ®èt th©n ho¾c h­¬ng khö trïng b»ng dung dÞch HgCl2 0,07% trong thêi gian 15 phót hoÆc dung dÞch HgCl2 0,1% trong thêi gian 10 phót cho tû lÖ sèng cao nhÊt (®¹t tõ 80 – 84%). 2. M«i tr­êng thÝch hîp ®Ó cÊy khëi ®éng chåi ho¾c h­¬ng lµ MS + 1,0 mg/l BAP. Trªn m«i tr­êng nµy cho sè chåi/®èt cÊy lµ 14,3 chåi (ë giai ®o¹n 40 ngµy sau cÊy), chåi ho¾c h­¬ng kh«ng bÞ mäng n­íc. 3. M«i tr­êng thÝch hîp ë giai ®o¹n nh©n nhanh cña ho¾c h­¬ng lµ MS + 2 mg/l BAP + 0,2mg/l a - NAA + 20g/l ®­êng, chåi ho¾c h­¬ng kh«ng bÞ mäng n­íc. 4. M«i tr­êng thÝch hîp ®Ó ra rÔ, t¹o c©y hoµn chØnh lµ MS +1 mg/l a - NAA hoÆc MS + 1mg/l IBA. 5. C©y con cña ho¾c h­¬ng in vitro cã thÓ ®­a ra v­ên ­¬m qua giai ®o¹n trång trong c¸t + ®Êt (tû lÖ 1:1) ®¹t tû lÖ sèng trªn 80%. 4.2. Tån t¹i: - Ch­a cã sè liÖu so s¸nh vÒ hiÖu qu¶ kinh tÕ cña ph­¬ng ph¸p nh©n in vitro víi ph­¬ng ph¸p truyÒn thèng (gi©m cµnh). - Ch­a cã sè liÖu theo dâi vÒ tèc ®é sinh tr­ëng cña c©y ho¾c h­ong trång tõ nguån c©y gièng lµ c©y in vitro vµ c©y gi©m cµnh truyÒn thèng. 4.3. §Ò nghÞ: C©y ho¾c h­¬ng lµ mét trong nh÷ng c©y thuèc cã gi¸ trÞ trong ch÷a bÖnh. CÇn tiÕp tôc nghiªn cøu n©ng cao hiÖu qu¶ kinh tÕ cña kh©u trång trät ®Ó ph¸t triÓn lo¹i c©y thuèc nµy lµm nguyªn liÖu chÕ t¹o thuèc vµ ®a d¹ng ho¸ c©y trång, t¨ng nguån thu cho ng­êi n«ng d©n. Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng ViÖt: 1. T¹ Nh­ Thôc Anh (2002). Nghiªn cøu c«ng nghÖ nh©n nhanh c©y trinh n÷ hoµng cung, luËn v¨n th¹c sÜ khoa häc, §¹i häc quèc gia Hµ Néi - §¹i häc khoa häc tù nhiªn. 2. Lª TrÇn §øc (1997), C©y thuèc ViÖt Nam, trång h¸i vµ chÕ biÕn, trÞ bÖnh ban ®Çu, NXB N«ng nghiÖp Hµ Néi. 3. Kü thuËt trång vµ chÕ biÕn d­îc liÖu (1979), NXB N«ng nghiÖp I, Hµ Néi. 4. §ç TÊt Lîi (1999), Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam, NXB Y häc, Trang 838 – 836. 5. Vò TriÖu M©n vµ céng t¸c viªn (1986) “Nghiªn cøu bÖnh virus h¹i khoai t©y miÒn B¾c ViÖt Nam”, TuyÓn tËp c«ng tr×nh nghiªn cøu khoa häc kü thuËt N«ng nghiÖp, Tr­êng ®¹i häc N«ng nghiÖp I, Hµ Néi. 6. Chu V¨n MÉn (2001), øng dông tin häc trong sinh häc, NXB §¹i häc quèc gia Hµ Néi, Trang 118 – 126 7. Hoµng Minh TÊn, NguyÔn Quang Th¹ch (1993), ChÊt ®iÒu hoµ sinh tr­ëng víi c©y trång, NXB N«ng nghiÖp Hµ Néi . 8. NguyÔn Quang Th¹ch (2001), C«ng nghÖ sinh häc trong trång trät – Gi¸o tr×nh sau ®¹i häc. 9. ViÖn D­îc liÖu (1976), Kü thuËt trång c©y thuèc, NXB Y häc, Hµ Néi . 10. ViÖn D­îc liÖu (1990), C©y thuèc ViÖt Nam, NXB Khoa häc Kü thuËt, Hµ Néi 11. Vò V¨n Vô (1999), Sinh lý thùc vËt, NXB gi¸o dôc, Hµ Néi. TiÕng Anh: 12. Asolkar, LV., Chadha, Y.R (1979),Diosgenon and other steroid Drug Precursors, Publicaonsn and information derctorate, CSIR. Delhi. 13. Bhojwani S.S, Razdan, M.K (1983), Plant tisue culture – Theory and practive, Elsvier Academic Publ,. Amsterdam. 14. Carlson R.F. (1964), Dwarf fruit trees, Mich. Arg. Ext. Serv.Bull, pp. 432. 15. Murashige, T., and R. Skoog. (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”. Phys. Plant. 15: 473 – 497 16. Murashige, T., (1980), Plant Growth Substances in commercial uses of tissue culture. In: Plant Growth Substaces 1979, ed. by F. Skoog. Springer – Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp.426 – 434. TiÕng Ph¸p 17. Van der Zaag. D.E. Plantes de pomme de terre Sources d’approvisionnement et traitement. Brochure de vulgaristion VIVAA.