Đề tài Nguồn thu nhận và ứng dụng enzyme protease

n), loại proteinaza xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptit, trong đó có nhóm - CO - của các axit amin thơm và axit amin kị nước. - Chymotrypsin là enzim tiêu hoá của dịch tuỵ, góp phần phân giải protein trong ruột non. - Ở tuyến tuỵ, chymotrypsin được tổng hợp ở dạng không hoạt động là chymotrypsinogen, sau đó chuyển thành dạng hoạt động dưới tác dụng của chymotrypsin hoặc tripxin. - Trung tâm hoạt động của a-chymotrypsin bao gồm nhóm hydroxyl của Ser - 195, imidazol của His-57 và nhóm carboxyl của Asp-102. Các gốc này ở khá xa nhau trong chuỗi polypetid nhưng giữa các nhóm chức năng của chúng chỉ cách nhau từ 2,8 - 3,0Å. 2) Hoạt động - Alpha - chymotrypsin là enzym thủy phân protein có tác dụng xúc tác chọn lọc đối với các liên kết peptid ở liền kề các acid amin có nhân thơm. - Chymotripsin chứa trong dịch tụy ở dạng chưa hoạt động là chymotripsinogen. Dưới tác động của enzyme trypsin và chymotrypsin, chymotrypsinogen biến thành dạng hoạt động. Enzyme này hoạt động tối ưu ở pH = 8,0, chúng thủy phân liên kết peptid có nhóm -CO- thuộc amino acid nhân thơm (Phe, Tyr và Trp). 3) Nguồn cung cấp - Alpha chymotrypsin là enzym được điều chế bằng cách hoạt hóa chymotrypsinogen, chiết xuất từ tụy bò. - Tìm thấy ở cơ thể động vật có xương sống bậc thấp và côn trùng. - Trích từ tuyến tụy của heo. - Enzym từ cây cỏ thực vật có nguồn gốc từ trái cây nhiệt đới như trái thơm. - Từ phế phụ liệu lò mổ động vật để sử dụng trong công nghệ thực phẩm 4) Ứng dụng - Enzym thủy phân protein trợ giúp phẫu thuật. - Enzym này được dùng trong nhãn khoa để làm tan dây chằng mảnh dẻ treo thủy tinh thể, giúp loại bỏ dễ dàng nhân mắt đục trong bao và giảm chấn thương cho mắt. - Dung dịch enzym 1:5.000 thường có tác dụng phân hủy dây chằng treo thủy tinh thể trong khoảng 2 phút và dung dịch 1: 10.000 trong khoảng 4 phút. - Chymotrypsin cũng được sử dụng nhằm giảm viêm và phù mô mềm do áp xe và loét, hoặc do chấn thương và nhằm giúp làm lỏng các dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, các bệnh phổi và viêm xoang. - Chymotrypsin dùng hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng. Dùng trong điều trị phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ. - Giảm đau, hạ sốt, kháng viêm. - Đẩy nhanh hoạt động tuyến bã và đào thải chất ứ. III. CHYMOSIN (RENNIN) 1) Định nghĩa - Thuộc loại aspartic acid protease - lL enzim proteolytic làm đóng cục sữa bằng cách làm đông cazein của nó. - thường ở dạng dung dịch, bột hoặc viên. - có thể chứa muối (ví dụ, clorua natri, clorua canxi, sunphat natri), còn lại từ quá trình sản xuất hoặc phụ vào cho chuẩn hoá, và chất bảo quản (ví dụ, glycerol). 2) Hoạt động - hoạt động trong môi trường acid yếu (pH 5,0 - 5,3) và cần sự có mặt của Ca++ - Renine làm đông vón sữa bằng cách biến caseinogen thành caseinate calcium - Rennin bẻ gãy liên kết peptide giữa phenylalanine và methionine của casein trong sữa, gây đông tụ sữa nhưng không lảm thủy phân sâu sắc 3) Nguồn cung cấp - được lấy từ những con bê nuôi bằng sữa. - Sau khi làm thịt, ngăn bao tử thứ tư trong dạ cỏ được lấy ra và đổ hết những thức ăn chứa bên trong. Sau đó phần bao tử này được qua nhiều tiến trình bao gồm ướp muối khô, rửa, cạo mỡ bề mặt, kéo căng trên khung để lấy hết hơi ẩm, sau đó cuối cùng là xay và trộn với một dụng dịch muối cho đến khi chiết ra được men dịch vị (rennet) - Phương pháp hiện đai hơn dùng hệ enzyme đặc hiệu để tách rennin từ bao tử bê 4) Ứng dụng - Chủ yếu dùng trong công nghệ làm pho mát. Người ta đang cố gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay thế một phần rennin - Dùng sản xuất các loại sữa đông IV. PEPSIN 1) Cấu tạo - Là enzim được tách ra từ dịch vị hoặc từ tế bào chính của dạ dày động vật (vd. dạ dày lợn) - có phân tử khối khoảng 35.000 - Điểm đẳng điện khoảng pH = 1 2) Hoạt động : - Là xúc tác cho quá trình thuỷ phân một số liên kết peptit nhất định trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptit phân tử thấp. - Tiền enzim là pepsinogen do dạ dày tiết ra ở dạng không có hoạt tính xúc tác. - Dưới tác dụng của axit clohiđric (HCl) (hay ion H+) hoặc chính của bản thân Pepsin xúc tác, pepsinogen được hoạt hoá thành hoạt động. - Thuỷ phân mạnh các liên kết peptit nối mạch do các nhóm amin của các axit amin thơm trong phân tử protein và peptit tạo thành, sản phẩm được tách ra là các peptit chứa 5 - 8 axit amin và một ít axit amin tự do. - Hoạt động trong môi trường axit, thích hợp nhất trong khoảng pH 1,5 - 2; ở điều kiện này Pepsin không bền do có sự tiêu enzim ( 1 gam pepsine của dịch dạ dày có thể thủy phân 50 kg albumine trứng trong vòng 2 giờ ở những điều kiện thích hợp.) - Có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạt lực của P thấp; từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease. - Pepsine có thể thủy phân collagen và elastine nhưng không thủy phân keratin của tóc, lông và các protein đơn giản có nguồn gốc thực vật 3) Nguồn gốc : - Pepsin được sản xuất nhờ phương pháp chiết suất hoặc tự phân. - Enzim hoạt động lấy từ dịch vị hoặc từ các dịch tự phân, dịch chiết được kết tủa bằng dung môi hoặc muối trung tính rồi sấy khô ở nhiệt độ thấp. 4) Ứng dụng : - Nghiên cứu protein - Điều chế môi trường nuôi vi sinh - Sản xuất phomat - Làm đồ uống để chữa một số bệnh về đường tiêu hoá. - Men tiêu hoá T-pepsin : là sự phối hợp giữa pepsin và thiamin nitrat + Men Pepsin có tác dụng làm tăng khả năng dung nạp và tiêu hoá protid ở thực phẩm kích thích tiêu hoá và hấp thụ chất đạm nhất là thức ăn giàu chất đạm. + Thiamin nitrat (vitamin B1) là Coenzym thúc đẩy quá trình chuyển hoá glucoza ở hệ thần kinh, hệ thống tiêu hoá và tim mạch. + Ngoài tác dụng trực tiếp đến quá trình tiêu hoá, men còn có tác dụng điều hoà PH dịch vị à có tác dụng tốt trong điều trị đau dạ dày và các trường hợp cần phẫu thuật dạ dày. + Tiêu hoá tốt, ăn ngon miệng, tăng cân, chóng phục hồi sau khi ốm. ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT I. NGUYÊN NHÂN PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP NÀY: Sản xuất enzym theo qui mô công nghiệp chủ yếu dựa vào vi sinh vât.So với động vật và thực vật,VSV có rất nhiều ưu điểm.Những ưu điểm đó được tóm tắt như sau: 1. Tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh: _Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh khối rất lớn. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tạo sinh khối ở VSV cao gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật. Để đạt được tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, VSV phải chuyển hóa một khối lượng cơ chất rất lớn. Cũng từ những nghiên cứu trên E.coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong vòng 24h, vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn lần khối lượng cơ thể chúng. Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng hợp ra được lượng enzym rất lớn. Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzym đảm nhận. Chính vì thế, nếu sử dụng VSV như nguồn sinh học để sản xuất enzym rất có lợi. Trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu enzym nội bào) mà còn thu được lượng enzym ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất cao. 2. Enzym thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao: _Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát triển của VSV. 3. VSV là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp: _Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzym từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được. 4. Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm: _Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm giá thành sản xuất ở mọi nơi trên thế giới. 5. VSV có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau: _Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả mọi chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzym khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt. Trong khi đó, cơ thể đa bào được phân hóa thành các cơ quan riêng, mỗi một cơ quan (hay mô bào) thực hiện những chức năng riêng. Chính vì thế, ở động vật và thực vật, việc khai thác enzym có giới hạn ở một vài enzym nhất định. _Đặc điểm này vừa có lợi và vừa bất lợi cho kỹ thuật tinh chế sau này. Có lợi vì khi ta sử dụng một loạt phản ứng sinh hóa cần có sự chuyển hóa liên tục theo một chuỗi phản ứng, ta không cần phải sử dụng nhiều nguồn enzym khác nhau. Nhưng nếu ta chỉ cần thực hiện một phản ứng, đòi hỏi phải làm tinh sạch enzym này bằng cách loại các enzym không cần thiết khác. Nhiều trường hợp công việc này rất phức tạp và tốn kém. Do đó, những enzym sau khi được tinh sạch người ta thường ứng dụng trong y học, trong phân tích và trong kỹ thuật di truyền. Trong công nghệ thực phẩm, người ta chỉ sử dụng các loại chế phẩm enzym tương đối sạch sẽ và thế phẩm enzym thô. II. TỔNG QUÁT: 1. Enzyme protease của vi sinh vật là một protease ngoại bào: Enzyme này khác với Protease của thực vật(fixin,Papain,Bromelin) và động vật (Tripxin,Pepxin,Renin) hơn nữa nó còn có tính đặc hiệu rộng rãi - Chế phẩm Protease tinh khiết từ vi khuẩn Bacillus có thể thủy phân hòan tòan nhiều Protein.Chế phẩm này có tên gọi là Subtilizin.Khi tác dụng trên Cazein thì họat độ sẽ đạt cực đại khi PH trung hòa - Điều đáng chú ý là các chế phẩm Protease từ những vi khuẩn này còn có khả năng làm đông sữa bằng chế phẩm từ Bacillus mesentericus này. - Ngòai ra,một số chế phẩm protease của vi khuẩn còn có họat độ elastaza,nghĩa là chỉ có thể thủy phân các liên kết Peptit kế liền bên gốc axit amin trung tính.Đây cũng là điểm khác biệt với Protease của nấm mốc. 2. Protease là nhóm enzyme thủy phân: liên kết peptide của protein, pepetid tạo ra các sản phẩm như peptone, đi-tri-peptide, acid amin.Protease của VSV có đủ loại, tùy theo pH thích hợp ta chia ra protease trung tính, kiềm acid. - Trong côngnghiệp, người ta có thể thu protease từ nguồn *Nấm mốc: Asp.moryzae, Asp.flavus,Asp.fumigatus, Asp.Oryzae, … *Vi khuẩn: ac.Subtilispha, Bac.Cireulans, Bac.Sphaericus, Bac.Thermophilus, Bac. Aerothermophilus… *Xạ khuẩn : Str. Griseus, Str. Rimosus, Str. Fradiae, Str. faecais…. - Protease vsv có đặc điểm là hoạt động được trong khoảng pH khá rộng, chúng tổng hợp được cả 2 loại enzym endo và exo – peptidase, do vậy thủy phân được tới 80% liên kết peptide - Protease của vi khuẩn hoạt động trong vùng pH hẹp hơn (7-8) so với vsv (2-11). Chế phẩm protease từ mốc đen (Asp.niger,Asp.awamori) có pH tối ưu 2.5 – 3 - Còn chế phẩm mốc vàng có pH tối ưu lân cận 6.5 - Chế phẩm enzym từ vi khuẩn Bac.subsilis khả năng thủy phân tốt protein gọi tên subtilizin, Bacillus mensetericus thủy phân protit đến acid amin và đông tụ được sữa có thể ứng dụng để thay thế 1 phần rennin trong sản xuất phomat, một số chế phẩm từ vi khuẩn có elactase có khả năng làm mềm thịt - Protease cũng như amilase có ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp,đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm 3. Ứng dụng: Những chế phẩm này đều được sản xuất từ các loại nấm mốc,vi khuẩn. Protease được ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp nhưng nhiều nhất là ngành công nghiệp thực phẩm như: - Công nghiệp đồ hộp thịt: có tác dụng làm mềm thịt như enzym elastaza keratiza…Chế phẩm enzym này thường lấy từ canh trường nuôi xạ khuẩn actimomyces faradise.Người ta ngâm thịt,hay tim enzim vào thịt,với liều lượng nồng độ,PH,nhiệt độ nhất định,sau một thời gian nhờ sự thủy phân một phần protein(mô liên kết) làm thịt mềm ra. - Trong công nghiệp sữa : Các chế phẩm từ vi khuẩn(Bac.mesentericus) hay từ nấm mốc(Asp.candidus,Mucor) có họat tính enzym tương tự Renin có thể thay thế một phần cho Renin(từ 25-50%) - Từ tháng 7-2003, dưới sự hướng dẫn của thạc sĩ trưởng khoa Đỗ Thị Ứng Sao và thầy Hoàng Xuân Thế, giảng viên của khoa, các bạn đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình tinh sạch cho dịch enzyme protease acid thu nhận được từ hai điều kiện nuôi cấy bề mặt và bề sâu của nấm mốc Aspergillus awamori 9 để ứng dụng chúng trong sản xuất phô mai. - Phô mai là một sản phẩm lên men từ sữa, rất giàu giá trị dinh dưỡng, được sản xuất chủ yếu nhờ enzyme rennin cung cấp từ dạ dày bê con. Thời gian gần đây, do sản lượng phô mai tăng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng đã dẫn đến sự thiếu hụt nguồn cung cấp enzyme rennin. - Từ đó, các nghiên cứu khoa học đã được tiến hành nhằm tìm ra nguồn enzyme thay thế cho việc giết mổ bê con. Và nhóm nấm mốc Aspergillus awamori đã được chú ý bởi có khả năng sinh ra enzyme protease acid gây đông tụ sữa cao. Vì thế, việc nghiên cứu tinh sạch và ứng dụng các chế phẩm enzyme protease acid thu nhận từ nấm mốc dùng cho sản xuất phô mai đã được tiến hành rộng rãi ở các nước châu Âu, Nhật Bản và Hoa Kỳ... - Đặc biệt trong công nghệ sản xuất nước chấm như nước tương,tương hột, chao…đều sử dụng chế phẩm protease từ vi sinh vật. - TS Trần Bích Lam (Bộ môn vi sinh Đại học Bách khoa TPHCM) cũng cho biết để sản xuất nước tương có tới 3 phương pháp công nghệ: công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công nghệ enzym. Phương pháp công nghệ vi sinh có thể sử dụng nguồn enzym protease do vi sinh vật sinh ra trong quá trình lên men. Đặc điểm là hiệu suất thủy phân thấp, thời gian thủy phân kéo dài, sản phẩm khó bảo quản, mùi vị thường bị đắng. Còn để sản xuất nước tương “sạch” hoàn toàn thì phương pháp lên men là tối ưu nhưng cần có thời gian đầu tư mặt bằng, dây chuyền thiết bị và nhất là làm sao cho người tiêu dùng quen dần với mùi vị nước tương lên men - Trong công nghiệp hương liệu mỹ phẩm,dùng chế phẩm protease pha lẫn xà bông, dầu gội đầu,kem chải tóc…làm cho tóc mềm mại,loại bỏ biểu bì đã chế t(sạch gầu). - Trong chế biến các loại bột giặt: Ngày nay, enzym được dùng nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy vết bẩn protein, vết máu, vết hồ... - Trong sản xuất tơ tằm,dịch enzym Protease từ nấm mốc vi khuẩn có tác dụng làm bóng sợi tơ,tách rời các sợi tơ tằm do thủy phân lớp xerixin(là một protit). Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên(luợng xerixin sấp xỉ 30%), làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. - Trong công nghiệp thuộc da: Dùng chế phẩm Protease thô từ VSV có thể dùng trong thuộc da,tách lông,làm mềm da(chủ yếu phá bỏ colagen,protit trong da). Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi colagen. Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút ngắn được quá trình tẩy lông. Lượng lông thu được tăng lên khoảng 25 ¸ 30% so với khi sử dụng phương pháp hóa học.Ở Mỹ chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. - Trong y học: Chế phẩm Protease để điều chế dịch thủy phân Protein dùng làm môi trường nuôi vi sinh vật(ví dụ Pepton).Cô đặc tinh chế huyết thanh kháng độc(huyết thanh miễn dịch) III. NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE: - Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease.Các enzym này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy.Một số protease nội bào đã sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp ,trong nông nghiệp và y học.Các lọai VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease được trình bày : VSV Ghi chú Vi khuẩn Bac. subtilispha Bac. cireulans Bac. sphaericus Bac. thermophilus Bac. aerothermophilus Bac.thermoacidurans Bac.thermoproteoly ticus Bac.brevis Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium Cl.perfingens Cl.histolyticum Cl.sporogens Ps.aeruginosa Protease trung tính, protease kiềm(subtilizin) Protease kiềm Protease trung tính Protease trung tính, Protease acid Protease acid và protease kiềm Colagenase Protease trung tính, Protease kiềm Xạ Khuẩn Str. griseus Str. rimosus Str. fradiae Str. faeca is Str.reetus var. pro-teolyticus Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, M ỹ, gồm ít nhất là 11 enzym với cơ chất procolagen phân giải 70% đến amino acid có 5 protease, 2 peptidase (lơxinamino-peptidase, cacboxypeptidase), 2 protease: protease-serin. Nấm mốc Asp. oryzae Asp. sato Asp. awamorl Asp. niegr Asp. shirousami Asp. fumigatus Asp. tericola Asp. candidus Asp. ocharaceus Asp. sojae Asp. flavus Pen. janthinellum Pen. chrysogenum Mucor. pusillus Rh. chinensis Rh. delemar Rh. niveus Rh. nodous Rh. pseudokinensis Rh. peka Phymatorrichum omnivorum Protease-kim loại protease serin,có 3 loại protease acid,protease trung tính,protease kiềm.Protease acid(aspergilopepti-dase A) Protease acid Hai protease acid Protease acid Hai protease:protease acid và protease kiềm Protease acid có tác dụng làm đông sữa Protease trung tính Protease kiềm Hai protease:protease kiềm và protease trung tính Protease acid Protease kiềm Protease acid có tác dụng lám đông sữa được dung ở Nhật thay cho rennin IV. ĐẶC ĐIỂM VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE VI SINH VẬT: - Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều.Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất.Căn cứ vào cơ chế phản ứng,pH hoạt đông thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành 4 nhóm như sau:Protease-xerin; protease-thiol; protease-kim loại;protease-acid - Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm,dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm:Protease-acid,protease trung tính,protease kiềm. - Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của amino acid.Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng.Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé nhất là protease-xerin. - Các protease-xerin có trọng lực vào khoảng20.000-27.000 dalton.Tuy nhiên, cũng có một số protease-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn nhu các enzyme của Penicillium cyoneo-fulvum(44.000),Asp.oryae OUT 5038(52.000).Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin( vào khoảng 33.800-48.400 ).Protease-tiol và nhiều loại protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000. - Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm protease này ở bảng sau: NHÓM NGUỒN ENZYME CHẤT KÌM HÃM ĐẶC ĐIỂM TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG pH tối thích Protease Xerin Bac.subsilis Bac.pumilus Str.tradiae Art.hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.sojae E.coli Xerin Proteinasetiol Streplococcus Clostridium histoly-ticum Lodoaxeta-mit Ps.cloromer-curbenzoat -SH 7.5 7.0 Protease Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac.subtilisamy Losaccarilicis Bac.megaterium Pseudomonasaeruginosa Atreptomyces naraensis Asp.oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolyticum EDTA++ 1,10ota-fenantrolin Proteinse Acid Asp.niger Asp.awamori Asp.sailoi,Peniccillum Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pusillus Endothia parasilica Diazoaxetil DI norlox-inmetil este COOH acid - Cách phân loại trên được nhiều tác giả nhất trí và được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, trong thời gian sau này, số protease vi sinh vật nghiên cứu ngày càng nhiều, ngày càng nhận được nhiều enzyme mang các tính chất trung gian của các nhóm kể trên,nhất là giữa nhóm 1 và nhóm 3.Do đó người ta bắt đầu có ý kiến về cách phân loại trên.Năm 1975,Morihara đã thừ phân loại protease vi sinh vật được chia thành 4 nhóm lớn,dựa vào tính đặc hiệu của nó đối với cơ chất thích hợp hoặc đối với chuỗi b-insulin đã bị oxy hóa: *Nhóm một có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở về phía nhóm – CO2 của liên kết peptit,do dó còn được gọi là carboxyendopeptidase *Nhóm ba có tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid về phía nhóm –NH- cùa liên kết peptit(aminoendopeptidase). *Nhóm thứ tư có đặc hiệu đối với các gốc amino acid ở cả hai phía của liên kết peptit - Mỗi nhóm này được phân thành các nhóm nhỏ dựa vào tính đặc hiệu của chung và một số tính chất khác - Nói chung,tính đặc hiệu của các protease không chỉ thể hiện đôí với gốc amino acid chứa nhóm –CO-hoặc nhóm –NH- của liên kết bị phân giải(đặc hiệu sơ cấp) mà còn cả đối với các gốc amino acid ở xa liên kết bị phân giải(đặc hiệu thứ cấp hoặc tương tác thứ cấp.Các enzyme cùng một nhóm, có tính đặc hiệu giống nhau cũng chịu ảnh giống nhau của tương tác thứ cấp.Nói chung,các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp ít hơn và ngược lại.Chẳng hạn các protease-xerin giống trpysine của Streptomyces, protease kim loại trung tính,…thường ít chịu ảnh hưởng của tương tác thứ cấp khi chúng tác dụng với cơ chất phân tử bé cũng như các peptit phân tử lớn hoặc protein.Ngược lại,các protease-xerin kiềm hoặc protease acid chiụ ảnh hưởng lớn của tương tác thứ cấp mặc dù các enzyme này có tính đặc hiệu nghiêm ngặt đối với cơ chất phân tử bé.Khi tác dụng trên các cơ chất phân tử lớn tính đặc hiệu của các enzyme này cũng đựơc xác định bởi tương tác thứ cấp - Các protease vi sinh vật mới được nghiên cứu từ năm 1960.Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rông quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng protease trong thực tế V. Một số loài vi sinh vật tổng hợp Enzym Protease: 1.Bacillus: a\ Đặc trưng,đặc tính: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: firmicutes - Bộ: Bacillales - Họ: Bacillacease - Các loài: Bac. subtilispha Bac. cireulans Bac. sphaericus Bac. thermophilus Bac. aerothermophilus Bac.thermoacidurans Bac.thermoproteoly ticus Bac.brevis Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium - Hình dạng: hình que - Hiếu khí bắt buộc - Bacillus thuộc loại vi khuẩn Gram dương nhưng nhiều bào tử có thể chuyển sang Gram âm vào những giai đoạn phát triển nào đó. - Trong tự nhiên, Bacillus bao gồm 2 loại là: loại gây bệnh và loại sống tự do. - Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt tế bào có khả năng sinh nội bào tử,chúng tồn tại ở dạng thể nghỉ trong suốt thời gian dài - Hai loại Bacillus được xem là có ý nghĩa trong y học là B.antharasis, vi khuẩn gây bệnh than và B.cereus cũng gây bệnh giống với Staphylococcu; B,thurigiensis được dùng để tiêu diệt côn trùng. Hai loại cơ bản nữa là B.subtilis và B.coagulans, chúng là nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm. b\ Nhu cầu dinh dưỡng và sự phát triển: b.1\ Nhu cầu dinh dưỡng: - Hầu hết Bacillus là sinh vật dị dưỡng hóa học,chúng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ khác nhau như:đường, amino acid, acid hữu cơ.Trong vài trường hợp chúng lên men carbohydrat qua một loạt các phản ứng để tạo glycerol và rượu butanediol - Một vài loại như vi khuẩn Bacillus megaterium không cần các chất hữu cơ để phát triển.Những loại khác có thể cần đến amino acid hoặc Vinamin B, hoặc có loài cần cả hai - Phần đông chúng là những sinh vật ưa ấm với khoảng nhiệt tối ưu từ 30oC-45oC, tuy nhiên cũng có loại chịu nhiệt với khoảng nhiệt tối ưu là 65oC b.2\ Sự phát triển: - Vi khuẩn Bacillus dễ dàng được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm vi khuẩn học - Cách đơn giản để tạo ra những bào tử hiếu khí là dùng phương pháp diệt khuẩn Pasteur một mẫu đất ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút.Sau đó đặt nó lên môi trường Agar giàu dinh dưỡng ( pepton:5g/l. nước chiết thịt bò: 3g/l, Agar 15g/l ; pH=6,8 ), và để ở to 37oC từ 24h đến vài ngày.Chúng có thể tạo bào tử trong vòng 24h nhưng có thể quan sát kích thước và hình dạng của những bào tử này ta phải đợi từ 5 đến 7 ngày - Các loại B.lariase, B.popilliae, B.lentimorbis thì khó khăn để nuôi cấy hơn.Chúng phải được nuôi trên loại J-Agar ( tryptone: 5g/l ,nước chiết nấm men: 15g/l ,K2HPO4: 3g/l, glucode 2g/l, agar 20g/l, pH=7,4) - Nhu cầu dinh dưỡng trung bình của Bacillus megaterium: Thành phần Lượng Sucrose 10g K2HPO4 2,5g KH2PO4 2,5g (NH4)2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,2g FeSO4.7H2O 0,01g MnSO4.7H2O 0,007g H2O 985ml Hỗn hợp có pH=7 - Người ta nuôi vi khuẩn trên môi trường CFB(cuttlefish power) và nhận thấy chúng sinh trưởng và sản xuất protease tốt trên môi trường này, điều này chứng tỏ vi khuẩn đã sử dụng nguồn C và N có trong môi trường để sinh trưởng và sản xuất protease.Ngoài ra, khi cho thêm vào môi trường FWW(fishery wastwaters) được pha loãng, các quá trình này lại được tăng trưởng, đặc biệt với môi trường FWW thêm vào được pha loãng 5- 10 lần, hiệu suất quá trình có thể lên đến 467% và 75%( đối với B.cereus BGL và B.subtilis) - Hồ tinh bột và (NH4)2SO4 là nguồn C và N tốt nhất cho vi sinh vật, ngoài ra CaCO3 cũng làm thúc đẩy sự sản xuất protease - Bacillus proteolyticus: + Sản xuất protease kiềm + Điều kiện tối thích để phát triển và sản xuất protease là: .to=37oC .pH=9 .thời gian 96h +protease sinh ra có độ hoạt động ở 40oC đến 50oC, mất 20% hoạt tính ở 60oC.Phân tử lượng vào khoảng 29kD, nó có tác dụng ngăn chặn sự sinh trưởng của sinh vật gây bệnh như:Escherichia coli,Cisteria manocytogenes, Bacillus cereus và Tersinia eterocolytica.Phương pháp quang phổ (SEM) cho thấy protease sẽ ảnh hưởng đến những tế bào của sinh vật gây bệnh này. 2.Penicillium: : a\Đặc trưng đặc tính - Giới : nấm - Ngành: Ascomycota - Lớp : Ecurotiomycetes - Bộ : Eurotialles -Họ : Trichocomaceae -Các loài : Pen. janthinellum Pen. Chrysogenum - Nấm Penicillium dễ nhận biết bởi cấu trúc của nó giống những cây bụi mang bào tử - Bào tử được sinh ra trên một túi ở phía đỉnh , chưa trưởng thành chúng có màu xanh - Hình dáng dạng nhánh là đặc trưng để nhận biết với các loại khác nấm Penicillium.Vài loài không có nhánh chúng chỉ gồm một bao túi phía trên cuống (hình trên cùng) - Một số loài khác có mang những cụm nhánh, mỗi nhánh mang túi chứa bào tử (hình bên trái) - Loại thứ ba chúng cũng có nhiều nhánh, và từ mỗi nhánh đó lại có thêm nhiều nhánh con và ở đỉnh cũng có túi mang bào tử - Penicillium sinh sản vô tính , không có khả năng sinh bào tử trong điều kiện khắc nghiệt , có bề mặt kị nước tuy nhiên vẫn có khả năng bị ẩm ướt , tạo điều kiện để mọc mầm . - Penicillium có thể phát triển tốt trong hai môi trường thiếu nước và hàm lượng nước cao - Penicillium là chủng sinh vật phổ biến rộng rãi chúng ta có thể gặp ở mọi nơi, chúng chiếm đa số trong giới nấm b\ Penicillium trong đời sống: - Sự xuất hiện phổ biến của Penicillium trong thức ăn là vấn đề đáng quan tâm, vài loài trong số đó sinh chất độc làm thức ăn hư hỏng dẫn đến nguy hiểm.Sự xuất hiện của Penicillium làm chúng ta phải bỏ các thực phẩm này - Penicillium là sinh vật dị dưỡng, là nhân tố phá hủy trái cây, chúng tạo nên lớp màng màu xanh bao bên ngoài , sản sinh etylen kích thích sự chín của trái cây , một số loài làm trái cây khô, quéo lại, có khi xuất hiện lớp màng nhầy bên ngoài, nhiệt độ thấp là thích hợp cho hoạt động của các loài này nên ta có thể thấy hiện tượng trái cây bị hư như vậy khi để quá lâu trong tủ lạnh - Tuy nhiên vài loài Penicillium lại có ích cho con người. Những loại pho mát như: Roquefort, Brie, Camembert, Stilton…được làm chín với việc sử dụng vài loài nấm Penicillium và chúng khá an toàn khi sử dụng. -Loại thuốc Penicillin được sản xuất từ Penicillium chrysogenum,là thuốc phổ biến có trong hầu hết tủ thuốc của mọi gia đình 3.Pseudomonas: a\Đặc trưng, đặc tính: - Giới : vi khuẩn - Ngành : proteobacteria - Lớp: gramma proteobacteria - Bộ : Pseudomonadales - Họ : Pseudomonadacease - Các loài: Ps.aeruginosa - Vi khuẩn hình que - Thuộc loại Gram âm - Có một hay nhiều cực mang tiêm mao,đây là cơ quan chuyển động của vi khuẩn - Thuộc loại vi sinh vật hiếu khí - Không sinh bào tử - Thí nghiệm dương với catalase - Một đặc tính cơ bản của các loài Pseudomonas ( có những loài ngoại lệ) là khả năng tạo huỳnh quang. Ở điều kiện chứa Fe nhất định, chúng sinh chất huỳnh quang màu vàng xanh. Dĩ nhiên, nhiều loài khác nhau tạo những chất khác nhau. Ví dụ, Pseudomonas aeruginosa tạo “ pyocyanin” Pseudomonas fluorescens tạo thioquinolobactin. - Pseudomonas aeruginosa được nghiên cứu vì khả năng gây bệnh cơ hội ở người. Pseudomonas syringae là mầm sinh bệnh thực vật… - Những yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sản xuất enzyme protease + T0 : từ 37 đến 45oC + pH : 6.0 đến 9.0, tốt nhất để sản sinh protease ở pH=7.0.Môi trường trung tính tốt hơn môi trướng axit và kiềm + Enzyme có độ hoạt đông cao ở môi trường tĩnh với dung dịch kháng sinh nồng độ 4.0%(v/v).Ở nồng độ 6.0 đến 10.0% sẽ làm giảm độ hoạt động của enzyme ( nếu thay đổi môi trường tĩnh bằng môi trường động ) b.Sự hình thành lớp màng sinh học – “Biofilm” - Ngoài sự phân loại đã kể trên, gần đây người ta phát hiện thêm loại Pseudomonas có lớp màng sinh học bên ngoài. lớp màng dó chính là polysaccharide ngoại bào. Sự có mặt của lớp màng này giúp vi khuẩn chống lại sự ăn thịt của những sinh vật khác, giúp chúng bám dính ở vị trí cố định. - Sự sinh trưởng của Pseudomonas trên những thực phẩm bị hư tạo ra mùi thơm trái cây. - Pseudomonas có khả năng chuyển hoá nhiều loại chất dinh dưỡng khác nhau. Kêt hợp với lớp màng sinh học bên ngoài, chúng có khả năng sống ở những điều kiện môi trường khác nhau ( chẳng hạn môi trường chứa bã xà phòng ). 4.Rhizopus: a.Đặc trưng, đặc tính. - Giới : nấm. - Ngành : zygomycota. - Lớp : zygomycetes - Bộ : mucorales. - Họ : mucoraceae - Chi : Rhizops. - Loài : Rh. chinensis Rh. delemar Rh. niveus Rh. nodous Rh. pseudokinensis Rh. peka - Rhizopus là giới nấm sợi nhỏ được tìm thấy nhiều nơi như trong đất, hoa quả hư, phân động vật, bánh mì cũ. Vài loài Rhizopus đôi khi gây ra các bào tử nấm gây bệnh. Chúng tạo sự nhiễm trùng quan trọng ở người và động vật vì chúng phát triển với tần số rất nhanh. Vài loài là mầm bệnh thực vật, ngoài ra, Rhizopus oligosporus, còn là loài nấm được sử dụng trong việc sản xuất những sản phẩm lên men từ đậu nành. b.Sự sinh sản và phát triển. - Rhizopus sinh sản theo hai cách : + Bào tử kín sinh ra bên trong một cấu trúc hình chóp nhọn, chúng mang di truyền từ cha mẹ. + Bào tử tiếp hợp được sản sinh khi hai sợi nấm tiếp hợp nhau trong suốt quá trình phiên bản giới tính, sau đó phát triển thành hệ sợi và cơ thể mang di truyền khác cha mẹ. - Rhizopus sinh trưởng rất nhanh. bởi vì thế, nếu chúng được nuôi trong phòng thí nghiệm, chúng sẽ phát tán khắp cả phòng trong vài ngày. - Có loài còn có thể chuyển đậu nành ra nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, chúng đựơc sử dụng nhiều ở các nước châu Á. 5.Clostridium: a.Đặc trưng, đặc tính. - Giới : vi khuẩn. - Ngành : Firmicutes - Lớp : Clostridia. - Bộ : Clostridiales. - Họ : Clostridiaceal. - Chi : Clostridium. - Loài : Cl.perfingens Cl.histolyticum Cl.sporogens - Clostridium là vi khuẩn Gram dương thuộc ngành Firmicutes. - Chúng là vi sinh vật kị khí bắt buộc, có khả năng sinh bào tử,những tế bào riêng rẽ hình que. - Đây là những tính chất đặc trưng của clostridium nhưng chúng không mang ý nghĩa cho cả hệ thống sinh vật này, nhiều loài có nguồn gốc từ clostridium đã di chuyển đến một nơi khác. b.Clostridium trong đời sống. - Clostridium có thể sống ở dạng tự do hay chúng có thể là mầm sinh bệnh. Chúng có các loài chính liên quan đến những căn bệnh của con người: + C. botulinum, một loại sinh độc tố trong thức ăn, gây ra ngộ độc thực phẩm. + C. perfringens, là nguyên nhân gây bệnh hoại thư hay bệnh độc huyết ở cừu, dê. + C. tetani, vi sinh vật gây bệnh uốn ván. - Một số loài khác bao gồm C. acetobutylicum, còn gọi là sinh vật Weizmann, vì lần đầu tiên được sử dụng để sản xuất thuốc nổ TNT, bột súng. - C. sordelli là nguyên nhân dẫn đến cái chết của những sản phụ sau khi sinh. - C. thermocellum có thẻ sản xuất rượu ethanol góp phần vào công nghiệp sản xuất rượu. chúng không đòi hỏi O2, và là vi sinh vật chịu nhiệt. 6.Aspergillus. Aspergillus là một trong khoảng 200 giống nấm mốc được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên. Aspergillus được liệt vào danh mục lần đầu tiên năm 1729 bởi một linh mục, một nhà sinh vật học người Ý Pietro Antonio Mocheli. Quan sát chúng dưới kính hiển vi, dựa vào hình dáng của chúng ông đã đặt tên cho chúng là Aspergillus. a.Đặc trưng, đặc tính. - Giới :nấm. - Nghành : Ascomycota - Lớp : Eurotiomycetes. - Bộ : Eurotiales. - Họ :Trichocomaceae. - Chi : Aspergillus - Loài : Asp. oryzae Asp. sato Asp. awamorl Asp. niegr Asp. shirousami Asp. fumigatus Asp. tericola Asp. candidus Asp. ocharaceus Asp. sojae Asp. flavus - Mốc Aspergillus đã được dùng phổ biến trong sản xuất nước tương , nước chấm ở các nước phương đông từ lâu đời. giống mốc nầy có hệ vi khuẩn ( hế sợi ) không màu hoặc vàng nhạt. Có hai loại khuẩn ty : khuẩn ty ký sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường đặc biệt ( còn gọi là khuẩn ty cơ chất ). Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân.cuống dính bào tử không phân nhánh dài và thẳng đầu có nhiều cuống nhỏ. Tuỳ loại có nhiều cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng. Tất cả các cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai. Khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. các đính bào tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần. Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng từng toả tròn trên chóp nang. Đính bào tử điển hình thường hình cầu đơn bào, đa hạch, bề mặt xù xì. Do cuống sinh bào tử và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc. Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là : vàng, vàng lục, đen, tro nâu … b.Sự phát triển và phân bố. - Aspergillus là sinh vật hiếu khí cao, sống trong môi trường giầu oxi. Trong môi trường, chúng sinh trưởng ở dạng nấm mổc trên bề mặt cơ chất để hấp thu được lượng O2 nhiều nhất. - Thông thường, nấm sinh trưởng ở trên những cơ chất giầu cacbon như monosaccharide ( glucose ), polysacchyride ( amylose ). - Aspergillus có thể gây nhiễm những thực phẩm giàu tinh bột ( như bánh mì, khoai tây ), chúng sinh trưởng trên nhiều loài thực vật. - Ngoài việc sinh trưởng trên cơ chất giàu cacbon, nhiều loài Aspergillus có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng hay ngay cả thiếu những chất dinh dưỡng quan trọng. - A.niger là ví dụ điển hình, quan trọng. Chúng có thể sinh trưởng trên những bức tường ẩm. - Ứng dụng nổi tiếng của A.niger là nguồn sản xuất axit citric rất lớn . sinh vật này giúp cho vịêc sản xuất khoảng 99% lượng axit citric toàn thế giới hay hơn 4,5 triệu tấn trên một năm. - Aspergillus niger thường gọi là mốc đen. sợi mốc màu trắng dính bào tử màu đen.từ cuống đàu tiên mọc ra thêm 2- 4 cuống nhỏ rồi mới mọc tiếp đến các dính bào tử. mốc sinh ra các enzym amylaza, invectaza, maltaza, proteaza, pectinaza, glucozooxydaza. mốc này dùng trong sản xuất rượu, sản xuất axit xỉtic, axit fumaric. Proteaza do mốc này sinh ra hoạt động ở pH 2.5- 3,5 , còn protease của A. oryzae không hoạt động ở vùng pH này. - A.niger cũng được sử dụng phổ biến để sản xuất enzym, bao gồm gluco oxydase và lysozyme lòng trắng trứng. Trong trường hợp này việc nuôi cấy híêm khi được thực hiện trên cơ chất đặc, dù phương pháp này vẫn còn phổ biến ở Nhật, nó được nuôi cấy phổ biến trong môi trường nuôi cấy chìm, với tác nhân sinh học. Bằng cách này các thông số quan trọng nhất được điều chỉnh chính xác và đạt hiệu suất cao. Dùng phương pháp này ta có thể dễ dàng tách riêng các hoá chất hay enzym từ môi trường nuôi cấy, điều này càng làm tăng hiệu suất. 7.Streptomyces: - Giới : vi khuẩn. - Nghành : Actinobacteria. - Bộ : Actinomycetales - Họ : Streptomycetaceae. - Chi : Streptimyces. - Loài : Str. griseus Str. rimosus Str. fradiae Str. faeca is Str.reetus var. pro-teolyticus . - Streptomyces thuộc nhóm vi sinh vật Gram dương, có khả năng sinh bào tử, chúng được tìm thấy nhiều trong đất, rau quả bị hư. - Streptomyces có mùi đặc trưng, như mùi đất. Chất này được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. - Streptomyces được đặc trưng bởi một loại biến thể thứ hai phức tạp. chúng sản xuất ra một lượng lớn kháng sinh được dùng trong điều trị bệnh. Thuốc streptomycin hiện nay đã được sử dụng hạn chế là do bắt nguồn từ streptomyces. Streptomyces ít khi là tác nhân gây bệnh. VI. TRUNG TÂM HỌAT ĐỘNG: - Trong trung tâm họat động của các Protease VSV ngòai gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác.Ví dụ His thường tham gia trong trung tâm họat động của các protease-xerin,Protease-tiol,Tyrosine,trong trung tâm họat động của các Protease kim lọai - Trung tâm họat động của các Prôtease VSV đủ lớn và bao gồm một số gố amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim lọai.Marihara và tập thể (1969-1970) xác định rằng trung tâm họat động của các subtilisin có kích thước giống nhau,vào khỏang 18 A0,tương ứng với 5-6 gốc amino acid. - Các Protease kim lọai có trung tâm họat động lớn hơn váo khỏang 21 ○A Đối với các Protease acid,theo nhiều tác giả đã nghiên cứu cấu trúc trung tâm họat động của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt,giữa chúng có khe hở vào khỏang 20 ○A.Khe hở này là phần xúc tác của enzym,các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.Dây có lẽ là kiểu cấu túc trung tâm họat động đặc trưng chung cho các Protease acid.Ngòai nhóm –COOH theo Ichishida và Yoshiđa1986),gốc Tryptophan cũng đóng vai trò quan trọng đối với Aspergilopeptidase A - Đối với các Protease không chứa cysteine,trung tâm họat động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. - Mặc dù trung tâm họat động của các Protease VSV có khác nhau nhưng các ezym này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E - S E - S + P1 E + P2 E là enzim S là cơ chất E-S là phức chất enzym-cơ chất P1 là sản phẩm đầu tiên của phản ứng(với nhóm amine tự do mới được tạo thành P2 là sản phẩm thứ hai của phản ứng(với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành) - Theo một số tác giả,cơ chế tác dụng của các protease VSV cũng giống với Protease xezin động vật,đều tiến hành theo kiểu xúc tác acid-bazơ theo sơ đồ của Polgar và Bender (1969).Proteinase acid của VSV có lẽ xúc tác cho phản ứng theo cơ chế giống với pepsin. VII. CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM PROTEASE: Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu Protease VSV đã góp phần mở rộng qui mô sản xuất chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong thực tế.Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng của Protease. - Để thu nhận chế phẩm Protease từ VSV cũng như các enzym khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt (phương pháp nổi) và phương pháp bề sâu(phương pháp chìm).Phương pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm sợi,phương pháp bế sâu thường dùng đối với vi khuẩn và nấm sợi. - Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng,sử dụng phương pháp bề mặt kinh tế hơn.Vì vậy các cơ sở sản xuất enzym mới xây dựng thường dùng phương pháp này.Hiện nay phương pháp bề mặt được sử dụng rộng rãi ở ở Nhật. Khi sử dụng phương pháp bề sâu thường dễ bị nhiễu hơn hơn phương pháp bề mặt - Ở phương pháp bề mặt, người ta thường sử dụng môi trường có độ ẩm và giữ ở nhiệt độ không đổi.Trong suốt quá trình nuôi,độ ẩm của môi trường vào khỏang 50-55%w.Nhiệt độ nuôi cấy tùy thusộc vào VSV,đối với nấm sợi trong thời gian đầu từ 10-18 giờ giữ ở 29-30 ○C, sau khi có mixen thì giảm nhiệt xuống còn 24-25 0C.Đối với vi khuẩn, nhiệt độ thích hợp là 37-38 0C. Một số môi trường thích hợp cho VSV tổng hợp protease ngoại bào Thành phần môi trường(%) Vi sinh vật Tác giả 1- Tinh bột khoai tây 2.00 Nước chiết ngô 1.00 (NH4)2HPO4 0.90 CaCl2 0.10 KCl 0.50 MgSO4 0.15 2- Bột ngô 3.00 Nước chiết ngô 0.50 CaCl2 0.10 (NH4)2HPO4 0.90 Bac.meentericus Inlis, 1969 Nước chiết ngô 0.32 Cám lúa mì 3.31 Bột khoai tây 2.18 CaCO3 0.20 Bac.mesentericu Gatrep và Luisk, 1970 Dịch thủy phân enzyme 0.30 Glucose 1.00 MgSO4.7H2O 0.05 KH2PO4 (tính theo phospho) FeCl3.6H2O vệt Bac.subtilis Ortrosoko, 1977 Chứa 50mmg phospho Bột ngô 2.00 Bột đậu tương 1.00 Nấm men ăn 0.50 Nước chiết ngô 0.30 CaCO3 0.20 Asp.oryzae 8FK Konovalov, 1972 pH ban đầu 6.25 pH cuối cùng 8.25 Bột mì 2.00 KH2PO4 0.500 MgSO4 ZnSO4 0.600 FeSO4 Casein 0.100 Asp.awamori 78.2 Asp.oryzae 8F - 1 Konovalov Sakhov, 1972 Bột đậu tương 1.120 Nước chiết ngô 0.670 CaCO3 0.100 Asp.oryzae 8F - 1 Gatrep, Vojno, 1970 Bột đậu tương 1.000 Tinh bột 4.000 KH2PO4 (NH4)2HPO4 0.065 ZnSO4.7H2O 0.002 FeSO4.7H2O 0.001 MnCl2.4H2O 0.001 Acl.Fradiae Konovalov, 1972 Glucose 7.001 C6H5O7Na3 0.425 KH2PO4 (NH4)2HPO4 0.125 ZnSO4.7H2O 0.001 FeSO4.7H2O 0.002 MgSO4.7H2O 0.575 Act.Sphereides Egorov và tập thể, 1976 Pepton 0.500 Nước chiết nấm men 0.500 Casein thủy phân 0.100 NaCl 0.500 Fructose hoặc maltose 1.000 Str.olivaceus Wojskowiez J. 1977 pH = 7.2 1. Nuôi cấy nô bắng phương pháp bề mặt: - Môi trường thường dùng là cám,có PH từ 5.6-6.2(đối với nấm sợi) hoặc từ 6.2-7.29đối với vi khuẩn).Đối với đa số nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ.Sau đó dùng nước hay dung dịch nuôi để chiết rút enzym khỏi môi trường,lọai bỏ những phần không hòa tan,kết tủa enzym bằng muối vô cơ hay dung môi hữu cơ 2. Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu: - Chuẩn bị môi trường thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng.Sau khi làm lạnh,cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%.Sau một thời gain nuôi cấy tiến hành kiểm tra họat độ enzym của dịch môi trường nuôi cấy.Khi họat độ đã đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzim ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc. - Để có kết quả tốt cần xác định cho được lượng oxi cần thiết trong thời gian sinh trưởng của mỗi lọai VSV.Thể tích thùng lên men càng lớn càng khó khống chế yếu tố này.Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30 m3.Theo các tác giả Nhật,nên cấy trực tiếp vi khuẩn vào thùng lên men (chứ không qua giai đọan nuôi cấy trung gian) sẽ đảm bảo môi trường khỏi bị nhiễm. 3. Tách enzym protease: Để tách enzym từ môi trường nuôi cấy VSV theo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối pha loãng hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch nói trên theo một tỷ lệ thích hợp, khuấy đều lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc ly tâm, thu lấy dịch trong. Trong sản xuất thường dùng nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích môi trường, tiến hành chiết rút enzym trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt. Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV hặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dich enzym. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym. Ở Nhật Bản đã tìm được phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường nuôi cấy. Theo các tác giả Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzym. VIII. MỘT SỐ KỸ THUẬT CHUNG TRONG NUÔI CẤY VI SINH VẬT THU NHẬN ENZYM : Quy trình lên men cổ điển được tiến hành theo các giai đoạn sau : Chế tạo môi trường Khử trùng môi trường Lên men Thu hồi sản phẩm Nhân giống VSV Nhân giống cấp 1, 2, 3 Kiểm tra sự tạo thành sản phẩm Trong nuôi cấy VSV thu nhận enzym có một số kỹ thuật chung và một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm: - Kỹ thuật tạo giống - Lựa chọn phương pháp nuôi cấy - Thiết kế thiết bị nuôi cấy - Kỹ thuật lên men - Tách, tinh chế thu nhận enzym - Như vậy, cho đến nay có hai phương pháp nuôi cấy VSV thu nhận enzym: Phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: 1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt: _Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (một số sách còn gọi là môi trường bán rắn). 1.1. Môi trường lỏng - Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzym. Enzym ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzym nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV. Không khí Sinh khối VSV Không khí Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Enzym ngoại bào Dung dịch môi trường Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay - Nuôi cấy VSV thu nhận enzym trong môi trường lỏng theo phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12 – 15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. _Ở đây, người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzym sẽ không cao. - Trong nhiều nhà máy, người ta tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao moi trường từ 5 – 7 cm là hợp lý. 1.2 Môi trường đặc: - Phần lớn các nhà máy sản xuất enzym, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzym, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. - Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzym nội bào và ngoại bào. Các enzym ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzym noi bào nằm trong sinh khối VSV. - VSV không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường, nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm cao quá sẽ làm bết môi trường lại, không khí không thể thâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta tạo độ ẩm khoảng 55 – 65%W là hợp lý. Không khí Sinh khối vi sinh vật Hạt môi trường Môi trường đặc Vi sinh vật phát triển bề Hạt môi truờng mặt hạt môi trường Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc - Nếu sử dụng cám là nguyên liệu chính để nuôi cấy VSV thu nhận enzym, người ta phải cho thêm 20 – 25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho không khí dễ dàng xâm nhập vào lòng môi trường. - Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi VSV lạ, thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ, ta rất dễ dàng xử lý. - Nhược điểm: phương pháp nuôi cấy bề mặt có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và rất khó cơ giới hóa, tự động hóa. Phương pháp này chỉ thích hợp cho nuôi cấy nấm sợi (nấm mốc), xạ khuẩn. 2. Phương pháp nuôi cấy chìm: - Phương pháp nuôi cấy bề mặt dần dần được thay thế bằng phương pháp nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. - Trong nuôi cấy theo phương pháp chìm, người ta thường sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men (fermento). Trong các thiết bị lên men, người ta thường lắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh PH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn. 2.1 Tác động của hệ thống thổi khí: - Người ta thường cung cấp không khí vào bể lên men bằng máy nén khí (compressor). Không khí sau khi ra khỏi máy nén khí được làm nguội, làm sạch và khử trùng. Không khí được phân phối vào thiết bị lên men bằng những ống dẫn khí có nhiều lỗ nhỏ. Khi không khí vào trong bể lên men, chúng có những tác động trực tiếp sau: * Làm xáo trộn môi trường. Nhờ dòng khí vận chuyển trong môi trường lỏng, các chất dinh dưỡng, tế bào VSV sẽ phận phối đều khắp môi trường và chúng luôn luôn ở trạng thái động. Nhờ ở trạng thái động như vậy, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào VSV sẽ rất cao. Khả năng tiếp xúc này càng cao bao nhiêu, khả năng sinh tổng hợp enzym sẽ cao bấy nhiêu. * Nhờ có máy nén khi hoạt động, không khí được cung cấp thường xuyên, oxy sẽ tan trong môi trường và VSV sẽ phát triển mạnh hơn (đối với VSV hiếu khí). Như vậy đây là quá trình thúc đẩy VSV sinh sản và phát triển. * Dòng khí được cung cấp liên tục và thải ra liên tục sẽ kéo theo những chất khí được tạo ra trong quá trình phát triển của VSV. Những chất khí được tạo ra trong quá trình trao đổi chất này thường gây ức chế quá trình trao đổi chất, sinh sản và phát triển của VSV. Nhờ có dòng khí thổi vào môi trường sẽ hạn chế ảnh hưởng xấu của các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đổi chất. 2.2 Tác động của hệ thống khuấy trộn: - Hệ thống khuấy trộn được thiết kế và lắp đặt trong các thiết bị lên men không chỉ trong lên men hiếu khí mà cả trong lên men yếm khí. Khuấy trộn là quá trình cơ học có ý nghĩa rất lớn trong thiết bị thu nhận chế phẩm enzym. Các tác động đó được tóm tắt như sau: - Cánh khuấy làm xáo trộn môi trường nuôi cấy, làm các thành phẩm môi trường và các tế bào VSV không lắng xuống, tăng khả năng tiếp xúc của các thành phần môi trường và VSV, từ đó làm tăng khả năng trao đổi chất của VSV, lượng enzym được tổng hợp sẽ tăng lên. - Trong lên men hiếu khí có thổi không khí, cánh khuấy hoạt động sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxy có trong không khí khi được thổi vào môi trường. Khi đó, các bọt khí, một mặt bị vỡ nhỏ ra, tăng thiết diện tiếp xúc với dung dịch, một mặt dòng thoát khí khỏi dung dịch sẽ tồn tại lâu hơn trong môi trường nước. Thời gian tồn tại của các bọt khí lâu sẽ làm tăng khả năng tan của oxy. VSV chỉ có thể đồng hóa oxy hòa tan chứ không có khả năng đồng hóa oxy ở dạng tự do. Cánh khuấy làm tăng nhanh quá trình sinh sản vô tính do tác động cơ học.