Đề tài Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:

Lời cảm ơn Trước hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật. Lời mở đầu Viện Di truyền nông nghiệp được thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội. Chức năng chính của Viện là : -Nghiên cứu, ứng dúng các phương pháp di truyền học hiện đại và công nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trường. -Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lương thực- thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường. -Tăng cường hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di truyền và Công nghệ sinh học. Để thực hiện được các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 người trong đó có 3 tiến sĩ , 6 phó giáo sư, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ. Trong những năm qua, Viện đã đạt được rất nhiều thành tựu, đã thực hiện và chủ trì 18 đề tài nhà nước, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo được nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các quy trình tiến bộ kỹ thuật được công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO... Nhờ các thành tự trên mà Viện đã nhận được nhiều giải thưởng có giá trị cả trong và ngoài nước: Giải thưởng quốc tế về đóng góp phát triển nông nghiêph Châu á Thái Bình Dương, huân chương lao động hạng 3 ... giới thiệu chung về bệnh học thực vật I. Quan niệm về bệnh hại thực vật Việc chỉ ra được chính xác lúc nào cây bị bệnh luôn là một vấn đề khó khăn và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Người ta cho rằng một cây được coi là khoẻ mạnh và phát triển bình thường khi nó biểu hiện các chức năng sinh lý ở mức tối đa tiềm năng di truyền của nó. Các tế bào mô phân sinh của cây khoẻ mạnh thực hiện chức năng phân chia và chuyên hoá khi cơ thể đòi hỏi là cần thiết. Các kiểu tế bào chuyên hoá khác nhau hấp thụ nước và dinh dưỡng từ đất, đưa nước và dinh dưỡng đến tất cả các bộ phận của cây, tiến hành quá trình quang tổng hợp, các quá trình chuyển hoá và trao đổi chất, hoặc lưu giữ các sản phẩm của quá trình quang tổng hợp và tạo hạt hoặc các cơ quan tái tạo khắc cho khả năng sinh tồn và phát triển. Bất cứ khi nào các tế bào của một cây hay một bộ phận nào đó của cây có khả năng thực hiện một hay nhiều chức năng đặc biệt bị can thiệp do các vi sinh vật hoặc là yếu tố môt trường bất lợi thì các hoạt động của các tế bào bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế hoặc bị chết và cây trồng trở nên bị bệnh. Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn chưa biểu hiện ra nhưng chỉ trong một thời gian ngắn, bệnh lan rộng và các bộ phận cây bị bệnh bắt đầu thay đổi và biểu hiện ra ngoài các triệu chứng bệnh mà mắt thường có thể thấy được. Dựa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâm nhiễm của vi sinh vật hay ảnh hưởng của các yếu tố môi trường bất lợi mà chúng ta có thể biết được mức độ bệnh của cây. Từ đó bệnh của cây có thể được định nghĩa là : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinh vật gây bệnh hoặc với các yếu tố môi trường mà ta có thể nhìn thấy được hoặc không nhìn thấy được, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, hoặc tình trạng nguyên vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy yếu hoặc có thể gây chết toàn phần hoặc từng phần của cây. Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thường gây bệnh bằng cách can thiệp vào quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các chất điều hoà sinh trưởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với cây chủ, hoặc hấp thụ dinh dưỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng của chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát triển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất yếu là làm tắc nghẽn đường vận chuyển lên xuống của nước và của đường. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ngưỡng chống chịu của cây. Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng được phân nhóm theo rất nhiều tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị bệnh ... Hiện nay, phổ biến nhất là người ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tác nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật được chia làm 2 loại: bệnh gây ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo tiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra được nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và cách lan truyền bệnh từ đó suy ra được biện pháp phòng trừ bệnh Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật I. Khái niệm chung: Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm: Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật như mẩu lá, mẩu rễ, một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả... Nuôi cấy phôi non (phôi chưa phân hoá hoàn toàn), phôi trưởng thành. Nuôi cấy mô sẹo (callus) Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào trần.... Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào do Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào của cơ thể đa bào có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện phù hợp. Cơ sở vật chất của tính toàn năng là mỗi tế bào trong cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật chất thông tin di truyền. Khi tạo được môi trường nuôi cấy phù hợp, sử dụng các chất điều khiển sinh trưởng thực vật, ta có thể hoạt hoá gen cần thiết để bắt một tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật phát triển được thành cây hoàn chỉnh. Phân hoá và phản phân hoá của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của công nghệ này. Trong đó, sự phân hoá là việc chuyển những tế bào phôi sinh trở thành các tế bào chuyên hoá để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý, sinh hoá; còn sự phản phân hoá là sự chuyển các tế bào đã chuyên hoá trở lại trạng thái phôi sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới. Điều kiện để tế bào thể hiện tính toàn năng qua con đường phân hoá và phản phân hoá là môi trường nuôi cấy. II.Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời. Thành phần chính bao gồm: Nguyên tố khoáng đa lượng: Là các nguyên tố như N, P, K, Mg, S, Ca...,chiếm nhiều trong môi trường nuôi cấy với hàm lượng của mỗi nguyên tố thường lớn hơn 30mg/l. Chúng là nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc. Các nguyên tố khoáng vi lượng: Là các nguyên tố như Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn, Co... với hàm lượng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30mg/l. Chúng là thành phần của coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào sống. Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, các mô và tế bào chuyển sang phương thức sống dị dưỡng nên cần phải cung cấp cho chúng một nguồn cacbon hữu cơ, thường là đường mía saccaroza (trong một số trường hợp còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza...). Ngoài ra, manitol, sorbitol được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng tổng hợp vitamin nhưng lượng tổng hợp được không đủ nên phải bổ sung vitamin ngoại sinh vào môi trường cấy. Vitamin thường dùng là nhóm B dễ hoà tan vào trong nước như B1, B2, B3, B5, B6....với hàm lượng từ một đến một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy. *Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (chưa được xếp vào vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, được sử dụng với lượng lớn ~ 100 mg/l. 5. Chất điều khiển sinh trưởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy, giúp điều khiển được quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào, thể hiện được tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật tách rời. Người ta thường sử dụng chủ yếu hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng thực vật sau: Auxin: kích thích quá trình tăng trưởng của tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thường dùng là IAA(axit indolaxetic), αNAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic)....Hàm lượng dùng nhỏ 10-5-10-7 mol/l. Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định. Các loại thường dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin), Zeatin, TDZ(Thidiazuron)....với hàm lượng 10-5-10-7 mol/l. Người ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lượng phù hợp để đạt mục đích mong muốn. Quy luật tương đối: tỷ lệ auxin trên xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì mẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi. Ngoài ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tưởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh; các hợp chất ức chế sinh trưởng: axit absisic (ABA), CCC sử dụng trong bảo quản nguồn gen invitro. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên: đây là thành phần thường dùng nhưng không bắt buộc trong môi trường nuôi cấy. Bao gồm nước dừa, dịch nghiền một số rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt....dịch chiết nấm men, hợp chất cazein, pepton....để gia tăng các chất dinh dưỡng, các chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng và sự phát triển của mẫu cấy. Chất làm đông cứng môi trường: Là giá thể cho mẫu cấy. Thường dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 800C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ hơn 400C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nước cao, chỉ cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nước và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu được các chất dinh dưỡng từ môi trường. III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào: Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 5 bước sau: Bước 0: Bước chuẩn bị Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau: Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần. Có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus. Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối ưu về điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn. Bước 1: Nuôi cấy khởi động Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ thuộc từng đối tượng nuôi cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy như mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non. Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu sạch vi sinh vật nhưng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phương pháp sát trùng bề mặt bằng chất hoá học, thường là HgCl2 0,1% sát trùng trong 5-10 phút. ít phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit như NaOCl, Ca(OCl)2 5% trong 20-30 phút. Ngoài ra còn dùng H2O2 15%,dung dịch Brom 5-10% nhưng hiệu quả không cao. Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào môi trường thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính. Việc lựa chọn môi trường thích hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng trong môi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh được hình thái. Bước 2: Nhân nhanh mẫu Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này được coi là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không ưu việt của phương pháp nuôi cấy mô tế bào. ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất điều khiển sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein...kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy nhiên, tuỳ từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể đạt được hệ số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường trong bước 2 vào môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở một số loài như chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt được trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng. Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào. Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ thành công hơn nếu trước khi đưa cây con ra đất ta ươm cây trên cát có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đượcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường. Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế bào.Đó là: Sự bất định di truyền + Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra hiện tượng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro. + Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia tăng ảnh hưởng của các chát điều khiển sinh trưởng. Sự nhiễm mẫu cấy + Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trường sau 2-3 tuần nuôi cấy. + Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu Sự tiết độc tố từ mẫu cấy + Sau 1-2 ngày đưa vào môi trường, mẫu cấy tiết ra những chất màu đen, nâu làm hỏng môi trường, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin, polyphenol bị oxy hoá. + Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lượng tanin, polyphenol ; gây vết thương cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm trong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit xitric; bổ sung vào môi trường than hoạt tính để hấp phụ các chất nói trên. Hiện tượng thuỷ tinh hoá mẫu cấy + Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nước, trở nên trong suốt, có hình dạng không bình thường + Khắc phục: Bổ sung vào môi trường chất gây áp suất cao, chất ức chế tổng hợp etilen, tăng cường độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi . IV. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác giống cây trồng: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro được ứng dụng để: Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống. Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao. Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh. Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro được quan tâm hơn cả. Người ta ước tính có khoảng 300 loại cây có thể được nhân giống bằng phương pháp này. Lợi ích của nó là ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể cây con với số lượng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ, đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trưởng tốt và cho năng suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, người ta có thể tạo ra được hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng khắc phục được những điều kiện bất lợi. Phương pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh. ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước đã được thành lập và cho đến nay đã thu được một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi... Tại trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây chất lượng cao, bước đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía Nam đã xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy trình nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm...có giá trị cao. Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh học cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hướng đi mới cho nghiên cứu di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật..., đặc biệt nó đem lại những ứng dụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng. V.Kết quả và thảo luận Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vườn của viện Di truyền nông nghiệp. - Mẫu cây được cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm. - Rửa mẫu bằng nước rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nước sạch 3 lần. - Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng nước sạch 3 lần. - Khử trùng mẫu bằng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sạch bằng nước cất. - Cắt cành thành từng đoạn ngắn, mỗi đoạn có ít nhất một mắt ngủ. - Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy có nồng độ aucin-cytokinin thích hợp, sau 3 tuần các mắt ngủ sẽ phát triển thành chồi. - Thường sau quá trình này câty được nuôi cấy bằng phương pháp cắt lát mỏng để có được hệ số nhân nhanh lớn. -Sau khi đã có được chồi tiến hành xử lý ra rễ bàng cách cắt chồi cấy vào môi trường thích hợp,sau khoảng 2 tuần sẽ có rễ. - Khi cây đã có rễ có thể tiến hành việc thích nghi cây với điều kiện sống tự nhiên trong vườn ươm :có giả thể thường là đất trộn trấu hun có bổ sung các nguồn chất dinh owỡng trong điều kiện chiếu sáng 50%. - Một thời gian sau,nếu tỷ lệ cây sống đạt hơn 85% có thể đem cây con trồng trong điều kiện bình thường. Phần ii: chẩn đoán bệnh I.Khái niệm 1.Tình hình bệnh hại trên giống cây trồng thực vật ở Việt Nam. Để đảm bảo an ninh lương thực đồng thời phát triển nhanh nền kinh tế, trong những năm gần đây Việt Nam đã nhập nhiều giống cây trồng và hoa cây cảnh từ nhiều quốc gia trên thế giới. Điều này luôn kèm theo các nguy cơ xân nhập của vi sinh vật gây hại, đặc biệt là các bệnh hại thực vật thuộc diện KDTV ở Việt Nam. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, bệnh hai thực vật gây nên những thiệt hại vô cùng to lớn và chúng đang làm ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng sản phẩm cũng như năng suất cây trồng. Đặc biệt là bệnh hại do virus gây ra: Virus PVY là virus gây bệnh thối củ khoai tây, làm giảm năng suất củ tới 80%, nó cũng gây thiệt hại đáng kể trên cây cà chua, ớt, thuốc lá. Khi thuốc lá bị nhiễm virus này thì năng suất giảm tới 30%. Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn. Việc áp dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh học phân tử và Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đáp ứng được đòi hỏi cấp bách của KDTV. Một số tác nhân gây bệnh thường thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá. Virus khảm dưa chuột – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hình nhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. Virus này được lan truyền qua Aphis gossyphii. Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Xuất hiện dịch bệnh không có quy luật báo trước. Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV) Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất là dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất cà chua, gây ảnh hưởng đến chất lượng thuốc lá. Virus này được lan truyền bằng con đường cơ học, đồng thời đối với cà chua virus này còn lan truyền qua hạt. Nó thuộc nhóm Tobamovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Virus Y khoai tây – Potato Y Viruses (PVY). Loại virus này gây ra các loại khảm và các dạng hoại tử ở thịt và gân lá khác nhau, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. Vectơ của virus này là các loại muội khác nhau. Nó thuộc nhóm polyvirus có cấu trúc ARN mạch đơn. 2.Sự lan truyền virus trong tự nhiên Virus thực vật không thể tự lây nhiễm vào các mô, tế bào của vật chủ mà chúng chỉ thâm nhập vào khi các tế bào hoặc các mô của vật chủ bị tổn thương. Trong tự nhiên quá trình này được thực hiện thông qua các vi sinh vật khác, những sinh vật mang virus từ cây này truyền cho cây khác gọi là vectơ truyền bệnh. Ngày nay những phương thức truyền bệnh của virus đã được xác định, bao gồm những phương thức sau: 2.1 Lây lan cơ học Các virus thực vật truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ nếu nồng độ virus trong cây bệnh và độ bền vững của virus là cao như các bệnh khảm thuốc lá, khảm cà chua, khảm dưa chuột chúng có thể truyền trực tiếp từ cây này sang cây khác khi lá chạm vào nhau, hoặc gián tiếp qua môi trường đất, nước, quần áo người lao động, chân tay Nhân giống vô tính cũng là phương thức là cho virus xâm nhập vào các vật chủ thông qua các dụng cụ chiết, cắt, ghép 2.2 Lan truyền qua chất dinh dưỡng Virus có khả năng lây nhiễm vào tất cả các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, củ mầm Những cây mới phát triển từ vật nhiễm virus đều duy trì cho virus sống từ mùa này sang mùa khác là nguồn lan truyền bệnh virus ra nhiều vùng trên thế giới. 2.3 Lan truyền qua hạt. Trước đây người ta cho rằng bệnh virus không lây lan qua hạt, đến năm 1910 đã phát hiện virus khảm cà chua, 1919 virus khảm đậu và ngày nay đã có những bằng chứng về sự lây lan của bệnh virus thông qua hạt. 2.4 Lan truyền nhờ các vectơ truyền bệnh Các vectơ truyền bệnh có thể là công trùng, rệp, bét, nấm người ta chia côn trùng truyền bệnh thành 4 nhóm: - Côn trùng sau khi mang virus lấy từ cây lây bệnh chỉ có khả năng truyền bệnh sau đó 1-2h, lâu hơn nữa thì virus không còn khả năng lây nhiễm, được gọi là tồn tại không vĩnh viễn (Non persistent). - Côn trùng sau vài giờ mang virus từ cây bệnh mới có khả năng truyền bệnh sang cây khác. Khả năng này chỉ tồn tại trong vài ngày liên tục, trường hợp này gọi là bán vĩnh viễn (semi-persistent). - Côn trùng chỉ cần 15 phút lây nhiễm virus từ cây bệnh nhưng chỉ có thể truyền bệnh sau đó vài giờ và truyền bệnh liên tục trong một vài tuần, gọi là truyền bệnh vĩnh viễn tuần hoàn (persistent circulative). - Côn trùng sau 15 phút lây virus có thể truyền bệnh liên tục suốt cả chu kỳ sống và cả thế hệ sau đó vẫn còn nguyên khả năng truyền bệnh, gọi là truyền bệnh vĩnh viễn lan truyền (persistent psopagative). 3. Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym ( ELISA – enzym linked immuno _sorbent assay) Phương pháp thử miễn dịch dựa trên phản ứng giữa một kháng nguyên và một kháng thể là những protein có trọng lượng phân tử lớn thu được do tạo miễn dịch ở máu nóng của động vật có vú ( chuột, thỏ, ngựa, dê...) bằng những phân tử gây miễn dịch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mạch bổ xung ,...).Trong trường hợp này kháng thể được gọi là kháng thể đa dòng (polyclonaux) vì chúng được tạo ra từ các dạng hoạt hoá của một quần thể dị chất của những tế bào limpho B trong máu động vật. Chúng là một hỗn hợp của các kháng thể khác nhau phản ứng với nhiều điểm cuối của kháng nguyên hoạc những đỉnh của phân tử gây miễn dịch. Phản ứng kháng thể – kháng nguyên là một công cụ rất hiệu nghiệm để chuẩn đoán bệnh virut, vi khuẩn, nấm, mycoplasma, tuyến trùng và các véc tơ truyền bệnh. Hiện nay kỹ thuật ELISA còn giúp chúng ta xác định được hàm lượng thuốc trừ sâu (pesticide) tồn dư trong đất. Các phân tử đánh dấu cũng là một phức hợp kháng thể –kháng nguyên đã được sử dụng từ lâu để chuẩn đoán bệnh cho phép nhận thấy kết quả bằng mắt thường. Hiện nay việc sử dụng các phân tử phóng xạ để đánh dấu đã bị hạn chế .Bên cạnh đó, người ta thường dùng enzym (Alkaline phosphatasa), peroxidaza, chất floresence và Avidin –Biotin để tăng độ nhạy của phép chuẩn đoán ta cũng có thể sử dụng các chất huỳnh quang, phosphattase alkaline... Phương pháp miễn dịch liên kết enzym được nhiều tác giả hoàn thiện vào năm 1971 (Avrameanvà Cs; Van Weemen và Cs; Engvall và Cs ). Nhóm cuối cùng đã sử dụng thuật ngữ ELISA (Enzym linked immuno –sorbent assay) lần đầu tiên vào năm 1971 để áp dụng vào phương pháp định lượng một vài kháng thể đặc hiệu. Đây là phương pháp được phát triển bởi rất nhiều tác giả và là một phương pháp nhanh nhậy trong chuẩn đoán và định lượng một số kháng nguyên, kháng thể. Nó đã được Voller và đồng nghiệp ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh virut thực vật năm 1976. Clack và Adams ở Anh là hai trong những người đầu tiên dùng phương pháp này để chuẩn đoán 2 bệnh virut là AWM ( Arabis Mosaic Virus) và PPV ( Plum PoxVirut). Phương pháp này rất nhạy, cho phép thăm dò ở mức nhiễm rất thấp. Để thực hiện phương pháp ELISA, ta phải tinh chế kháng thể (IgG) và biết sử dụng kháng thể đánh dấu. Sự đánh dấu kháng thể cho phép nhìn thấy phản ứng kháng nguyên kháng thể và tăng thêm khả năng thăm dò của những phản ứng đặc hiệu. Phân tử đánh dấu có thể là enzym, chất phóng xạ (S35 hoặc I128), kim loại (hoặc chất keo ), hoặc chất huỳnh quang. Phản ứng miễn dịch diễn biến ở pha rắn. Virus được giữ lại bằng cách chọn lọc và cố định bằng một kháng thể đặc hiệu hấp thụ trên bề mặt vật cứng tại các going của một vi chuẩn độ ( plaque de microtitration ) cấu tạo bằng polyvinyl hoặc polystyrene. Những phản ứng khác nhau xảy ra liên tiếp và những phân tử tự do được loại trừ bằng các lần rửa. Phản ứng của virus cũng tập trung và được tăng cường bằng một pha đưa thêm vào một kháng thể đặc hiệu có gắn một enzym đánh dấu, có phản ứng hoàn toàn với virus và được tìm ra bằng nhuộm màu trong diễn biến giảm dần của enzym ỏ chất nền thích hợp. Sự thuỷ phân diễn ra qua một phản ứng màu quan sát được bằng mắt hoặc đo bằng dụng cụ quang học. Trong trường hợp không có virus trong mẫu kiểm tra, enzym gắn với kháng thể không giữ lại được giữ lại và sẽ không có mẫu. Phương pháp ELISA không những đáp ứng được những tiêu chí phức tạp mà còn dễ dàng tự động hoá và dễ dàng tìm kiếm những chất phản ứng trên thị trường . Ư'ng dụng của ELISA trong việc phòng chống và phát hiện bệnh: Nhận biết các tác nhân gây bệnh chủ yếu, đưa ra những dữ liệu về bệnh dịch học, xác định được mức độ nhiễm để quản lý đánh giá các giống kháng bệnh Thu được các nguyên liệu thực vật sạch bệnh bằng quy trình chọn giống sạch bệnh ở những giai đoạn nhân giống khác nhau. Kiểm tra nguyên liệu thực vật nhập nội và ngăn ngừa sự xâm nhập của các bệnh lạ vào lãnh thổ. Theo dõi thường xuyên các loại vi sinh vật, phát hiện và diệt trừ ổ dịch có thể là các kho chứa các vật truyền bệnh (côn trùng, tuyến trùng, nấm) II.Vật liệu và nghiên cứu 1.Vật liệu nghiên cứu. 1.1 Vật liệu thực vật. Các mẫu cà chua thu thập tại vườn thí nghiệm của viện di truyền nông nghiệp. Vật liệu vi sinh Loại bệnh được nghiên cứu là : Potato virus Y, Tobaco etch virus. 1.3 Các dung dịch đệm dung trong DAS-ELISA. Dung dịch Coating pH=9,6 NaCO3 1,59g NaN3 0,20g NaHCO3 2,93g Nước cất 2 lần 1000ml Dung dịch PBS pH7,4 NaCl 8,00g KCl 0,20g KH2PO4 0,20g NaN3 0,20g Na2PO4 42,9g Nước cất 2 lần 1000ml Dung dịch PBS – T: PBS + 0,5ml Tween 20. Dung dịch PBS – T – PVP PBS – T + 2% PVP (polyvinyl pyrolidone) Dung dịch hiện màu (Substrate) pH9,8 Diethanolamine 97,00ml NaN3 0,20g Nước cất 2 lần 900ml 2 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu. 0,5 gam mẫu được lấy ở các vị trí khác nhau (Virus để chẩn đoán bệnh ta lấy mẫu ở lá, một số mẫu lấy ở ngọn ) và được nghiền trong dung dịch chiết. Mẫu được nghiền trong dung dịch dịch chiết với tỷ lệ 1/10 (1mg/ 10ml dung dịch đệm). Sau đó dịch nghiền được lọc qua bông thuỷ tinh để giữ lại những phần thực vật không bị nghiền nát để thu được một dịch đồng nhất. Dịch này được pha loãng với các tỷ lệ khác nhau để: Xác định ngưỡng giới hạn của phép thử (Giới hạn độ hoà loãng kháng nguyên). Tìm ra nồng độ hoà loãng tốt nhất, nó có nồng độ đủ để chẩn đoán lượng tác hân gây bệnh và đông thời phép thử không bị che khuất bởi sắc tố diệp lục của cây. (Để loại trừ diệp lục trong dịch chiết mẫu ở nồng độ hoà loãng thấp ta tiến hành ly tâm ở 7000 rpm trong 5 phút) 2.2 Phương pháp DAS-ELISA, các bước tiến hành *Nguyên lý của phương pháp DAS-ELISA Dùng kháng thể đa dòng bao phủ bề mặt giếng để bắt giữ kháng nguyên thích hợp Cho kháng nguyên vào Kháng thể gắn enzyme được sử dụng để phát hiện Cuối cùng là sự nhân biết các mẫu bằng phản ứng tương tác với chất hiện màu.  Hình 1. Nguyên lý của phương pháp ELISA “Sandwich kẹp kháng thể 2 lần” – Phương pháp trực tiếp. Đặt kháng thể đặc hiệu Kháng thể Kháng nguyênngnguyên nguyên Bề mặt cứng Đặt kháng nguyên Thể cộng hợp (Conjugate) Enzyme Đặt kháng thể có gắn ENZYME gọi là thể cộng hợp (conjugate) Kháng thể Chất nền cho phản ứng nhuộm màu Biểu hiện của phản ứng Các bước tiến hành Đặt kháng thể đặc hiệu đã được hoà loãng trong dung dịch đệm coating vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ trong 2h ở 370C Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS – T. Cho dịch cây nghiên cứu đã được hoà loãng trong dung dịch đệm PNS – T + PVP vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ ở 370C trong 2h hoặc 1 đêm ở 40C. Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS – T. Đặt kháng thể gắn enzyme Phosphataza kiềm đã được hoà loãng trong dung dịch đệm PBS – T + PVP vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ ở 370C trong 2h hoặc 1 đêm ở 40C. Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS – T. Chất nền của enzyme là para Nitro Phenyl Phosphat (pNPP) pha vào dung dịch đệm hiện màu substrate nồng độ 2mg/ml sau đó cho vào giếng của đĩa plaque (100ml/giếng). ủ ở 370C trong 30 phút đến 2h. Khi muốn dừng phản ứng thì dùng 50ml dung dịch NaOH 3M để dừng phản ứng. Đọc kết quả bằng máy so màu quang học ở bước sóng 405nm. Chỉ số quang học D.O thể hiện kết quả của phản ứng O.D lớn gấp 2 lần O.D đối chứng sạch bệnh là cây đã bị nhiễm virus (Theo Sanofi-Pasteur). Iii: Kết quả và thảo luận Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Mẫu đối chứng đối với 10 giếng đầu tiên là TEV: kiểm tra mẫu cà chua. Mẫu đối chứng đối với 10 giếng tiếp theo là TSV: kiểm tra mẫu cà chua. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B TP 1 4 7 10 - 3 6 9 C TP 1 4 7 10 - 3 6 9 D + 2 5 8 TP 1 4 7 10 E + 2 5 8 TP 1 4 7 10 F - 3 6 9 + 2 5 8 G - 3 6 9 + 2 5 8 H Bảng tổng hợp kết quả đo O.D Tên virus Mẫu TEV (Tobacco Etch Virus) TSV (Tobacco Spot Virus) 1 1.6985 0.3165 2 1.6440 0.330 3 1.583 0.294 4 1.925 0.3075 5 2.548 0.3035 6 1.1665 0.3005 7 1.378 0.325 8 1.817 0.268 9 * 0.2815 10 1.870 0.440 TP 1.4205 0.206 P * 0.3385 N 1.945 0.318 Từ bảng kết qủa nói trên ta thấy: Với bệnh do virus TEV gây ra trên cây cà chua, mọi mẫu phân tích đề cho kết quả gần tương tự như mẫu đối chứng sạch, thậm chí có mẫu còn cho kết quả nhỏ hơn, điêù này cho phép ta kết luận mẫu cà chua đem phân tích hoàn toàn không bị nhiễm TEV. Với bệnh do virus TSV gây ra, hầu hết các mẫu phân tích đều cho kết quả O.D nhỏ hơn mẫu đối chứng sạch, chỉ có mẫu số 2 là cho kết quả lớn hơn nhưng lại chỉ lớn hơn có 1.037 lần. Mẫu số 10 có chỉ số O.D lớn hơn cả chỉ số mẫu đối chứng dương. Như vậy kết quả mẫu phân tích cho ta thấy cây đêm phân tích bước đầu đẫ nhiễm virus TSV. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của DAS-ELISA: 1. ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản: - Mẫu sau khi tách chiết được chia ra bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau 20, -4, -20 và -840C cho những giá trị OD khác nhau rõ rệt. Từ số liệu thu được cho thấy -840C cho giá trị cao nhất. 2. ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu tới kết quả thí nghiệm: - Mẫu tiến hành thí nghiệm ngay sau khi được tách chiết cho kết quả chính xác nhất. Nghĩa là nêu skhông bắt buộc phải bảo quản mẫu trong -840C cho kết quả chính xác và nhạy nhất. Nếu sử dụng mẫu qua bảo quản kết quả sẽ cho độ nhạy kém hơn và chỉ nên dùng một lần không nên lặp lại. 3. ảnh hưởng của thời gian bảo quản đĩa tới kết quả thí nghiệm sau khi cho kháng thể hút bám bề mặt các giếng: - Khi so sánh giá trị OD đối với đối chứng bệnh và đối chứng sạch của thí nghệim ở tại các thời điểm sau khi cho kháng thể hút bám bề mặt giếng cho thấy thời gian bảo quản đĩa khác nhau không ảnh hưởng tới giá trị OD. 4. ảnh hưởng của bọt khí khi cho dung dịch chất hiện màu vào trong mỗi giếng trước khi đọc kết quả: Giá trị OD thay đổi rất lớn trong cùng một mẫu khi có bọt khí và không có bọt khí trong các giếng, thậm chí trong một số trường hợp đối chứng sạch bệnh cho kết quả dương tính (bị bệnh). Vì vậy hết sức tránh có bọt khí khi đặt kháng nguyên, kháng thể và chất nền để kết quả được chính xác hơn. Phần III : Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và nấm đối kháng. I.Tổng quan Mỗi loại cây đều có một hệ vi sinh vật đặc trưng cho cây đó. Nghiên cứu về hệ vi sinh vật tham gia vào sự sinh trưởng, phát triển cũng như duy trì nòi giống ở thực vật là một trong những nội dung quan trọng giúp cho việc nâng cao sức sống, năng suất cũng như phẩm chất tốt của cây trồng. *Nhóm vi sinh vật gây bệnh sống nhờ vào chất hữu cơ của thực vật đang sống, chúng tiết ra các hợp chất phân huỷ mô và tế bào thực vật làm cây chết (khác với nhóm hoại sinh- sống trên những tế bào thực vật đã chết). Vi sinh vật gây bệnh có khả năng tồn tại trong đất hoặc trên tàn dư thực vật từ vụ này qua vụ khác dưới dạng bào tử hoặc các dạng tiềm sinh khác tạo thành nguồn bệnh tiềm tàng. Từ đó chúng được phát tán nhờ nước mưa, gió, dụng cụ lao động, động vật và người, đặc biệt là nhờ côn trùng môi giới. Qua các con đường đó chúng lây lan sang cây khoẻ và bắt đầu nảy mầm, xâm nhiễm vào cây khi gặp điều kiện thuận lợi. Quá trình hoạt động của vi sinh vật gây bệnh làm cho cây bị thay đổi các đặc tính sinh lý, sinh hoá sau đó thay đổi về hình thái, cấu tạo tế bào và cuối cùng là xuất hiện những triệu chứng bệnh như đốm trên lá, trên thân Nấm chỉ chiếm khoảng dưới 1% tổng số vi sinh vật trong môi trường sống của thực vật nhưng lại có những ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển bình thường của hầu hết các loại cây trồng. Cũng như các vi sinh vật gây bệnh khác nấm gây bệnh là một trong những nguyên nhân chính gây nên sự sụt giảm năng suất, chất lượng, tàn phá mùa màng. Phần lớn nấm gây bệnh có hình thức sinh sản bằng bào tử và có vòng đời ngắn do đó chúng lây lan với một tốc độ vô cùng lớn và rất khó ngăn chặn. Chính vì vậy, việc phát hiện, nghiên cứu nấm bệnh là một nội dung vô cùng quan trọng giúp cho việc tìm ra các biện pháp phòng ngừa, tiêu diệt và ngăn chặn sự lây lan của chúng, bảo vệ mùa màng. *Để tránh bệnh cho cây người ta sử dụng nhiều biện pháp hoá học, sinh học cũng như các biện pháp tổng hợp rất phong phú. Ngày nay, các biện pháp hoá học bị hạn chế do những tác động phá hoại sự cân bằng sinh thái hay gây ô nhiễm môi trường của chúng. Các biện pháp sinh học như sử dụng vi sinh vật đối kháng, thuốc trừ sâu sinh học, chuyển gen chống chịu vào cây trồngđang được nghiên cứu và áp dụng ngày càng nhiều nhờ những ưu điểm của chúng. Một trong những biện pháp sinh học có khả năng đem lại hiệu quả cao trong bảo vệ cây trồng là sử dụng vi sinh vật chống lại các vi sinh vật hại cây hay nói cách khác là tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cho cây nhờ các vi sinh vật đối kháng với chúng. Hiện nay, người ta đã tìm ra các cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh dựa vào các chủng vi sinh vật đối kháng như: Sự cạnh tranh về dinh dưỡng. Các chủng vi sinh vật đối kháng thường phát triển nhanh làm biến đổi dinh dưỡng và không gian sống của vi sinh vật gây bệnh. Sinh chất kháng nấm Tăng sức đề kháng ở vật chủ: Một số chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sự tạo thành các chất chống chịu ở vật chủ. Tác động trực tiếp vào tác nhân gây bệnh: một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh ra enzim thuỷ phân ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác, phân giải thành thành tế bào hay tạo ra các lỗ rò dẫn tới sự rò rỉ tế bào.. Nghiên cứu các vi sinh vật đối kháng thì nấm đối kháng là một nội dung mới mẻ và quan trọng, đang được đầu tư ở Việt Nam. II.Phương pháp nghiên cứu Trong nội dung báo cáo này đề cập đến một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và nấm đối kháng phục vụ cho nghiên cứu ảnh hưởng của nấm đến cây trồng cũng như sản xuất ra các chế phẩm sinh học nhờ những nghiên cứu ấy. 1.Kỹ thuật mồi nấm gây bệnh * Nguyên tắc: - Sử dụng mô của cây chủ sạch bệnh để bắt các vi sinh vật gây bệnh cho cây cùng loại. Vi sinh vật có trong đất sẽ bị thu hút bởi mô thực vật mà nó có thể sống kí sinh và gây bệnh trên đó, nhờ vậy ta tách riêng được chủng VSV cần nghiên cứu. * Cách tiến hành: - Lấy mẫu đất bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh lấy từ cánh đồng, mang vào phòng thí nghiệm, phơi khô và nghiền nhỏ. Lấy 100g đất cho vào đĩa Petri đã khử trùng, thêm nước cất khử trùng để làm ẩm Cắt lá cây chủ sạch bệnh kích thước 1cm2 đặt vào đĩa đó (khoảng 10 miếng trên một đĩa). Giữ đĩa petri chứa đất ở nhiệt độ phòng và quan sát sự phát triển của nấm trên mô chủ dưới kính hiển vi độ phóng đại x10. Cấy chuyển sang môi trường WA (hình 1) hoặc môi trường trung gian PDA cho đến khi tạo thành canh trường thuần khiết (hình 2) Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H1 * Phạm vi ứng dụng: - Phương pháp này dùng để phân lập nấm gây bệnh trong đất - Cũng có thể phân lập nấm có trong mô thực vật bằng cách đặt mẫu cần phân lập lên đất đã khử trùng sạch bệnh để nấm xâm nhiễm và được nhân lên nhờ đất. Sau đó phân lập nấm bệnh từ đất theo các bước trên. 2. Kỹ thuật tách vi sinh vật gây bệnh * Nguyên tắc: - Nuôi mô thực vật bị nhiễm nấm bệnh trên môi trường nuôi cấy phù hợp để nấm phát triển mạnh mẽ tạo thành khuẩn lạc, nhờ đó tách riêng chúng. * Cách tiến hành: - Các thành phần gây bệnh ở thực vật tập trung trên lá cây hoặc trên vỏ cành cây con và quả. Những mẫu đó được đưa tới PTN làm sạch dưới vòi nước chảy, sau đó khử trùng bề mặt bằng Clorox 10%. - Cắt mảnh lá rộng 1-2mm2 chứa một nửa mô sạch và một nửa mô bệnh, sau đó ngâm trong Clorox 10% trong 5 phút - Cấy mô đã khử trùng bề mặt trên môi trường WA, và giữ ở nhiệt độ phòng. - Quan sát khuẩn lạc của nấm mốc mọc lên trong môi trường đó và cấy chuyển nhiều lần sang môi trường WA hoặc PDA cho đến khi tạo được canh trường thuần khiết. - Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H2 * Phạm vi ứng dụng: - Phân lập được các chủng nấm gây bệnh trực tiếp từ mô thực vật. 3.Phương pháp pha loãng * Nguyên tắc: - Nuôi cấy dung dịch loãng chứa VSV ở các nồng độ khác nhau trên môi trường phù hợp để tạo thành các khuẩn lạc. Nuôi cấy tách riêng các khuẩn lạc đó để thu được các chủng nấm riêng biệt. * Cách tiến hành - Cho 1g đất mẫu vào trong ống nghiệm đã khử trùng - Thêm 10ml nước cất khử trùng để hoà tan đất sau đó lắc đều trong 20-30 phút. - Pha loãng mẫu đất đã hoà tan trong nước cất khử trùng và cấy lên môi trường thạch thích hợp, mỗi độ pha loãng lấy 0.1ml. - Giữ ở nhiệt độ 24-30oC trong vài ngày và đếm khuẩn lạc. - Cấy chuyển nhiều lần trên môi trường thích hợp để tạo ra khuẩn lạc thuần khiết - Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H3 * Phạm vi ứng dụng: - Phân lập VSV trong đất - Xác định hàm lượng VSV trong đất 4. Mồi bắt vi sinh vật đối kháng: * Nguyên tắc: - Tạo ra môi trường nghèo dinh dưỡng để VSV gây bệnh khó hoặc không phát triển được. Khi đó những VSV phát triển trên môi trường ấy hầu hết là VSV đối kháng (???) * Cách tiến hành: - Lấy 10 g đất tốt cho vào đĩa petri đã khử trùng - Phun nước cất khử trùng để làm ẩm đất - Đặt lên bề mặt một lớp vật liệu cellulose (giấy hay rơm rạ ). - ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 ngày. - Cấy chuyển bào tử nấm sang môi trường trung gian PDA cho đến khi tạo canh trường thuần khiết. - Quan sát bào tử nấm dưới kính hiển vi Stereo để nhận biết chủng loại. - Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H4 * Phạm vi ứng dụng: Phân lập được một số chủng nấm từ đất phục vụ cho việc nghiên cứu nấm đối kháng. **Thành phần các môi trường sử dụng: Môi trường PDA: Thành phần Hàm lượng -Đường glucose 20 g/l - Khoai tây 200g/l - Agar 20 g/l - Nước 1000ml Môi trường WA: Thành phần Hàm lượng - Agar 20 g/l - Nước 1000ml Mẫu đất và nước khử trùng Đặt vật liệu mồi chủ của mẫu lên bề mặt cho nước vào và ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi trong 3-5 ngày Quan sát dưới kính hiển vi (x10) Tách sợi nấm chuyển sang môi trường PDA cho tới khuẩn lạc thuần Định danh dưới kính hiển vi và chụp ảnh H1: Kỹ thuật mồi nấm bệnh Phytophthora và Pythium (theo GS. Kasem soytong) Phần bệnh và khoẻ Làm sạch Đặt vài miếng lên môi trường WA và ủ ở nhiệt độ phòng 3-5 ngày Định danh dưới kính hiển vi và chụp ảnh H2: Kỹ thuật tách nấm bệnh từ mẫu bệnh (theo Kasem soytong) Tách sợi nấm sang môi trường PDA tới khuẩn lạc thuần Lắc 20-30 phút 1g mẫu đất + 10ml nước cất khử trùng 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-1 -2 -3 -4 -5 -6 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml No 10-1 -2 _-3 -4 -5 -6 Môi trường PDA Đơn vị khuẩn lạc tạo thành (CFU) H3: Kỹ thuật pha loãng Mẫu đất ( Phơi khô sau đó nghiền nhỏ lấy 100g đặt vào đĩa) Đặt vật liệu mồi cellulose lên bề mặt (Giấy whatman hoặc cọng rơm) ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 ngày và giữ ẩm sau đó quan sát dưới kính lúp Phân lập tới khuẩn lạc thuần Định danh dưới kính hiển vi và chụp ảnh H4: Kỹ thuật mồi nấm đối kháng (theo GS. Kasem soytong) III. Kết quả và thảo luận 1.Kỹ thuật mồi nấm gây bệnh: -Tiến hành thí nghiệm trên 2 mẫu đất trồng Cam ở Huyện Văn Giang, tỉnh Bắc Giang là: CVG1 và CVG2. - Vi sinh vật phân lập được là nấm mốc Phytophthora : bào tử hình cầu, thành dày, sợi phát triển chậm. 2. Kỹ thuật tách vi sinh vật gây bệnh : -Tiến hành thí nghiệm trên mẫu lá cây xoài ở Viện Di Truyền Nông Nghiệp - Vi sinh vật phân lập được là ??? 3. Kỹ thuật pha loãng: Tiến hành thí nghiệm trên mẫu đất trồng Cam ở Huyện Văn Giang, tỉnh Bắc Giang là: CVG1 và mẫu đất trồng Hồng Môn tại VDTNN là HM1 Các chủng vi sinh vật phân lập được là : Tricoderma; Aspergillus và Penicillium 4. Kỹ thuật mồi vi sinh vật đối kháng: Tiến hành thí nghiệm trên mẫu đất trồng Hồng Môn tại VDTNN là HM1T, tuy nhiên do thời gian thí nghiệm hạn chế nên chưa thu được kết quả. ( Giới thiệu 1 số chủng nấm đối kháng đã được các nhà khoa học phân lập: Tricoderma) kết luận Sau 3 tuần thực tập kỹ thuật tại Viện Di truyền Nông nghịêp,em nhận thấy đây là một đợt thực tập bổ ích vì em đã có cơ hội hiểu rã hơn về một số vấn đề đã được học trong học kỳ vừa qua,được học tập trên thực tế chứ không phải chỉ trên lý thuyết vì thế em thấy mình nắm các vấn đề sâu hơn và dễ hiểu hơn.Đây là một số kết quả em nhận được sau đợt thực tập này: - Biết rõ hơn về thực tế nghiên cứu chung. - Chẩn đoán bệnh cây. - Tìm và phân lập nấm. - Nuôi cấy mô tế bào. Qua đợt thực tập này em đã phần nào hình dung và định hướng được công việc mình sẽ là trong tương lai.Tuy đây là đợt thực tập thứ hai của em nhưng là đợt thực tập ký thuật đầu tiên nên không tránh được những bỡ ngỡ nên em rất mong có được sự góp ý và giúp đỡ của cô để em có thể hoàn thiện hơn kiến thức của mình. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Xuân Sâm, Hoàng Lan cùng các cô và các anh chị tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ em hoàn thành đợt thực tập này.