Đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của một số chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng xử lý phế thải ligno - Xenluloza

hân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh sản xenlulaza, là enzym thuỷ phân xenluloza. Cấu trúc của xenluloza là một cấu trúc phức tạp, chặt chẽ. Chính vì vậy mà xenluloza rất bền trong tự nhiên. Các thành phần hợp thành xenluloza có cấu tạo và tính chất rất khác nhau. Do đó, việc phá vỡ cấu trúc này đòi hỏi phải có sự hiểu biết sâu sắc đặc tính riêng của từng phần tạo ra chúng. Từ đó tìm ra những biện pháp, những chủng vi sinh vật thích hợp để phân giải chúng. Bên cạnh đó,xenluloza là thành phần có số lượng và cấu tạo phức tạp hơn cả trong ligno-xenluloza . Sự tồn tại của hai vùng kết tinh và vô định hình của xenluloza cũng đòi hỏi phải có những biện pháp hoàn toàn khác nhau. Chính vì thế, quá trình thuỷ phân xenluloza trong tự nhiên thường diễn ra rất chậm chạp. Vấn đề xử lý các chất thải có chứa xenluloza là vấn đề không dễ dàng.[11] 2.4.Hemixenluloza Trong tế bào thực vật, hemixenluloza đứng thứ hai về khối lượng. Hemixenluloza là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với xenluloza. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đưòng. Các gốc đưòng được nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β -1.5, β -1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắn và phân nhánh. Do đó, so với xenluloza thì hemixenluloza có cấu trúc không chặt chẽ bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi hemixenluloza còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải bởi enzym hemixenlulaza. Hemixenluloza tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ, trấu. Trong các loại hemixenluloza thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên. Trong đó nhiều nhất là ở rơm, rạ (chiếm hơn 30%) kế đến là cây lá rộng (20 – 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 – 17%).[5,10,20] 2.5.Lignin Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic.[5] Tuy nhiên, tỷ lượng ba loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau.Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và C-C. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến. Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic; 14% cumarylic và 6% cynapylic. Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác từ bên ngoài. Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối với tác dụng của các enzym. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất. Ba cấu tử xenluloza, hemixenluloza, lignin tạo nên ligno-xenluloza. Thành phần lignin, xenluloza, hemixenluloza trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật lý và thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau.[5, 20] 2.6.Cơ chế chuyển hoá ligno-xenluloza Từ các yếu tố trên ta thấy rằng ligno-xenluloza là một chất rất khó chuyển hóa và chuyển hoá rất chậm trong điều kiện tự nhiên. Đặc tính khó chuyển hoá này do một số nguyên nhân: Ligno-xenluloza là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzym. Các cấu phần hợp thành nên ligno-xenluloza được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ. Do thành phần cấu tạo của ligno-xenluloza rất đa dạng và phức tạp nên để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzym tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng hợp một phức hệ enzym phong phú và đa dạng như vậy. Muốn chuyển hoá được ligno-xenluloza cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau. 2.6.1.Enzym và cơ chế thuỷ phân xenluloza a) Enzym thuỷ phân xenluloza: xenlulaza Xenlulaza ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzym thuỷ phân xenluloza tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác giả cho rằng phức hệ enzym xenlulaza bao gồm ba enzym chủ yếu sau: -Exo-β(1,4)-glucanaza (Avicelaza) hay xenlobiohydrolaza (1,4 β-D-glucanxenlobiohydrolaza E.C.3.2.1.91) Enzym này phân cắt chuỗi xenluloza từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzym này không thuỷ phân xenluloza kết tinh cũng như xenluloza hoà tan (caboxymetyl xenluloza) nhưng có thể thuỷ phân được xenluloza đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ vai trò chính của enzym này là giúp cho enzym endoxenlulaza tác động lên được xenluloza kết tinh. -Endoglucanaza hay Endoxenlulaza (1,4 β-D-glucano-hydrolaza E.C.3.2.1.4) Enzym này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết β 1,4-glucozit trong phân tử xenluloza một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobioza và glucoza. Enzym này phân giải mạnh mẽ các xenluloza vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên xenluloza kết tinh và không phân giải được xenlobioza. Chính nhờ sự phân cắt trước của endoxenlulaza, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzym xenlobio-hydrolaza, do đó mà thuỷ phân được xenluloza kết tinh. Còn thứ tự ngược lại thì hiện nay người ta chưa biết. -Enzym β-1,4-glucozidaza hay xenlobiaza Đây là những enzym rất đặc hiệu. β-glucozidaza làm thuỷ phân xenlobioza và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucoza. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân xenluloza phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiaza. Tuy nhiên theo một số tác giả cơ chế thuỷ phân xenluloza bởi phức hệ enzym trên diễn ra theo một trật tự khác nhau. b)Cơ chế thuỷ phân xenluloza Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzym “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu. Các enzym này chỉ có tác dụng làm trương xenluloza tự nhiên. Các xenluloza tự nhiên sẽ được chuyển thành các xenluloza hoạt động trương nở có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzym Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đường tan (xenlobioza) và sau cùng thành glucoza[11]. Xeluloza tự nhiên Xenluloza hoạt động Đường tan Glucoza C1 Cx Xenlobiaza Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzym endoglucanaza tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt xenluloza, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanaza sẽ cắt ra tạo thành những đoạn xenlobioza. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit mạch ngắn,xelobioza, glucoza. Cuối cùng enzym xenlobiaza thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucoza. Endoglucanaza Vùng vô định hình Vùng kết tinh Exoglucanaza β-glucozidaza Glucoza Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzym C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở xenluloza kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra xenluloza biến tính. Sau đó enzym endoglucanaza tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobioza. Ông cho rằng sự thuỷ phân xenluloza là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanaza, enxoglucanaza và xenlobiaza. Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân xenluloza nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân xenluloza vẫn chưa hoàn toàn thồng nhất. 2.6.2. Enzym và cơ chế thuỷ phân hemixenluloza Khi nghiên cứu hemixenluloza, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống nhau giữa hai thành phần này.Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzym hemixenlulaza cũng có nhiều điểm tương đồng với xenlulaza ví dụ như cơ chế tác động.... Tuy nhiên, giữa hemixenlulaza và xenlulaza vẫn còn nhiều điểm khác biệt: - Hemixenluloza có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền hơn so với xenluloza - Hemixenluloza là cơ chất dễ đồng hoá hơn xenluloza do đó hemixenlulaza thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemixenluloza thường diễn ra song song với quá trình phân giải xenluloza.[5] 2.6.3. Enzym và cơ chế thuỷ phân lignin Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra ligninaza. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzym tham gia vào quá trình thuỷ phân lignin . Ligninaza không thuỷ phân lignin thành các tiểu phần hoà tan như phân giải xenluloza và hầu hết các polime khác, vì lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác ligninaza lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với lignin . Quá trình thuỷ phân có thể diễn ra theo điều kiện phản ứng hoá học sau: -Cắt oxy hoá mạch bên của đơn vị phenylpropan -Hình thành nhóm carboxyl thơm -Tách nhóm methoxyl - Hydroxyl hoá vòng thơm 2.7. Vi sinh vật phân giải xenluloza và một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật 2.7.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza vô cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. 2.7.1.1. Nấm sợi Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp xenlulaza thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp xenlulaza mạnh nhất. Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzym chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn.[11] Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzym cần cho quá trình chuyển hoá xenluloza đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài loại enzym nào đó mà thôi. Các loại nấm đáng chú ý nhất là:Alternaria tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [10] Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzym bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh xenluloza nhưng hoạt tính xenlulaza của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất xenlulaza cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6.[11] 2.7.1.2. Vi khuẩn Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kỵ khí có khả năng phân giải xenluloza. Những năm đầu thế kỷ XX(1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza, niêm vi khuẩn chiếm một vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận được năng lượng khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải xenluloza thành CO2 và H2O.[11] Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân huỷ xenluloza. Trong điều kiện kỵ khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải xenluloza. Chúng phát triển yếu trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải xenluloza thành glucoza và xenlobioza, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O. Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt. Chúng có khả năng phân giải xenluloza thành các sản phẩm.Các vi sinh vật đó thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium....[11] Ngoài ra còn có Cellulomonas, Bacillus cũng có khả năng phân giải xenluloza rất mạnh. 2.7.1.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng: Xạ khuẩn ưa ấm: phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300C Xạ khuẩn ưa nhiệt: phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 700C Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Xenlulaza của xạ khuẩn là enzym ngoại bào.[5] Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân xenluloza. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazein thường thuận lợi cho sinh trưởng. xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng .[11] Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp xenluloza và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và cộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzym xenlulaza của hai chủng Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp. 0143 với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C và pH tối thích là 5,9.[11] 2.7.2. Vi sinh vật phân giải hemixenluloza Hemixenlulaza là enzym ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanaza vì xylan là một loại hemixenluloza phổ biến trong tự nhiên.Các tác giả cho rằng nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả xenlulaza đồng thời tổng hợp cả hemixenlulaza. Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium. Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp xylanaza. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, ,T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium... 2.7.3. Vi sinh vật phân giải lignin Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Các vi sinh vật phân giải lignin thường là các loại nấm mục xốp như Paocylimyces,Allescheria, Pseussis, Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites... Ngoài ra còn có các loại nấm trắng như Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus... 2.7.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzym xenluloza của vi sinh vật 2.7.4.1.ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Xenlulaza là enzym cảm ứng, cơ chất của enzym này là xenluloza. Vì thế, xenluloza có ảnh hưởng rất rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp xenlulaza. Xenluloza gây cảm ứng cho việc hình thành xenlulaza ở nhiều loại nấm khác nhau.[11] Nấm sợi Trichoderma lignorum và Trichodema koningi tổng hợp rất nhiều enzym C1 và enzym Cx khi cho vào môi trường dinh dưỡng nguồn cacbon giấy lọc. Còn T.reesei lại rất thích hợp trong môi trường gồm cám bã và củ cải đường. Một số nguồn cacbon khác lại gây ức chế quá trình sinh tổng hợp xenlulaza như glucoza, xenlobioza... Khi nuôi cấy nấm trên môi trường chứa giấy lọc và tăng dần lượng glucoza lên, người ta nhận thấy khi glucoza tăng lên đến 2-3% sẽ xảy ra sự ức chế việc sinh tổng hợp xenlulaza. Với Pyrenochaeta terrestris là 0,001% với Fusarium culmorum là 2%.....[11] 2.7.4.2.ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Nguồn nitơ có ảnh hưởng rất rõ tới quả trình sinh tổng hợp xenlulaza của nấm mốc và vi sinh. Sin cho thấy khi sử dụng hết 1 gam nitơ, nhiều vi khuẩn có khả năng phân huỷ hết 24- 25 g xenluloza.[5] Nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp xenlulaza ở rất nhiều nấm sợi như: Aspergillus, Fusarium, Trichoderma. Muối amôn thường làm ức chế sinh tổng hợp enzym xenlulaza ở Aspergillus, Trichoderma và một số nấm khác. Nguyên nhân có thể là do muối amôn làm giảm pH của môi trường, làm bất hoạt một số enzym và làm cho các enzym này nằm trong khuẩn ty của nấm mà không thoát ra ngoài được. Các nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng không giống nhau đến các loài vi sinh vật. Pepton làm kích thích sinh tổng hợp ở Helminihosporium, Penicillium oxalicum. Nhưng pepton lại ức chế quá trình sinh tổng hợp ở Myrothecium, các loài nấm sợi Aspergillus, Chaetomium. Pepton có ảnh hưởng tốt đối với Trichoderma lignorum.[5,11] Urê làm giảm khả năng sinh tổng hợp của một loài các vi sinh vật. Cao ngô với lượng 0,5% sẽ làm kích thích sự sinh tổng hợp xenlulaza của T.koningi, A.niger, nhưng lại ức chế sự sinh tổng hợp xenlulaza ở nấm chịu nhiệt. Một số axit amin có ảnh hưởng rất rõ rệt đến quả trình tổng hợp xenlulaza của một số nấm. Khi bổ sung 0,01% valin và axit aspartic vào môi trường có thể làm tăng quá trình tổng hợp của Trichoderma. Đối với Aspergillus, một số axit amin như arginin, leuxin, histidin, cystein làm tăng khả năng sinh tổng hợp xenlulaza. Nhưng các axit amin khác lại làm giảm khả năng này.[5,11] 2.7.4.3.ảnh hưởng các nguyên tố vi lượng tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Trong các nguyên tố vi lượng, các nguyên tố sau có ảnh hưởng kích thích đến sinh tổng hợp xenlulaza: Fe, Mn, Co. Nồng độ thích hợp cho tuyệt đại đa số các loài nấm là: Zn từ 2-10 mg/l, Fe tử 3,4-27,2 mg/l. Các nguyên tố vi lượng khác từ 0,11-2,2 mg/l. 2.7.4.4.ảnh hưởng pH môi trường tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Đại đa số các loài nấm sợi phát triển và sinh tổng hợp xenlulaza mạnh ở pH=4-6. Tuy nhiên cũng có một số loài nấm sợi phát triển và phân huỷ xenluloza ở pH=1,8-2,0 như Fusarium oxysporum, Trichoderma koning. 2.7.4.5.ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh tổng hợp của các loài nấm rất khác nhau. Đại đa số chúng phát triển ở nhiệt độ 28-320C. Nhưng các loài ưa nhiệt có thể phát triển được tới 650C. Các chủng A. fumigatus ưa nhiệt thích hợp sinh trưởng và hình thành enzym phân giải xenluloza ở 650C. Những nghiên cứu của các tác giả trên về các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cho thấy khả năng phân huỷ ligno-xenluloza tập trung chủ yếu ở hai nhóm nấm sợi và vi khuẩn. Cả hai nhóm nấm sợi và vi khuẩn đều có khả năng phân huỷ ligno-xenluloza trong điều kiện tự nhiên. Các loài vi sinh vật thường không có khả năng sinh tổng hợp cùng một lúc tất cả các enzym trong phức hệ enzym xenlulaza. Phân huỷ ligno-xenluloza trong thiên nhiên được thực hiện bởi hàng loạt các vi sinh vật. Các vi sinh vật này thay phiên nhau phân huỷ các thành phần hữu cơ chứa ligno-xenluloza, tạo nên một chuỗi phản ứng liên tục cho đến khi nguyên liệu ligno-xenluloza được chuyển hoá hết. Enzym xenlulaza là một loại enzym cảm ứng. Xenluloza là cơ chất cảm ứng của enzym xenlulaza. Tuy nhiên tính chất cảm ứng của xenluloza không chặt chẽ.Tính không chặt chẽ này có lẽ phụ thuộc nhiều vào cấu tạo của cơ chất xenluloza. Trong đó tỷ lệ xenluloza kết tinh và xenluloza vô định hình có tính chất quyết định đặc tính này. Chính vì thế có loài nấm sợi phát triển tốt trên giấy lọc, loại khác lại không thể phát triển tốt được. Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp xenlulaza của sinh vật là nitơ từ các muối nitrat. Các nguyên tố vi lượng như Fe, Mn, Co; pH của môi trường trong khoảng 4-6; nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng 28-32oC thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật phân giải ligno-xenluloza. III. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.1. Nguyên vật liệu - Vi sinh vật: Các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza được phân lập được từ mẫu rác được lấy từ xí nghiệp xử lý chất thải Cầu Diễn-Hà Nội. - Dụng cụ: Máy so màu; Máy ly tâm; Kính hiển vi; Máy đo pH; Máy lắc; Cân điện; Tủ sấy; Nồi hấp; Tủ ấm. - Hoá chất: Các hoá chất dùng để làm môi trường phân lập và môi trường nuôi cấy, xác định hoạt lực enzym có tại phòng thí nghiệm tại Viện Khoa học và Công nghệ Môi trường ĐH Bách khoa HN - Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Để phân lập, nuôi cấy và giữ các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza, chúng tôi sử dụng các môi trường sau: - Môi trường 1: Để giữ giống nấm, chúng tôi sử dụng môi trường Czapek có thành phần như sau (g/l). Saccaroza 30,0 NaNO3 2 KH2PO4 1 MgSO4. 7 H2O 0,5 FeSO4. 7 H2O 0,01 KCl 0,5 Agar 20 Nước 1000 ml ; pH = 6; Khử trùng ở 1 at trong 30 phút. - Môi trường 2: Để phân lập và giữ giống vi sinh vật chúng tôi sử dụng môi trường Hutchinson-Clayton có thành phần như sau Thành phần g/l KH2PO4 1 CaCl2 0.1 MgSO4.7H2O 0.3 NaCl 0.1 FeCl3 0.01 NaNO3 2.5 CMC 5 Agar 20 Khử trùng ở 1at trong 30 phút - Môi trường 3: Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi khuẩn và nấm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường dịch thể có thành phần như môi trường 2 nhưng không có Agar. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Các phương pháp vi sinh vật học. 3.2.1.1. Phương pháp phân lập. Để thu nhận được những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza từ mẫu rác chúng tôi sử dụng môi trường 2. Môi trường sau khi khử trùng được phân phối ra các đĩa petri vô trùng. Sau đó bao gói và đặt vào tủ ấm 300C trung bình 2 ngày cho khô mặt thạch và kiểm tra mức độ vô trùng của môi trường. Chỉ những đĩa không bị nhiễm mới dùng để phân lập. Mẫu rác lấy về phòng thí nghiệm được nghiền nhỏ rồi pha ở các độ loãng khác nhau bằng cách lấy 1g rác đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng, lắc đều rồi dùng pipet hút 1 ml dịch huyền phù từ bình sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng. Cứ như vậy pha loãng tới nồng độ mong muốn. Hút ở mỗi độ pha loãng 104, 105, 106 ra 0,1 ml dịch huyền phù và nhỏ vào các đĩa petri chứa môi trường 2 đã vô trùng. Dùng que trang dàn đều dịch trên bề mặt môi trường. Đậy nắp hộp lại, bao gói và nuôi trong tủ ấm ở 300C. Phía dưới giá nuôi vi sinh vật đặt một khay nước để tạo ẩm không khí thích hợp. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong 5 - 7 ngày. Từ môi trường phân lập, chọn các khuẩn lạc phát triển mạnh, mọc riêng rẽ dùng que cấy đầu tròn cấy dích dắc vào ống thạch nghiêng chứa môi trường 2 đã vô trùng. Nuôi ở tủ ấm 300C trong 7 ngày cho vi sinh vật phát triển tốt rồi đưa các ống giống vào bảo quản lạnh trong tủ lạnh 40C. 3.2.1.2. Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Cân 1g mẫu cho vào bình tam giác chứa 99 ml nước vô trùng, lắc đều. Sau đó pha loãng, rồi dùng pipet vô trùng hút từ mỗi nồng độ pha loãng đó ra 0,1 ml dịch huyền phù và cấy lên các hộp petri chứa môi trường 4 vô trùng. Dàn đều bằng que trang, đậy nắp, bao gói rồi đưa vào nuôi trong tủ ấm. Sau 2 ngày đem ra đếm số lượng vi sinh vật. Số lượng vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau: X = x . k. v x: Số vi sinh vật trung bình trong một hộp petri k: Nồng độ pha loãng v: Thể tích dịch huyền phù dùng để cấy. 3.2.2. Các phương pháp hoá sinh 3.2.2.1. Chiết rút enzym Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng với tốc độ lắc 200vòng/phút. Sau đó loại bỏ sinh khối, dịch trong thu được chính là dịch enzym thô. 3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xenlulaza ngoại bào Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza ngoại bào của nấm sợi chúng tôi sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch, hiện màu bằng Lugol. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: Khi enzym xenlulaza thuỷ phân CMC (Cacboxymetyl Xenluloza) có trong thạch sẽ tạo thành vòng thuỷ phân màu vàng xung quanh lỗ trên nền xanh tím (do còn CMC). Dựa vào hiệu số giữa đường kính của vòng thuỷ phân và đường kính của lỗ đục mà ta xác định được hoạt tính enzym xenlulaza của vi sinh vật. Cách tiến hành như sau: Hoà tan 20g Agar và 1g CMC bằng cách đun nóng trong 500 ml nước cất. Sau đó thêm 500 ml dung dịch đệm xitrat - photphat 0,2 M (pH = 5,5). Đổ dịch lỏng vào các hộp petri sao cho chiều dày của lớp thạch khi đông lại là 3 mm. Dùng ống đục lỗ tròn với đường kính 10 mm Nhỏ vào lỗ 0,2 ml dịch enzym, lỗ đối chứng nhỏ nước cất. Để vào tủ lạnh trung bình 12h cho enzym khuếch tán sau đó cho vào tủ ấm 400C trong 6h để enzym tác dụng với cơ chất (CMC). Lấy ra, cho vào mỗi đĩa 5 ml dịch Lugol, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết dịch Lugol đi. Đo vùng CMC bị phân giải xung quanh lỗ (Vùng mầu vàng trên nền xanh tím). Hoạt tính CMC – aza biểu thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ khoan: D - d(mm) Trong đó: D - Đường kính vòng phân giải d - Đường kính lỗ khoan 3.2.2.3. Xác định sinh khối nấm sợi Cân giấy lọc đã được sấy khô ở 1050C đến trọng lượng không đổi. Dùng giấy lọc này lọc dịch nuôi cấy vi sinh vật rồi lại đem sấy khô đến trọng lượng không đổi. Cân và xác định trọng lượng khô của vi sinh vật theo công thức: P = P2 - P1 P1: Trọng lượng khô của giấy lọc P2: Trọng lượng khô của giấy lọc và vi sinh vật 3.2.2.4. Xác định sinh khối vi khuẩn Lấy 2,5 ml dịch nuôi cấy vào ống li tâm. Lắc li tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút. Thêm 1ml NaOH 2N lắc đều. Đun sôi cách thuỷ 5 phút sau đó làm lạnh. Cho thêm 0,5 ml CuSO4 2,5%, lắc đều. Đưa vào máy li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. So màu ở bước sóng 555nm. Mẫu đối chứng cũng làm tương tự nhưng thay dịch nuôi cấy bằng nước cất. Dựng đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein (casein trong nước cất) làm như trên. So màu ở bước sóng 555 nm. Sau đó dựng đồ thị chuẩn. IV. Kết quả và thảo luận 4.1. Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cao. Sau khi lấy mẫu rác và thực hiện quá trình phân lập trên môi trường 2, tôi đã lựa chọn ra 10 chủng vi khuẩn phát triển mạnh và có hình thái bên ngoài khác nhau. Các chủng này được đặt tên quy ước là: V1,V2,V3,V4,V5,V6,V7,V8,V9,V10. Bên cạnh đó, tôi cũng phân lập được 7 mẫu nấm. Các chủng này cũng được đặt tên quy ước là: N1, N2, N3, N4, N5, N6 ,N7. Nhằm mục đích tuyển chọn ra những chủng có hoạt tính xenlulaza cao nhất từ những chủng vi khuẩn kể trên, tiến hành tiếp tục quá trình nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trên môi trường 3 (môi trường 2-dịch thể). Sau khi nuôi cấy các mẫu được đem xác định hoạt tính CMC-aza. Các kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng sau: Bảng1: Khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng vi khuẩn. Chủng vi sinh vật V1 V2 V3 V4 V5 Hoạt tính CMC-aza (D, mm) 22 21 18 23 22 Chủng vi sinh vật V6 V7 V8 V9 V10 Hoạt tính CMC-aza (D, mm) 21 26 19 22 16 Đối với nấm, tiến hành nuôi cấy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trên môi trường 3 (môi trường 2-dịch thể), sau đó tiến hành xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp CMC-aza. Kết quả được trình bày trong bảng sau: Bảng 2: Khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của các chủng nấm. Chủng vi sinh vật N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 Hoạt tính CMC-aza (D, mm) 24 21 18 20 19 20 18 Kết quả thực nghiệm cho thấy, các chủng vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza khá cao. Trong các chủng vi khuẩn chọn chủng V7, còn đối với nấm tôi chọn chủng N1 làm đối tượng nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza. Đây là những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza cao hơn cả. 4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. 4.2.1. ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của chủng nấm N1. Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của N1, tiến hành nuôi lắc chủng N1 trên môi trường 3. Sau đó, chủng N1 được tiến hành xác định hoạt tính CMC-aza, cân sinh khối hàng ngày. Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng và biểu đồ sau: Bảng3: ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp của xenlulaza của chủng nấm N1. Thời gian nuôi cấy (ngày) pH cuối Hoạt tính CMC-aza (D, mm) Sinh khối (mg/ml) 1 6,1 15 3,1 2 6,3 17 4,62 3 7,2 20 4,68 4 7,3 25 4,74 5 7,6 32 4,8 6 6,5 26 3,64 7 6,4 23 3,58 Qua bảng và biểu đồ 3, ta nhận thấy hoạt tính CMC-aza và sinh khối của chủng N1 cao nhất sau 5 ngày nuôi. Tại thời điểm đó, nấm N1 phát triển mạnh nhất và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza cũng cao nhất. Khoảng thời gian thích hợp cho N1 phát triển và sinh tổng hợp xenlulaza khoảng từ 4-6 ngày. Kết quả này được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2.ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của nấm N1. pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm. Để xác định ảnh hưởng của pH ban đầu, tiến hành nuôi cấy lắc chủng nấm N1 trong môi trường 3 với vận tốc 200 vòng/phút. Môi trường ban đầu đã được điều chỉnh các mức pH khác nhau bằng HCl và NaOH để có được các mức pH từ 4-8. Sau 5 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza, pH sau nuôi cấy, sinh khối. Kết quả được trình bày trong bảng 4 và biểu đồ 2 dưới đây: Bảng 4: ảnh hưởng của pH của môi trường đầu tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. pH đầu pH cuối Hoạt tính CMC-aza (D, mm) Sinh khối (mg/ml) 4 6,83 31 2,7 5 7,36 32 3,18 6 7,67 35 3,92 7 7,96 33 2,96 8 7,59 22 2,44 Kết quả cho thấy N1 có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng (pH=3-7). Tại pH=6 thì chủng N1 có khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza mạnh nhất. Tại pH=6 thì sinh khối của của nấm cũng lớn nhất. Đa số pH sau khi nuôi cấy đều tăng lên (chỉ trừ có pH=8). Kết quả này sẽ được sử dụng cho các thí nghiêm tiếp theo. 4.2.3. ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của nấm. Khả năng hoạt động của nấm thay đổi theo sự biến thiên của nhiệt độ. Hoạt động sống của nấm cũng như các vi sinh vật khác dựa trên sự chuyển hoá của hàng loạt các phân huỷ theo những trật tự xác định. Khi nhiệt độ tăng cao thì tốc độ các quá trình này cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá một giới hạn nhất định , tốc độ các phản ứng trong cơ thể sẽ giảm đi. Điều này là do cấu trúc của protein enzym chỉ được ổn định trong một giới hạn nhiệt độ nhất định. Và cũng như vậy khi nhiệt độ xuống đến mức quá thấp cho phép. Chủng nấm N1 được nuôi cấy trong môi trường 3 với vận tốc lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian lắc 5 ngày ở pH=6 , tiến hành xác định hoạt tính CMC-aza, cân sinh khối. Kết quả thực nghiệm được trình bày theo bảng 5 và biểu đồ 3: Bảng 5: ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1 Nhiệt độ (oC) Sinh khối (mg/ml) Hoạt tính CMC-aza (D,mm) 20 3,12 32 25 3,56 34 30 3,94 36 35 3,02 27 40 2,7 22 Kết quả cho thấy N1 có khả năng phát triển trong một dải nhiệt độ khá rộng.Khi nhiệt độ tăng lên thì khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cũng tăng theo nhưng khi nhiệt độ tăng lên quá cao thì khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza lại giảm. ở nhiệt độ 30oC thì sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng N1 đạt lớn nhất Kết quả này được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.4. ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. Chủng nấm N1 được nuôi cấy trong môi trường 3 với vận tốc lắc 200 vòng/ phút. Nguồn nitơ ban đầu là NaNO3 được thay thế bằng KNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, Pepton với tổng số N/ 1lít môi trường bằng nhau. Sau 5 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza, pH cuối sau khi nuôi và sinh khối của nấm. Kết quả được trình bày trong bảng 6 và biểu đồ 4 dưới đây: Bảng 6: ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. Nguồn Nitơ pH sau khi nuôi Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối (mg/ml) NaNO3 7,34 30 4,02 KNO3 7,25 30 3,94 (NH4)2SO4 4,52 22 4,02 NH4NO3 4,58 24 3,38 Pepton 4,21 30 5,66 Nguồn Nitơ có ảnh hưởng khác nhau tới khả năng tạo thành xenlulaza ở nấm. Nitrat là nguồn Nitơ thích hợp để sinh tổng hợp xenlulaza nhưng ta lại thấy muối amôn làm ức chế sự sinh tổng hợp xenlulaza. Nguồn nitơ vô cơ là NaNO3 cho hoạt tính của xenlulaza cao nhất và sinh khối của nấm cũng đạt mức cao, pH của môi trường nuôi cấy tăng. Còn nguồn nitơ hữu cơ là pepton cũng cho thấy hoạt tính của enzym và sinh khối của nấm tạo thành khá cao có thể so sánh với nguồn nitơ vô cơ. Kết quả này sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.5. ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. Nguồn cacbon có ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza và sự phát triển của nấm. Mỗi nguồn cacbon khác nhau sẽ có tác dụng cảm ứng khác nhau lên việc hình thành xenlulaza của nấm . Chủng nấm N1 được nuôi cấy trong môi trường 3 với vận tốc lắc 200 vòng/phút. Nguồn cacbon CMC ban đầu được thay thế bằng Sacaroza, Glucoza, tinh bột. Sau quá trình nuôi cấy 5 ngày, tiến hành xác định hoạt tính CMC-aza, cân sinh khối và đo pH sau nuôi cấy của môi trường. Kết quả của nghiên cứu được trình bày trong bảng 7 và biểu đồ 5 dưới đây: Bảng 7: ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. Nguồn cacbon pH cuối Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối (mg/ml) CMC 7,34 30 4,12 Sacaroza 7,46 28 4,00 Glucoza 7,62 29 4,14 Tinh bột 7,2 30 3,78 Kết quả cho thấy nguồn cacbon có ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1. Với nguồn cacbon là CMC thì hoạt tính CMC-aza của nấm đạt cao nhất tuy nhiên, sinh khối của nấm lại phát triển cao nhất khi nguồn cacbon là glucoza.Tinh bột có hoạt tính CMC-aza khá cao nhưng sinh khối lại thấp. Đối với nguồn cacbon là sacaroza và glucoza thì pH môi trường tăng đáng kể. Chúng ta thấy rằng nguồn cacbon là CMC cho hoạt tính của enzym xenlulaza cao và lượng sinh khối cũng khá cao nên có thể coi là nguồn cacbon thích hợp cho chủng N1. 4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7. 4.3.1. ảnh hưởng của thời gian tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. Cũng như đối với chủng nấm, thời gian là một yếu tố quan trọng tác động đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của chủng V7. Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên chủng V7, tiến hành nuôi cấy chủng V7 trong môi trường 3 dịch thể với vận tốc lắc 200 vòng/phút. Sau mỗi ngày nuôi cấy bắt đầu từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 8, chúng tôi tiến hành đo pH, đo sinh khối và tiến hành xác định hoạt tính CMC-aza. Kết quả của thí nghiệm được trình bày trong bảng 8 và biểu đồ 6 dưới đây: Bảng 8: ảnh hưởng của thời gian tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. Thời gian nuôi cấy (ngày) pH cuối Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối (mg/ml) 1 7,01 22 0,34 2 7,81 26 0,82 3 7,56 23 0,69 4 7,43 21 0,64 5 7,41 17 0,61 6 7,23 16 0,52 7 7,03 15 0,41 Như qua bảng 8 và biểu đồ 6 ta nhận thấy sau 2 ngày nuôi cấy (tại ngày nuôi thứ 3) thì tại đây hoạt tính CMC-aza của chủng vi khuẩn V7 đạt giá trị cao nhất. Tại thời điểm này thì sinh khối của vi khuẩn cũng đạt mức lớn nhất. Bảng 8 và biểu đồ 6 cũng cho ta thấy rõ sự phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi khuẩn phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy. Kết quả này được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.3.2. ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. Giống như nấm, vi khuẩn muốn phát triển và sinh tổng hợp enzym mạnh nhất cũng đòi hỏi phải có một dải pH thích hợp. Để xét ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7, tiến hành nuôi cấy chủng V7 trong môi trường 3 dịch thể với vận tốc lắc 200 vòng/ phút. Môi trường đã được điều chỉnh pH bằng NaOH và HCl để có được các mức pH thích hợp từ 5-9. Sau 2 ngày nuôi cấy, mẫu chủng V7 được xác định hoạt tính CMC-aza, đo pH cuối sau nuôi cấy, xác định sinh khối của chủng V7. Kết quả của thí nghiệm được trình bày trong bảng 9 và biểu đồ 7 dưới đây: Bảng 9: ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. pH ban đầu pH sau nuôi cấy Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối (mg/ml) 5 7,81 23 0,59 6 8,03 26 0,89 7 8,48 25 0,69 8 8,65 23 0,61 9 8,71 21 0,55 Chủng vi khuẩn V7 có khả năng phát triển trong một dải pH khá rộng, từ 5-8. Kết quả của bảng 9 và biểu đồ 7 cho thấy, tại pH = 6 thì hoạt tính CMC-aza của chủng V7 đạt giá trị cao nhất . Bên cạnh đó thì cũng tại pH=6 thì sinh khối của chủng V7 cũng là lớn nhất. Kết quả này được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.3.3. ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7, tôi tiến hành nuôi cấy V7 trong môi trường 3 dịch thể, với vận tốc lắc 200 vòng/ phút ở các nhiệt độ khác nhau. Sau 2 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza, đo sinh khối của chủng V7. Kết quả của thí nghiệm được trình bày trong bảng 10 và biểu đồ 8 dưới đây: Bảng 10: ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. Nhiệt độ (oC) Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối 20 20 0,64 25 26 0,79 30 23 0,59 35 21 0,33 40 18 0,26 Qua bảng 10 và biểu đồ 8 ta nhận thấy chủng V7 phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza mạnh nhất ở nhiệt độ 25oC. Kết quả này được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.3.4. ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7. Chủng vi khuẩn V7 được nuôi cấy trong môi trường 3 dịch thể với vận tốc lắc 200 vòng/phút. Nguồn nitơ NaNO3 ban đầu được tôi thay thế bằng KNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, Pepton. Sau 2 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza, đo pH cuối và xác định sinh khối của vi khuẩn V7 Kết quả thí nghiệm được trình này trong bảng 11 và biểu đồ 9 dưới đây: Bảng 11: ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7. Nguồn Nitơ pH cuối Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối (mg/ml) NaNO3 8,16 24 0,59 KNO3 8,06 24 0,61 (NH4)2SO4 4,9 26 0,61 NH4NO3 3,17 25 0,71 Pepton 4,92 26 1,31 Từ kết quả của thí nghiệm cho thấy: Với các nguồn nitơ khác nhau thì chủng vi khuẩn V7 đều có khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza khá cao. Nhưng thích hợp nhất vẫn là nguồn (NH4)2SO4 và Pepton. Hai nguồn nitơ này cho hoạt tính của enzym vượt trội. Chúng ta có thể kết hợp cả hai nguồn nitơ này sao cho khả năng sinh tổng hợp enzym và sự phát triển của vi khuẩn đạt hiệu quả cao. 4.3.5.ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7. Nguồn cacbon là một trong những yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi khuẩn. Để xác định các tác động của nguồn cacbon đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7, nuôi cấy chủng V7 trong môi trường 3 dịch thể với vận tốc lắc 200 vòng/phút. Nguồn cacbon CMC ban đầu của môi trường được thay bằng Sacaroza, Glucoza, Tinh bột. Sau 2 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza. đo pH cuối và xác định sinh khối của chủng V7. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 12 và biểu đồ 10 dưới đây: Bảng 10 : ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7. Nguồn cacbon pH cuối Hoạt tính CMC-aza (D,mm) Sinh khối (mg/ml) CMC 8,07 25 0,33 Sacaroza 8,65 18 0,38 Glucoza 8,39 20 0,78 Tinh bột 8,52 23 0,65 Quá trình tổng hợp xenlulaza chịu ảnh hưởng của các tác động trong môi trường. Quá trình sinh hoá của các chất cảm ứng, sự kiềm chế của các chất trao đổi và các sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải đều có tác động đến quá trình này. Kết quả cho thấy, khi nguồn cacbon là CMC thì hoạt tính CMC-aza của chủng V7 sẽ cao nhưng ngược lại sinh khối lại thấp nhất. Điều này cho thấy, enzym xenlulaza là enzym cảm ứng thích hợp với các thành phần trong phức hợp xenluloza. Ngược lại, với nguồn cacbon là Glucoza thì hoạt tính không cao nhưng sinh khối lại cao nhất. Khi bổ sung glucoza thì vi khuẩn sẽ giảm cường độ sinh tổng hợp xenlulaza. Với nguồn cacbon là CMC và tinh bột thì quá trình sinh tổng hợp xenlulaza đạt hiệu quả khá cao. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượn, Phạm Văn Ty (1978),“Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập III”, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 2. Nguyễn Lân Dũng (1983), “Một số sản phẩm của vi nấm”, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 3. Nguyễn Lân Dũng (1984), “Vi sinh vật đất và sự chuyển hoá các hợp chất cacbon, nitơ”. 4.Nguyễn Lân Dũng (1982), “Thực hành vi sinh vật học”, Nhà xuất bản Đại học và THCN. 5. Nguyễn Đức Lượng (1996), “Nghiên cứu tính chất của một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp xenlulaza cao và ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ”, Luận án PTS. 6. Lê Văn Nhương (1992), “Công nghệ sinh học-cơ hội cho tất cả”, Nhà xuất bản giáo dục. 7. Lê Văn Nhương, “Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm”, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. 8. Đinh Văn Sâm, Trần Văn Nhân, “Tổng quan về chất thải Việt Nam”, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. 9. Nguyễn Thị Sơn (1979), “Thực hành vi sinh vật công nghiệp”, Trường đại học Bách khoa Hà Nội. 10. Phạm Hồ Trương (1993), “Chuyển hoá phế liệu ligno-xenluloza nhờ nấm sợi bằng phương pháp lên men bán rắn”, Luận án PTS. 11. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân, Nguyễn Lân Dũng (1982), “Enzym vi sinh vật tập II” ,Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 12. Lê Ngọc Tú và các cộng sự (1982), "Enzym vi sinh vật tập II", Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 13. Lê Ngọc Tú, Nguyễn Chúc (1975), “Men và công nghiệp thực phẩm” , Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật. 14. Lê Ngọc Tú (2002), “Hoá sinh công nghiệp”, Nhà xuất bản KHKT. 15. Công ty môi trường đô thị Hà Nội (1993), “Hiện trạng môi trường và quản lý môi trường Hà Nội”. 16. Công ty môi trường đô thị Hải Phòng (1993), “Hệ thống hình thành rác ở Hải Phòng”. 17.Bomberger D.C.R Lewis and A.Valdes, Waste characterization study: Assessment of recylable and Hazardous compinents 18. Charles Gebelein .G (1990)Biotechnology and polymers, Plenum Press New York and London. 19. Conghlan M.P. and Folan M.A (1979), “Ceelulose and cellulase: Food for thought, food for future”Int.T.biochem. 20. P.R.Hesse (1980), Improving soil fertility throught organic recycling, FAO/UNDP Regional Project RAS/75/004,The collected lectuer delivered during the project Training Course held at New Delhi, Indian. Mục lục Trang I. Mở đầu........................................................................................... II. Tổng quan.................................................................................. 2.1.Sơ lược tình hình và thành phần của rác thải sinh hoạt ở Việt Nam...... 2.1.1.Sơ lược tình hình rác thải ở Việt Nam........................................ 2.1.2.Thành phần của các rác thải sinh hoạt ở Việt Nam.................... 2.1.2.1.Thành phần cơ học........................................................... 2.1.2.2.Thành phần hoá học ........................................................ 2.2. Các phương pháp xử lý rác bằng vi sinh vật......................................... 2.2.1. Bản chất của phương pháp ........................................................ 2.2.2.Các phương pháp xử lý rác bằng công nghệ vi sinh vật ............ 2.2.2.1.Phương pháp sản xuất khí sinh học (Biogas)................... 2.2.2.2.Phương pháp chôn lấp (landfill) _ phương pháp ủ rác yếm khí................................................................................. 2.2.2.3.Phương pháp ủ rác hiếu khí (aerobic composting)............ 2.3.Sự phân bố và cấu trúc của xenluloza trong tự nhiên.............................. 2.3.1.Sự phân bố của xenluloza trong tự nhiên...................................... 2.3.2. Cấu trúc của xenluloza................................................................ 2.4.Hemixenluloza ...................................................................................... 2.5.Lignin....................................................................................................... 2.6.Cơ chế chuyển hoá ligno-xenluloza ........................................................ 2.6.1. Enzym và cơ chế thuỷ phân xenluloza ........................................ 2.6.2. Enzym và cơ chế thuỷ phân hemixenluloza.................................. 2.6.3. Enzym và cơ chế thuỷ phân lignin................................................. 2.7. Vi sinh vật phân giải xenluloza và một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của vi sinh vật...................................... 2.7.1. Vi sinh vật phân giải xenluloza .................................................... 2.7.1.1. Nấm sợi.............................................................................. 2.7.1.2. Vi khuẩn............................................................................. 2.7.1.3. Xạ khuẩn.............................................................................. 2.7.2. Vi sinh vật phân giải hemixenluloza ............................................ 2.7.3. Vi sinh vật phân giải lignin ......................................................... 2.7.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzym xenluloza của vi sinh vật.................................................................................................... 2.7.4.1. ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật.................................................................................. 2.7.4.2. ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật................................................................. 2.7.4.3. ảnh hưởng các nguyên tố vi lượng tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật................................................................. 2.7.4.4. ảnh hưởng pH môi trường tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật........................................................................................ 2.7.4.5. ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp xenlulaza của vi sinh vật............................................................................................. III. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu..... 3.1.Nguyên vật liệu......................................................................................... 3.2.Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 3.2.1. Các phương pháp vi sinh vật học.................................................. 3.2.1.1. Phương pháp phân lập. ...................................................... 3.2.1.2.Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí............ 3.2.2.Các phương pháp hoá sinh............................................................ 3.2.2.1.Chiết rút enzym.................................................................. 3.2.2.2.Xác định hoạt tính enzym xenlulaza ngoại bào ................ 3.2.2.3.Xác định sinh khối nấm sợi .............................................. 3.2.2.4. Xác định sinh khối vi khuẩn............................................. IV. Kết quả và thảo luận......................................................... 4.1.Phân lập và tuyển chọn những chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cao.......................................................................... 4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1............................................................ 4.2.1. ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của chủng nấm N1.................................................................. 4.2.2. ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của nấm N1.................................................. 4.2.3. ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1.............................................. 4.2.4. ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1..................................... 4.2.5. ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng nấm N1...................................... 4.3.Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7....................................................... 4.3.1. ảnh hưởng của thời gian tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7....................................................... 4.3.2. ảnh hưởng của pH ban đầu tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. ............................................. 4.3.3.ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng V7. ..................................................... 4.3.4. ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7. .............................. 4.3.5.ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym xenlulaza của chủng vi khuẩn V7................................ 1 3 3 3 5 5 6 7 7 9 10 10 11 12 12 13 16 16 17 18 20 21 22 22 22 23 24 25 25 25 25 26 27 27 27 29 29 30 30 30 31 32 32 32 33 33 34 34 36 36 37 39 41 43 46 46 47 49 51 52