Đề tài Phân tích chuyên dùng trong kiểm định chất lượng thủy sản

cho đến khi phân tích. Nếu các mẫu không thể bảo quản đông, có thể bảo quản trong tủ lạnh 0 – 40C nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm khó hư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Tốt nhất nên giữ mẫu trong các bao bì ban đầu. Nếu phải chuyển mẫu qua bao bì khác, mẫu phải được chứa đựng trong bao bì vô trùng/sạch và làm bằng vật liệu không ảnh hưởng đến chất lượng và tình trạng ban đầu của mẫu, làm sai lệch kết quả phân tích. Mẫu phải được bảo quản trong điều kiện thích hợp trước khi vận chuyển về phòng kiểm nghiệm. Các vật dụng chứa mẫu phải được thiết kế sao cho mẫu không bị nhiễm bẩn và tránh các hiện tượng thay đổi khác do các yếu tố cơ, lý, hóa học. Chế độ bảo quản mẫu: Đối với mẫu mau hỏng (Sushi các loại, đông IQF, dạng hút chân không, dạng ướt đá) : Phải được bảo quản lạnh ngay sau khi lấy mẫu bằng thùng cách nhiệt có đá để duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp ( 0 – 40C). Mẫu cần được để trong bao bì kín, tránh tiếp xúc trực tiếp với nước đá. Mẫu không thuộc mẫu mau hỏng: Sử dụng các bao túi kín, nhiệt độ bảo quản trong thời gian vận chuyển không vượt quá 450C. Mẫu dạng đông block: không được để tan đá một phần hoặc toàn bộ trước khi về đến phòng kiểm nghiệm. Yêu cầu về mẫu kiểm: Mẫu được chấp nhận khi Dụng cụ chứa mẫu không rò rỉ, có nắp đậy kín, không bị rứt, thủng gây nhiễm bẩn vào mẫu. Mẫu dạng hút chân không: bao bì kín, không có khí bên trong. Mẫu dạng block, dạng nguyên con phải nguyên vẹn, không giập nát. Mẫu phải được phân tích trong vòng 24 giờ từ khi lấy. Trong trường hợp xác định được thời gian sử dụng, yêu cầu về nhiệt độ và thời gian chờ kiểm có thể rộng hơn.Mẫu kiểm dạng đông phảo được bọc để chống mất nước và giữ ở nhiệt độ tối đa 180C cho đến khi phân tích. Thực phẩm đông lạnh: Mẫu kiểm hang đông phải được rã đông ở 40C trong vòng 18 giờ. Những mẫu có kích thước nhỏ hoặc dễ tan có thể đặt trong tủ ấm ( ≤ 370C ) để rã đông. Quá trình rã đông phải được hoàn tất trong vòng 15 phút. KIỂM TRA NHANH Kiểm tra hàm lượng Urê trong thủy sản: Giấy thử urê và dụng cụ cảm biến urê do một nhà khoa học vừa mới chế tạo TS.Trần Bích Lam, Khoa Kỹ thuật Hóa học – Trường ĐH Bách khoa (ĐH Quốc gia TPHCM) và các cộng sự vừa thành công trong việc chế tạo 2 dụng cụ phân tích nhanh giúp xác định urê trong thực phẩm. Đó là giấy thử urê và dụng cụ cảm biến urê - có thể cho kết quả chỉ trong vòng 10-15 phút. Theo TS Lam thì 21/30 mẫu thử nghi vấn (cá, tôm, mực, muối dùng ướp cá, nước đá ướp cá, nước rỉ từ xe ướp cá...) cho kết quả có chứa hàm lượng urê quá cao. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự có mặt của urê trong thực phẩm, ngoài lượng urê nội sinh thì urê được dùng để bổ sung vào môi trường lên men, dùng trong thức ăn cho bò sữa, thậm chí để ướp thủy hải sản. Có trường hợp urê còn được những đối tượng gian lận cho thêm vào sản phẩm nhằm làm tăng độ đạm tổng, dẫn đến việc xác định sai hàm lượng protein và giá trị dinh dưỡng thật của thực phẩm. Ngoài ra, urê còn xuất hiện trong nguồn nước ô nhiễm và thực phẩm bị nhiễm phân - nguyên nhân gây ra một số bệnh và dịch bệnh liên quan đến đường ruột, viêm gan A, viêm gan E... “Vì thế, kiểm soát hàm lượng urê trong thực phẩm là việc làm cần thiết để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng”- TS Lam nhấn mạnh. Giấy thử urê: Được làm từ một loại cellulose có đủ độ dai, cứng để khi đưa vào môi trường dung dịch lỏng vẫn giữ được hình dạng. Phải đủ độ xốp để có thể thấm được dung dịch lên nó. Giấy thử này hoạt động trên nguyên lý ứng dụng thành tựu của enzym học để phân tích nhanh. Giới hạn phát hiện là 50 ppm. Nếu được thương mại hóa, mỗi miếng giấy thử chỉ có giá khoảng 900 đồng, sử dụng cho một lần thử. Phưong pháp: Đặt đầu trắng của giấy thử vào dung dịch cần thử và chờ khoảng 15 phút. Khi đó, dung dịch sẽ tự thấm lên giấy và giấy sẽ đổi màu. Nếu trong dung dịch có urê thì cột màu sẽ chuyển sang màu hồng hay đỏ. Dung dịch chứa càng nhiều urê thì màu đỏ càng đậm hơn. Nếu cá nhiễm urê thì giấy thử sẽ chuyển sang màu đỏ Dụng cụ cảm biến urê (urea biosensor) Cảm biến này được chế tạo trên cơ sở máy đo pH được gắn cố định enzym urease Ngoài việc xác định mẫu có urê hay không còn có khả năng cho biết hàm lưọng của urê. Dụng cụ cảm biến biosensor có giá khoảng 600.000 đồng/chiếc, không giới hạn thời gian và số lần sử dụng. Nguyên tắc: Nếu dung dịch thử có chứa urê thì sẽ phản ứng với enzym làm tăng pH. Dựa vào khoảng pH biến đổi có thể biết được có urê hay không và lượng urê là bao nhiêu. Phưong pháp: Nhúng điện cực của dụng cụ cảm biến vào dung dịch, để khoảng 10 phút và dựa vào đường chuẩn để biết được nồng độ urê. Nhờ tính tiện dụng và thời gian cho kết quả nhanh, các dụng cụ này có thể trở thành công cụ đắc lực cho các bà nội trợ chọn lựa thực phẩm an toàn cho gia đình, những người giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm, các trạm thu mua sữa, thủy hải sản... NITRIT Nitrite là một hóa chất có tác dụng chống thối, làm tươi thực phẩm Nhiều loại thực phẩm trên thị trường được ướp chất này để bảo quản. Nitrit là một dạng hóa chất cực độc - chất gây bệnh ung thư.Tuy nhiên, nếu ăn thực phẩm chứa độc tố này sẽ dễ bị ngộ độc, về lâu dài có thể ung thư dạ dày, đại tràng. Chỉ cần dùng thẻ có tẩm dung dịch quết lên thực phẩm, sau năm phút người tiêu dùng sẽ biết chính xác hàm lượng nitrit có trong thực phẩm. Kiểm nhanh dư lượng Chloramphenicol: Chloramphenicol là một loại kháng sinh phổ rộng, nó được sử dụng thường xuyên cho quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc động vật nhờ có các đặc tính kháng khuẩn và dược động học tuyệt vời của nó. Tuy nhiên, trong cơ thể người nó lại có thể gây ra những độc tính huyết học, cụ thể là thiếu máu biến dạng với 1 hàm lượng nào đó chưa được xác định rõ. Điều này dẫn đến việc Chlorampheni col đã bị cấm sử dụng trong việc điều trị cho súc vật dùng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm. Dư lượng Chloramphenicol trước đây thường được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunologically) hoặc sắc ký khí (gas chromatographically). Dụng cụ: Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol (40 chiếc). Chất hút ẩm (một miếng cho mỗi gói). Chất đệm PBST (một lọ cho mỗi bộ). Ống nhỏ giọt sử dụng một lần (một ống cho mỗi gói). Tờ hướng dẫn sử dụng. NGUYÊN LÝ: Nguyên tắc của xét nghiệm này là phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Xét nghiệm nhanh bằng 1 bước duy nhất này là một xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh, trong đó chất dò (detector reagent) bao gồm những mảnh vàng keo (colloidal gold) được tráng phủ bởi các kháng thể kháng Chloramphenicol tinh khiết ái lực. Trong khi đó chất phát hiện (capture reagent) là một phức hợp Chloramphenicol-protein được đính trên màng của dụng cụ xét nghiệm. Trong quá trình xét nghiệm, mẫu thử đi qua màng này. Càng có nhiều chất phân tích trong mẫu thử, chúng sẽ càng cạnh tranh mạnh hơn với Chloramphenicol đính trên màng để gắn kết với các kháng thể của chất dò (có số lượng giới hạn). Chloramphenicol, nếu tồn tại trong mẫu thử với hàm lượng trên 0,1 ppb  sẽ ngăn chặn sự gắn kết của chất dò với Chloramphenicol đính trên màng, cho ra kết quả dương tính. Các ưu điểm của phương pháp này: Sử dụng đơn giản, không cần phải có trình độ hoặc kỹ năng đặc biệt. Không cần trang bị kiến thức đặc biệt, chỉ cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước khi thực hiện. Rẻ tiền, và không cần phải trang bị các máy móc đắt tiền và chuyên dùng. Kết quả dễ xem xét và đánh giá. Có thể thực hiện ngoài trời, tại điểm thu mua/ thanh tra. Tiết kiệm thời gian: chỉ cần vài phút để đọc kết quả. Chính xác: phát hiện chính xác đến ngưỡng của các thiết bị thông dụng hiện nay, và tương thích với các quy định hiện hành trên thế giới. Sạch và an toàn: không gây hại cho sức khỏe người, súc vật và môi trường. Dễ bảo quản: bảo quản trong điều kiện bình thường, ở nhiệt độ phòng. Phân tích thủy ngân bằng phương pháp CV-AAS Phương pháp: Phương pháp hóa hơi lạnh chỉ được dùng để xác định thủy ngân vì ở nhiệt độ phòng, Hg tồn tại ở thể lỏng với áp suất hơi bão hòa khá cao 1,3.10-3 mm Hg(1,71.10-6atm ở 25o C). Mặt khác ở thể hơi thì Hg tồn tại ở trạng thái đơn phân tử, cho nên thay vì sử dụng nhiệt độ cao để nguyên tử hóa Hg từ các hợp chất của thủy ngân người ta sử dụng chất khử mạnh để khử trực tiếp Hg2+ về Hg0 dễ bay hơi và dòng thời sử dụng một dòng khí mang sục vào dung dịch lôi cuốn hơi Hg đến ống thạch anh, tại đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 253.7 nm từ đèn HCL. Khí mang thường sử dụng là Ar, N2 hoặc không khí sạch. Chất khử mạnh được sử tốt hiện nay là NaBH4 (E0H+/H = -2.107 V) khử Hg2+ ( ) trong môi trường acid HCl theo phản ứng: BH4 - + 3 H2O + H+ = H3BO3 + 8 H HgCl42- + 2 H = Hg 0 + 2 H ++ 8 Cl- Mẫu thủy sản được vô cơ hóa bằng acid nitric đậm đặc trong bình phá mẫu bẳng nhựa teflon có nắp vặn kín. Thủy ngân trong dung dịch mẫu bị hydride hóa bằng dòng khí hydro. Hydride thủy ngân dễ bay hơi bị cuốn theo dòng khí hydro và được bơm vào hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. Tại đây hydride thủy ngân bị phân hủy thành hơi thủy ngân và được xác định theo phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không dùng ngọn lửa. các phản ứng xảy ra trong hệ thống bay hơi : NaBH4 + HCl = NaCl + BH2 + 2H 4H + HgCl2 = HgH2 + 2 HCl HgH2 = Hg + H2 Thiết bị và dụng cụ: Máy quang phổ hấp thu nguyên tử sử dụng đèn cathode thủy ngân rỗng với hệ thống bay hơi nguyên tử hydride. Bình phá mẫu bằng nhựa teflon có năp vặn kín dung tích 50 ml. Tủ sấy nhiệt độ 150 0C. Dụng cụ thủy tinh đã được rửa sạch bằng acid nitric nồng độ 8N và tráng lại bằng nước cất trước khi sử dụng. Cân phân tích có độ chính xác loại đến 0.01g và loại đến 0.0001g. Hóa chất và chất chuẩn: Acid nitric đậm đặc. Acid sunfuric đậm đặc. HCl 1N. Dung dịch hòa tan cho khoảng 300 – 500 ml nước cất vào bình định mức1000 ml, cho thêm 58 ml acid nitric và 67 mn acid sulfuric, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất. Dung dịch NaOH 0.25M: hòa tan 10 g NaOH trong 1000ml nước cất . Dung dịch tetrahydrua boric natri (NaBH4) nồng độ 3%: hòa tan 1.5 g NaBH4 trong 10 ml dung dịch NaOH. Dung dịch thủy ngân chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml: hòa tan 1.000g Hg trong 1000 ml H2SO4 1N. Dung dịch chuẩn trung gian 1 mg/ml: pha loãng 1ml dung dịch chuẩn gốc thành 1000 ml bằng dung dịch H2SO4 1N. Dung dịch chuẩn làn việc: pha loãng dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm viếc có hàm lượng Hg lần lượt là 0.0; 2.0; 4.0;6.0; 8.0; 10.0 mg/l bằng dung dịch acid nitric 1N. Phương pháp tiến hành: Vô cơ hóa mẫu Cân khoảng 1.00 g mẫu sao cho khối lượng khô không nhiều hơn 300mg. Đối với mẫu có hàm lượng chất béo cao, lượng mẫu dùng sao cho khối lượng khô không lớn hơn 200mg. cho mẫu vào bình phá mẫu, thêm 5ml acid nitric đậm đặc rồi vặn chặt nắp đậy kín bình lại. Để bình vào tủ sấy đã đặt ở nhiệt độ 1500C trong vòng 30 – 60 phút hoặc cho đến khi dung dịch trở nên trong. Lấy bình ra khỏi tủ sấy, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi mở nắp và chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 250ml. Tráng rửa bình phá mẫu bằng khoảng 95ml dung dịch hòa tan (IV.3.2.d), rót nước rửa vào bình định mức bằng nước cất cho đến vạch rồi lắc đều. Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 1g mẫu bằng 1mm nước cất rồi tiến hành các bước như vô cơ hóa mẫu. Tiến hành phân tích Tối ưu hóa các điều kiện làm việc của máy quang phổ hấp thu nguyên tử nà hệ thống bay hơi nguyên tử hydride. Nối hệ thống nhưng chưa nối đầu khí vào của bình đun chứa mẫu điều chỉnh lưu lượng không khí đầu ra của bơm để đạt được lưu lượng khoảng 2 l/phút bằng cách điều chỉnh tốc độ của bơm thông qua điện áp kế. Nối hoàn chỉnh hệ thống thiết bị theo sơ đồ lắp đặt hệ thống quang phổ hấp thu nguyên tử, Xây dựng đường chuẩn bằng cách bơm các mẫu chẩu với hàm lượng Hg lần lượt là 0.0; 2.0; 4.0;6.0; 8.0; 10.0 ppb rồi xác định độ hấp thu của chúng thông qua diện tích peak. Khi đường chuẩn có độ tuyến tính tốt, tiến hành bơm các dung dịch mẫu thử và mẫu trắng rồi xác định độ hấp thụ của chúng thông qua diện tích peak.Tính hàm lượng thủy ngân trong mẫu thông qua đường chuẩn sau khi đã trừ đi mẫu trắng. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích: Độ lặp lại của 2 lần bơm: độ lệch chuẩn (CVs ) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơm liên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0.5%. Độ thu hồi (R) được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch Hg chuẩn biết chính xác nồng độ. Độ thu hồi tính dược phải nằm trong khoảng 85% - 100%, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%. Tính kết quả : Hàm lượng Hg trong mẫu thử thủy sản được tính theo công thức sau: Trong đó: CHg là hàm lượng Hg có trong mẫu thử (mg/l) MHg là hàm lượng Hg có trong dịch mẫu tính được theo đường chuẩn (mg/l) V là thể tích dung dịch dùng để hòa tan mẫu thử (ml) M là khối lượng mẫu thử (g) 4. Nguyên tắc kỹ thuật nguyên hóa không ngọn lửa - Nguyên tắc kỹ thuật nguyên hóa không ngọn lửa là dùng năng lượng của dòng điện công suất lớn hay năng lượng của dòng cao tần cảm ứng để nguyên tử hóa gần như tức khắc mẫu chúa chất phân tích trong cuvet graphite và trong môi trường khí trơ để tạo ra các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc tạo ra phố hấp thụ nguyên tử của nó. Mẫu chứa nguyên tố cần xác định được đưa vào lò graphite bằng bộ hút mẫu tự động hoặc bằng tay với thể tích rất nhỏ từ 20 µm - 50 µm. Quá trình phân tích nguyên tố trong lò graphite bằng phương pháp này xảy ra theo 4 giai đoạn kế tiếp nhau trong tổng thời gian là 60 – 80s. Các giai đoạn đó là : Sấy khô mẫu: làm cho dung môi hòa tan mẫu bay hơi nhẹ nhàng và hoàn toàn nhưng không làm mất mẫu. Tro mẫu hóa: nhằm mục đích đốt cháy các hợp chất hữu cơ có trong mẫu sau khi sấy khô. Mỗi nguyên tố đều có nhiệt độ tro hoá mẫu giới hạn cho nó trong phép đo GF- AAS. Nhiệt độ tro hóa giới hạn của mỗi nguyên tố là khác nhau. nó phụ thuộc vào bản chất của mỗi nguyên tố và phụ thuộc vào dạng hợp chất mà nguyên tố đó tồn tại cũng như nền màu. Nguyên tử hóa: thực hiện nguyên tử hóa trong thời gian rất ngắn, thông thường từ 3-6 s nhưng tốc độ tăng nhiệt độ lại rất lớn thường cỡ 18000C/s- 2500 0C/s. mỗi nguyên tố đều có nhệt độ nguyên tử hóa tới hạn cho nó trong phép đo GF-AAS. Nhiệt độ này phụ thuộc vào bản chất của mỗi nguyên tố và cũng phụ thuộc vào bản chất mà nguyên tố đó tồn tại và thành nền của mẫu, nên tiến hành nguyên tử hóa ở nhiệt độ không được lớn hơn nhiệt độ tới hạn và chọn thời gian nguyên tử hóa sao cho peak cường độ vạch phổ nhọn. Làm sạch cuvet: thực hiện ở nhiệt độ trên 27000C để bốc hơi tất cả các chất còn lại trong lò, chuẩn bị cho lần phân tích tiếp theo. Khí argon tinh khiết 99.999% được dùng làm môi trường cho quá trình nguyên tử hóa. Các nguyên tố Hg, Cd, Pb, As đều có nhiệt độ hóa hơi thấp vì vậy nếu tro hóa cũng như nguyên tử hóa ở nhiệt độ cao thì xảy ra sự mất mát đáng kể các nguyên tố phân tích. Để khắc phục người ta sử dụng các chất modifier trong phân tích các nguyên tố trên bằng phương pháp GF-AAS. Các chất modifier tạo với nguyên tố phân tích bền với nhiệt nên cho phép tro hóa và nguyên tử hóa ở nhiệt độ cao hơn, làm tăng độ nhạy của phương pháp Pd là chất có tác dụng modifier rất mạnh trong việc xác định hầu hết các nguyên tố phân tích. Pd loại trừ được nhiễu hóa học nói chung cũng như cho phép tiến hành nguyên tử hóa ở nhiệt độ cao mà không bị hao hụt chất phân tích. Trong quá trình nguyên tử hóa hợp kim Pd – kim loại bay hơi một cách đột ngột và hoàn toàn giúp ổn định tín hiệu hấp thu của kim loại. Ngoài ra mỗi nguyên tố còn có thể sử dụng các chất modifier khác nhau tùy theo yêu cầu của nhà sản xuất hoặc khi có sự nhiễu rõ. Đối với phép đo GF – AAS phần lớn các trường hợp phải hiệu chỉnh nền. Ngoại trừ trường hợp đo ở λ > 450 nm. Một trong các kĩ thuật hiệu chỉnh cản nhiễu do matrix là hiệu chình nền dựa trên hiệu ứng Zeeman. Nguyên tắc theo sơ đồ trên: Bức xạ phát ra từ đèn HCL hoặc EDL là bức xạ không phân cực sau khi khi đi qua phân kính cực quay bức xạ này tách thành 2 thành phần phân cực mà các mặt phẳng phân cực trực giao với nhau. một từ trường mạnh được áp vào hơi nguyên tử trong lò graphite. Từ trường tách ra các mức năng lượng điện của nguyên tử thành vài vạch hấp rất sít nhau ( gần bằng 0.1 nm). Bức xạ phân cực đi qua hơi nguyên tử đặt trong từ trường. Ở nửa chu kì quay, tại đó thành phần phân cực có mặt phẳng song song với trường ngoài ta đo được tín hiệu Vmẫu + matrix. ở giữa chu khì quay tiếp theo tại đó thành phần phân cực trực giao với từ trường ngoài ta đo được tín hiệu Vmatrix. Vậy : Vmẫu = Vmatrix - Vmẫu + matrix Các ứng dụng: Xác định Pb Nhiệt độ tro hóa 8000C. Nhiệt độ nguyên tử hóa 12000C. Các chất modifier thường được dùng là: 50 µg NH4NO3,hoặc 50 µg La(NO3)2,hoặc 50 µg Mg(NO3)2,hoặc 50 µg ascorbic acid Tín hiệu hấp thụ: 20µL của 1.7 µg/L dung dịch Pb cho tín hiệu 0.1A Xác định Cd: + Khi không có modifier : Nhiệt độ tro hóa 3000C. Nhiệt độ nguyên tử hóa 9000C. + Khi có modifier 10 µg Pd(NO3)2 hoặc 20 µg NH4NO3 hoặc 20 µg Mg(NO3)2: Nhiệt độ tro hóa 8000C. Nhiệt độ nguyên tử hoá 10000C Tín hiệu hấp thu : 20µL của 0.6 µg/L dung dịch Cd cho tín hiệu khoảng 0.1A. Xác định As : + Không có modifier nhiệt độ tro hóa 4000C: Nhiệt độ nguyên tử hóa 21000C. + Khi có modifier 20 µg Ni(NO3)2. Nhiệt độ tro hóa 12000C. Nhiệt độ nguyên tử hóa 26000C. Tín hiệu hấp thu: 20 µL của 0.6 µg/L dung dịch As cho tín hiệu khoảng 0.1A. Xác định thủy ngân : + Khi không có modifier Nhiệt độ tro hóa 2000C. Nhiệt độ nguyên tử hóa 7500C. + Có modifier 50 µg (NH4)2Cr2O7 hoặc 500 µg vàng hoặc 500 µg Pd. Nhiệt độ tro hóa 5000C. Nhiệt độ nguyên tử hóa 7500C. Tín hiệu hấp thu 20µL của 60 µg/L dung dịch Hg cho tín hiệu cỡ 0.1A. Ưu nhược điểm của phương pháp GF-AAS Ưu điểm: Có độ nhạy cao cỡ ppb, có khi gấp hàng trăm đến hàng ngàn lần phép đo F-AAS. Do đó khi phân tích hàm lượng vết các kim loại trong mẫu thực phẩm không cần phải làm giàu mẫu. Phép đo đòi hỏi lượng mẫu nhỏ mỗi lần đo chỉ cần từ 20 µL - 50 µL dung dịch mẫu. Do đó không cần lượng lớn mẫu phân tích ít tốn hóa chất cũng như các dung môi tinh khiết cao, đắt tiền.Thao tác đo dễ dàng và có thể xác định liên tiếp nhiều nguyên tố trong cùng một mẫu. Kết quả phân tích ổn định, sai số nhỏ. Nhược điểm: Do có độ nhạy cao nên tránh sự nhiễm bẩn, các dụng cụ hóa chất phải có độ tinh khiết cao. Ảnh hưởng của phổ nền lớn nhưng hiện nay đã khắc phục được bằng các hệ thống bổ chính nền để đảm bảo độ nhạy cỡ ppb đối với nhiều nguyên tố. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THEO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG Phương pháp định lượng Sulfit trong sản phẩm thủy sản Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng sulfit trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 mg/g. 1.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Ủy ban Phân tích thực phẩm khối Bắc Âu NMKL số 132 - 1989 (NODISK METODIKKOMMITTE FOR LIVSMEDEL Nordic committee on food analysis - Sulphite Spectrophotometric determination in foods). 1.3.Nguyên tắc Mẫu sản phẩm được axit hóa bằng axit sulfuric H2SO4 và chưng cất trong thiết bị Kjeldahl bán vi lượng. Hơi SO2 tạo thành phản ứng với 2,2'- đinitro-5,5'-đithiobenzoic axit (DTNB) trong cốc nhận để hình thành phức axit 5-mercapto-2- nitrobenzoic có mầu vàng chanh đậm. Cường độ mầu của phức axit được đọc trên máy quang phổ tại bước sóng l là 412 nm. Nồng độ của SO2 trong mẫu được tính toán theo cường độ mầu của phức axit theo phương pháp ngoại chuẩn. 1.4. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu thử: đồng nhất mẫu thử bằng máy nghiền đồng thể .Cân 2 mẫu, mỗi mẫu 5,00 g trong cốc có mỏ 100 ml. Trộn đều mẫu đã cân với 15 ml nước cất. Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng là mẫu được xác định trước không chứa sulfit. Chuẩn bị mẫu trắng giống như đối với chuẩn bị mẫu thử quy định như trên. Lập đường chuẩn Cho vào 2 bình tam giác dung tích 250 ml, mỗi bình 5 ml dung dịch chuẩn Iot Chuẩn độ với dung dịch chuẩn đisulfit (0,0005 M) (0,064mg SO2/ml) đến mầu vàng nhạt. Thêm dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch đổi mầu. Dùng pipette nhỏ lần lượt 0,1, 2, 3, 4, và 5 ml dung dịch đisufit đã được chuẩn độ ở trên vào trong các bình định mức 50 ml có chứa 25 ml dung dịch thuốc thử 2,2'-đinitro-5,5'-đithiobenzoic axit (DTNB). Sau đó, pha loãng đến vạch với dung dịch đệm phosphat pH=8 rồi để yên trong 10 phút. Hiệu chỉnh máy quang phổ UV-VIS với nước cất ở 412 nm (độ hấp thu là 0 đối với nước cất). Xác định lần lượt độ hấp thụ của các dung dịch đã được chuẩn bị ở trên bằng máy quang phổ. Thành lập đồ thị theo các giá trị của độ hấp thu và nồng độ sulfit của dãy chuẩn theo mg/ml. Hàm lượng SO2 trong dịch mẫu được tính theo đường hồi quy tuyến tính của đồ thị thu được sau khi hiệu chỉnh với giá trị hấp thu của mẫu trắng. Tiến hành thực nghiệm Chuyển mẫu trắng và các mẫu thử đã chuẩn bị theo Điều 5.1 lần lượt vào các bình chưng cất. Tráng rửa các cốc đựng mẫu với 10 ml nước cất rồi cho hết vào bình chưng cất. Lắp đặt bình vào bộ chưng cất Kjeldahl bán vi lượng, dung tích 100 ml. Đặt bình tam giác thu hồi chứa 50 ml DTNB ở đầu ra của ống ngưng tụ. Nối các đường dẫn khí nitơ và nước làm nguội vào thiết bị chưng cất. Cho vào bình chưng cất 20 ml axit sulfuric 10 N qua chiếc phễu gắn ở phía trên bộ chưng cất và nhanh chóng đóng kín hệ thống lại.Chưng cất trong vòng 4 phút. Lấy bình hứng ra khỏi bộ chưng cất. Rửa bình ngưng và ống nối với dung dịch đệm phosphat pH = 8, chuyển dịch rửa vào bình thu hồi. Chuyển toàn bộ dịch cất vào bình định mức dung tích 50ml rồi rửa bình thu hồi với dung dịch đệm phosphat .Chuyển dịch rửa vào bình định mức rồi định mức với dung dịch đệm. Đọc chỉ số ABS sau 10 phút với bước sóng 412 nm và dùng nước cất là dung dịch so sánh. Nếu trị số ABS > 1,5, phải pha loãng dung dịch với hỗn hợp với tỷ lệ 1:1 của dung dịch đệm phosphat và dung dịch thuốc thử DTNB rồi tiến hành đọc lại. 1.5. Tính kết quả Tính nồng độ dung dịch gốc đisulfua theo công thức sau: Trong đó: V0 là số ml dung dịch iot 0.05M được sử dụng tại Điều 5.2.1. VSO2 là số ml dung dịch gốc đisulfit 0.0005M dùng cho chuẩn độ, C0 là nồng độ của dung dịch iot , tính theo mol/1, MV là phân tử gam của SO2 (64,06 g/mol). Tính hàm lượng SO2 trong mẫu . Tính lượng SO2 trong dung dịch mẫu từ đường chuẩn . Tính nồng độ SO2 trong mẫu theo công thức sau: Trong đó: A là nồng độ SO2 tìm thấy từ đường chuẩn, tính theo mg/ml, V là thể tích của dịch cất , tính theo ml, g là hệ số pha loãng , g = 1 nếu không pha loãng, m là khối lượng mẫu cân, tính theo g 1.6.Báo cáo kết quả Hàm lượng của sufit là giá trị trung bình của 2 lần thử song song tính theo mg/kg. Phương pháp định tính axit boric và muối borat trong sảm phẩm thủy sản. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính axit boric và muối borat của nó trong sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1 %. Phương pháp tham chiếu: Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chính thức của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích quốc tế AOAC 970.33 -1995 (AOAC official method 970.33 - Boric acid and borates in food) và Thường quy kỹ thuật định tính và bán định lượng xít boric hoặc natri borat trong thực phẩm (Quyết định số 3390/QĐ-BYT ngày 28/91/2000 của Bộ Y tế). Nguyên tắc Mẫu sản phẩm được chiết thử sơ bộ bằng dung dịch nước cất hoặc thử xác nhận bằng than hóa trước khi chiết. Axit boric và muối có trong dịch chiết đã được xít hóa tác dụng với curcumin trên giấy nghệ tạo thành phức mầu cam đỏ. Trong môi trường hơi amoniac (NH3) mầu cam đỏ chuyển thành mầu xanh lục và trở lại mầu đỏ bởi hơi axit clohyđric (HC1). Phương pháp tiến hành: Thử sơ bộ. Dùng đũa thủy tinh khuấy trộn đều 25 g mẫu đã xay nghiền với 10 ml nước cất trong bình tam giác 125 ml rồi đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ. Đun từ từ bình tam giác trên bếp điện cho đến sôi dung dịch. Chú ý phải lắc đều khi đun. Làm nguội mẫu rồi lọc dịch trong bằng giấy lọc whatman số 02. Axit hóa dịch lọc bằng axit HCl đậm đặc tới khi pH = 5 rồi rót dịch vào trong ống nghiệm 15 ml. Nhúng một đầu giấy nghệ vào trong ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng 1/2 chiều dài tờ giấy. Lấy giấy ra rồi để khô tự nhiên. Quan sát mẫu của giấy thử, tiến hành đọc kết quả . Thử xác nhận: Tiến hành thử khẳng định đối với các mẫu cho kết quả dương tính trong phép thử sơ bộ theo quy trình sau: Kiểm hóa 25 g mẫu với nước vôi hoặc sữa vôi trong chén sứ . Đun từ từ mẫu trong chén sứ trên bếp điện cho bay hơi đến khô. Đặt chén sứ vào trong lò nung ở nhiệt độ 3500c trong 4 giờ cho đến khi các chất hữu cơ cháy thành than hoàn toàn. Sau đó, để nguội rồi hòa tan cặn với 4 ml nước cất và thêm từng giọt axit HCl đậm đặc cho đến khi dung dịch có tính axit rõ rệt (pH = 5). Lọc dung dịch vào ống nghiệm. Nhúng một đầu giấy nghệ vào trong ống nghiệm chứa dịch mẫu cho ngập khoảng 1/2 chiều dài tờ giấy. Lấy giấy ra rồi để khô tự nhiên. Quan sát mầu của giấy thử, tiến hành đọc kết quả . Đọc kết quả: Nếu có borat trong mẫu thì giấy nghệ chuyển sang mầu cam đỏ đặc trưng. Đặt giấy nghệ lên miệng ống nghiệm chứa dung dịch amoni hyđroxit NH4OH đậm đặc. Giấy nghệ phải chuyển sang mầu xanh lục và trở lại mầu đỏ khi đặt giấy trên ống nghiệm chứa axit HCl . 3. Phương pháp định tính Urê trong sản phẩm thủy sản 3.1. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính urê trong sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 %. Nguyên tắc : Mẫu sản phẩm được chiết với dung dịch nước. Urê có trong dịch chiết phản ứng với thuốc thử p - đimetylaminobenzalđehyt tạo phức mầu vàng chanh đặc trưng. Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu Đồng nhất khoảng 200 g mẫu thủy sản bằng máy nghiền đồng thể . Cân 25 g mẫu đã xay nghiền đưa vào bình tam giác dung tích 50 ml. Thêm 25 ml nước cất rồi khuấy trộn đều bằng đũa thủy tinh. Sau đó, đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ . Đun từ từ bình tam giác trên bếp điện cho đến sôi. Chú ý, khi đun phải lắc đều. Làm nguội mẫu rồi dùng giấy lọc Whatman để lọc lấy dịch trong. Tiến hành: Nhỏ 5 - 6 giọt dịch mẫu vào trong ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch thuốc thử urê. Đun nóng dung dịch trong 1 phút. Quan sát mầu dung dịch. Tiến hành đọc kết quả Đọc kết quả: Kết luận mẫu có Urê nếu mầu dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang mầu vàng chanh đậm. Nồng độ của Urê trong mẫu càng cao thì mầu vàng của dung dịch càng đậm. Phương pháp định lượng bằng sắc ký ion muối Polyphosphat trong sản phẩm thủy sản 4.1.Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng muối polyphosphat bao gồm ortophosphat (monophosphat), pyrophosphat (điphosphat), tripolyphosphat trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký ion. Phương pháp tham chiếu: Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp của Trung tâm Hóa học tư pháp quốc gia của Cục Thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ (National Forensic Chemistry Center, U.S. Food and Drug Administration, Cincinnati, Ohio: De- termination of tripolyphosphate and related hydrolysis products in processed shrimp). Nguyên tắc: Polyphosphat trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng nước cất khử ion. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột chiết pha rắn C18. Hàm lượng polyphosphat có trong dịch chiết được xác định trên máy sắc ký ion sử dụng hệ thống phản ứng sau cột với tác chất phản ứng là sắt nitrate trong axit percloric và đầu dò UV tại bước sóng là 330 cm theo phương pháp ngoại chuẩn. Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 0,5 g mẫu thủy sản (ký hiệu m) đã được đồng nhất vào trong chai nhựa dung tích 100 ml . Thêm 50 ml nước cất khử ion vào trong chai rồi lắc mạnh trong 30 phút trên máy lắc mẫu. Sau đó, ly tâm chai trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút trên máy ly tâm. Lọc dịch chiết qua màng lọc mẫu 0,45 âm . Chuẩn bị mẫu trắng: Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử nhưng thay 0,5 g thủy sản bằng 0,5 ml nước cất đã khử ion. Làm sạch dịch chiết: Chuẩn bị cột: Nối cột chiết pha rắn C18 vào đầu ra của một xilanh thủy tinh 100 ml. Thêm lần lượt 10 ml metanol, 10 ml nước cất đã khử ion vào xanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột. Làm sạch dịch chiết: Cho dịch chiết thu được ở trên vào các cột C18 đã được chuẩn bị . Sau khi cho dịch chiết vào cột, thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 100 ml (đã bỏ 2 ml đầu). Sau đó, tráng rửa bình chứa 3 lần, mỗi lần bằng 2 ml nước cất khử ion. Cho nước tráng qua cột rồi gom dịch qua cột vào bình định mức trên. Định mức tới vạch bằng nước cất (ký hiệu v). Tiến hành phân tích các dịch thu được trên máy sắc ký ion. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký ion : Điều kiện phân tích +Đặt chế độ làm việc cho máy sắc ký ion như sau: Cột sắc ký ion: Dionex IonPac (L x ID: 250 x 4 mm, tiền cột IonPac NG1 (L x ID: 4 x 50mm). Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phòng. Pha động: Dung dịch axit Nitric 70 mm Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 330 nm Thể tích tiêm: 100 m l +Điều kiện trong hệ thống phản ứng sau cột: Tác nhân: 1g/l sắt nitrat trong axit Percloric 2 % Tốc độ dòng là 0,5 ml/phút: Nhiệt độ phản ứng trong ống teflon nhiệt độ trong phòng. Ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động. Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ từng loại phosphat theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). Tiêm dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu trắng đã được làm sạch vào hệ thống sắc ký, mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích : Độ lặp lại của 2 lần tiêm: Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn pyrophosphat 10 m g/ml và 25m g/ml phải nhỏ hơn 1,2 %. Đường chuẩn đối với mỗi loại phosphat phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. Khoảng tuyến tính: Ortophosphat: 10 - 100 m g/ml Pyrophosphat: 0,5 - 50 m g/ml Tripolyphosphat: 10 - 500 m g/ml. Tính kết quả: Hàm lượng các phosphat có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.4.3). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các phosphat có trong mẫu được tính theo công thức sau: Trong đó: C là nồng độ các phosphat có trong mẫu, tính theo m g/g Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào máy, tính theo đơn vị diện tích. a, b là các thông số của đường chuẩn được xác định. F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỷ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch và khoa lượng mẫu m sử dụng . Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí hàm lượng Cloramphenicol trong sản phẩm thủy sản 5.1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol (sau đây gọi tắt là CAP) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 m g/kg. 5.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp được công bố trong tạp chí của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích; tập 77, số 3, năm 1994 (Journal of AOAC intemational; Voi. 77, No. 3, 1994: Gas chromatographic determination of chloramphenicol residues in shrimp). 5.3. Nguyên tắc CAP trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng etyl axetat. Dịch chiết sau đó được cô cạn, cặn được xử lý với sylon (chất tạo dẫn xuất trimetylsylyl), để tạo dẫn xuất trimetylsylyl của CAP. Hàm lượng dẫn xuất CAP được xác định trên hệ thống GC với đầu dò bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD) theo phương pháp nội chuẩn. HEÄ THOÁNG SAÉC KYÙ KHÍ : Hình 1: Heä thoáng saéc kyù khí Nguyeân taéc hoaït ñoäng: Maãu khaûo saùt daïng loûng hay khí ñöôïc bôm vaøo boä naïp maãu 2 (neáu maãu loûng seõ ñöôïc gia nhieät taïi ñaây ñeå chuyeån sang daïng khí), ñöôïc khí mang cung caáp töø heä thoáng 1 (bao goàm bình khí vaø boä ñieàu chænh löu löôïng) daãn vaøo heä thoáng coät taùch 3 naèm trong buoàng ñieàu nhieät. Sau khi ñöôïc taùch, caùc caáu töû laàn löôït ñi vaøo detector 4 vaø ñöôïc chuyeån thaønh tín hieäu ñieän. Tín hieäu naøy ñöôïc khueách ñaïi roài chuyeån sang boä ghi 5. ÔÛ caùc maùy hieän ñaïi, thay vì chuyeån sang boä ghi, tín hieäu seõ ñöôïc chuyeån sang tích phaân keá vaø maùy tính. Taïi ñaây, caùc tín hieäu ñöôïc xöû lyù vaø chuyeån sang boä phaän in keát quaû 6. Treân saéc ñoà nhaän ñöôïc ôû boä phaän in keát quaû 6 ta thu ñöôïc caùc tín hieäu öùng vôùi caùc caáu töû goïi laø peak vôùi thôøi gian löu tR cuûa peak laø ñaïi löôïng duøng ñeå ñònh tính, coøn dieän tích cuûa peak ñöôïc söû duïng ñeå ñònh löôïng. tR(A) tR(B) t 5.4. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử Cân 10,0 g mẫu thủy sản đã được nghiền nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml. Thêm 100 ml dung dịch M - CAP làm việc và 20 ml etyl axetat vào trong ống rồi nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong khoảng 10-15 giây. Sau đó, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê 100 ml. Cho thêm 20 ml etyl axetat vào phần cặn trong ống ly tâm rồi trộn đều. Sau đó, ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Gạn dịch trong vào bình quả lê ở trên. Có dịch trong bình quả lê trên máy cô quay chân không cho đến khi còn khoảng 2,0 - 4,0 ml dung dịch ở nhiệt độ 500c. Chuyển dịch còn lại sang ống ly tâm 50 ml bằng pipet Pasteur. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần bằng 2,0 ml etyl axetat. Tất cả dịch rửa được cho vào ống ly tâm. Cô cạn dung dịch trong ống ly tâm bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ 50 0C. Thêm 25 ml dung dịch muối NaCl 4 % , 2 ml methanol và 15 ml hexan vào ống ly tâm. Đậy nắp ống ly tâm và lắc thật mạnh trong 1 phút. Sau đó, ly tâm trong 1 phút ở tốc độ 800 vòng/phút. Loại bỏ lớp hexan ở trên bằng pipet Pasteur. Lặp lại quá trình này thêm 2 lần, mỗi lần 15 ml hexan. CAP trong pha nước được chuyển sang pha hữu cơ bằng cách lắc mạnh với 15 ml etyl axetat trong 30 giây. Ly tâm hỗn hợp trong 1 phút ở tốc độ 800 vòng/phút. Dùng pipet Pasteur chuyển lớp etyl axetat ở trên vào bình quả lê 100 ml. Lặp lại quá trình này một lần nữa với 15 ml etyl axetat. Dịch chiết cũng được đưa vào bình quả lê. Cô hỗn hợp dịch chiết còn lại khoảng 2 - 4 ml trên máy quay chân không ở nhiệt độ 550c. Chuyển lượng dịch còn lại vào ống ly tâm 15 ml. Rửa bình quả lê 3 lần, mỗi lần với 2 ml etyl axetat. Cô cạn dịch thu được bằng dòng nitơ ở nhiệt độ 500c. Chuyển tiếp sang bước tạo dẫn xuất Sylyl . Chuẩn bị mẫu trắng: Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có cloramphenicol. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử quy định ở trên. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi : Cho thêm 30,0 ml dung dịch chuẩn CAP 0,1m g/ml và 30 m l dung dịch chuẩn M-CAP 0,1 m g/ml vào 10,0g mẫu trắng rồi tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử quy định ở trên. Tạo dẫn xuất Sylyl: Thêm 100 m l Sylon vào cặn trong ống ly tâm, đóng nắp rồi lắc mạnh trên máy rung trộn mẫu. Đặt ống ly tâm vào trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 0c trong 40 phút: Làm bay hơi dung dịch trong ống cho đến gần khô (lưu ý không để khô hoàn toàn) dưới dòng nitơ tại nhiệt độ trong phòng. Thêm 500ml toluen rồi lắc mạnh cho tan cặn hoàn toàn. Tiến hành phân tích trên hệ thống GC Điều kiện phân tích: Đặt chế độ làm việc cho hệ thống GC như sau: +Chương trình nhiệt độ cột: Tăng từ nhiệt độ 1500C lên nhiệt độ 2700C Với tốc độ 200 0 C/phút, giữ 8,5 phút. Tăng từ nhiệt độ 2700C lên nhiệt độ 2900C Với tốc độ 200C/phút, giữ 2,0 phút. + Nhiệt độ đầu tiêm: 2700C: + Nhiệt độ detector: 3400C. + Tốc độ dòng khí mang He: 1 ml/phút. + Khí bổ trợ: N2 theo điều kiện của GC. + Thể tích tiêm: 1 m l. Ổn định cột sắc ký trong 3 giờ tại chế độ làm việc. Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất trước và sau mỗi 5 dung dịch thử. Xác định tỷ số diện tích pic (CAP/M-CAP). Tiêm các dung dịch đã được tạo dẫn xuất của mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi vào hệ thống GC mỗi mẫu 2 lần. Tính kết quả thu được theo Điều 6. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Độ lặp lại của 2 lần tiêm: Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. Độ thu hồi (R): Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu. Độ thu hồi tính được phải lớn hơn 80%. Kiểm tra xác nhận (confirmatory test) : Đối với các mẫu đã phát hiện Cloramphenicol bằng phương pháp GC-ECD này, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng GC-MS. 5.5. Tính kết quả Hàm lượng cloramphenicol (C CAP) được tính theo công thức: Trong đó: X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/M- CAP) cho dung tích mẫu thử. C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất , tính theo ng/g. V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml. Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/M-CAP trong dung dịch các chuẩn đã được dẫn xuất W là khối lượng mẫu thử, tính theo g/l Ngoài ra, người ta còn đáng giá kết quả thử nghiện dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng Kít Elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC-MS/MS Yêu cầu của một số thị trường về giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp phân tích các chỉ tiêu kháng sinh cấm được thống kê trong bảng 1. Bảng 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích một số kháng sinh cấm TT Kháng sinh cấm Chỉ tiêu kiểm tra Giới hạn phát hiện tối thiểu EU Mỹ Nhật Chloramphenicol Chloramphenicol (CAP) 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb Malachite green/Leucomalachite green Malachite green / Leucomalachite green (MG/LMG) 2.0 ppb 2.0 ppb 2.0 ppb Furazolidone 3-amino-2-oxazolidone (AOZ) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Furaltadone 5-methylamorfolino-3-amino-2-oxazolidone (AMOZ) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Nitrofurantoin 1-aminohydantoin (AHD) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Nitrofurazone Semicarbazide (SEM) 1.0 ppb 1.0 ppb 1.0 ppb Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC-MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ và AMOZ. Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC-MS/MS. Để có cơ sở xem xét tính hữu dụng của các phép thử trên ELISA trong kiểm tra và chứng nhận chất lượng thực phẩm thuỷ sản, trong phạm vi báo cáo này, chúng tôi sẽ đưa ra những đánh giá về kết quả phân tích CAP trên ELISA. Nội dung của báo cáo sẽ xem xét đến hai vấn đề chính là tỉ lệ phát hiện dương giả trên ELISA; và độ tương đồng kết quả kiểm nghiệm giữa hai phương pháp phân tích trên ELISA và LC-MS/MS. Kết quả đánh giá dựa trên số liệu thống kê kết quả phân tích tại phòng kiểm nghiệm của NAFIQAVED 4 – Tp Hồ Chí Minh, từ ngày 1/1/2006 đến tháng 7/2007. Phương pháp phân tích Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA. Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Giới hạn phát hiện: 0,1ppb Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong thực nghiệm Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA (phần 2.2.1) được phân tích khẳng định trên LC-MS/MS theo qui trình tóm tắt như sau: Thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattro-micro API (tripple quadrupole, ESI(-) Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch sơ bộ bằng 1ml hexan và sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18. Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên LC-MS/MS Phân tích trên LC-MS/MS: Các thông số chính: LC: Pha động: ACN: H20 (80:20) Tốc độ dòng: 0,3ml Thể tích tiêm:10ul MS/MS: ESI (-) MRM : 321->152 321->194 321->256 326->157 Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Nội chuẩn CAP-d5 được sử dụng để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu (biological maxtrices) đối với kết quả phân tích. Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Vương quốc Anh - Central Science Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2). So sánh sự tương đồng kết quả phân tích giữa ELISA và LC-MS/MS Kết quả thực nghiệm trên các mẫu thuỷ sản nhiễm CAP của ELISA và LC-MS/MS được trình bày trong các biểu đồ từ 1-7. Các giá trị hàm lượng CAP xác định được bằng ELISA và LC-MS/MS trên cùng một mẫu được thể hiện trên cùng một cột. Biểu đồ:.Mẫu ghẹ, cua 6.Ứng dụng của phương pháp nguyên tử hóa bằng ngọn lửa 6.1. Nguyên tắc của phương pháp Trong phương pháp mày người ta dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn để hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích. Các loại đèn khí được áp dụng là: C2H2/Không khí , N2O/ C2H2 hay C2H2/O2. bằng phương pháp nguyên tử hóa này có thể dịnh lưỡng được các hầu hết các kim loại và một số á kim như As, Si, Se, Te. Muốn đo phổ hấp thu F-AAS, trước hết chuẩn bị mẫu phân tích ở dạng dung dịch. Sau đó dẫn mẫu vào ngọn lửa đèn khí để hóa hơi và nguyên tử hóa nguyên tố cần phân tích thành đám hơi nguyên tử. một đèn HCL phát ra một tia đơn sắc đặc trưng cho nguyên tố cần đo xuyên qua đám hơi nguyên tử. Đo độ hấp thu căn cứ vào đường chuẩn để xác định hàm lượng nguyên tố trong mẫu. 6.2.Ứng dụng: Xác định Pb Nếu nguồn nguyên tử hóa là ngọn lửa sử dụng hỗn hợp khí C2H2/Không khí, tốc độ đo ở bước sóng 283,3 nm, thì phương pháp cho phép xác định Pb đến nồng đô 0.04 mg/l với giới hạn phát hiện là 0.01 mg/l. các chất gây nhiễu chủ yếu ở nồng độ cao là Al, Si, Sr, Mg, Ca. bước sóng 283.3 nm thường được sử dụng đo phổ hấp thu của Pb. Các bước sóng 217 nm và 261.4 nm ít được đo. Xác định Cd Dùng ngọn lửa C2H2/Không khí tốc, độ nhiên liệu 1.0-1.3 l/m, đo độ hấp thụ của Cd ở bước sóng 228.8 nm. Giới hạn phát hiện cỡ 0.0005 mg/l. mức độ cao của các chất rắn không hòa tan có thể là nguyên nhân của tín hiệu nền, và nếu trong dung sịch chúa lượng lớn silicate thì làm suy giảm sự đáp ứng của Cd. Xác định As Đối với các As có các vạch hấp thụ ở vùng tử ngoại chân không. Vùng này bị hấp thu rất mạnh bởi không khí và sản phẩm cháy của các chất hữu cơ nên phép định lượng có độ nhạy thấp. nguồn nguyên tử hóa là Nitrous- Oxide/Acetylen và đo ở bước sóng 193.7 nm thì các hiệu ứng phân tán rất rõ vì vấy nên sử dụng hiệu chỉnh nền để loại bỏ. Xác định thủy ngân Nếu nguồn nguyên tử hóa là ngọn lửa C2H2/Không khí đo ở bước sóng 253.7 nm, phương pháp cho phép xác định trực tiếp thủy ngân với giới hạn phát hiện là 0.2 mg/l. Co gây nhiễu khi xác định thủy ngân, nồng độ lớn của Co sẽ hâp thụ ở vạch cộng hưởng 253.7 nm của thủy ngân. Dung dịch Co 1000 mg/l cho độ dấp thụ xấp xỉ 10 %. 7. Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction 7.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR). Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự AND đích qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN polymerase. 7.2. Nguyên tắc Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích. 7.3 Phương pháp tiến hành Lấy mẫu: Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng. Tăng sinh: Nhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0oC 1,0oC trong khoảng 18 giờ 2 giờ. Xử lý mẫu giải phóng AND: Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau: Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước. Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại. Khuếch đại: Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ. Chuẩn bị ống khuếch đại: Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml. Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết. Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước cất vô trùng. Chương trình khuếch đại: Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau: Duy trì nhiệt độ 95oC trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC cho đến khi điện di. Ðiện di sản phẩm khuếch đại Chuẩn bị gel điện di agarose 1%: Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE. Chuẩn bị dịch điện di: Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều. Ðiện di: Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vôn. Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu: Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di. Nhuộm gel: Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư. Quan sát, chụp hình: Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả. 7.4. Ðọc và giải thích kết quả Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này. Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp. 7.5. Qui định về đảm bảo an toàn Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các qui định sau đây: Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật. Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ. Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ. Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu. Phòng thí nghiệm phải được bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả.  TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản-NXB.Nông nghiệp-Hà Nội 2004 [2] Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction. (JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD. PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA AND IL. PEPPER. - Appl. Environ. Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993). [3] [4]www.google.com [5] www.ndl.com.vn