Đề tài Phương pháp ly trích, thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic trong mỡ cá basa pangasius bocourtisauvage

pha rắn loại Bond Elut SCX (0,5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng. 17 Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane. 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải li tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc kí cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng l3 với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải li cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) [20] CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33oC và áp suất thấp 17.7MPa để tránh sự oxid hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). Ba mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), ba mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 45oC) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 40oC và 300 phút. 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc (silver nitrate method) [8] Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc kí lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 100oC. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bản mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. 18 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.1. Phương pháp transester hóa [13] Trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật, một triglycerid sẽ phản ứng với một alcol có mặt chất xúc tác sẽ thu được sản phẩm là một hỗn hợp alkyl ester của acid béo và glycerin. Phương trình phản ứng : 3ROH C C C H2 H2 H OH OH OH R1COOR R2COOR R3COOR xuùc taùc CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O Triglycerid Rượu Glycerin Hỗn hợp akyl ester Để thực hiện phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật có thể sử dụng các loại xúc tác khác nhau như: 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid[33],[9] a) Ưu điểm: Là loại xúc tác cơ bản từ lâu đời. Dễ sử dụng, cho hiệu suất cao, rẻ tiền. b) Nhược điểm: Quá trình transester hóa được xúc tác bằng acid Bronsted như acid sulfuric cho một hiệu xuất rất cao nhưng lại xảy ra chậm, đòi hỏi nhiệt độ trên 100oC và 3giờ mới đạt độ chuyển hóa hoàn toàn. Ngoài ra, phản ứng trên phải được thực hiện trong môi trường không có nước để tránh có sự cạnh tranh tạo ra acid carboxilic làm giảm hiệu suất phản ứng. Thiết bị phản ứng mau hư do bị ăn mòn. Theo William W. Christie (Scotland) thông thường lipid được hòa tan trong chất phản ứng và hỗn hợp được đun nóng khoảng 2 giờ, nhưng nó có thể cũng được đun nóng trong ống kín ở nhiệt độ cao và thời gian ngắn hơn. Lượng xúc tác H2SO4 cho vào khoảng 1-2% trong dung môi là methanol. 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ [9],[31] Xúc tác bazơ thường được sử dụng trong công nghiệp như: NaOH, KOH, Carbonat kim loại kiềm, CH3ONa,… Trong đó, CH3ONa được xem là xúc tác hoạt động tốt nhất (cho hiệu suất trên 98% trong 30 phút với một lượng nhỏ 0,5%). a) Ưu điểm: - Xúc tác bazơ ít có tính ăn mòn đồng thời cũng thúc đẩy tiến trình xảy ra nhanh hơn khi so sánh với xúc tác acid. - Giá thành rẻ (KOH, NaOH). Việc tăng nồng độ xúc tác lên khoảng 1% hoặc 2% là có hiệu suất cao không kém gì alkoxid kim loại. - K2CO3 được dùng với nồng độ 2% hoặc 3% cũng cho hiệu suất cao đồng thời tránh được sự thủy phân ester do bicarbonat được tạo thành thay vì nước ở xúc tác hydroxyd. 19 b) Nhược điểm: - KOH và NaOH với giá thành rẻ nhưng kém hoạt động hơn K2CO3, CH3ONa. Tuy nhiên, với loại xúc tác hyroxyd này sẽ làm sản sinh ra một lượng nước ngay cả trong môi trường khan nước ban đầu (do phản ứng với rượu), điều này sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng (do có nước sẽ thúc đẩy quá trình thủy phân ester tạo thành). - Việc sử dụng xúc tác bazơ mạnh trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật rất dễ xảy ra quá trình xà phòng hóa, điều đó dẫn đến làm giảm hiệu suất phản ứng và việc tách loại ester và glycerin tạo thành cũng gặp khó khăn. Theo nghiên cứu của trường đại học Idaho [31], quá trình transester hóa dầu cải chịu tác động của nhiều yếu tố: 1) nhiệt độ, 2) xúc tác, 3) tốc độ khuấy trộn, 4) nước trong alcol được sử dụng, 5) lượng alcol dư được sử dụng. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là: 1) nhiệt độ phòng, 2) xúc tác NaOCH3 0,5% hoặc KOH 1% so với trọng lượng dầu cải, 3) tốc độ khuấy trộn nhanh, mãnh liệt trong những giai đoạn đầu của phản ứng và không quan trọng lắm sau khi đã trở thành hỗn hợp đồng nhất, 4) ethanol tuyệt đối thì cho tốc độ chuyển hóa nhanh, 5) lượng alcol dư là hơn 50% đối với NaOCH3 và hơn 100% đối với KOH. Theo cuộc nghiên cứu đó thì quá trình transester hóa trải qua ba giai đoạn: 1) phản ứng transester hóa, 2) sự phân lớp, 3) quá trình rửa. 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym[41],[42] Sự tạo thành acid docosahexaenoic (DHA) đã được nghiên cứu trong dầu cây anh thảo (Oenothera biennis L) và dầu cây borage (Borago officinalis L.) (một loại cây mà hoa và lá được dùng làm món sà lát và tạo hương vị cho thức uống) bằng con đường transester hoá với xúc tác lipase.[41] Có 6 loại lipase: Novozym 435 từ Candida antarctica, Lipozyme IM từ Mucor miehei, PS-30 từ Pseudomonas sp., AP-12 từ Aspergillus niger, AY-30 từ Candida rugosa, và Novozym-677BG từ Thermomycelanuginosus được kiểm tra cho khả năng hợp thành DHA (22:6 ω-3) trong dầu cây anh thảo. Trong số các enzym đã ví dụ thì Novozym 435 từ Candida antarctica được chọn làm xúc tác cho phản ứng transester hóa vì lý do hợp thành DHA cao. Khi có sự tập trung của enzym cao, tỷ lệ chất nền, và thời gian ủ tăng thì sự hợp thành DHA cũng tăng. Trong một tiến trình phản ứng sự hợp thành DHA tăng lên 25,2% sau 24giờ. Cao nhất là 37,4% khi tỷ lệ dầu cây anh thảo/DHA là 1/3. Cây anh thảo[42] (Oenothera biennis L.) là cây hai năm thuộc họ dừa nước (Onagraceae) là một loại cây thông thường sống ở Bắc Mỹ. Điều thú vị là dầu anh thảo có chứa γ-linolenic acid (GLA; 18:3 ω-6) (Senanayake và Shahidi, 1999a). Ưu điểm:[14] Đa số các enzym làm xúc tác đều được thực hiện ở điều kiện bình thường (nhiệt độ phản ứng là 20-40oC), không tốn năng lượng và không đòi hỏi thiết bị phức tạp. Các chất thải enzym dễ bị phân hủy nên không gây ô nhiễm môi trường. Hiệu lực xúc tác của enzym lại rất lớn (vận tốc phản ứng gấp 108-1011 lần) so với những phản ứng dùng xúc tác hóa học thông thường. Nhược điểm:[14] Mỗi loại enzym chỉ xúc tác nên một số chất nền và kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử. Ngoài ra, việc sử dụng xúc tác enzym có mặt hạn chế là thời gian phản ứng rất lâu (20 giờ). Đồng thời phải tìm được loại enzym phù hợp với đối tượng nghiên cứu. 20 1.3.1.4. Xúc tác zeolit[9] Trong những năm gần đây, người ta thường ứng dụng xúc tác acid, bazơ rắn,… đặc biệt là zeolit đang được xem là một chất xúc tác hiệu quả cho phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật do có một số ưu điểm nổi bật sau: • Có tính chọn lọc cao • Việc tách các sản phẩm sau phản ứng dễ dàng. • Xúc tác zeolit sau khi thu hồi có thể sử dụng lại. • Hiệu suất phản ứng cao • Phản ứng không sinh ra sản phẩm phụ (do không có hiện tượng xà phòng hóa so với các xúc tác bazơ cổ điển). Ngoài ra người ta còn thường sử dụng các chất xúc tác khác cho hiệu quả cao nhưng qui trình thực hiện lại khá phức tạp. Ví dụ như sử dụng chất xúc tác calicined Mg-Al hydrotalcites[43]. Xúc tác này gồm: 187ml dung dịch chứa Mg/Al theo tỷ lệ Mg(NO3)2.6H2O và Al(NO3)3.9H2O (tổng metal nitrat, 0,375mol), thêm từ từ 187ml dung dịch thứ hai chứa NaOH (0,4375 mol) và Na2CO3 (0,1125 mol), pH = 8-10. Trong phần thực nghiệm này chúng tôi không sử dụng xúc tác là Zeolit vì qui trình tổng hợp hơi phức tạp. Chúng tôi sử dụng loại xúc tác có sẵn là bazơ (KOH, NaOH) rẻ tiền và kinh tế với hàm lượng nhỏ khoảng 1-2%. 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột[12] Theo Teshima, S. et al [40], mô tả về phương pháp cô lập của EPA và DHA từ dầu cá bằng xà phòng hóa với ethanol xúc tác KOH. Phần metyl ester của acid béo thô được làm tinh bằng sắc kí cột trên silica gel và sau đó EPA được phân chia ra khỏi DHA bằng sắc kí cột trong hỗn hợp bạc nitrat và silica gel. Sắc ký pha lỏng trên cột (Sắc ký cột hở) là tên gọi chung cho một số hệ thống vật lý trong đó một cột được nạp chặt chẽ bởi chất hấp thu và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Sắc ký cột nhanh khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc giải ly của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được. Ưu điểm của sắc ký nhanh cột khô là nhờ có lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly nên thời gian triển khai nhanh hơn sắc ký cột cổ điển. Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thuận lợi là sử dụng các thiết bị có sẵn trong phòng thí nghiệm (phễu, bình tam giác, vòi nước tạo áp suất kém.v.v…). Hệ thống bao gồm: phễu lọc xốp thủy tinh loại 150ml, fiole, và hệ thống tạo áp suất bằng vòi nước (20-70 mmHg). Chất hấp thu là silica gel khô vào phễu đến tận miệng, gõ nhẹ ngoài thành phễu để chất hấp thu gọn lại. Gắn phễu vào hệ thống tạo áp suất kém và dùng nút thủy tinh có đáy bằng để nén ép đều silica gel xuống đáy phễu, tạo thành một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều cao của chất hấp thu sau khi nén cao khoảng 5cm. Tiền giải ly cột bằng ether dầu hỏa. Rót dung môi lên đầu cột, gắn vào hệ thống tạo áp suất kém, dung môi sẽ đi xuống xuyên qua cột. Thực hiện vài lần để có cột đồng nhất. Cột được rút khô, tắt áp suất kém. 1.3.2.2. Phương pháp tủa urê [40],[43] 21 Các acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated fatty acid(s)) có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp, tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những acid béo bất bão hòa đa được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê. Đây là một phương pháp để tách các acid béo bão hòa ra khỏi acid béo bất bão hòa dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) với các acid béo bão hòa ở nhiệt độ thấp. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này có thể gia tăng hàm lượng acid béo bất bão hòa đặc biệt là omega-3 trong hỗn hợp lên đến 60-85% (trong trường hợp là dầu cá hồi). Trong việc xử lý với urê, urê được thêm vào dung môi hữu cơ mà có thể hòa tan được cả urê và cả acid béo trong đó, ví dụ như methanol, ethanol, isopropanol, ether dầu hỏa, benzen, trichoroethylene và methyl isobutyl ketone. Ethanol được sử dụng tốt hơn do ít độc. Urê được hòa tan trong dung môi, nếu cần thiết thì đun nóng, lượng urê cho vào khoảng từ 10 – 20%. Dung dịch urê và hỗn hợp ester của acid béo được trộn chung với nhau. Khi trộn hỗn hợp acid béo vào trong dung dịch urê tốt hơn hết là hỗn hợp acid béo được pha loãng trong dung môi hữu cơ để tạo khả năng bảo vệ acid béo chống lại nhiệt độ cao của dung dịch urê. Lượng dung môi urê được điều chỉnh để tối thiểu là 0,5 phần trọng lượng. Dung dịch urê được trộn thành một hỗn hợp đồng nhất với acid béo. Urê sau đó sẽ được tủa bằng cách làm lạnh hỗn hợp. Vào lúc này acid béo bão hòa trong hỗn hợp acid béo sẽ hình thành phức với tinh thể urê và tủa xuống. Sự làm lạnh được kiểm soát bằng cách để dung dịch trong một khoảng thời gian thật lâu, nếu được yêu cầu (thường là qua đêm). Urê kết tinh khi có sự hiện diện metyl ester của acid béo, nó hình thành nên tinh thể hình lục giác có lỗ rỗng ở giữa, với lỗ rỗng này một vài acid béo có thể lọt vừa khít vào và nhờ thế được lọc, loại bỏ ra khỏi dung dịch. Acid béo mạch thẳng thì hình thành phức dễ dàng , nhưng acid béo, ester có nối đôi hoặc cầu metyl làm tăng mức độ phức tạp của cấu tạo thì hình thành kết tinh khó hơn hoặc không thể kết tinh. Khi tiến trình kết tinh hoàn thành, acid béo bão hòa và một phần acid béo bất bão hòa tạo phức, trong khi đó acid béo bất bão hòa đa, có phân nhánh, hoặc có vòng sẽ ở lại trong dung dịch. Phương pháp: Metyl ester (100mg) trộn trong hexan (4ml), methanol (1ml) và urê (1,5g). Để qua đêm, phần rắn được lọc ra khỏi dung dịch và rửa với hexan, phần được rửa và phần lọc trộn chung rồi rửa lại với nước, làm khô bằng muối sulfat natri khan và làm bay hơi. Còn lại phần bất bão hòa và/hoặc có phân nhánh. Một phương pháp khác từ Shucheng Liu và cộng sự[43]: Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kỹ ở 60 – 70oC đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Ban đầu để kết tinh ở nhiệt độ phòng sau đó ở các nhiệt độ khác nhau (25oC, 15oC, 0oC, -15oC, -25oC). Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -5oC trong 20 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H2SO4 đậm đặc sao cho pH = 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp: lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa. 22 1.3.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng [7] Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn lỏng; trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp thụ trơ. Chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng. Loại bản mỏng được sử dụng trong đề tài này là bản nhôm tráng silica gel có trộn thêm chất phát huỳnh quang (Merck) và sắc ký lớp mỏng được khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. Mẫu chất cần phân tích được hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất thành một vết nhỏ gọn lên tấm lớp mỏng; vết chấm ở cách vị trí đáy 1 cm. Sấy nhẹ để đuổi một phần dung môi hòa tan mẫu, như thế mẫu chất chỉ còn ở dạng bột khô trên tấm bản mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng, vào trong một ly có chứa sẵn một loại dung môi phù hợp (chiều dày của lớp dung môi không quá 1cm). Trước khi đặt bản vào ly, ly đựng dung môi phải ở trạng thái bão hòa dung môi để có được một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách phủ lên bề mặt trong cua ly một tờ giấy lọc có tẩm ướt dung môi dùng để giải ly. Dung môi sẽ được lực mao quản hút di chuyển cao lên trong tấm bản, quá trình như thế thì sẽ phân chia hỗn hợp mẫu chất ban đầu thành những vết riêng biệt. Khi dung môi lên gần hết tấm bản (còn cách khoảng 0,5cm), lấy tấm bản ra khỏi bình, sấy khô. Các vết mẫu được xác định bằng phương pháp hóa học với dung dịch thuốc thử là H2SO4 đậm đặc. Bản mỏng sau đó được lưu trữ trong bao plastic. Dung môi giải ly phù hợp là dung môi có thể làm cho hỗn hợp các chất ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau. Các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 - 0,7). Mỗi hợp chất sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Rf được tính bằng công thức: Mục đích chính của sắc ký lớp mỏng trong bài thực nghiệm này là để theo dõi diễn tiến của quá trình transester hóa . Sắc ký lớp mỏng có các ưu điểm: ¾ Mẫu để phân tích chỉ cần một lượng rất ít. ¾ Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. ¾ Việc triển khai sắc ký nhanh, nên trong một thời gian ngắn có thể biết kết quả mẫu cần phân tích. ¾ Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. ¾ Sau quá trình giải ly, dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hoặc hóa học để phát hiện sự hiện diện chất, nên không phải lo đến vấn đề hậu sắc ký như ở sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 1.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CÁ BASA Ở VIỆT NAM 1.4.1. Phân loại [17] Cá Basa là một trong số 11 loài thuộc họ Cá tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long. ™ Giới động vật Animalia Rf Khoaûng ñöôøng di chuyeån cuûa hôïp chaát Khoaûng ñöôøng di chuyeån cuûa dung moâi Rf  1 23 ™ Ngành có giây sống hoàn chỉnh Chordata ™ Ngành phụ có xương sống Vertebrata ™ Nhóm có hàm Gnathostomata ™ Tổng lớp cá Pisces ™ Lớp cá xương Osteichthyes ™ Lớp phụ cá vây tia Actinopterygii ™ Tổng bộ cá toàn xương Teleostei ™ Bộ cá nheo Siluriformes ™ Họ Chilbeidea ™ Giống Pangasasius ™ Loài Pagasius bocourt (Sauvage, 1880) (Cấp phân loại từ giới đến bộ được tham khảo từ tác giả Trần Thanh Tòng) 1.4.2. Đặc điểm cá basa [32] Cá basa phân bố ở sông Tiền và sông Hậu; có tập tính di cư ngược dòng sông Mekong để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên; có tính ăn tạp thiên về động vật. Trên thế giới có bốn nước ở lưu vực sông Mekong: Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan nuôi cá basa. Ở Việt Nam, cá basa được nuôi thương phẩm chủ yếu trong bè trên sông nước chảy vì chịu đựng kém ở môi trường có hàm lượng oxi hòa tan thấp. Khu vực ương nuôi cá giống tập trung chủ yếu ở huyện Hồng Ngự (Đồng Tháp) và huyện Châu Đốc (An Giang), nay phát triển nhiều ở Cần Thơ… Hiện nay riêng An Giang có hơn 2.300 bè nuôi cá basa với sản lượng khoảng 23.000 tấn. Bụng cá trắng bạc, và đặc biệt có buồng mỡ rất lớn, chiếm khoảng 25% khối lượng cá. Lượng mỡ cá basa thu hồi từ các cơ sở chế biến thủy sản hàng năm 4000 - 5000 tấn mỡ cá. 1.4.3. Những sản phẩm từ mỡ cá basa [33] Trước đây, lượng mỡ lớn từ cá basa chưa được chế biến công nghiệp, chưa tinh luyện nên chưa đạt chỉ tiêu dầu mỡ thực phẩm. Chủ yếu là chiên mỡ cá, bằng gia nhiệt trực tiếp thành dạng lỏng, sau đó đem trộn với mỡ heo bán cho tư nhân hoặc bán ở vùng cao, Campuchia, Trung Quốc… Ngoài ra, mỡ cá thô sau khi tinh luyện làm dầu thực phẩm, được phối trộn sử dụng thay thế shortening- một loại mỡ để chiên mì ăn liền hay đem phối chế sản xuất margarin. 1.4.3.1. Tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá basa[32] Qui trình công nghệ chiết tách mỡ lỏng từ mỡ cá basa được trình bày trong sơ đồ 1. Tỷ lệ acid béo không bão hòa và bão hòa có trong nguyên liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô được trình bày trong bảng 8. Nhận xét với loại cá basa đạt trọng lượng 1 - 1,5kg: - Tỷ lệ mỡ cá so với trọng lượng cá 25% - Trong đó tỷ lệ mỡ phần (mỡ trong) 12,03% - tỷ lệ mỡ bụng (mỡ ngoài) 12,25% Mỡ cá thô có đặc tính: 24 - Tỷ trọng 30oC 0,917 - Chỉ số chiết quang ở 40oC 1,460 - Chỉ số acid 0,22 mg KOH/g - Chỉ số peroxyd 4 ml Na2SO3 - Chỉ số xà phòng 196,96 mg KOH/g - Chỉ số Iod 78,72 g I2/100g Hiệu suất thu hồi mỡ cá lỏng: - Ðạt 94-95% so với trọng lượng mỡ phần (mỡ trong) - Ðạt 60-62% so với trọng lượng mỡ bụng (mỡ ngoài) Mỡ cá basa thô nên tách riêng 2 phần - Phần đặc chiếm 10% (tạm gọi mỡ cá basa) - Phần lỏng chiếm 90% (tạm gọi dầu cá basa) Sơ đồ 1: Qui trình công nghệ chiết tách mỡ lỏng từ mỡ cá basa Mỡ cá (mỡ phần hay mỡ bụng) Rửa và làm sạch trong nước lạnh (xay nhỏ 3- 5mm) Gia nhiệt gián tiếp (hơi nước 1kg/cm2, 90-95oC) Ép cơ học Mỡ cá lỏng 25 Rửa bằng dung dịch nước muối 10% Lắng tách nước Mỡ lỏng sạch Bảng 7: Tỷ lệ acid béo không bão hòa và bão hòa có trong nguyên liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô (*) Thứ tự Nguyên liệu Acid béo loại một nối đôi (%) Acid béo loại nhiều nối đôi (%) Acid béo bão hòa (%) 1 2 3 4 5 6 Dầu dừa Dầu cọ Bơ Mỡ heo Mỡ bò Mỡ cá basa thô 5,00 40,00 30,00 50,00 43,00 31,52 1,0 10,0 4,0 3,0 2,6 12,72 94,00 50,00 66,00 47,00 44,4 44,35 (*) Thông tin lấy từ dầu cọ của hiệp hội những người phát triển dầu cọ Malaysia năm 96 (Malaysian Palm Oil Promotion Council 96). Thành phần mỡ cá basa có acid béo một nối đôi 31,5%, nhiều nối đôi 12,72% và acid béo bão hòa 44,35% gần tương đương với đầu cọ nhập ngoại. 1.4.3.2. Tinh luyện mỡ cá basa thành dầu mỡ thực phẩm[32] Từ kết quả nghiên cứu, các cơ sở khai thác chế biến mỡ cá basa tiến hành tinh luyện thành dầu mỡ thực phẩm, mục đích để tận dụng triệt để các sản phẩm phụ từ mỡ cá: phần đặc sau khi tinh luyện phối trộn thay thế shortening chiên mì ăn liền, phần lỏng làm dầu thực phẩm phối trộn thành dầu ăn, sản xuất margarin có thành phần mỡ cá đặc biệt có ω-3 đạt 0,34% rất tốt cho trẻ em, người già. Thành phần acid béo trong mỡ cá basa thô và sau khi tinh luyện được trình bày ở bảng 8. Bảng 8: Thành phần acid béo trong mỡ cá basa thô và sau khi tinh luyện 26 Trong mỡ cá sau tinh luyện (%) Thứ tự Thành phần acid béo Trong mỡ cá thô (%) phần lỏng (%) phần đặc (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C14:0 acid myristic C16:0 acid palmitic C18:0 acid stearic C18:1 acid oleic C18:2 acid linoleic C18:3 acid linolenic C20:0 acid arachidic C20:1 acid gadoleic C22:1 acid cetoleic C22:6 acid docosahexaenoic 0,22 28,66 6,49 33,60 12,63 1,48 0,34 0,60 0,83 0,59 1,21 22,22 6,70 44,43 16,76 0,91 0,37 0,62 0,43 0,34 1,25 32,96 13,11 35,40 11,93 0,24 0,94 0,33 0,33 0,11 (Trung tâm Dịch vụ Phân tích và Thí nghiệm kiểm định theo phiếu số 9812507, 9906107, 991181) 2.3. DỤNG CỤ - NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Dụng cụ Bình cầu 150ml Becher 100ml, 250ml Erlen 150ml,500ml Ống đong 10ml Pipette 1ml Lọ thủy tinh loại 10ml và 100ml Ống nghiệm Phễu thủy tinh Bình lóng 250ml Giấy lọc Ống vi quản Đèn cồn Bản mỏng Silica gel 20x20cm (Merck) Bình giải ly Đá bọt Thiết bị Máy cô quay chân không Máy đun cách thủy Máy khuấy từ Cân điện tử Máy sắc ký ghép khối phổ Tủ đông Hóa chất: Ether dầu hỏa (Trung Quốc) Benzen (Trung Quốc) Diethy ether Chloroform Ethyl acetate Ethanol Methanol Iso propanol Acetone Dung dịch H2SO4 98,08% NaOH KOH Na2SO4 khan 2.1.2. Nguyên liệu Mỡ cá basa (mỡ lỏng) lấy từ Phân Viện Công NghiệpThực Phẩm thành phố Hồ Chí Minh - 58 Nguyễn Bỉnh Khiêm, Quận 1 - TP.HCM. 2.4. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp transester hóa (transesterification)[31] Cách thực hiện : Bước1: 0,05g chất xúc tác KOH hoặc NaOH cho vào bình cầu 150ml Thêm 30g methanol vào bình cầu. Đun hoàn lưu ở nhiệt độ nhẹ (khoảng 40-50oC) cho đến khi chất xúc tác tan hoàn toàn trong dung môi. Bước 2: Dầu cá basa (5g) được cho vào bình cầu. Đun hoàn lưu ở nhiệt độ 70-80oC. Khuấy từ (400 vòng/phút), trong khoảng thời gian 1-8 giờ. Sau mỗi khoảng thời gian khoảng 1 giờ lấy ra một ít chấm sắc ký bản mỏng để kiểm tra mức độ hoàn thành của phản ứng. Bước 3: Sau khi phản ứng hoàn tất, hỗn hợp được để qua đêm. Hỗn hợp tách làm 2 pha: pha trên là hỗn hợp ester, pha dưới là glycerin. Sử dụng bình lóng tách riêng lấy phần trên. Bước 4: Rửa ester với nước. Glycerin và xúc tác dư tan vào nước chìm xuống phía dưới bình lóng và được loại bỏ. Trong suốt quá trình rửa, ester chuyển thành dạng nhũ tương trắng. Bước 5: Cho thêm dung môi với lượng vừa đủ vào phần nhũ tương để hòa tan. Dung môi có thể là methanol, ether dầu hỏa, ethyl acetate, chloroform. Làm khan nước bằng Na2SO4. Lọc và đuổi dung môi bằng cách cô quay hoặc đun ở nhiệt độ thấp, thu được ester sạch dạng lỏng. Cân trọng lượng sản phẩm thu được. Quy trình phản ứng được trình bày ở sơ đồ 2. Trong phản ứng transester hóa chúng tôi khảo sát một số yếu tố khác nhau như sau. a) Thay đổi dung môi thực hiện phản ứng transester hóa lần lượt là: methanol, ethanol tuyệt đối, propanol. b) Thay đổi tỷ lệ dung môi/dầu cá lần lượt là 20/1; 15/1; 12/1; 10/1; 8/1; 7/1; 6/1; 5/1; 4/1; 3/1. c) Thay đổi hàm lượng xúc tác (%) cho phản ứng transester hóa lần lượt là: 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%. 28 d) Thay đổi 2 loại xúc tác thực hiện phản ứng transester hóa lần lượt là NaOH và KOH. e) Thay đổi thời gian phản ứng từ 1giờ; 2giờ; 3giờ; 4giờ; 5giờ; 8giờ; 10giờ; 24giờ; 48giờ; 72giờ. Trong mỗi phản ứng sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra tiến trình của phản ứng. 2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp thực hiện được trình bày ở sơ đồ 3. Tiếp thu những kết quả có sẵn từ anh chị đi trước chúng tôi chỉ khảo sát vài loại dung môi giải ly như chlorofom:methanol là 9:1, 95:5, benzen. Sơ đồ 2: Qui trình transester hóa Chaát xuùc taùc, dung moâi Daàu caù basa (5g) Ñun cho tan Ñun hoaøn löu coù khuaáy töø ôû nhieät ñoä 70-80oC Theo doõi tieán trình phaûn öùng theo thôøi gian baèng saéc kyù lôùp moûng Hoãn hôïp goàm ester acid beùo, glycerol, chaát xuùc taùc Ñeå yeân qua ñeâm ôû nhieät ñoä phoøng Theâm dung moâi cho ñuû Hoãn hôïp chia laøm hai pha. Loùng laáy pha treân laø ester cuûa acid beùo Röûa ester baèng nöôùc baèng bình loùng Hoøa tan nhuõ töông vaøo dung moâi. Laøm khan baèng Na2SO4 Ñuoåi dung moâi Ester saïch (metyl ester, etyl ester) Laáy phaàn ester saïch beân treân (baây giôø ñang ôû daïng nhuõ töông) Caân löôïng ester thu ñöôïc 29 Sơ đồ 3: Phương pháp sắc ký lớp mỏng Chuaån bò maãu (laáy moät gioït trong maãu ñang thöïc hieän phaûn öùng transester hoùa) Chuaån bò taám lôùp moûng, oáng vi quaûn, dung moâi giaûi ly Duøng oáng vi quaûn chaám ít maãu leân taám lôùp moûng Khai trieån giaûi ly ñeå dung moâi di chuyeån leân Saáy khoâ taám lôùp moûng Thaám öôùt baûn baèng dung dòch H2SO4 50% SaÁy khoâ baûn ñeå hieän caùc veát treân baûn moûng 2.2.3. Phương pháp kết tinh của ester với urê (urea crystallization)[40] Bước 1: Cân 2g ester đã transester hóa thu được ở sơ đồ 2 cho vào erlen A. - Cho 100ml ether dầu hỏa cho chung vào erlen A. - Lắc trộn để ester tan vào trong ether dầu hỏa tạo thành dung dịch đồng nhất. Bước 2: Cân 15g urê cho vào erlen 500ml. - Cho 100ml ether dầu hỏa vào erlen 500ml đã chứa urê. - Đun cho urê tan trong ether dầu hỏa tạo thành một hỗn hợp đồng nhất (ở nhiệt độ khoảng 60-70oC, đun hoàn lưu có khuấy từ). Bước 3: Đổ erlen A vào chung trong erlen 500ml chứa dung dịch urê - ether dầu hỏa. - Tráng lại erlen vài lần cho sạch. - Đun tiếp cho đến khi tạo thành hỗn hợp đồng nhất. - Lấy ra để nguội tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Bước 4: Bỏ vào tủ mát một thời gian (khoảng 1 tiếng) rồi mang erlen cho vào tủ đông -5oC. Để qua đêm để urê tạo thành kết tinh với các ester bão hòa. Bước 5: Lấy erlen ra, lúc này dung dịch chia làm hai pha: pha rắn và pha lỏng. - Lọc bằng giấy lọc, lấy pha lỏng. - Pha rắn rửa lại thật kỹ bằng dung môi là ether dầu hỏa rồi lại lọc tiếp. 30 - Cho chung hai phần phần lọc và phần được rửa vào một erlen sạch khác. - Đem cô quay đuổi dung môi được phần dầu cá chứa ester béo bất bão hòa. Phương pháp được trình bày ở sơ đồ 4. Sơ đồ 4: Phương pháp kết tinh của ester với urê. Ñun noùng cho tan heát ureâ 15g ureâ ether daàu hoûa 100ml Ñun noùng Dung dòch ñoàng nhaát - Ñeå nguoäi, cho vaøo tuû laïnh - Cho vaøo tuû ñoâng (qua ñeâm) - Dung dòch taùch laøm hai pha Pha raén Pha loûng Röûa Loïc Troän chung Coâ quay ñuoåi dung moâi Ester baát baõo hoøa 2g daàu 100ml ether daàu hoûa Laéc Dung dòch ñoàng nhaát - Caân löôïng ester thu ñöôïc - Khaûo saùt baèng GC/MS Dung dòch daàu transester hoùa vaø ureâ trong eter daàu hoûa 3.1. Kết quả phản ứng transester hóa 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ methanol/dầu cá theo thể tích Tỷ lệ methanol/mol dầu cá là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng transester hóa. Chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng bằng cách thay đổi tỷ lệ methanol/dầu cá theo thể tích lần lượt là 20/1; 15/1; 12/1; 10/1 ; 8/1; 7/1; 6/1; 5/1; 4/1; 3/1 và giữ cố định các yếu tố còn lại: khối lượng dầu cá (5g), khối lượng xúc tác (0,5g), nhiệt độ phản ứng (70-80oC), tốc độ khuấy (400vòng/phút). Kết quả trình bày ở bảng 9, hình 4. 31 Bảng 9: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ methanol/dầu cá theo thể tích Số thứ tự Tỷ lệ methanol/dầu cá (V:V) Khối lượng dầu ban đầu (g) Khối lượng dầu sau phản ứng (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 20:1 5,50 5,35 97,3 2 15:1 5,47 5,31 97,1 3 12:1 5,06 4,91 97,0 4 10:1 5,01 4,83 96,5 5 8:1 4,99 4,80 96,0 6 7:1 5,78 5,50 95,2 7 6:1 5,23 4,86 93,0 8 5:1 5,54 4,71 85,0 9 4:1 - - - (xúc tác: NaOH 1%, nhiệt độ: 70-75oC, thời gian phản ứng: 7 giờ, tốc độ khuấy: khoảng 400 vòng/phút). Hình 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ methanol/dầu cá (thể tích : thể tích) Ả n h h ư ở n g c ủ a t ỷ lệ m e t h a n o l / d ầ u c á l ê n p h ả n ứ n g t r a n s e s t e r h ó a 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 9 8 5 : 1 6 : 1 7 : 1 8 : 1 1 0 : 1 1 2 : 1 1 5 : 1 2 0 : 1 T ỷ lệ m e t h a n o l /d ầ u c á H iệ u su ất (% ) Nhận xét: Bảng 9 cho thấy với tỷ lệ methanol/dầu cá là 4:1 phản ứng xảy ra rất kém, nên chúng tôi không xác định hiệu suất. Khi tỷ lệ được tăng lên 5:1 hiệu suất phản ứng có tăng. Tỷ lệ 7:1 hiệu suất chuyển hóa tốt là 95,2%. Tiếp tục tăng tỷ lệ lên 8:1; 10:1; 12:1; 15:1; 20:1 hiệu suất có tăng nhưng không đáng kể. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ methanol/dầu cá là 7:1 cho các quá trình khảo sát tiếp theo. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa. Trong phản ứng transester hóa loại dung môi có ý nghĩa quan trọng xác định hiệu suất phản ứng. Chúng tôi đã sử dụng ba loại dung môi khác nhau là methanol, ethanol tuyệt đối, propanol và giữ nguyên các yếu tố khác như (nhiệt độ, xúc tác, thời gian phản ứng , tốc độ khuấy…). Kết quả trình bày ở bảng 10. 32 Bảng 10: Kết quả ảnh hưởng loại dung môi lên phản ứng Số thứ tự Loại dung môi Khối lượng dầu ban đầu (g) Khối lượng dầu sau phản ứng (g) Hiệu suất (%) 1 Ethanol 5,22 5,12 4,28 3,95 82,0 77,1 79,6 2 Methanol 5,21 5,56 4,57 4,75 5,00 4,26 91,2 89,9 93,2 91,4 3 Propanol 5,00 4,87 4,25 4,18 85,0 85,8 85,4 (xúc tác: NaOH 1%, nhiệt độ: 70-75oC, thời gian phản ứng: 7 giờ, tốc độ khuấy: khoảng 400 vòng/phút). Nhận xét: Bảng 10 cho thấy methanol là loại dung môi tốt nhất cho phản ứng vì cho hiệu suất cao. Nguyên nhân: - Methanol hòa tan tốt dầu cá. - Ethanol cho hiệu suất không cao có thể là do tuy sử dụng ethanol tuyệt đối nhưng chai này được mua ở những cửa hàng, có thể trong quá trình bảo quản đã khá lâu nên đã hút ẩm khiến ethanol đã lẫn một ít nước, làm giảm hiệu suất phản ứng. - Propanol cho hiệu suất cũng không cao bằng có thể do không hòa tan tốt dầu cá. 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác Trong thí nghiệm chúng tôi thử sử dụng hai loại xúc tác đó là NaOH và KOH thì nhận thấy rằng không có sự khác biệt giữa hai loại. Vì vậy có thể sử dụng bất kỳ loại nào cho những phản ứng tiếp theo. 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác Trong phản ứng transester hóa, lượng xúc tác cho vào cũng ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Để khảo sát lượng xúc tác chúng tôi thay đổi lần lượt là 0,5%; 0,8%; 1%; 1,2%; 1,5%; 2% và 2,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 11 và hình 5. Bảng 11: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác lên phản ứng transester hóa. Số thứ tự Lượng xúc tác (g) Hàm lượng (%) Khối lượng dầu ban đầu (g) Khối lượng dầu sau phản ứng (g) Hiệu suất (%) 1 0,0125 0,5 2,50 1,75 70,0 2 0,0160 0,8 2,00 1,84 92,0 3 0,0250 1,0 2,50 2,31 92,2 4 0,0300 1,2 2,44 2,25 92,4 5 0,0300 1,5 2,00 1,85 92,5 6 0,0512 2,0 2,56 2,38 93,0 7 0,0612 2,5 2,45 - - (xúc tác: NaOH , dung môi methanol 30g, nhiệt độ: 70-75oC, thời gian: 7giờ, tốc độ khuấy: khoảng 400vòng/phút) Hình 5: Ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác lên phản ứng transester hóa 33 Ả n h h ư ở n g c ủ a h à m lư ợ n g x ú c t á c lê n p h ả n ứ n g t r a n s e s t e r h ó a 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 H à m l ư ợ n g x ú c t á c ( % ) Hi ệu s uấ t ( % ) y Nhận xét: Phản ứng xảy ra tốt nhất khi lượng xúc tác vào khoảng 0,8 – 1,2%. Nếu tăng hàm lượng xúc tác quá cao không xác định được hiệu suất phản ứng vì sau phản ứng hỗn hợp trở nên đặc khó cô lập sản phẩm, có thể là do phản ứng đã tạo ra quá nhiều xà phòng. Nếu cho quá ít xúc tác thì hiệu suất quá thấp. 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng Để khảo sát thời gian tối ưu của phản ứng transester hóa chúng tôi thực hiên phản ứng trên 2g dầu cá, thay đổi thời gian phản ứng từ 1 giờ đến 3 ngày. Sử dụng sắc ký lớp mỏng để khảo sát mức độ hoàn thành của phản ứng theo thời gian. Kết quả được trình bày trong bảng 12 và hình 6. Bảng 12: Kết quả ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên phản ứng transester hóa Số thứ tự Thời gian phản ứng (giờ) Khối lượng đầu (g) Khối lượng cuối (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 1 - - - 2 2 2,5 2,13 85,2 3 3 2,23 2,01 90,1 4 4 2,01 1,85 91,3 5 5 1,99 1,83 92,0 6 8 2,32 2,14 92,5 7 10 2,15 2,00 93,0 8 24 2,5 2,37 94,8 9 48 2,56 2,43 94,9 10 72 2,81 2,7 95,0 (xúc tác: NaOH 1%, dung môi methanol 30g, nhiệt độ: 70-75oC, tốc độ khuấy: khoảng 400vòng/phút) Hình 6: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên phản ứng transester hóa 34 Ả n h h ư ở n g c ủ a t h ờ i g ia n p h ả n ứ n g lê n p h ả n ứ n g t r a n s e s t e r h ó a 2 1 0 8 5 4 3 7 24 82 4 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 T h ờ i g ia n p h ả n ứ n g ( g iờ ) H iệ u su ất (% ) Nhận xét: Bảng 12 cho thấy sau khi đun 1 giờ. phản ứng chưa xảy ra. Sau 2 giờ, phản ứng đã có xảy ra nhưng chưa hoàn tất. Tiếp theo sau 3 giờ, 4 giờ phản ứng đã có suất hiện sản phẩm. Từ 4 giờ trở đi phản ứng xảy ra mạnh, hiệu suất đạt được lên đến 91,3%. Từ 5 đến 10 giờ hiệu suất không tăng bao nhiêu khoảng 92 – 93%. Khi đun lâu 2 ngày hoặc 3 ngày hiệu suất có tăng chút ít nhưng thời gian phản ứng dài, do đó chúng tôi chọn thời gian tối ưu là 3 giờ - 4 giờ. Do sản phẩm tạo ra sau phản ứng cũng là một dạng ester, mặc dù mạch hydrocarbon đã ngắn hơn rất nhiều nhưng độ phân cực cũng không khác nhau mấy. Rất khó sử dụng sắc ký lớp mỏng để phát hiện sản phẩm tạo ra đến mức độ nào do đó chúng tôi buộc phải khảo sát ở nhiều thời gian khác nhau và sau đó dùng cân để xác định hiệu suất phản ứng. Kết quả sắc ký lớp mỏng: Kết quả được trình bày ở hình 7, 8, 9, 10. Từ các hình 7, 8 nhận thấy rằng vết của sản phẩm (vết thứ nhì) đã có sự khác biệt so với vết của dầu cá ban đầu (vết thứ nhất), điều đó chứng tỏ rằng phản ứng đã xảy ra nhưng để xác định phản ứng xảy ra hoàn toàn hay chưa cần kết hợp với phương pháp cân, xác định hiệu suất. Từ hình 9 cho thấy dung môi giải ly tốt là benzen, vì các vết hiện lên rõ, đẹp. Hình 10 cho thấy dù phản ứng xảy ra sau 3 giờ và 9 giờ thì vết sắc ký cũng không khác nhau bao nhiêu. Điều đó cho thấy không thể chỉ sử dụng sắc ký lớp mỏng để xác định mức độ hoàn thành của phản ứng transester hóa. 3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo bằng phương pháp tủa urê Để khảo sát khả năng kết tinh của ester với urê chúng tôi thử nghiệm trên hai điều kiện nhiệt độ khác nhau lần lượt là -5oC và -10oC, 15g urê, 200ml ether dầu hỏa, 2g dầu transester hóa. Sau khi để qua đêm, làm khan bằng Na2SO4, lọc thu được sản phẩm. Cân và khảo sát thành phần hóa học bằng sắc ký ghép khối phổ (GC/MS). Kết quả được trình bày ở bảng 13 và phục lục 1, 2. Bảng 13: Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo bằng phương pháp tủa urê Số lượt phản ứng Nhiệt độ phản ứng (oC) Lượng dầu trước khi tủa (g) Lượng ester metyl của acid béo thu được (g) Ghi chú 1 -5 2,0 1,5 Khảo sát GC/MS 2 -10 2,0 1,2 Khảo sát GC/MS Kết quả lần khảo sát GC/MS của hai mẫu thử nghiệm được trình bày ở bảng 14. So sánh với phương pháp tủa của acid béovới urê của bạn Lê Hoàng Anh được trình bày ở sơ đồ 5, bảng 15. Bảng 14: Thành phần acid béo trong hỗn hợp ester sau khi tủa ở nhiệt độ -5oC, -10oC 35 Phần trăm trong hỗn hợp (%) Số thứ tự Tên acid của methyl ester Tủa ở -5oC Tủa ở -10oC 1 Tetradecanoic 5,14 4,51 2 Pentadecanoic 0,18 3 9-Hexadecenoic 1,65 1,21 4 Hexadecanoic 28,63 29,26 5 Heptadecanoic 0,23 6 6,9,13-Octadecatrienoic 0,17 7 9,12-Octadecadienoic 13,50 13,22 8 9-Otadecenoic 35,45 37,80 9 Octadecanoic 10,45 9,35 10 5,8,11,14-Eicosatetraenoic 0,27 11 5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic 0,34 0,50 12 7,10,13-Eicosatrienoic 0,54 0,46 13 10,13-Eicosadienoic 8,11-Eicosadienoic 0,40 0,50 14 10,13-Eicosadienoic 11,13- Eicosadienoic 0,56 15 11-Eicosenoic Cyclopropaneoctanoic 1,65 1,34 16 Eicosanoic 0,40 17 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic (DHA) 0,47 1,81 36 Sơ đồ 5: So sánh các bước cơ bản của hai tiến trình thí nghiệm Daàu caù basa (haøm löôïng DHA 0,34%) - Thuûy giaiû vôùi KOH/ethanol - Acid hoùa Tuûa ureâ Hoãn hôïp acid beùo baõo hoøa vaø baát baõo hoøa Acid beùo baát baõo hoøa Metyl ester hoùa Metyl ester cuûa acid beùo Phaân tích baèng GC/MS Sô ñoà tieán haønh maãu thí nghieäm cuûa Leâ Hoaøng Anh Daàu caù basa (haøm löôïng DHA 0,34%) Metyl transester hoùa Hoãn hôïp metyl ester acid beùo baõo hoøa vaø baát baõo hoøa Tuûa ureâ Metyl ester acid beùo baát baõo hoøa Phaân tích baèng GC/MS Sô ñoà tieán haønh thí nghieäm Bảng 15: So sánh hàm lượng các acid béo chủ yếu trong mẫu thí nghiệm với mẫu của Lê Hoàng Anh Hàm lượng (%) Tên acid béo Mẫu thí nghiệm Mẫu của Lê Hoàng Anh Tổng acid béo bão hòa Myristic Palmitic Stearic 43,12 4,51 29,26 9,35 1,01 -- 1,01 -- Tổng acid béo bất bão hòa Palmitoleic Oleic Linoleic Linolenic Arachidonic Eicosapentaenoic Docosahexaenoic (DHA) 56,88 1,21 36,10 13,22 -- -- 0,49 1,81 98,99 7,2 -- 40,62 -- 4,62 -- 5,87 Nhận xét: a) Hàm lượng acid béo DHA thu được ở lần tủa thứ nhất là 0,47% và lần tủa thứ nhì là 1,81%. Cả hai lần tủa đều cho DHA hàm lượng thấp. 37 b) Kết quả GC/MS cho thấy sản phẩm thu được sau khi tủa urê vẫn còn chứa khoảng 43% ester béo bão hòa. Bảng 15 cho thấy hàm lượng acid béo bão hòa vẫn còn quá nhiều (43,2%), trong khi đó việc tủa acid béo với urê của bạn Lê Hoàng Anh lại cho tổng acid béo bão hòa là 0,1%. điều này có thể việc tủa urê với ester béo không hiệu quả bằng tủa urê với acid béo và cần được khảo sát lại kỹ hơn. 4.1. KẾT LUẬN Từ dầu cá basa dạng lỏng chúng tôi đã chuyển thành dạng ester của các acid béo bằng phương pháp thực hiện phản ứng transester hóa. Phản ứng transester hóa được khảo sát với nhiều loại dung môi, xúc tác, nhiệt độ, thời gian phản ứng, cuối cùng tìm được điều kiện tối ưu cho phản ứng đó là sử dụng dung môi methanol, xúc tác KOH 1%, thời gian phản ứng 3 giờ, nhiệt độ 70-80oC. Từ sản phẩm là metyl ester của acid béo có chứa nhiều loại ester của acid béo bão hòa và bất bão hòa, nhằm muốn thu được DHA chúng tôi sử dụng phương pháp tủa urê ở điều kiện nhiệt độ lạnh (-5oC). Ở điều kiện này các ester béo bão hòa sẽ tạo phức với urê, lắng xuống đáy bình chứa, phức này được lọc, loại ra khỏi dung dịch, còn lại là ester béo bất bão hòa. Như vậy hàm lượng ester béo bão hòa sẽ tăng lên cũng đồng nghĩa với việc làm giàu DHA trong hỗn hợp. Từ dầu metyl ester của acid béo thu được sau khi transester hóa, thực hiện 2 thí nghiệm tủa urê. - Sản phẩm của thí nghiệm tủa số 1 cho hàm lượng DHA là 0,47%, số liệu này cho thấy hàm lượng DHA tăng rất ít so với tài liệu (0,34%). - Sản phẩm của thí nghiệm tủa số 2 cho hàm lượng DHA là 1,81% có tăng lên nhưng vẫn thấp so với các phương pháp xử lý khác của các tác giả khác. Một trong những nguyên nhân của kết quả thu DHA hàm lượng thấp có thể là: - Khi phản ứng transester hóa kết thúc, sản phẩm ester không có điều kiện bảo quản tốt trong khi chờ kết tinh với urê, dầu mỡ thì rất khó bảo quản, do đó có thể một số chất trong đó có DHA đã bị biến đổi thành chất khác. - Phản ứng transester hóa là một phản ứng thuận nghịch, nên khi phản ứng transester hóa kết thúc sản phẩm bao gồm các ester béo và triglycerid ban đầu chưa phản ứng hết. Khi sử dụng nước để rửa loại glycerol và chất xúc tác, sản phẩm thu được vẫn là các ester béo và triglycerid ban đầu – Cả hai loại hợp chất này đều là ester mang dây dài nên tính phân cực không khác nhau nhiều, không thể tách riêng chúng ra được. Trong phản ứng tủa urê thì urê tạo tủa tốt với acid béo hơn là với ester béo nên bài thực nghiệm là tạo tủa urê với ester béo, sản phẩm cho thấy vẫn còn chứa rất nhiều (43,12%) các ester bão hòa. Vậy cần khảo sát lại để xác định nên hay không nên áp dụng tạo tủa urê với ester béo. Mặt khác do điều kiện thí nghiệm không cho phép và không đủ thời gian để thử ở những điều kiện nhiệt độ cũng như hàm lượng urê khác nhau, do đó mà hàm lượng thu được không đạt yêu cầu. Trong quá trình thực hiện phản ứng transester hóa, để theo dõi phản ứng chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng nhưng kết quả giải ly không rõ ràng lắm nên phải kết hợp với phương pháp cân để tính hiệu suất phản ứng. Nguyên nhân là do sản phẩm sau phản ứng cũng là một dạng ester (mỡ cá ban đầu là một triglycerid-bản chất cũng là một ester, có trọng lượng phân tử lớn hơn) do dó khi sử dụng sắc ký lớp mỏng xuất hiện những vệt không khác nhau bao nhiêu. Vì vậy cần có nhiều nghiên cứu thêm cách kiểm tra mức độ hoàn thành của phản ứng transester hóa. 4.2. ĐỀ NGHỊ * Trong phản ứng transester hóa: 38 - Nên sử dụng các loại xúc tác khác nếu có điều kiện như zeolit để phản ứng diễn ra nhanh hơn và quá trình rửa ester cũng đỡ vất vả. - Dung môi sử dụng vẫn nên dùng là methanol, vì các acid béo chuỗi dài từ 20 carbon trở nên có thể hòa tan tốt trong methanol, phản ứng transester hóa diễn ra với hiệu suất cao. - Nên tìm kiếm cách khác tốt hơn để theo dõi mức độ hoàn thành của phản ứng transester hóa vì ester và mỡ cá ban đầu có mức độ phân cực gần như nhau, rất khó phát hiện sự khác biệt của các vết trên bản mỏng. * Trong việc kết tinh ester với urê: - Nên sử dụng hàm lượng dầu cá/urê theo tỷ lệ 1:15 và kéo dài thời gian tạo phức là 20 giờ. - Thử quá trình kết tinh trong điều kiện lạnh hơn. Có thể xuống -20oC hoặc thấp hơn nữa. - Urê kết tinh với acid béo có thể dễ dàng hơn nhưng nếu sử dụng ester thì chúng ta có thể tận dụng được nguồn dầu diesel có sẵn, vì hiện nay có rất nhiều công trình khoa học đang sử dụng mỡ cá basa dư thừa làm nhiên liệu sinh học bằng phản ứng transester hóa và ở Việt Nam hiện nay đã có công ty TNHH Minh Tú sản xuất loại dầu này (báo Người lao động, thứ 6, 14-7-1006) với quy mô 3 triệu lit/năm. Như vậy, chúng ta vừa có thể trích ly được thành phần quý vừa có thể sử dụng nguồn năng lượng sạch này. SÁCH THAM KHẢO [1]: Algis J. Vingrys, James A. Armitage, Harrison S. Weisinger, B.V.Bui, Andrew J. Sinclar, Richard S. Weisinger, The role of omega-3 polyunsaturated fatty acids in retinal function, Fatty Acids, 193-217, 2001 (CA 136:117762). [2]:Barbara B. Ellenbogen, S. Aaronson, S. Goldstein, M. Belsky. Polyunsaturated fatty acids of aquatic fungi: possible phylogenetic significance. Comp. Biochem. Physiol. 29,805,1969 (CA 71:10511x). [3]: Gerard Hornstra, Omega-3 Long chain Polyunsaturated Fatty Acids and Health. Benefits, Maastricht University, 3-26, 2002. [4]: Hoàng Đức Như, Dầu thực vật và sức khỏe, Trung tâm Dinh dưỡng Trẻ em TP. HCM, trang 12 – 15, 1997. [5]: L.Sijtsma, M.E.De Swaaf. Biotechnological production and applications of the ω-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid. Applied Microbiology and Biotechnology. 64, 146-153, 2004 (CA 141:52900). [6]: Lê Hoàng Anh, Phương pháp ly trích, thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic trong mỡ cá basa pangasius bocourti sauvage. Khóa luận cử nhân khoa học, khoa Sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, 2006. [7]: Lê Ngọc Thạch, Trần Hữu Anh, Hóa Học Hữu Cơ, NXB Giáo dục, 155-171, 1999. [8]: Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, trang 175-205, 1998. [9]: Lê Trần Duy Quang, Nghiên cứu chế tạo và khảo sát ứng dụng của zeolit NaX trong phản ứng transester hóa mỡ động vật thành biodiesel. Luận văn Kỹ sư Công nghệ hóa học, trường Đại Học Bán Công Tôn Đức Thắng, 2006. [10]: Lương Thị Nguyên Linh, Tìm hiểu quy trình nhận danh, cô lập và trích ly docosahexaenoic acid (DHA) trong mỡ cá tra Pangasius hypophthalmus sauvage. Khóa luận cử nhân khoa học, khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2005. [11]: Martin E. de Swaaf, Theo C. de Rijk, Pieter van der Meer, Gerrit Eggink, Lolke Sijtsma. Analysis of docosahexaenoic acid biosynthesis in Crypthecodinium cohnii by 13C labelling and desaturase inhibitor experiments. Journal of Biotechnology. 103, 21-29, 2003 (CA 139:210565). [12]: Nguyễn Kim Phi Phụng, Các phương pháp nhận danh, trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ. Học phần cao học chuyên ngành Hóa Hữu Cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 7, 2000-2001. 39 [13]: Nguyễn Thiệt Thuật, Bước đầu nghiên cứu phản ứng transester hóa dầu hạt bông vải Việt Nam, khoa Hóa, Khóa luận Tốt nghiệp, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2004. [14]: Nguyễn Vũ Anh Thư, Điều chế biodiesel từ dầu dừa dùng xúc tác PPL. Tiểu Luận Tốt Nghiệp, khoa Hóa, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2004. [15]: Paul B. Kelter, James D. Carr, Andrew Scott, Chemistry: A world of Choices, McGraw – Hill, 513, 1999. [16]: R. Hardy, J.N. Keay, The isolation of the polyunsaturated acids of the fish oil as their methyl esters by preparative scale gas chromatography. Journal of Chromatography, 27, 1967 (CA 67:34068b). [17]: Trần Thanh Tòng, Thực tập động vật có xương sống. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 28-35, 2001. [18]: Trần Thị Áng, Hóa sinh học. Nhà xuất bản Giáo dục, 177-126, 2001. [19]: Virginia F.Stout, A simple procedure for obtaining docosahexaenoic acid, Journal of American Oil Chemists’Society, 40, 40, 1963 (CA 58:7051). [20]: Yukihisa Tanaka, Ikuko Sakaki, Takeshi Ohkubo. Extraction of phospholipids from salmon roe with supercritical carbon dioxide and an entrainer, Journal of Oleo Science, 53, 417-424, 2004 (CA 141:394384). TÀI LIỆU INTERNET [21]: [22]: [23]: [24]: [25]: [26]: [27]: [28]: [29]: [30]: [31]: [32]: HNMD/congnghiep/CABASA.htm [33]: [34]: [35]: [36]: [37]: [38]: [39]: [40]: United States Patent, Patent Number: 4,792,418, Date of Patent: Dec. 20, 1988. [41]: S.P.J. Namal Senanayake, Fereidoon Shahidi, Lipase-catalyzed incorporation of docosahexaenoic acid (DHA) into borage oil: optimization using response surface methodology, Food chemistry 77,115-123, 2002. [42]: S.P.J. Namal Senanayake, Fereidoon Shahidi, Incorporation of docosahexaenoic acid (DHA) into evening primrose (Oenothera biennis L.) oil via lipase-catalyzed transesterification, Food chemistry 85, 489-496, 2004. 40 [43]: Shucheng Liu, Chaohua Zhang, Pengzhi Hong, Hongwu Ji, Concentration of docosahexaenoic acid (DHA) anh eicosapentaenoic acid (EPA) of tuna oil by urea complexation: optimization of process parameters, Journal of food engineering 73, 203-209, 2006. [44]: Wenlei Xie, Hong Peng, Ligong Chen, Calcined Mg-Al hydrotalcites as solid base catalysts for methanolysis of soybean oil, Journal of Molecular Catalysis 246, 24-32, 2005 [45]: thông tin từ hội công nghiệp hóa nghề cá Nhật Bản the Japanese Society of Scientific Fisheries), 44 (8) 927 (1978)