Mục lục
I. Giới thiệu
1.1. Inulin
1.2. Định nghĩa
1.3. Công thức cấu tạo
1.4. Nguồn thu nhận
1.5. Ứng dụng
2. Enzyme inulinase
2.1. Định nghĩa
2.2. Phân loại
2.3. Các bậc cấc trúc và cơ chế xúc tác
2.4. Ứng dụng
3. Vi sinh vật
3.1. Nhóm vi sinh vật sử dụng sinh tổng hợp inulinase
3.2. Đặc điểm sinh lý
3.2. Đặc điểm sinh lý
II. Quy trình công nghệ
III. Giải thích quy trình công nghệ
1. Chuẩn bị môi trường
2. Tiệt trùng môi trường
3. Chuẩn bị giống
4. Nhân giống
5. Cấy giống
6. Lên men
7. Tinh sạch
7.1. Ly tâm lần 1
7.2. Kết tủa
7.3. Ly tâm lần 2
7.4. Hòa tan kết tủa
7.5. Thẩm tách
7.6. Trao đổi sắc ký ion
7.7. Trao đổi sắc ký ái lực
7.8. Sấy
IV. Sản phẩm
V. Thành tựu công nghệ
VI. Tài liệu tham khảo
56 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2630 | Lượt tải: 3
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Qui trình công nghệ thu nhận inulinase, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ng nhiều inulinase càng tốt.
- Phương pháp thực hiện:
Nạp môi trường vô trùng vào trong thiết bị.
Cho giống cấy vào thiết bị với tỉ lệ giống 5% so với thể tích của môi trường lên
men.
Lên men bề sâu trong thiết bị lên men ở 300C, pH 6.5. Khuấy trộn trong
200rpm, lưu lượng khí 0.75 vvm.
Thời gian lên men: 60h
- Các biến đổi:
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 21
Vật lý : Nhiệt độ của quá trình tăng và được điều nhiệt cố định ở 300C trong
suốt quá trình phản ứng bằng bột phận điều nhiệt được lấp ở vỏ của thiết bị lên men.
Hóa học: Nồng độ cơ chất trong môi trường giảm dần, sản phẩm trao đổi chất
được tạo thành ngày càng nhiều.
Hóa lý: Độ nhớt tăng.
Hóa sinh: Enzyme xúc tác cho các phản ứng trao đổi chất trong tế bào vi
khuẩn diễn ra mạnh.
Sinh học: Sinh khối tế bào tăng lên.
- Thiết bị:
Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tương tự như thiết bị nhân giống vi sinh vật.
Chúng cũng cũng có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ. Bên trong
thiết bị có hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH… để có thể theo dõi trực
tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Motor cho cánh khuấy thường được đặt
phía trên nắp thiết bị. Còn cửa nạp và tháo môi trường được bố trí phía đáy. Ngoài ra thiết bị
còn có cửa quan sát, van lấy mẫu…
Hình 9 Thiết bị lên men
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 22
Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
a. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Khả năng sản xuất enzym từ nhiều nguồn carbon khác nhau:
Inulin> sucrose> fructose> glucose> lactose > Maltose> tinh bột
Hình 10 Ảnh hưởng của nguồn carbon inulin (a), ảnh hưởng của các nguồn carbon khác với
inulin như là chất cảm ứng cho sản xuất inulinase
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 23
Inulin là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất inulinase từ K. marxianus YS-1. Những
nguồn carbon khác thì cho hiệu suất sản xuất inulinase thấp khi sử dụng cô lập, và khi sử
dụng tinh bột là nguồn carbon thì hoat tính inulinase hoàn toàn không có (hình 9a). Hiệu quả
của từng nguồn cacbon (1%, w / v) kết hợp với Inulin ở nồng độ 0,1% và% 0,5 (w / v) đã
được nghiên cứu (hình 9b). Có sự gia tăng đáng kể trong hoạt tính của enzyme khi sử dụng
kết hợp.
Inulin với từng nguồn carbon như trên. Vì vậy, có thể kết luận rằng inulinase là
enzyme cảm ứng trên cơ chất cảm ứng là inulin. Người ta thấy rằng inulin là cơ chất cảm ứng
cho quá trình sản xuất inulinase, trong khi sự nuôi cấy của vi sinh vật sử dụng các nguồn
carbon khác ức chế quá trình sản xuất enzyme này. Và điều này có thể là do những nguồn
carbon này kìm hãm sinh tổng hợp inulinase enzym .
b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Khả năng sản xuất inulinase dưới ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau: chất
chiết thịt> chất chiết thịt bò> peptone>chất chiết men > ammonium clorua > Ammonium
sulfate> dịch bắp> ammonium nitrat> Natri nitrat> urê (hình 10). Hoạt tính tối đa của
inulinase đạt được là 6,5 IU / ml khi sử dụng chất chiết thịt. Hoạt tính inulinase cũng khá cao
khi sử dụng peptone và chất chiết thịt bò. Những nguồn nitơ hữu cơ tốt hơn so với các nguồn
nitơ vô cơ. Chất chiết thịt được xem là nguồn nitơ tốt nhất cho việc sản xuất inulinase từ
Chrysosporium pannorum (Xiao et al. 1988). Chất chiết thịt heo sau chất chiết thịt bò đã được
sử dụng là nguồ nitơ tốt để tổng hợp từ inulinase từ Kluyveromyces sp. Y-85 (Wenling et al,
1998b.). Do đó, chất chiết thịt là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sản xuất inulinase, và được
chọn cho những nghiên cứu sau này. Để xác định nồng độ tối ưu của các chất chiết thịt, người
tat thay đổi nồng độ của nó từ 0.5-5.0%, w/v được sử dụng trong môi trường. Khi nồng độ
của chất chiết thịt đạt đến 2% (w/v) thì hoạt tính enzyme cực đại (12.1 IU/ml) và nếu nồng độ
vượt qua 2% có sự giảm hoạt tính enzyme. Điều này có thể là do bản chất phức tạp của nguồn
nitơ và ở nồng độ cao một vài thành phần của nó có thể gây độc cho quá trình sản xuất
inulinase
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 24
Hình 11 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt tính của enzyme
c. Ảnh hưởng của các nguyên tố vết
Bảng 3: chỉ ra sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme. Chỉ có
Mn
2+
(0.1 mM) và Ca
2+
(0.5 mM) nâng cao hoạt tính của inulinase trong khi Mg2+, Cu2+, Zn2+,
Co
2+
, K
+
, BO3
3-
và MoO4
2-
không có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp inulinase. Tuy nhiên,
nếu nồng độ của những nguyên tố này cao hơn sẽ tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp
inulinase. Fe
2+
và Ni
2+
làm giảm khả năng tạo inulinase.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 25
Bảng 3 Sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme
d. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt
Trong số những chất hoạt động bề mặt được sử dụng, chỉ có SDS nâng cao khả
năng sản xuất inulinase (hình 11). Những nghiên cứu trước cho thấy chất hoạt động bề mặt
ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của màng tế bào ((Tukmachev et al., 1977). Để tối ưu
nồng độ của SDS, người ta thay đổi nồng độ SDS từ 0.05–2.5 mM trong môi trường. Khi
nồng độ của SDS tăng đến 0.1 mM thì hoạt tính inulinase cực đại là 21.5 IU/ml. Khi nồng độ
SDS cao hơn 0.1 mM thì nó có khả năng hòa tan màng protein và phospholipids, từ đó giết
chết tế bào nấm men.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 26
Hình 12 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính của inulinase
e. Ảnh hưởng của tuổi và tỉ lệ giống cấy
Hoạt tính enzyme đạt tối đa 24,8 IU/ml khi sử dụng canh trường giống 12h tuổi.
Hoạt tính enzyme thấp hơn với canh trường giống dưới 12h tuổi. Điều này có thể do canh
trường giống chưa vào giai đoạn sinh trưởng. Sử dụng canh trường giống này, hoạt tính
inulinase tăng cực đại (24.8 IU/ml) khi tỉ lệ giống cấy là 5%(v/v). Nếu tỉ lệ giống cấy thấp,
lượng sinh khối nấm men sinh ra có thể không đủ để tận dụng hết nguồn cơ chất. Tuy nhiên,
hàm lượng vi sinh vật cao, độ nhớt của môi trường thể lên men dẫn đến sự mất cân bằng dinh
dưỡng trong môi trường.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 27
f. Hiệu quả việc kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường
Hiệu quả của việc dử dụng kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường lên men
được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4 Sự kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường
Từ bảng trên, cho thấy rằng sự kết hợp các thành phần đã được tối ưu: inulin 1.5%,
chất chiết thịt 2%, CaCl2 0.5mM, và SDS 0.1mM sẽ cho hoạt tính enzyme cực đại 24.7
IU.ml.
g. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ
Kết quả cho thấy rằng hoạt tính enzyme cực đại là 24.5 IU/ml khi tăng pH của môi
trường lên 6.5. Ở pH 4.0 và 8.0 , hoạt tính enzyme rất thấp: tương ứng với pH 8 hoạt tính
enzyme là 4.2 IU/ml. Khoảng pH 6.4 – 6.6 tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp inulinase từ K.
marxianus (Gupta et al., 1994). Năng suất cực đại cũng đạt được bởi K. marxianus ở pH 6.5
bởi (Kalil et al., 2005; Silva-Santisteban and Filho, 2005). Hoạt tính inulinase tối đa 24.3
IU/ml ở 30oC, nếu nhiệt độ vượt quá nhiệt độ này thì hoạt tính enzyme sẽ giảm đáng kể. Nói
chung nhiệt đô ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào.
h. Ảnh hưởng của sự khuấy trộn
Tác động khuấy trộn có ảnh hưởng mạnh đến quá trình sinh tổng hợp inulinase.
Hoạt tính enzyme tăng đáng kể 28.1 IU/ml khi tốc độ khuấy trộn là 150rpm so với điều kiện
không khuấy trộn 5.9 IU/ml. Nếu tốc độ khuấy trộn vượt quá 150 rpm thì hoạt tính enzyme
giảm. Tốc độ khuấy trộn không chỉ ảnh hưởng đến lượng oxy, mà còn ảnh hướng đến những
chất dinh dưỡng khác trong môi trường. Khi tốc độ khuấy trộn cao hơn, hoạt tính enzyme sẽ
thấp do sự ảnh hưởng của ứng suất trượt lên tế bào nấm men cũng như cấu trúc tế bào
enzyme.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 28
i. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Hoạt tính enzyme đạt 30.8 IU/ml khi thời gian lên men là 72h, và sau đó sẽ giảm.
Điều này cho thấy rằng sự sinh tổng hợp inulinase từ K. marxianus liên quan đến sự sinh
trưởng của tế bào và đạt đến giá trị tối ưu (Al-Dagal and Bazaraa, 1998). Hoạt tính enzyme
sẽ giảm sau 72 lên men do sự giảm của chất dinh dưỡng trong môi trường, hoặc do phản ứng
dị hóa của enzyme.
7. Tinh sạch
7.1. Ly tâm lần 1
- Mục đích: Tách sinh khối vi sinh vật
- Các biến đổi:
Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.
Hóa lý: Độ nhớt giảm, huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng
Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn –
lỏng.
Vi sinh: Hàm lượng vi sinh vật giảm.
- Thiết bị:
Sử dụng các cơn lốc ly tâm để tách riêng các phần tử rắn và lỏng có tỷ
trọng khác nhau.
Hình 13 Thiết bị ly tâm lắng
- Nguyên tắc hoạt động:
Cấu tạo: gồm một máy ly tâm nằm ngang có sức chứa lớn,quay khoảng
10000rpm, lực ly tâm lớn làm cho các pha tách ra khỏi nhau nhờ vào tỉ trọng khác nhau của
chúng. Khi máy hoạt động, hỗn hợp huyền phù được nạp theo ống nạp liệu vào khoang trong
của vít tải rồi qua cửa tháo vào bên trong rotor. Dưới tác động của lực li tâm, huyền phù được
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 29
phân chia và các tiểu phần của pha rắn được lắng trên tường của rotor. Chất lỏng trong
chảy vào cửa rót, tràn qua ngưỡng rót và được tháo ra khỏi rotor.
- Thông số công nghệ:
Tốc độ ly tâm 10000rpm.
Nhiệt độ 40C
Thời gian 20 phút.
Hiệu suất thu hồi 100%
Độ tinh sạch 1
Hoạt tính riêng 9.4 IU/mg
Tổng lượng protein 185.0 mg
Tổng hoạt độ 1750 IU
7.2. Kết tủa
- Mục đích:
Khai thác: Tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô, thu protein dưới dạng
kết tủa.
Chuẩn bị: Chuẩn bị cho quá trình sấy thu nhận sản phẩm.
- Các biến đổi:
Vật lý: Nhiệt độ giảm.
Hóa lý: Sự kết tủa và tách pha. Enzyme chuyển từ dạng lỏng
sang dạng rắn.
Hóa học: Hàm lượng enzyme hòa tan trong dung dịch giảm.
Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt hoặc ức chế. Vi sinh vật nổi
lên trên bề mặt .
- Phương pháp thực hiện:
Dịch enzyme thô thu được sau quá trình ly tâm lắng tách sinh khối và tạp chất rắn
sẽ được thêm vào môi trường dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa 80% theo tỉ lệ giữa thể tích môi
trường và thể tích chất làm kết tủa là 1:5. Trong quá trình thêm vào, hỗn hợp được khuấy với
tốc độ 1000rpm. Quá trình trên nhằm mục đích đưa (NH4)2SO4 bão hòa vào để tăng nhanh
hiệu suất quá trình kết tủa tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô.
- Các yếu tố ảnh hưởng:
Nồng độ dung dịch enzyme ban đầu càng loãng thì enzyme càng khó kết
tủa và ngược lại.
Lượng muối hòa tan bổ xung càng nhiều thì khả năng kết tủa enzyme
càng cao nhưng nếu quá cao thì khả năng kết tủa giảm.
- Thiết bị:
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 30
Hình 14 Thiết bị kết tủa
Một cách tổng quát, thiết bị kết tủa gồm các bộ phận chủ yếu sau: thùng hình trụ
với đáy tròn hoặc nón. Theo đường tâm của thiết bị lắp trục khuấy với cánh khuấy. Trục
khuấy xuyên qua nắp và được bít kín bởi hộp đệm phía trên nắp. Truyền chuyển động cho
trục khuấy từ động cơ cánh khuấy qua hộp giảm tốc độ để tạo tốc độ thích hợp cho cánh
khuấy. Thực hiện nhập liệu qua các cửa phần trên của thiết bị còn tháo sản phẩm qua đường
dưới đáy thiết bị. Trên nắp và thân thiết bị, người ta bố trí cửa sửa chửa và cửa quan sát.
- Thông số công nghệ:
Nhiệt độ 40C
Muối: (NH4)2SO4 bão hòa 80%
Thời gian 30 phút
Tổng lượng protein 35.0 mg
Tổng hoạt độ 850 IU
Hoạt độ riêng 38 IU/mg
Độ tinh sạch 2.5
Hiệu suất thu hồi 48.5%
7.3. Ly tâm lần 2
- Mục đích: Thu nhận kết tủa.
- Các biến đổi:
Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.
Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn –
lỏng.
Hóa lý: Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng
- Các yếu tố ảnh hưởng :
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 31
Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều
thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn.
Tốc độ quay của roto: Tốc độ quay càng nhanh thì quá trình ly tâm càng
thuận lợi.
- Thiết bị: Giống ly tâm lần 1.
- Thông số kỹ thuật:
Tốc độ quay 10000rpm
Thời gian 10 phút
Nhiệt độ 40C
7.4. Hòa tan kết tủa
- Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình thẩm tách.
- Các biến đổi:
Hóa lý: Enzyme chuyển từ dạng rắn sang dạng lỏng.
Hóa học: Nồng độ dung dịch enzyme giảm do mất các chất
hòa tan.
- Các yếu tố ảnh hưởng:
Lượng dung dịch đệm càng nhiều thì khả năng hòa tan càng cao nhưng gây
khó khăn trong quá trình lọc gel.
Chêng lệch pH của dung dịch đệm và pI của enzyme càng cao thì hòa tan
càng tốt
- Thiết bị: Dạng thiết dạng hình trụ có cánh khuấy.
- Thông số công nghệ:
Dung dịch đệm: Citrate-phosphate . pH 6.0
Trong dung dịch thu được, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao
phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường
monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện
pháp khác nhau.
7.5. Thẩm tách
- Mục đích:
Hoàn thiện: Loại bỏ phần muối sau quá trình kết tủa còn dư ra khỏi enzyme, tách
các tạp chất có kích thước nhỏ.
- Các biến đổi:
Hóa lý: Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng, tách các cấu tử hòa tan và
các chất có kích thước rất nhỏ cỡ vi sinh vật.. Các đại phân tử bị giữ lại.
Vật lý: Nhiệt độ tăng, có sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng của dung
dịch.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 32
Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn –
lỏng.
- Các yếu tố ảnh hưởng :
Kích thước các tạp chất rất nhỏ: Nếu quá nhỏ, lưu lượng qua lỗ thấp, dễ gây
bít lỗ màng, giảm hiệu suất quá trình thẩm tách.
Nhiệt độ: Các quá trình tinh sạch, thu nhận enzyme đều thực hiện ở nhiệt độ
thấp (40C ) nên các chất hòa tan, các chất kích thước nhỏ chuyển động chậm, giảm hiệu suất
thẩm tách, chúng tự chui qua lỗ màng. Vì thế tốn thời gian.
- Phương pháp thực hiện:
Cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta
dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất. Màng cellophane là màng bán thấm,
có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng
theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn.
Để giảm thời gian thẩm tách, tăng hiệu suất quá trình, người ta thường tạo ái lực
trong thiết bị thẩm tách.
Hình 15 Cơ chế thẩm tách
- Thông số công nghệ:
Nhiệt độ 40C
Dung dịch Nước cất
7.6. Trao đổi ion
- Mục đích:
Khai thác: Thu nhận enzyme
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 33
Hoàn thiện: Tách tạp chất khỏi sản phẩm.
- Biến đổi:
Vật lý: lực hút tĩnh điện giữa các hạt tích điện dương trong cột và các ion âm
trong dịchlên men.
Hóa học: Nồng độ các chất hòa tan tích điện dương giảm đáng kể
- Phương pháp thực hiện:
Nguyên lý của phương pháp:
Phương pháp sắc ký trao đổi ion có thể coi là 1 dạng đặc biệt của sắc ký hấp phụ
mà trong đó các cấu tử mang điện có khả năng tương tác tĩnh điện 1 cách thuận nghịch với
pha tĩnh là các hạt nhựa mang điện trái dấu, còn pha động là các dung dịch điện ly.
Quy trình thực hiện gồm 4 bước:
Bước 1: Nhồi hạt nhựa trao đổi ion vào cột .
Bước 2: Đưa các mẫu vào cột .
Bước 3: Các thành phần của mẫu có thể tích điện dương, âm hay trung
hòa về điện, khi đi qua cột chỉ có phần tử mang điện trái dấu mới kết hợp với hạt nhựa,
các phần tử khác do không bị giữ lại bởi pha tĩnh sẽ rời khỏi cột, trong đó có enzyme
inulinase cần thu nhận.
Bước 4: Tái sinh cột.
Do enzyme inulinse tích điện âm nên ta dùng thiết bị trao đổi anionit .Các ion âm
sẽ bị giữ lại trên cột, ngoài ra còn có các ion âm khác như ion acetate , ion photphate,... Các
ion dương và các chất không mang điện trong dung dịch sẽ đi ra khỏi cột.
Các ion âm có ái lực khác nhau với pha tĩnh (hạt nhựa) v à pha động (chất rửa
giải) nên các cấu tử sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động và được pha động lôi
cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau.
Ta sử dụng dung dịch rửa giải là NaCl để lôi cuốn ion âm ra khỏi cột.
- Thiết bị:
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 34
Hình 16 Cơ chế sắc ký trao đổi ion
Hình 17 Thiết bị trao đổi ion
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 35
- Thông số công nghệ:
Nhựa trao đổi anion DEAE-Sephacel (2.5 x 30 cm)
Dung dịch đệm 50 mM tris (pH 8.0)
Tốc độ rửa giải khoảng 0.4 ml/phút
Tổng lượng protein 4.2 mg
Tổng hoạt độ 160 IU
Hoạt độ riêng 38 IU/mg
Độ tinh sạch 4
Hiệu suất thu hồi 9.1%
- Các yếu tố ảnh hưởng:
Pha tĩnh: Phụ thuộc vào tính chọn lọc của nhựa trao đổi ion
Tính chọn lọc cao: Các peak thu được tách rời nhau ra .
Tính chọn lọc thấp: Các peak thu được không hoàn toàn tách rời.
Đối với nhựa trao đổi anion: ion F – bị giữ lại ít nhất.
Pha động: Phụ thuộc bản chất ion đối (ion thuộc pha động) và nồng độ của nó.
Dung dịch đệm:
Đối với các chất lưỡng tính có khả năng tích điện ở pH khác nhau, pH lớn
hơn pI thì phân tử tích điện âm và ngược lại.
Do đó cần lựa chọn pH dung dịch đệm thích hợp.
7.7. Sắc ký ái lực
- Mục đích:
Khai thác: Thu nhận enzyme
Hoàn thiện: Tách tạp chất khỏi sản phẩm, thu enzyme với
độ tinh sạch cao.
- Các biến đổi:
Hóa học: Xuất hiện liên kết ái lực giữa inulinase với các hạt ConA-CL Agarose.
Tăng nồng độ enzyme trong dung dịch.
- Phương pháp thực hiện:
Dịch enzyme thu được sau quá trình trao đổi ion được bơm vào thiết bị sắc ký ái
lực nhằm thu được enzyme inulinase với độ tinh sạch cao nhất. Những protein không hấp thu
trên cột sẽ tách ra ngoài với dung dịch đệm tương tự. Trong khi đó, các protein bị hấp thu trên
cột được tách ra bởi quá trình rửa giải từng bậc bằng methyl- -D-mannopyranoside (0–0.5
M) trong dung dịch đệm 25 mM citrate ( pH 6.0 )
- Thiết bị:
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 36
Hình 18 Cơ chế sắc ký ái lực
- Thông số công nghê:
Sắc ký ái lực: cột có kích thước 2.0 x 2.8 cm với ConA-CL Agarose.
Dung dịch đệm: 25 mM citrate (pH 6.0)
Dung dịch rửa giải: methyl- -D-mannopyranoside (0–0.5 M)
Tổng lượng protein: 0.5 mg
Tổng hoạt độ: 85 IU
Hoạt độ riêng: 170 IU/mg
Độ tinh sạch: 18.0
Hiệu suất thu hồi: 4.8%
8. Sấy
- Mục đích: Bảo quản (do sau quá trình sấy phun độ ẩm sản phẩm bé hơn 5%),tạo
sản phẩm dạng bột mịn.
- Các biến đổi:
Vật lý: Có sự giảm về khối lượng do nước bay hơi, nhiệt độ tăng.
Hóa lý : Sự bay hơi nước và các chất dễ bay hơi dưới tác động của nhiệt độ
cao. Có sự chuyển pha: dung dịch enzyme sau quá trình sấy phun sẽ có dạng bột.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 37
Hoá sinh: Inulinase có thể bị vô hoạt hoặc giảm hoạt tính bởi nhiệt độ nên
có thể sẽ làm giảm các phản ứng do enzym xúc tác. Tuy nhiên thời gian lưu trong buồng sấy
là rất ngắn nên ảnh hưởng không đáng kể đến hoạt tính enzyme.
Sinh học: Tiêu diệt vi sinh vật.
- Phương pháp thực hiện:
Dịch dextran sau khi ly tâm được bơm vào máy sấy phun trong điều kiện chân
không để sấy ở 300C và thu được dextran ở dạng bột. Lượng dextran tạo thành được tính
toán theo hàm lượng chất khô.
- Thiết bị:
Hình 19 Máy sấy phun chân không 2 giai đoạn.
Với hệ thống này, độ ẩm bột sản phẩm từ buồng sấy phun được hiệu chỉnh
cao hơn 2 – 5% so với giá trị độ ẩm cuối cùng. Phần ẩm còn lại cần tách sẽ được bốc hơi tiếp
trong thiết bị sấy tầng sôi.
Với hệ thống này giai đoạn 1 là sấy phun bình thường, giai đoạn 2 là sấy tầng sôi.
Tuy phải tiêu tốn thêm một phần năng lượng cho sấy tầng sôi nhưng nhờ sấy tầng sôi nên hạt
sản phẩm sau quá trình sấy đạt kích thước cần thiết, nghĩa là quá trình sấ y tầng sôi
tương đương với quá trình tạo hạt, do đó tiết kiệm chi phí thiết bị so với hệ thống sấy phun 1
giai đoạn và hệ thống sấy thăng hoa.
- Thông số công nghệ:
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 38
Nhiệt độ 1500C
Thời gian lưu của các hạt trong buồng sấy 5s
Độ ẩm sản phẩm 3 – 4%
IV. SẢN PHẨM
Sản phẩm dạng bột
Hoạt tính riêng 40000 IU/mg
Màu sắc Bột màu trắng
Mùi Không có mùi lạ
pHopt 5.5
topt 55
o
C
Tổn thất do sấy <5%
Samonella Không phát hiện
E.coli Không phát hiện
Tổng số vi sinh vật hiếu khí <3000 cfu/G
V. THÀNH TỰ CÔNG NGHỆ
1. Sản xuất inulinse bằng phương pháp lên men bề mặt sử dụng Response
surface methodology ( RSM )
Theo truyền thống, người ta sản xuất inulinase theo phương pháp lên men bề
sâu.. Gần đây, có nhiều bài nghiên cứu khoa học sản xuất inulinase theo phương pháp lên
men bề mặt. Phương pháp lên men bề mặt (SSF) có những thuận lợi hơn phương pháp lên
men bề sâu là: năng suất cao, kĩ thuật đơn giản, ít chi phí đầu tư, năng lượng cần ít, và cần ít
nước thu hồi sản phẩm tốt hơn và phù hợp với các nước đang phát triển. SSF là tiềm năng lớn
trong sản xuất enzyme và gần đây nó được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme.
Mô hình tối ưu các thành phần của môi trường là một khía cạnh rất quan trọng
trong việc phát triển quá trình SSF. Kĩ thuật mô hình thực nghiệm thống kê là một công cụ
hữu ích cho việc lựa chọn thành phần của môi trường lên men, vì nó cung cấp mô hình thống
kê giúp ta hiểu được các tương tác giữa các thông số của quá trình ỡ những mức độ khác nhau
và có thể tính toán được mức tối ưu cho từng thông số cho mục đích đưa ra, ví dụ như sản
xuất enzyme với hiệu suất tối đa. Ứng dụng của kĩ thuật mô hình thực nghiệm thống kê trong
việc phát triển quá trình lên men có thể dẫn đến cải thiện hiệu suất thu nhận sản phẩm, giảm
sự biến đổi của quá trình, giảm thời gian và giá tổng cộng của quá trình. Response surface
methodology( RSM) là một mô hình bao gồm kĩ thuật toán học và thống kê, được sử dụng
rộng rãi để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều biến số và tìm ra điều kiện tối ưu cho một hệ đa
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 39
biến. Ứng dụng thành công của RSM trong nâng cao năng suất sản xuất enzyme bằng việc tối
ưu hóa môi trường đã được nghiên cứu. Nói cách khác nghiên cứu xem xét tối ưu hóa môi
trường lên men bề mặt để sản xuất inulinase vẫn cón khá mới. Sau đây là nghiên cứu sản xuất
inulinase từ giống mới, Kluyveromyces S120. RMS được đưa ra ở đây như là công cụ để tối
ưu hóa môi trường lên men bề mặt.
Vi sinh vật sử dụng : Kluyveromyces S120 được phân lập từ đất, được giữ trên,
môi trường thạch nghiêng với môi trường tương ứng (g/l):
Glucose 20
Chất chiết nấm men 10
Pepton 10
Agar 20.
Lên men bề mặt
Môi trường lên men chứa (g/l):
Chất chiết nấm men 10
Pepton 20
Inulin 10.
20g cám lúa mì
3.0 mg MgSO4.H2O
9.0 mg FeSO4.6H2O tính trên 100g cơ chất khô được chỉnh
2.5 mg ZnSO4.7H2O
3.5 mg CaCl2
pH 6.0
Hàm ẩm 65%
Môi trường được chứa trong bình nón 250ml và được bịt kín bằng bông không
thấm nước. Sau đó đem bình nón đi tiệt trùng ở 1210C trong vòng 20 phút. Sau khi tiệt trùng,
bình nón được làm nguội, sau đó bổ sung 4% giống vào bình , trộn đều nhưng vẫn đảm bảo
được môi trường vẫn vô trùng. Sau đó được ủ trong buồng vói hàm ẩm 80%, nhiệt độ 300C
trong vòng 72h. Bằng việc sử dụng mô hình Plackett-Burman và mô hình của Box-Behnken
để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên quá trình sản xuất inulinase, thành
phần của môi trường thay đổi dựa trên mô hình thực nghiệm.
Nghiên cứu các thành phần bổ sung sử dụng mô hình Plackett-Burman
Mô hình Plackett-Burman một kĩ thuật hiệu quả để tối ưu hóa thành phần của môi
trường, được sử dụng để lựa chọn các nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase và
những nhân tố nào không quan trọng sẽ được loại ra nhằm thu hẹp các nhân tố ảnh hưởng
đến quá trình và dễ dàng điều khiển các nhân tố còn lại. Cám lúa mì được bán trên thị trường
được sử dụng làm cơ chất rắn. Các thành phần bổ sung được điều chỉnh bằng mô hình
Plackett-Burman cho 8 biến số ở hai mức độ.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 40
Tối ưu hóa các thành phần bổ sung sử dụng mô hình Box-
Behnken
Một khi các nhân tố được xác định qua màn hình, mô hình Box-Behnken cho 3
biến số độc lập, mỗi biến số ở 3 mức độ với 3 bản sao ở những điểm trung tâm, được sử dụng
để phù hợp với một mô hình đa thức:
Trong đó Y - hiệu suất tạo inulinase,
0
- hệ số chặn,
1 2 3, ,
- hệ số tuyến
tính,
12 13 23, ,
- hệ số tương tác,
11 22 33, ,
- hệ số bậc hai và X1, X2, X3 - các biến số đã
độc lập được mã hóa.
Gói SAS được sử dụng cho thiết kế thực nghiệm và phân tích hồi quy các dữ liệu
đạt được.
Hoạt tính enzyme
Hoạt tính của enzyme được xác định bằng cách xác định hàm lượng đường khử
được tạo ra trong quá trình thủy phân sucrose. 0.5 ml dịch chiết enzyme đã pha loãng phù hợp
được trộn với dung dịch sucrose ( 2%, w/w ) trong dung dịch đệm acetate 0.1M, pH 4.8. Phản
ứng được thực hiện ở 500C trong 10 phút, sau đó đun sôi 10 phút. Xác định lượng đường
fructose trong hỗn hợp phản ứng bằng phương pháp DNS. Đường cong hiệu chỉnh được
chuẩn bị với dịch fructose đã biết nồng độ và mẫu trắng được thực hiện đồng thời với enzyme
và cơ chất. Một đơn vị hoạt tính của inulinase được định nghĩa là lượng enzyme cần để sản
xuất ra 1
mol
fructose dưới điều kiện đã nêu trên.
Đếm Kluyvermyces
Vất chất lên men được trộn đầy dủ với 10 thể tích nước vô trùng. Hỗn hợp được
pha loãng đến nồng độ thích hợp trong điều khiện vô trùng. 0.1 ml hỗn hợp đã pha loãng
được trải đều trên môi trường chất chiết malt. Sau khi ủ trong 48h ở 300C, số khuẩn lạc
CFU/g được đếm theo hệ số pha loãng .
Kết quả
Sàng lọc các nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase
Dựa trên những nghiên cứu gần đây, ảnh hưởng của tổng 8 thành phần khác nhau
lên sản xuất inulinase được phân tích trên cơ sở sử dụng mô hình Plackett – Burman ( bảng
5).
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 41
Bảng 5 Các thành phần của môi trường dựa trên mô hình
Plackett –Burman
Trong mẫu thực nghiệm, từng hàng đại diện cho một thí nghiệm, và từng cột đại
diện cho một biến số độc lập. Dấu (+) và (-) đại diện cho hai mức khác nhau ( cao và thấp)
của biến số độc lập. Hiệu suất sản xuất inulinase, xác định cho từng thí nghiệm, được trình
bày ở bảng 6. Việc phân tích các biến số (ANOVA) cho mô hình thực nghiệm được tính toán,
và mức độ quan trọng của từng biến số môi trường lên men được quyết định bởi giá trị t như
bảng 7. Kết quả phân tích chỉ ra rằng inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 có ảnh hưởng quan trọng
đến sản xuất inulinase. Tất cả các biến số không quan trọng sẽ được loại bỏ và sự kết hợp của
ba biến số trên sẽ được phân tích kĩ hơn bằng mô hình Box-Behnken.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 42
Bảng 6 Mô hình thực nghiệm sử dụng phương pháp Plackett – burman
Bảng 7
Thực nghiệm được tiến hành lặp để đi đến một sự kết hợp tối ưu của ba nhân tố
trên trên mô hình Box-Behnken. Dựa trên kết quả của mô hình thực nghiệm Plackett-Burman,
inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 có ảnh hưởng tích cực lên quá trình sản xuất inulinase và nồng
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 43
độ của ba nhân tố trên sẽ được tăng lên trong mô hình Box-Behnken. Bảng 8 đưa ra các mức
thay đổi khác nhau.
Bảng 8 Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường cơ chất rắn
Bảng 9 Mô hình thực nghiệm cho tối ưu hóa các nồng độ thành phần của môi trường
Bảng 9 đưa ra mô hình và kết quả thực nghiệm được thực hiện theo mô hình Box-
Behnken. Kết quả đạt được được kiểm tra theo ANOVA trên gói SAS và phương trình hồi
quy được đưa ra như sau:
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 44
Trong đó Y1 – hiệu suất sản xuất inulinase, X1 – nồng độ inulin, X2 – nồng độ dịch
bắp, X3 – nồng độ (NH4)2SO4. ANOVA của mô hình hồi quy cấp 2 diễn tả rằng: phương
trình * là một mô hình quan trọng, là bằng chứng từ hệ số Fisher với giá trị xác suất rất thấp
[(pmodel > F) = 0.001261](bảng 10). Tính chất phù hợp của mô hình được kiểm tra bằng hệ số
tương quan (R2). Trong trường hợp này (R2 = 0.978) chỉ ra rằng chỉ có 2.2% của sự biến đổi
toàn bộ không được giải thích bằng mô hình.Giá trị của hệ số xác định điều chỉnh (AdjR2 =
0.9385) cũng cao để tán thành cho mức ý nghĩa cao của mô hình. Cùng thời điểm, giá trị thấp
hơn của hệ số biến thiên (CV = 1.68%) chứng tỏ độ chính xác và độ tin cậy tốt hơn của những
thí nghiệm được tiến hành. Trong các số hạng của phương trình, X2, X3, X1
2
, X2
2
và X3
2
có
mức ý nghĩa với xác suất 99%, X1 có mức ý nghĩa với xác suất 95%
(bảng 10). Tương tác
giữa X1, X2, X3 ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất sản suất inulinase. Sự phản hồi phù
hợp với mô hình hồi quy được thể hiện trên hình1 và 3.
Bảng 10 Phân tích kết quả các biến số thực nghiệm của mô hình Box - Behnken
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 45
Hình 20 Ảnh hưởng của Inulin ( X1) và dịch bắp ( X2) lên quá trình sản xuất inulinase
( Y1) ( khi bổ sung 1.61% (NH4)2SO4 )
Hình 21 Ảnh hưởng của dịch bắp ( X2) và (NH4)2SO4 ( X3 ) lên quá trình sản xuất
inulinase ( Y1 ) ( khi bổ sung 12.72% inulin )
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 46
Hình 22 Ảnh hưởng của inulin ( X1 ) và (NH4)2SO4 ( X3 ) lên quá trình sản xuất inulinase (
Y1 ) ( khi bổ sung 10.76% dịch bắp )
Biểu đồ không gian ba chiều sinh ra cho sự kết hợp từng đôi một của 3 yếu tố
trong khi cố định một yếu tố ở mức tối ưu cho quá trình sản xuất inulinase. Biểu đồ nêu bật
vai trò của các yếu tố khác nhau và cũng nhấn mạnh vai trò của những ràng buộc vật lý với
các phương diện tổng hợp sinh học trong hiệu suất cuối sinh tổng hợp inulinase. Hoạt tính tối
đa của inulinase 412.0 U/g cơ chất khô (gds) nhận được từ nồng độ ban đầu của các chất
inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 lấn lượt là 12.72%, 10.76%, 1.61%. Hoạt tính inulinase
(409.8U/gds) trong môi trường tối ưu từ 3 bản sao (ví dụ 410.2; 409.6; 409.6 U/gds) trùng
hợp với giá trị tiên đoán và mô hình được chứng tỏ ngược với lên men bề sâu. Nó đạt được
hiệu suất cao nhất trong các tài liệu từ trước đến nay. Nồng độ cuối của môi trường được tối
ưu hóa với RSM là 12.72% inulin, 10.76% dịch bắp, 1.61% (NH4)2SO4.
Các hợp chất carbon là nguồn carbon của skelelon và năng lượng của tế bào vi
sinh vật, trong khi nguồn nitơ cung cấp nguyên tố N với tế bào chất và các cấu trúc khác của
tế bào. Inulin không những là nguồn carbon quan trọng mà còn là tác nhân sản xuất inulinase
bẳng vi sinh vật Kluyvermyces S120. Tuy nhiên nếu nồng độ inulin cao hơn sẽ gây ức chế quá
trình dị hóa, do vậy làm giảm hiệu suất tổng hợp enzyme. Điều này được thể hiện ở hình.
Inulin là cơ chất không đắt và có nhiều. Trong công nghiệp nó có thể được thay thế bằng chất
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 47
chiết từ Jerusalem artichoke, rau diếp, thược dược. Dịch bắp cung cấp nguồn nitơ, vitamin và
các dưỡng chất khác cho môi trường, là một nguồn nitơ quan trọng trong sản xuất inulinase
bởi vi sinh vật Kluyvermyces S120. Dịch bắp là nguồn nitơ tốt nhất trong sản xuất inulinase
bẳng giống Actinomycete và Kluyvermyces SP.Y85 theo con đường lên men chìm. Tuy nhiên
nồng độ dịch bắp cao sẽ làm giảm khả năng sinh inulinase như trong hình 1 và 2, điều này có
thể là do bản chất phức tạp của dịch bắp và một vài thành phần của nó ở nồng độ cao có thể
gây độc ức chế sản xuất inulinase. NH4
+
nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp inulinase hiệu quả
hơn NO3
-
được thể hiện trong so sánh việc bổ sung (NH4)2SO4 và NH4 NO3 (bảng 3). Tuy
nhiên nếu nồng độ ammonium sẽ kìm hãm sự tổng hợp inulinase, điều này được thể hiện trên
hình 2 và 3. Vì vậy, nếu tăng nồng độ inulin, dịch bắp hay (NH4)2SO4 trong môi trường sẽ
gây ức chế sinh tổng hợp inulinase dù sự sinh trưởng của tế bào vẫn tiếp tục tăng chậm. Mặt
khác nếu giảm nồng độ của các thành phần môi trường thì sự sinh trưởng của tế bào và sinh
tổng hợp inulinase sẽ giảm nhanh chóng.
Hình 23 Hoạt tính của inulinase ( )và số tế bào sống( )theo thời gian
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 48
Thời gian lên men
Thời gian lên men trong môi trường tối ưu được điều chỉnh trong 120h ( hình 4).
Sau khoảng 12h, sự sinh trưởng tế bào tăng nhanh đáng kể do sự hình thành sinh khối, trong
khi inulinase tạo thành tăng đột ngột sau 12h. Số tế bào sống cực đại là 4.3 109 CFU/gds sau
84h. Sau đó số tế bào giảm có thể do môi trường dinh dưỡng đã cạn kiệt hoặc sự ức chế quá
trình dị hóa trong suốt quá trình nuôi cấy kéo dài. Hoạt tính tối đa của inulinase là 409.2U/gds
sau 96h. Do sự giảm sự sinh trưởng tế bào sau 84h hoặc giảm inulinase bởi những enzyme tự
phân, thời gian chọn để sản xuất inulinase bẳng Kluyvermyces S120 là 96h.
Kết luận
Sử dụng RSM có thể xác định được môi trường tối ưu để sản xuất inulinase với hiệu
suất cao cho Kluyvermyces S120. Thành phần môi trường lên men bề mặt (SSF) là 12.72%
inulin, 10.76% dịch bắp, 1.61% (NH4)2SO4 trên cơ chất rắn là cám lúa mì. Ứng dụng môi
trường RSM, năng suất cực đại đạt được là 409.2U/gds. Đây là hiệu suất cao nhất từ trước
đến nay.
2. Sinh tổng hợp inulinase bằng cách cố định khuẩn ty ( hệ sợi) Aspergillus
Niger
Bào tử đính của Aspergillus Niger 20 Osm sản xuất inulinase ngoại bào được
cố định trên đá bọt hoặc vật liệu xốp polyurethane và được sử dụng trong quá trình lên men
từng mẻ nhiều lần. một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp inulinase bằng cố định khuẩn
ty của Aspergillus Niger 20 Osm trên đá bọt được nghiên cứu Lượng inulinase tối đa xảy ra
trong 50 ml môi trường chứa 0.5g chất mang ở 300C, pH 6.0, tốc đậ khuấy trộn 200rpm. Quá
trình sản xuất này có thể sản xuất enzyme nhiều mẻ, có thể lên men 6 mẻ, mỗi mẻ 24h. Đây là
bài báo cáo đầu tiên về sinh tổng hợp inulinase bằng cách cố định bào tử đính A. niger trên
vật liệu xốp polyurethan sử dụng bão hòa oxy không thông thường trong canh trường đảm
bảo rằng nồng độ oxy hòa tan vẫn liên tục.
Vật liệu và phương pháp
Giống và môi trường
- Biến thể Aspergillus Niger 20 Osm.
- Giống có đặc tính có khả năng sản xuất và hoạt tính inulinase cao trong lên men
chìm.
- Giống được giữ trên trên môi trường thạch malt nghiêng ở 40C và sinh trưởng
trong môi trường cơ bản với (g/l): sucrose 33.3, chất chiết nấm men 19.7, NaNO3 3.65,
K2HPO4 2.6, MgSO4.7H2O 0.15.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 49
Chuẩn bị bào tử Aspergillus Niger 20 Osm cho cố định tế bào
Aspergillus Niger 20 Osm được sinh trưởng trong môi trường malt. Sau 4 hoặc 5
ngày phát triển ở 300C, bào tử được thu nhận, rửa 2 lần với đệm Mellvain 0.1M đã tiệt trùng,
pH 5.0, và lọc qua bông thủy tinh để lọc bỏ cặn. Bào tử sau đó sẽ ở trạng thái lơ lửng và pha
loãng trong cùng dung dịch đệm như trên để đạt được 7.8 107 bào tử/ml.
Vật liệu cố định
Hạt đá bọt (BDH Chemical Ltd, UK),10 – 24 mesh, vật liệu xốp polyurethane đường
kính 9cm, dày 0.8cm và đường kính trung bình lỗ xốp là 0.3mm.
Thử nghiệm cố định
Thử nghiệm Cố định bào tử A. niger được thực hiện trong những bình nón có lắc đảo
300ml, từng bình chứa 0.3 g đá bọt như trên. 5 đĩa quay được dán chặt với vật liệu xốp
polyurethane tiệt trùng trong 30 phút trong nồi hấp tiệt trùng ở áp suất 0.075MPa được sử
dụng để cố định bào tử. Huyền phù bào tử từ 3 ống nghiêng (20ml và 1.61 củ dung dịch đệm
0.1M Mellvaine, pH 5.0)được đổ vào thiết bị phản ứng chứa vật liệu xốp polyurethane.
Huyền phù được ủ trong ở 300C trong 24h. sau thời gian đó các bào tử không được hấp phụ sẽ
được tách ra khỏi chất mang, sau đó sẽ được rửa hai lần với nước cất. 1.6L môi trường căn
bản được cho vào thiết bị phản ứng.
Điều kiện sinh trưởng
Bào tử đính của A. niger được cố định trên đá bọt được sinh trưởng trong bình lắc
đảo 200 rpm trong 3 đến 6 ngày. Môi trường được thay bằng môi trường tiệt trùng mới sau
24h trong suốt thời kì này.
Được cố định trên vật liệu xốp polyurethane, bào tử đính sinh trưởng trong bình lên
men thủy tinh 2L ( Biostat B, B. Braun Biotech International GmbH, Germany) chứa đầy
1.6L môi trường cơ bản trong 12 ngày ở 300C (200rpm). Môi trường được thay bằng môi
trường tiệt trùng mới sau 48h một lần trong suốt thời kì này. Sản lượng inulinase được xác
định sau mỗi 24h.
Lưu lượng oxy cung cấp (1 l /phút) và khuấy trộn 200 rpm trong thiết bị phản ứng
không cố định tế bào được thực hiện trong 96h ở 300C và có thiết bị chống tạo bọt. pH được
giữ ở 6.0 bằng việc thêm NaOH 0.1M. Nồng độ oxy hòa tan của dịch lên men được đo bằng
điện cực Ingold (Mettler – Toledo GmbH). Giá trị đọc được là phần trăm của mức đầu tiên
cua sự bão hòa.
Nồng độ oxy hòa tan trong môi trường được bão hòa oxy không thông thường được
điều khiển tự động bằng một dụng cụ nhân tạo mới, có khả năng đo liều lượng của H2O2 và
oxy trong môi trường từ 1 – 100%.
Hỗn hợp phản ứng chứa 0.1ml canh trường pha loãng thích hợp và 0.5% (w/v) inulin
hòa tan trong dịch đệm acetate 0.1M (pH 5.0) và được ủ ở 500C. sau 20 phút ủ sự tăng hàm
lượng đường khử được đánh giá bằng phương pháp acid 3,5 – dinitrosalicylic. Sự hấp thu
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 50
được đo ở bước sóng 550 nm. Một đơn vị hoạt tính của inulinase được xác định bằng lượng
enzyme để sản xuất 1
mol
đường khử/phút dưới điều kiện trên. Hoạt tính xúc tác được đo
quang phổ bằng cách quan sát sự giảm hấp thu ánh sáng ở bước sóng 525 nmtrong suốt quá
trình phân hủy H2O2 bởi enzyme. Hàm lượng protein trong môi trường và trong dịch lọc canh
trường được xác định bằng phương pháp Schacterle và Pollack. Để xác định hàm lượng chất
khô, toàn bộ lượng vật chất trong bình phản ứng được qua giấy lọc đã sấy khô đến khối lượng
không đổi. Hàm lượng sinh khối khô được xác định từ sự khác nhau giữa bào tử dính cộng
chất mang và chỉ có chất mang. Quá trính lên men được thực hiện trong bô ba bình canh
trường và phân tích được tiến hành lặp. Dữ liệu đưa ra ở đây trung bình của các phép đo. Sai
số chuẩn trung bình cho đánh giá inulinase là 0.23và khoảng giá trị là 0.003 đến 0.36
U/ml.
Kết quả và thảo luận
Quá trình sản xuất inulinase trong công nghiệp hay trong những bài báo cáo khoa
học bao gồm lên men chìm và lên men bề mặt. Giữa những cơ chất, inulin và sucrose được
sử dụng như là nguồn carbon thích hợp. Nói chung inulin là cơ chất tốt nhất để sản xuất
inulinase. Nhưng nếu vi sinh vật tiết ra cả hoạt tính inulinase và hoạt tính invertase, sucrose
được xem là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất enzyme. Vì giá thành của inulin cao hơn
sucrose nên sucrose được sử dụng cho nghiên cứu tối ưu. Đây là chất thay thế đáng quan tâm
vì sucrose có khả năng hòa tan cao, rẻ và là thành phần chính trong mật rỉ, một nguyên liệu
hấp dẫn trong lên men với năng suất lớn, trong khi inulin chỉ có sẵn trong một lượng giới hạn
và giá thành cao.
Thực nghiệm liên quan cố định bào tử A. niger bởi quá trình hấp phụ vậ lý lên đá
bọt và vật liệu xốp polyurethane.
Trong giai đoạn đầu một vài điều kiện như pH của môi trường, lượng chất mang,
thể tích môi trường nhiệt độ và tốc độ khuấy trộn được thay đổi để tối ưu điều kiện để sản
xuất inulinase. Trong tất cả các thí nghiệm, môi trường cơ bản được thay mới sau 24h, và len
men mẻ tuần tự ba lần. Hệ sợi nấm trong lỗ xốp mọc tràn ra bề mặt chất mang sản xuất
inulinase. A. niger lúc đầu được cố định bên trong chất mang, dần dần phát triển thành một
lớp dày đặc trên bề mặt chất mang được quan sát rõ trên kính hiển vi điện tử.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 51
Hình 24 Ảnh hưởng của pH ( A); Khối lượng chất mang ( B); Thể tích môi trường (C);Nhiệt
độ ( D ); tốc độ khuấy ( E )lên sản xuất inulinase
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 52
pH đầu của môi trường, tối ưu cho sản xuất inulinase bằng bào tử đính của A. niger
cố định trên đá bọt là 6.0 ( hình 24A) và cũng tương tự như quá trình sản xuất inulinase bằng
bào tử tự do. Hoạt tính inulinase cao nhất bằng việc cố định trên 2.0 g chất mang khi lượng
sinh khối lớn nhất tích lũy được. Nếu thêm vào một lượng chất mang thì hoạt tính enzyme sẽ
giảm (hình 24B). Hoạt tính enzyme tối đa xảy ra trong mẻ len men thứ hai khi sử dụng 50ml
môi trường cơ bản (hình 23C). Hoạt tính inulinase khi cố định bào tử đính tăng khi nhiệt độ
đạt 300C, nhưng giảm ở 350C (hình 24D). điều này trùng sản xuất inulinase bằng bào tử tự do,
nhiệt độ tối ưu để sản xuất inulinase là cũng là300C. Tốc độ khuấy trộn tối ưu là 200 rpm
(hình 24E). sau 6 mẻ lên men được thực hiện chỉ ra rằng hoạt tính của inulinase vẫn tăng cho
đến mẻ thứ 5 và sau đó giảm chậm (hình 24F). Để đánh giá tiềm năng sản xuất thật sự của
biến thể, bắt đầu khảo sát trong thiết bị phản ứng là cần thiết. Thật sự, trong giai đoạn này
thường thì có thể nhận được dấu hiệu hữu ích về phía tính ổn định trong quá trình sản xuất
thừa của biến thể và về phía tính thực thi trong việc thiết kế quy mô sản xuất lớn hơn.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 53
Bảng 11 Phương pháp cố định và không cố định tế bào trong sản xuất inulinase từ A.Niger
20 Osm
Một thông số quan trọng của quá trình lên men hiếu khí cần đạt được là nồng độ tối
ưu của oxy hòa tan (DO). DO giới hạn để xác định khả năng tối ưu của vi sinh vật thay đổi
và phụ thuộc vào sản phảm mong muốn cuối cùng. Giới hạn oxy trong canh trường có thể tùy
thuộc vào tỷ trọng của bào tử đính, nồng độ nguồn carbon và giá trị pH. Sản xuất inulinase
bởi A. niger chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi nồng độ DO trong pha lỏng. Bổ sung H2O2 được nêu
thêm như là một phương pháp thay thế để tăng nồng độ oxy hòa tan và hiệu suất sản xuất
inulinase.
Sản xuất inulinase bởi bào tử Aspergillus Niger 20 Osm ở trong trường hợp bào tử
tự do hay cố định trên vật liệu xốp polyurethane, được nghiên cứu trong bình phản ứng 2l sử
dụng canh trường bão hòa oxy thông thường và không thông thường. Hoạt tính enzyme
inulinase của bào tử tự do tăng trong suốt quá trình sục khí tông thường, và đạt giá trị tối đa là
22.1 (U/ml) sau 96h lên men (hình 24A). Ngược lại dưới điều kiện sục khí không thông
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 54
thường hoạt tính enzyme của bào tử tự do tăng chậm, giá trị cực đại là 3.4 (U/ml) trong
khoảng 48h lên men. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sinh khối trong canh trường bão hòa oxy
với H2O2 ít hơn so với canh trường sục oxy thông thường (hình 24 B). Điều này có thể gây ra
bởi ức chế oxy tác động mạnh tới kìm hãm sự phát triển của bào tử tự do và sản xuất enzyme.
Trong suốt quá trình sục khí thông thường, sự giảm mạnh nồng độ oxy trong canh trường (từ
100% đến 70% và 0% sau 24h và 48h) được quan sát, trong khi canh trường sục khí không
thông thường không gây ra sự thay đổi nồng độ oxy hòa tan (60 2%). Sự tang hoạt tính
enzyme không phải lúc nào cũng liên quan với hàm lượng protein cao trong canh trường lên
men. Ví thế chúng tôi suy đoán rằng sự tăng hoạt tính enzyme bởi sự thay đổi trong chính
enzyme. Một khả năng khác là khả năng tận dụng protein trong môi trường của Aspergillus
Niger 20 Osm. Sau 96h, lượng đường khử cao hơn trong canh trường bão hòa oxy với H2O2
so với canh trường sục khí thông thường.
Giảm hiệu ứng kìm hãm của H2O2 lên sự sinh trưởng của bào tử tự do và sản xuất
inulinase trong anh trường bão hòa oxy, bào tử của Aspergillus Niger 20 Osm được cố định
trong vật liêu xốp polyurethane. Để thực hiện mục đích này, thiết bị lên men được trang bị 5
đĩa gắn chặt với vật liêu xốp polyurethan. Kết quả của 6 mẻ lên men được trình bày trong
hình 24C. Kết quả tục nghiệm chỉ ra rằng năng suất tạo inulinase tăng trong cả 6 mẻ trong
điều kiện sử dụng bào tử cố định bão hòa oxy với H2O2. Cố định trên vật liêu xốp
polyurethan cho kết quả tốt do có sự bền cơ của chất mang . Sự tăng hoạt tính xúc tác sau mẻ
thứ ba và sự tích lũy đáng kể khối lượng khô (13g/l) chứng tỏ rằng bào tử cố định có thể chịu
được ức chế oxy. Khống có thay đổi đáng kể hàm lượng proteintrong môi trường. Có thể kết
luận rằng bào tử cố định A. niger có thể sản xuất inulinase trong thời gian ngắn khoảng 48h
và xa hơn nữa có thể thời gian rút ngắn xuống chỉ còn 24h. Hoạt tính của inulinase tăng trong
mẻ thứ 5 và 6 đề xuất ra rằng quá trình lên men có thể liên tục trong hơn 6 mẻ (hình 24 C ).
Trong thiết bị lên men từng mẻ sử dụng bào tử cố định trong điều kiện sục khí bình thường,
hoạt tính inulinase tăng đến me thứ ba 7.5 U/ml. Tuy nhiên canh trường này sẽ thể không kéo
dài vì sự tích lũy của bào tử cao 20.0 (g/l) và xảy ra sự giải phóng các bào tử tự do vào môi
trường. Kết quả nghiên cứu được so sánh với các nghiên cứu trước đây. Hoạt tính của
inulinase sản xuất bởi bào tử cố định và không cố định của Aspergillus Niger 20 Osm nằm
trong khoảng giá trị của bào tử tự do của A.niger nhưng cao hơn so với tổng hợp enzyme từ
Penicillium purpurogenum và Fusarium oxysporum. Dựa vào bảng 2 hệ thống của chúng tôi
đạt được sự giảm thời gian sản xuất đáng kể và hoạt tính inulinase cao và do đó năng suất sản
xuất inulinase sẽ cao. Hơn nữa, môi trường sản xuất inulinase mà chúng tôi đưa ra thành phân
khá đơn giản so với các môi trường trước đây.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 55
Bảng 12 So sánh hoạt tính inulinase đạt được bởi các điều kiện khác nhau
Kết luận:
Trong giới hạn thực nghiệm của nghiên cứu này, chúng ta có thể sản xuất inulinase
liên tục. Bào tử được cố định A. niger sử dụng canh trường bão hòa oxy không thông thường
sản xuất ra lượng inulinase lớn và từ đó có thể thiết lập bước đậu trong quá trình tổng hợp
enzyme liên tục . Sự cải thiện xa hơn nữa quá trình có thể đạt được bằng việc tối ưu hóa nồng
độ oxy.
Cấn nhấn mạnh rằng bão hòa oxy không thông thường cho canh trường được sử
dụng lần đầu tiên cho sản xuất inulinase bằng việc cố định bào tử A. niger. Quá trình lên men
chống được sự nhiễm vi sinh vật lạ do có sự hiện diện của H2O2. Phương pháp canh trường
bão hòa oxy cho phép tiến dần đến một sự cân bằng chính xác về lượng oxy tiêu thụ và hứa
hẹn sẽ có ứng dụng rộng đặc biệt là trong trường hợp vi sinh vật nhạy cảm trượt thể hiện hoạt
tính xúc tác.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 56
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bùi Ái, Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản đại học
quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
2. Lê Ngọc Tú ( chủ biên) - Lê Văn Chứ - Đặng Thị Thư – Phạm Quốc Thăng-Nguyễn thị
Kim Thịnh – Bùi Đức Hợi – Lưu Duẩn – Lê Doãn Diên. Hóa sinh côngnghiệp.Nhà xuất bản
khoa học và kĩ thuật Hà Nội – 2002.
3. R.S. Singh *, Balwinder Singh Sooch, Munish Puri, Optimization of medium and
process parameters for the production of inulinase from a newly isolated Kluyveromyces
marxianus YS-1( From Carbohydrate and Protein Biotechnology Laboratory, Department of
Biotechnology, Punjabi University, Patiala 147 002, India), Received 6 July 2006; received in
revised form 31 August 2006; accepted 7 September 2006 Available online 27 October 2006
4. R.S. Singh *, Rajesh Dhaliwal, Munish Puri, Production of inulinase from
Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus racemosus, ( From
Production of inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus
racemosus, Punjabi University, Patiala 147002, Punjab, India), Received 17 December 2005;
received in revised form 24 February 2006; accepted 9 March 2006.
5. Chen Xiong, Wang Jinhua, Li Dongsheng, Optimization of solid-state medium for the
production of inulinase byKluyveromyces S120 using response surface methodology ( From
College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Hubei Key Laboratory of
Industrial Microbiology, Wuhan 430068, PR China), Received 4 February 2006; received in
revised form 31 October 2006; accepted 2 December 2006.
6. Andrelina M.P. Santos1* and Francisco Maugeri, Synthesis of Fructooligosaccharides
from Sucrose Using Inulinase from Kluyveromyces marxianus, ( From Laboratory Devices
and Nanostructures (LDN), UFPE, C.P. 7800, CEP 50711-970, Recife, PE, Brazil;
Department of Food Engineering (FEA), UNICAMP, CEP 13081-970, Campinas, SP, Brazil).
Received: December 19, 2005;
Accepted: September 25, 2006
7. Prabhjot Kaur Gill, Rajesh Kumari Manhas, Prabhjeet Singh, Purification and
properties of a heat-stable exoinulinase isoform from Aspergillus fumigatus ( From
Department of Biotechnology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, Punjab, India;
Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, Punjab, India),
Received 20 January 2005; received in revised form 22 April 2005; accepted 24 April 2005;
Available online 16 June 2005.
Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 57
8. Arun Dev Sharma, Prabhjot Kaur Gill, Purification and characterization of heat-
stable exo-inulinase from Streptomyces sp (From Department of Biotechnology, Lyallpur
Khalsa College, Jallandhar 144001, Punjab, India; Department of Biotechnology, Lovely
Institute of Higher Studies, Phagwara (Chehru), Punjab, India), Received 13 October 2005;
accepted 10 April 2006; Available online 29 April 2006.
9. Emanuele Ricca , Vincenza Calabro , Stefano Curcio, Gabriele Iorio, Fructose
production by chicory inulin enzymatic hydrolysis:A kinetic study and reaction mechanism (
From Department of Engineering Modelling, University of Calabria, I-87030 Arcavacata di
Rende (CS), Italy).
10. Prem P. Sehgal and Aubrey W.Naylor, Purication and properties of urease derived
from hydrated seeds of jack bean, Canavalia ensiformis (L), Plant Physiology. 4, 567 –
572, Horsham, 1966.
Các trang web:
1.
2.
3.
4.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- inulinase.pdf