Đề tài Sản xuất acid propionic

Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 1 Phần 1 NGUYÊN LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG Acid propionic (danh pháp khoa h ọc acid propanoic) là một acid cacboxylic có nguồn gốc tự nhiên với công thức hóa học CH 3CH2COOH. Ở trạng thái tinh khiết và trong điều kiện thông thường, nó là một chất lỏng không màu có tính ăn mòn và mùi hăng. Trong công nghiệp, acid propionic thông thường được sản xuất từ phản ứng oxy hóa của propionaldehyde bằng không khí khi có mặt các xúc tác nh ư côban, mangan sắt, phản ứng này diễn ra nhanh chóng thậm chí ở nhiệt độ vừa phải (thông thường từ 40-50°C). Một lượng lớn acid propionic đã từng được sản xuất như là phụ phẩm của việc sản xuất acid acetic, nhưng ngày nay th ì nó chỉ là một nguồn rất nhỏ trong sản xuất acid propionic. Acid propionic cũng được tạo ra theo phương pháp sinh học từ sự phân hủy do trao đổi chất của các acid béo chứa số lẻ các nguyên tử carbon, cũng như từ sự phân hủy của một số acid amin. Các vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium cũng tạo ra acid propionic như là sản phẩm cuối cùng trong hoạt động trao đổi chất kỵ khí của chúng. Các vi khuẩn n ày được tìm thấy rất phổ biến trong dạ dày của các động vật nhai lại, và hoạt động của chúng là một phần nguyên nhân tạo ra mùi vị của cả phó mát Thụy Sỹ và mồ hôi. Acid propionic chủ yếu được sử dụng làm chất bảo quản trong các kho chứa thức ăn cho vật nuôi và ngũ cốc. Về kĩ thuật, nó là một loại thuốc dùng để diệt nấm mốc và sát trùng. Trên 75% acid propionic được sử dụng cho mục đích trên ở dưới dạng muối ammonium propionate, bởi vì nó hạn chế sự ăn mòn dụng cụ cho nông trại. Những áp dụng cụ thể trong nông nghiệp là:  Các kho có chứa những loại ngũ cốc có độ ẩm cao (yến mạch, bắp, lúa mạch, lúa mì và lúa miến - một loại kê trồng để làm lương thực ở các vùng có khí hậu ấm)  Chất cho thêm vào trong nước uống của vật nuôi và gia cầm (kháng khuẩn)  Khu vực kho chứa thức ăn cho gia súc ủ cyclo và ngủ cốc (vệ sinh bề mặt). Một số chức năng khác của acid propionic bao gồm:  Chất bảo quản và tác nhân tạo mùi cho các sản phẩm phomai và bánh nướng.  Phụ gia thực phẩm để chống mốc bánh mì, bánh bắp, và phomai (như Ca propionate và Na propionate).  Sản xuất Cellulose acetate propionate (CAP).  Hóa chất trung gian để sản xuất thuốc diệt cỏ, dược phẩm, thuốc nhuộm, sản phẩm dệt, chất dẻo, chất làm mềm dẻo, mỹ phẩm và nước hoa. Đóng vai trò là một phụ gia thực phẩm, acid propionic được liệt kê trong danh sách “Generally Recgnized as Safe” (GRAS) của ban quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ. Acid propionic là một thành phần bình thường trong sự trao đổi chất của con người. Về mặt hiệu quả kinh thế và ứng dụng trong công nghiệp th ì các dạng muối propionate tỏ ra vượt trội hơn hẳn so với acid propionic. Do đó trong bài báo cáo này, chúng em xin đề cập đến Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 2 phương pháp sản xuất natri propionate từ acid propionic dưới tác dụng của vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium trong quá trình lên men propionic. Đặc tính tiêu biểu và phổ biến nhất của Propionibacterium là sự sản xuất acid propionic, acid acetic, acid succinic và khí carbonic Đặc biệt, chủng P. freudenreichii rất quan trọng trong việc làm gia tăng mùi khi quá tr ình ủ chín trong công nghệ sản xuất phomát Thụy Sĩ, như là loại Emmental. Sự tạo thành khí cacbonic là nguyên nhân của những lỗ nhỏ của loại phomát này, còn acid propionic và acid lactic tạo ra vị đặc trưng đặc biệt. Việc tạo thành proline và các amino acid khác rất quan trọng trong việc tạo ra mùi thơm của phomát (Vorobjeva, 1999). Propionibacteria còn được dùng trong sản xuất acid propionic và vitamin B12 Cho tới ngày nay, P. acidipropionici là chủng được sử dụng phổ biến nhất trong công nghiệp sản xuất acid propionic (Colomban et al., 1993) bằng lên men. 1.2 VI SINH VẬT 1.2.1 TỔNG QUÁT Nhiều giống vi khuẩn, như Propionibacterium, Rhodospirillum, Micrococcus, Rhizobium, Mycobacterium; cũng như động vật nguyên sinh Ochromonas malhamensis (Wegner et al., 1968; Haase et al., 1984) đ ều sản sinh ra acid propionic. Chỉ với propionibacteria, nh ư những chủng Propionibacterium freudenreichii , P. shermanii, P.acidipropionici , acid propionic mới là những sản phẩm chính của quá tr ình trao đổi chất sinh năng lượng; còn với các vi sinh vật khác, chỉ là con đường sống khác. 1.2.2 PHÂN LOẠI PROPIONIBACTERIA Vào năm 1978, Fitz đã quan sát theo dõi những sinh vật phân lập từ phomát sẽ l ên men lactate thành propionic and acid acetic và đ ồng thời giải phóng khí carbonic cùng lúc (Fitz, 1878). Người ta chia chúng thành 2 nhánh chính : các propionibacteria được phân lập từ các sản phẩm sữa “Propionibacteria sữa” hay “Propionibacteria cổ điển” và các Propionibacteria được phân lập từ da “propionibacteria da”. Dựa trên trình tự của 16S rDNA, Dasen và cộng sự (1998) sắp xếp 1 cây phân loại của giống Propionibacterium theo đó những nhánh có thể xếp thành 2 nhóm khác nhau. Nh ững nhánh cổ điển P. acidipropionici, P. jensenii và P. thoenii xếp thành 3 nhóm có mối liên hệ mật thiết với nhau. Xa hơn, nhóm vi khuẩn trên da P. acnes, P. avidum và P. propionicum được xếp theo 3 nhóm có liên hệ gần hơn với nhau. Trong khi đó, P. granulosum được xếp dưới dạng như khác như là trung gian gi ữa nhánh vi khuẩn cổ điển và vi khuẩn da. P. lymphophilum được chấp nhận là có mối liên hệ xa nhất trong toàn giống vi khuẩn này. Xét về khả năng ứng dụng của Propionibacteria cổ điển, lưu ý là những nhánh của vi khuẩn cổ điển và vi khuẩn da chư từng được thấy là có thể ở cùng 1 nhóm. Hình 1.1 cho thấy phiên bản mới nhất của cây phân loại vừa được cập nhật bởi Dasen. Rõ ràng rằng P. acidipropionici có mối quan hệ gần nhất với chủng vừa tìm thấy P. microaerophilu. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 3 P. jenseniiP.. thoenii P. microaerophilum P. acidipropionici P. lymphophilum P. freudenreichii shermani P. cyclohexanicum P. freudenreichii freudenreichii P. granulosum P. propionicum P. acnes Hình 1.1 Cây phân loại thể hiện mối quan hệ trong giống Propionibacterium.(Theo G. Dasen) 1.2.3 ĐẶC TÍNH Hình thái: Khi nuôi cấy chúng trong môi trường trung tính, chúng có h ình cầu, xếp thành từng đôi hay từng chuỗi. Khi nuôi cấy trong môi trường thóang khí chúng có h ình que hay hình phân nhánh. Khuẩn lạc mịn, màu đỏ, cam hay nâu. Propionibacteria không sinh bào tử, không chuyển động, kỵ khí tùy tiện (Vorobjeva, 1999). Cấu tạo tế bào: Propionibacteria là vi khuẩn gram dương. Thành phần G+C trong AND của chúng trong khoảng 53-67% (Cummins and Johnson, 1986), nên được xếp vào nhóm vi khuẩn có lượng G+C cao (Olsen et al., 1994). Thành phần G+C của vi khuẩn cổ điển vào khoảng 64-68% (Cummins and Johnson, 1986). Trong tế bào có chứa các hemin (hệ thống cytocrom, catalase) Trong tế bào vi khuẩn propionic, người ta tìm thấy các loại enzyme như transcarboxylase, hexosephosphate isomerase, fructose diphosphate aldolase, triosephosphate dehydrogenase…. Hình thức sinh sản: nhân đôi tế bào. Phân bố: Nhóm vi khuẩn Propionic có nhiều trong dạ cỏ và đường ruột của các động vật nhai lại (vd: bò, trâu…). Ở đó, chúng tham gia vào sự tạo thành acid béo. Các nguồn chất dinh dưỡng: Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 4 - Nguồn Cacbon (C): Đường: glucose, saccharose, lactose, pentose , xylose, raffinose, arabinose. Acid hữu cơ: acid lactic, acid malic, acid tartaric, acid quinic. Glycerin, các chất khác: vd: nguồn C của vi khuẩn P.technicum là tinh bột, dextrin, glycogen, manitol; (các vi khuẩn khác không sử dụng được) - Nguồn Nitơ (N) Dịch chiết nấm men nồng độ ~ 0.4%. Pepton, whey, bột bắp Vi khuẩn propionic có khả năng sử dụng NH 3 như là nguồn Nitơ duy nhất.,nhiều loài có khả năng chuyển amin để sử dụng trong môi tr ường nuôi cấy tổng hợp không có N hữu c ơ. - Chất kích thích sinh trưởng: Vitamin B1 cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn Propionic, đặc biệt là khi có mặt acid amin nhưng không phải tất cả vi khuẩn propionic đều cần vitamin B1. Riboflavin (vitamin B2): lượng 0.05  /ml kích thích sự phát triển của vi khuẩn Propionic trong 1 lượng trung bình (NH4)2SO4. Qúa trình trao đổi chất: Ion Mg2+, Mn2+ đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá của propionibacteria (Balamurugan et al.,1999). Sự decarboxyl acid succinic, nửa đầu của phản ứng kép cuối cùng trong chu trình hình thành acid propionic do CoA transferase xúc tác dẫn đến sự hình thành acid propionic sau đó, được xúc tác nhờ Mg2+, Mn2+ (Katagiri và Ichikawa, 1953) pH tối thích cho sự phát triển là từ 6 đến 7 (Hsu và Yang, 1991), nhiệt độ tối thích là 30- 32oC trong điều kiện kị khí với sự có mặt của N2. Nếu pH nhỏ hơn 4.5, sẽ không có bất kỳ sự phát triển hay hoạt tính nào của tế nào (Hsu và Yang, 1991: Jin và Yang, 1998: Playne, 1985). Vấn đề chính trong quy trình lên men acid propionic là tác động ức chế của acid propionic tạo thành lên sự phát triển của Propionibacteria và quá trình lên men (Blanc và Goma, 1987a; Gu et al., 1998; Herrero, 1983; Ibragimova et al.,1969; Lewis và Yang, 1992a; Lueck, 1980; Neronova et al., 1967; Ozadali et al.,1996; Paik và Glatz, 1994). Acid propionic phá v ỡ gradient pH, động lực tối cần thiết cho sự vận chuyển chất dinh dưỡng và sản phẩm trao đổi chất vào và ra tế bào. Màng tế bào chất không cho các hợp chất ion hoá khuếch tán vào bên trong tế bào vì vậy chỉ có acid propionic phân tử mới có khả năng khuếch tán xuyên qua màng tế bào vào bên trong tế bào chất. pH kiềm bên trong tế bào chất khiến acid propionic phân ly thành proton H + và anion propionate, tạo nên sự vượt trội proton H+ bên trong tế bào chất (Gu et al.,1998; Pèrez Chaia et al.,1994). Vì vậy, H+-ATPase sử dụng thêm ATP để đẩy phần proton dư ra bên ngoài. Kết quả là có ít ATP cung cấp cho quá trình trao đổi chất điều làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật và quá trình lên men (Gu et al.,1998; Pèrez Chaia et al.,1994). Vi ệc duy trì gradient pH là cần thiết cho tế bào trong điều kiện bình thường. Năng suất và hiệu suất quá trình lên men cao hơn khi hàm lượng tế bào trong thiết bị lên men cao (Paik và Glatz,1994) và tác đ ộng ức chế của acid propionic lên tế bào sẽ giảm ( Boyaval và Corre, 1987). Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 5 1.2.4 Propionibaterium acidipropionici P. acidipropionici là chủng có khả năng chịu được pH acid do sự tạo thành acid propionic. Chúng có khản năng lên men ở pH 4.5-5.5 thấp hơn rất nhiều so với pH tối thích 6-7. Vì vậy, P. acidipropionici là chủng được sử dụng phổ biến nhất trong công nghiệp sản xuất propionic acid (Colomban et al., 1993) bằng con đường lên men Con đường trao đổi chất ở P. acidipropionici diễn ra như sau: 1.5 phân tử glucose được lên men có thể tạo ra lần lượt theo thứ tự sau: 2 phân tử acid propionic, 1 phân tử acetic acid, và 1 phân tử CO2. Kết quả của việc lên men acid propionic được diễn tả theo công thức: 1.5 Glucose 2 acid propionic + 1 acid acetic + 1 CO2 + 1 H2O Glucose được vận chuyển vào trong tế bào chất, đi vào chu trình đường phân và được chuyển hóa thành phosphoenolpyruvic (PEP), một chất trung gian giàu năng lượng. Sau đó, phần lớn PEP được chuyển thành pyruvate và ch ỉ một phần nhỏ còn lại chuyển hoá thành oxaloacetate. Oxaloacetate tham gia vào con đư ờng hình thành acid succinic. Do đó, acid succinic được tạo thành như một sản phẩm phụ. Trong sự hình thành pyruvate, 1 mol PEP cho ra 1 mol pyruvate và 1 mol ATP. Sau khi được tạo thành, pyruvate có ba khuynh hướng. Một là phần lớn pyruvate được chuyển hoá thành acid propionic theo chu trình Wo od-Werkman. Hai là một lượng nhỏ tham gia vào con đường hình thành acid acetic. Ba là m ột phần rất nhỏ còn lại không bị chuyển hoá mà chỉ làm tăng lượng chất khô của tế bào. Sau những nghiên cứu, con đường chuyển hóa acid propionic trong quá trình lên men được xác định bởi sự ước lượng cân bằng nguồn C trong việc sản xuất propionic acid bằng propionibacteria được trình bày như sau: Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 6 - Sự chuyển đổi từ oxaloacetate thành succinate đư ợc xúc tác bởi các enzyme như: malate dehydrogenase, fumarase, and succinate dehydrogenase. - Sự chuyển hóa acetate là chuyển hóa quan trọng trong quá trình sinh học vì đây là con đường tạo ra ATP. Đó là lý do vì sao acid propionic luôn được tạo thành cùng với acid acetic. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 7 Hình 1.2 Con đường trao đổi chất ở P. acidipropionici Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 8 1.3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 1.3.1 ALGINATE  Cấu tạo: Alginate là nguyên liệu có rất nhiều trong tự nhiên được trích xuất từ loài tảo nâu hay thu nhận từ quá trình lên men của vi sinh vật. Alginate là một polymer không phân nhánh bao gồm β-D-mannuronic acid (M) và α-L- guluronic acid (G) nối với nhau thông qua liên kết 1,4-glycoside với trật tự sắp xếp đa dạng. Cấu trúc của alginate bao gồm ba loại: hai trong ba loại đó l à chuỗi alginate đồng nhất bao gồm các phân tử G hoặc M, trong khi loại thứ ba bao gồm một chuỗi các dimer của các phân tử M v à G nằm rải rác trong cấu trúc của phân tử alginate. Trật tự v à thành phần sắp xếp của chuỗi alginate không tuân theo bất kỳ quy luật bào mà dao động khá lớn phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu ban đầu. Hình 1.3 Cấu tạo phân tử calcium alginate Alginate thương mại được sản xuất chủ yếu từ các lo ài tảo nâu như Laminaria hyperboreo, Macrocystis pyrifera, Laminaria digitana, Ascophyllum nodosum, Laminar japonica, Eclonia maxima, Lessonia nig rescens, Durvillea antarctica và Sargassum spp.  Đặc điểm alginate: Alginate cũng như agar và carrageenan có những tính chất công nghệ và chứa năng đặc biệt, trong đó quan trọng nhất là khả năng tạo đông và tạo gel. Hầu hết các chất này đều là những chất ái nước, khi tiếp xúc với nước nó sẽ trương nở lên, làm đặc dung dịch, từ đó làm tăng độ nhớt. Gel tạo thành từ alginate không có khả năng thuận nghịch về nhiệt độ. Độ nhớt của dung dịch, độ bền gel phục thuộc vào nguổn gốc của alginate, nhiệt độ, pH v à sự có mặt của các ion như K+, Ca2+… 1.3.2 CƠ CHẾ TẠO GEL Ion calcium thường được sử dụng chủ yếu để tiến hành polymer hóa tạo gel do giá thành thấp và ít độc hại, thích hợp cho các quy tr ình công nghiệp hay chuyển hóa sinh học. Tuy nhi ên, quá trình tạo gel cũng có thể xảy ra với sự có mặt của một số các ion khác. Gel tạo th ành có bền hay không phụ thuộc vào ái lực của các ion, chúng có thể thay đổi phụ thuộc vào nguồn alginate: Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 9 Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+ = Ni2+ = Zn2+ > Mn2+. Với mỗi ion khác nhau thì cấu trúc cơ học của các hạt gel cũng khác nhau: các ion có ái lực càng cao thì có khả năng tạo gel càng chắc. Độ bền của gel Ca-alginate sẽ giảm khi có mặt của các hợp chất chelate ( hợp chất hữu c ơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) như phosphate, citrate,và lactate hay b ởi một số các ion không có khả năng tạo gel nh ư Na+ hay Mg2+. Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho các hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước lỗ xốp, giảm tính ổn định và làm phá vỡ cấu trúc gel. Alginate có khả năng tạo gel theo hai phương pháp: phương pháp khuếch tán và phương pháp tạo gel từ bên trong.  Phương pháp khuếch tán: Khi nhỏ alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel nh ư Ca2+ thì bề mặt của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa. Sau đó các cation n ày sẽ tiếp tục khuếch tán từ môi tr ường xung quanh vào bên trong hạt gel làm cho các phâm tử alginate ở trong tiếp tục bị gel hóa. Phương páhp này có ưu điểm là gel tạo thành nhanh, phương pháp tiến hành đơn giản. Tuy nhiên nhược điểm là cấu trúc gel tạo thành không đồng nhất.  Phương pháp tạo gel từ bên trong: Cho các muốn có chứa các cation tạo gel như CaCO3, CaSO4, EDTA – Ca, calcium citrate…) vào dung dịch alginate. Sau đó ta sẽ hiệu chỉnh giá trị pH bằng các tác nhân acid hóa như D-glucono--lacton. Do độ hòa tan của các muối trên phụ thuộc vào pH, nên khi ta thay đổi pH thì ion Ca2+ sẽ được giải ph1ong dần vào trong dung dịch và tạo gel với alginate. Phương pháp này so với phương pháp khuếch tán thì hạt gel tạo thành có tính đồng nhất cao hơn; có thể tạo gel với nhiều hình dạng khác nhau trong khi phương pháp khuếch tán chỉ tạo gel có dạng hình cầu. Gel alginate thường không tạo thành nếu hàm lượng acid guluronic nhỏ hơn 20-25%. Tính chất của gel alginate phụ thuộc rất lớn v ào thành phần của nó. Nếu tỉ lệ mannuronide so với guluronide thấp thì sẽ tạo thành gel rắn chắc; còn nếu tỉ lệ này cao sẽ tạo thành gel đàn hồi. Độ bền chắc của gel tăng tỉ lệ với khối lượng phân tử polysaccharide khi tăng từ 400-500 kDa. 1.3.3 ƯU – NHƯỢC ĐIỂM  Ưu Điểm - Mật độ tế bào thu được từ nhừng chuyển hóa sinh học của tế b ào cố định cao, tiết kiệm được thể tích trong thiết bị , tăng hiệu suất, giảm thời gianlên men. - Cố định tế bào giúp giảm chi phí tách sinh khối ra khỏi sản phẩm - Hoạt tính và độ bền của tế bào cố định cao. Chất mang có tác dụng bảo vệ tế b ào khỏi những điều kiện vật lý và hóa học như pH, nhiệt độ, dung môi và các km loại nặng. - Tăng khả năng chịu đựng của tế bào đối với nồng độ cơ chất cao đồng thời hạn chế các tác động của chất ức chế đối với tế b ào. - Hạn chế việc rửa trôi tế bào khi canh trường tiếp tục bị pha loãng - Dễ thu hồi sản phẩm và có khả năng tái sử dụng tế bào cố định.  Nhược điểm: - Quá trình khuếch tán cơ chất vào trong tế bào bị hạn chế. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 10 - Nồng độ chất dinh dưỡng phân bố không đều trong chất mang, càng vào đến trung tâm thì nồng độ càng giảm. Một số kỹ thuật cố định tế có thể gây độc, l àm tổn thương tế bào từ đó làm tế bào bị mất hoạt tính. 1.4 MÔI TRƯỜNG 1.4.1 NGUỒN CARBON Hai loại môi trường phổ biến nhất hiện nay l à glucose và lactose, trong đó: Môi trường lactose thuận lợi cho quá tr ình sinh trưởng của chủng P.acidipropionici, tốc độ sinh trưởng riêng và hàm lượng tế bào tạo thành trong môi trường lactose vượt trội hơn so với cùng điều kiện nuôi cấy trong môi trường glucose. Trong khi đó, môi trường glucose lại thích hợp cho quá tr ình tổng hợp acid propionic. Tốc độ sinh trưởng riêng và hàm lượng tế bào tạo thành chỉ bằng một nửa lượng tạo thành trong môi trường lactose. Bên cạnh đó, hàm lượng acid succinic và acid acetic tạo thành thấp hơn. Chính vì lý do này mà môi trường nhân giống vi khuẩn P.acidipropionici sẽ có th ành phần chính là lactose, môi trường lên men sẽ có thành phần chính là glucose. Các thành phần khác tương tự nhau. Tốc độ sinh trưởng riêng, hàm lượng tế bào, các sản phẩm acid được trình bày trong bảng sau: Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon và pH tới quá trình lên men μ tốc độ sinh trưởng riêng Yx hàm lượng tế bào Yp hàm lượng propionic Ya hàm lượng acetic Ys hàm lượng succinic . Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 11 Hình 1.4 Biểu diễn sự thay đổi nồng độ cơ chất và các acid theo thời gian Hình 1.5 Biểu diễn sự biến đổi cơ chất và các acid trong quá trình lên men c ủa glucose với lactose Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 12 1.4.2 NGUỒN NITƠ Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men (Theo -and-vegetable-products/7691/2) Thành phần Hàm lượng Protêin 27.8g Carbohydrate 11.8g Nước 37g Tro 23.4 Vitamin Khoáng Thiamin 9.7mg Ca 86mg Riboflavin 14.3mg Fe 3.7mg Vitamin B6 1.3mg Mg 180mg Folate 1010mcg Phospho 104mg Vitamin B12 0.5mcg K 2600mg Choline 65.1 mg Na 3600mg Zn 2.1mg Cu 0.3mg Se 18mcg Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 13 Phần 2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ Hình 2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Natri propionate . P.acidipropionici Nhân giống Ly tâmTạo dung dịch vô khuẩn Phối trộn Tạo hạt Alginate Lên men Tiệt trùng Phối trộn Nguyên liệu Trao đổi ion Kiềm hóa Sấy tầng sôi Natri propionate Dịch Cô dặc Kết tinh Tạp chất và acid khác Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 14 Phần 3 THUYẾT MINH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 3.1 PHỐI TRỘN Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men. Biến đổi: xảy ra sự tăng thể tích và chuyển pha từ rắn sang lỏng . Phương pháp thực hiện: khuấy trộn đều nguyên liệu với nước, rồi chỉnh lại pH của dung dịch bằng NaOH 6M Thông số công nghệ: sau khi phối trôn môi trường có pH 6.6 - 7.2 và thành phần các chất: Bảng 3.1 Thành phần môi trường lên men. Thành phần Hàm lượng Glucose g/l 40 Dịch chiết nấm men g/l 10 Tryptone g/l 5 K2HPO4 g/l 0.25 MnSO4 g/l 0.05 Thiết bị: Sử dụng thiết bị cánh khuấy turbin Hình 3.1 Sơ đồ dòng chảy trong thiết bị cánh khuấy turbin . Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 15 3.2 TIỆT TRÙNG Mục đích: Chuẩn bị môi trường lên men. Biến đổi: - Sinh học: vi sinh vật bị tiêu diệt. - Hoá học: xảy ra phản ứng Mailard, phản ứng tạo các tiền chất cho phản ứng Caramel. - Vật lý: nhiệt độ thay đổi. Phương pháp thực hiện: Tiệt trùng UHT, sử dụng nhiệt độ cao trong thời gian ngắn. Thông số công nghệ: - Nhiệt độ : 142- 146oC - Thời gian: 3- 4 s Thiết bị: Sử dụng thiết bị tiệt trùng UHT gồm ba giai đoạn - Giai đoạn một:  Thiết bị tiệt trùng dạng hình trụ đáy côn phía trên có hệ thống vòi phun hơi nước với áp suất cao 965 x 103 Pa.  Phía dưới bên hông thiết bị có lắp một đầu phun để phun hỗn hợp v ào thiết bị  Hỗn hợp sẽ tiếp xúc trực tiếp với hơi nước ở nhiệt độ cao, áp suất cao và sẽ được làm nóng tới 142 - 146oC trong 0.3s.  Hỗn hợp môi trường lên men sẽ tiếp tục qua hệ thống ống lồng ống giữ nhiệt với thời gian là 3s. Hình 3.2 Bộ phận gia nhiệt của thiết bị tiệt trùng UHT. -Giai đọan hai:  Hỗn hợp được dẫn qua thiết bị làm nguội chân không.  Hỗn hợp được làm nguội bằng nước lạnh trong thiết bị ống lồng ống .  Có bơm chân không để hút các khí không ngưng tụ hay chưa ngưng tụ ra ngoài. -Giai đọan ba:  Tiếp tục làm nguội hỗn hợp môi trường lên men bằng hệ thống ống lồng ống .  Tác nhân là nước lạnh  Môi trường khi vào thùng lên men có nhiệt độ khoảng 30-32oC Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 16 3.3 NHÂN GIỐNG Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình cố định tế bào. Biến đổi: Sinh học: Số lượng tế bào tăng lên ( tăng sinh khối) Hóa sinh: Các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật Phương pháp thực hiện: Chọn môi trường lên men có thành phần chính là lactose. Thành phần môi trường: - Lactose : 40 g/l - Mg2SO4.7H2O : 20 mg/l - K2HPO4 : 0.25 g/l - MnSO4 : 0.05 g/l - Dịch chiết nấm men : 10 g/l - Tryptone : 5 g/l Thông số công nghê: Điều kiện nhân giống: hiếu khí - pH: 6.6 (môi trường lên men) - Nhiệt độ: 25 - 35oC - Thời gian: 35 - 45h Tỷ lệ giống cấy: 10% 3.4 LY TÂM Mục đích: khai thác, tách sinh khối Thiết bị: Ly tâm lắng Nguyên lý hoạt động: dưới tác dung của lực ly tâm dòng sản phẩm nghèo vi sinh vật có tỷ khối nhỏ chuyển động lên phía trên, thoát ra ngoài. Dòng s ản phẩm giàu vi sinh vật có tỷ khối lớn hơn chuyển động phía dưới, ra ngoài. Thiết bị: thiết bị ly tâm 2 dòng sản phẩm. 3.5 TẠO DUNG DỊCH VÔ KHUẨN Mục đích: chuẩn bị cho quá trình cố định tế bào. Phương pháp thực hiện: Hòa tan muối natri alginate với nước vô khuẩn tạo dung dịch có nồng độ 25g/l. Tiến hành hấp tiệt trùng dung dịch natri alginate ở 121oC, áp suất 15 psi (1.05 at), thời gian 15 phút. Làm nguội dung dịch natri alginate về nhiệt độ 30oC, thời gian 20 phút. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 17 Thiết bị: Thùng khuấy turbin có thanh chắn, 2 vỏ. Vỏ ngo ài chứa tác nhân gia nhiệt và làm lạnh. Tác nhân gia nhiệt: hơi nóng Tác nhân làm lạnh: nước lạnh 3.6 PHỐI TRỘN Mục đích: chuẩn bị cho quá trình tạo hạt. Phương pháp thực hiện: Dịch tế bào được trộn chung với nước muối vô trùng (8.5g/l NaCl) và dung d ịch natri alginate 25g/l) theo tỉ lệ thể tích là 3:1:6 (tế bào: nước muối : alginate). Thiết bị: thùng chứa có cánh khuấy. 3.7 TẠO HẠT Mục đích: Chuẩn bị cho qúa trình lên men. Phương pháp thực hiện: tạo hạt từ bên ngoài - Hỗn hợp huyền phù sau khi đã khuấy trộn được dẫn qua thiết bị tạo hạt có chứa dung dịch CaCl2 0.05 M. - Ngâm hạt: Hạt vi sinh vật tạo ra được ngâm trong dung dịch CaCl2 0.05M trong 2h. Sục khí trơ để đảo trộn. Ta phải thay mới dung dịch CaCl 2 0.05M sau mỗi giờ ngâm để nồng độ ion Ca 2+ trong dung dịch không bị giảm xuống thấp. - Rửa hạt: Tháo dung dịch CaCl2, rửa lại hạt gel bằng nước vô khuẩn ở nhiệt độ phòng và dịch lên men để muối CaCl2 không còn bám trên bề mặt gel. Tiến hành rửa hạt gel 2 lần bằng nước vô khuẩn và một lần bằng dịch lên men . - Bảo quản trong điều kiện vô trùng dung dịch nước muối CaCl2 0.05M tại 4oC và sử dụng trong 72h. - Hạt tạo thành có đường kính khoảng 3.5 mm . Các hạt đ ược xử lý tại 37oC trong 3h. Thiết bị: - Có dạng hình trụ. - Phía trên của thiết bị có đầu phun áp lực hai d òng để phun huyền phù vào dung dịch CaCl2 bên trong. Cùng đi với huyền phù là khí nén 0.5m3/kg - Bên hông thiết bị có các cửa để dẫn nước muối sinh lý và môi trường lên men.bên dưới thiết bị là cửa tháo dung dịch và ống sục khí có tác dụng đảo trộn - Phía trên cửa tháo dịch được lắp một tấm lưới lọc với kích thước lỗ lọc nhỏ hơn 3.5 mm 3.8 LÊN MEN Mục đích: Khai thác acid propionic Phương pháp thực hiện: lên men theo mẻ Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 18 Môi trường: - Nguồn cacbon: glucose - Nguồn Nitơ: Dịch chiết nấm men, tryptone - Yếu tố sinh trưởng:  Vitamin B1 (thiamin) kích thích sự phát triển của vi khuẩn propionic, đặc biệt khi có mặt các amino axit. Nhưng không phải tất cả các vi khuẩn propionic đều cần vitamin B cho sự phát triển mạnh mẽ của nó (theo Tatum và các cộng sự 1936).  Riboflavin (Wood et al,1937) ở nồng độ 0.05γ/ml kích thích sự phát triểncủa vi khuẩn propionic trong môi trường có chứa amonisunfat. - Nguồn khoáng: Mg2SO4.7H2O; K2HPO4; MnSO4 - Trạng thái vật lý : dạng lỏng Thông số công nghệ: - Lượng hạt gel trong thùng lên men: 0.1g hạt gel/ ml - pH : 6.6- 7.2 - Nhiệt độ: 30oC - Thời gian lên men thích hợp khoảng 30 giờ Hình 3.4 Thiết bị cố định - lên men 1- Thùng tạo hạt 2- Đầu tạo hạt 3- Lưới lọc 4- Cửa vào nước muối vô khuẩn 5- Cửa vào môi trường 6- Cửa vào dung dịch CaCl2 7- Ống sục khí trơ 8- Cửa tháo hạt 9- Ống sục khí trơ 10- Cửa vào nước muối vô khuẩn 11- Cửa tháo 12- Thùng lên men 1 2 3 4 5 6 7 9 8 10 11 12 Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 19 3.9 TRAO ĐỔI ION Mục đích: Khai thác: thu nhận acid propionic Hoàn thiện: tách tạp chất khỏi sản phẩm. Biến đổi: Vật lý: lực hút tĩnh điện giữa các hạt tích điện dương trong cột và các ion âm trong dịch lên men. Phương pháp thực hiện: Do acid propionic tích điện âm nên ta dùng thiết bị trao đổi anionit . Các ion âm sẽ bị giữ lại trên cột, trong đó chủ yếu là ion propionate, ngoài ra còn có các ion âm khác như ion acetate , ion succinate,... Các ion dương và các chất không mang điện trong dung dịch sẽ đi ra khỏi cột. Hình 3.5 Cơ chế của quá trình trao đổi ion Các ion âm có ái lực khác nhau với pha tĩnh (hạt nhựa) v à pha động (chất rửa giải) nên các cấu tử sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động và được pha động lôi cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau. Ta sử dụng dung dịch rửa giải là NaCl để lôi cuốn ion âm ra khỏi cột. Việc định tính và định lượng các thành phần ra khỏi cột được thực hiện một cách tự độn g bằng cách kết nối đầu ra của cột với một đ ường dẫn vào một đầu dò (detector), nhờ đó mà thu được dung dịch acid propionic. Thông số công nghệ Nhựa trao đổi anion: polystyrene có nhóm điện tích l à base mạnh –N+(CH3)3 Chiều cao cột: 72 in Nhiệt độ: 30oC Thiết bị Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 20 Hình 3.6 Thiết bị trao đổi anionit 3.10 KIỀM HÓA Mục đích: Chế biến: kiềm hóa acid propionic tạo muối natri propionate. Biến đổi: Vật lý: có sự thay đổi về độ nhớt, khối l ượng riêng, nhiệt độ nóng chảy, … Hóa học: xuât hiện các phân tử natri propionate. Phương pháp thực hiện: Tiến hành kiềm hóa trong thiết bị phản ứng có cánh khuấy. Tác nhân kiềm hóa: dung dịch NaOH 6M. Thông số công nghệ: pH cuối: 7.5 – 10.5 Thiết bị: Hình 3.7 Thiết bị kiềm hóa Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 21 3.11 CÔ ĐẶC Mục đích: Khai thác : làm tăng nồng độ của sản phẩm cần thu nhận . Chuẩn bị cho quá trình kết tinh. Biến đổi: - Vật lý : nhiệt độ tăng, độ nhớt tăng, tỉ trọng tăng - Hóa học: tăng nồng độ của sản phẩm trong dung dịch. - Hóa lý: nước bốc hơi. Phương pháp thực hiện: Tiến hành cô đặc ở thiết bị cô đặc chân không nhiều cấp. Thiết bị: - Sử dụng hệ thống cô đặc chân không nhiều cấp - Dung dịch được cho vào buồng đốt để gia nhiệt, sau đó đ ược chuyển sang buồng bốc có áp suất chân không để bốc hơi nước. Áp suất chân không trong buồng bốc đ ược hình thành bằng 1 bơm chân không. - Ưu điểm : + Dùng hệ thống cô đặc chân không sẽ l àm giảm nhiệt độ sôi của dung dịch + Dùng hệ thống nhiều cấp sẽ tiết kiệm đ ược nhiên liệu do tận dụng được hơi thứ từ nồi trước để gia nhiệt cho nồi sau Hình 3.8 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị cô đặc chân không nhiều cấp. Thông số công nghệ: Nhiệt độ: nhỏ hơn 400C Nồng độ sản phẩm cuối: khoảng 60 % 3.12 KẾT TINH Mục đích: khai thác, tách nước khỏi sàn phẩm Biến đổi: Hóa lý: nước bốc hơi, propionate chuyển pha sang pha rắn. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 22 Phương pháp thực hiện: Thực hiện kết tinh trong thiết bị kết tinh li ên tục tuần hoàn Thiết bị Thiết bị kết tinh chân không liên tục tuần hoàn. Hình 3.9 Nguyên lý hoạt động của thiết bị kết tinh chân không liên tục tuần hoàn Thông số công nghệ: Nhiệt độ: thấphơn 400C 3.13 SẤY TẦNG SÔI Mục đích: Hoàn thiện sản phẩm Bảo quản: do hàm ẩm của sản phẩm giảm Biến đổi: Vật lý: nhiệt độ tăng Hóa học: hàm ẩm giảm Hóa lý: nước bốc hơi. Phương pháp thực hiện: Tiến hành sấy trong thiết bị sấy tầng sôi. Thiết bị: Thiết bị sấy tầng sôi có cấu tạo dạng hộp hay buồng h ình trụ, trong có lớp lưới để đỡ vật liệu và phân phối dòng tác nhân sấy, không khí nóng được thổi từ đáy buồng, thổi bung lớp vật liệu lên, làm vật liệu ở trạng thái lơ lửng (tầng sôi) Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 23 Hình 3.10 Nguyên lý hoạt động của thiết bị sấy tầng sôi. Cấu tạo dạng hộp hay buồng h ình trụ, trong có lớp lưới để đỡ vật liệu và phân phối dòng tác nhân sấy, không khí nóng được thổi từ đáy buồng, thổi bung lớp vật liệu l ên. Nhờ vậy mà diện tích tiếp xúc tăng lên đáng kể và hiệu quả tách ẩm là tốt hơn rất nhiều. Hình 3.11 Thiết bị sấy tầng sôi. Thông số công nghệ: Nhiệt độ : 36oC Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 24 Phần 4 SẢN PHẨM 4.1 ACID PROPIONIC 4.1.1 THUỘC TÍNH Tỷ trọng và pha 0,99 g/cm3, lỏng pKa 4.88 Độ hòa tan trong nước rất tốt Điểm nóng chảy -21 °C (252 K) Điểm sôi 141 °C (414 K) Độ nhớt 10 mPa.s (Các dữ liệu được lấy ở 250C và 100 kPa) 4.1.2 CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG Bảng 4.1 Một số tính chất và chỉ tiêu chất lượng của acid propionic THỬ NGHIỆM Thông tin phụ thuộc vào phương pháp phân tích và mức độ của các chất dễ oxy hóa. ĐỒNG NGHĨA Propanoic acid, ethylformic acid, methylacetic acid, INS No. 280 ĐỊNH NGHĨA Tên hóa học Propionic acid C.A.S. number 79-09-4 Công thức hóa học C3H6O2 Công thức cấu tạo CH3CH2COOH Phân tử lượng 74.08 Phân tích Không nhỏ hơn 99.5% trên căn bản vật liệu khô Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 25 MÔ TẢ chất lỏng trơn, có mùi hăng không đáng kể. CHỨC NĂNG SỬ DỤNG chất bảo quản, chống mọt, tác nhân tạo hương ĐẶC ĐIỂM NHẬN DẠNG khả năng hòa tan Có thể tan trong nước và ethanol. khối lượng riêng : 0.993 - 0.997 ĐỘ TINH KHIẾT Vùng chưng cất 138.5 - 142.5°C Bã không bay hơi sau chưng cất Không lớn hơn 0.01% khi sấy khô ở 1400C đến khối lượng không đổi. Những chất dễ oxy hóa : Thông tin bắt buộc Kim loại nặng Không nhiều hơn 10 mg/kg Aldehyde Không nhiều hơn 0.2 % (như propinaldehyde) 4.2 NATRI PROPIONATE Bảng 4.2 Mốt số tính chất của natri propionate ĐỒNG NGHĨA Sodium propanoate, INS No. 281 ĐỊNH NGHĨA Tên hóa học Sodium propionate C.A.S. No. 137-40-6 Công thức hóa học C3H5NaO2 Công thức cấu tạo CH3CH2COO-Na+ Phân tử lượng 96.06 Phân tích Không nhỏ hơn 99.0 % trên căn bản vật liệu khô TÍNH CHẤT Màu trắng hay không màu, tinh thể hút ẩm, có mùi đặc trưng nhẹ. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 26 CHỨC NĂNG SỬ DỤNG chất bảo quản, diệt mốc ĐẶC ĐIỂM NHẬN BIẾT Tính tan Tan tốt trong nước, có thể hòa tan được trong ethanol. Bảng 4.3 Ttiêu chuẩn sản phẩm natri propionate: FAO/WHO 1995, HG2922-1999 ĐỘ TINH KHIẾT Thất thoát trong quá trình sấy khô Không lớn hơn 4 % (1050, 2 h) Các chất không hòa tan trong nước Không lớn hơn 0.1 % pH 7.5 - 10.5 Fe Không lớn hơn 50 mg/kg Chì Không lớn hơn 5 mg/kg. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 27 Phần 5 THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 5.1 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN GENE Nhờ sự nghiên cứu và tiến bộ trong quy trình lên men propionic như sử dụng các cơ chất rẻ tiền, cố định tế bào lên men nên năng suất sản xuất acid propionic tăng l ên đáng kể. Tuy nhiên, đi kèm theo đó là sự tạo thành acid acetic như một sản phẩm phụ chủ yếu của quá tr ình lên men- Điều này gây ra khó khăn và tốn kém trong việc tách sản phẩm l ên men. Việc loại bỏ acid acetic trong quá tr ình lên men sẽ làm tăng khả năng tinh sạch acid propionic, làm giảm rất nhiều chi phí thu hồi sản phẩm, từ đ ó làm giảm giá thành san 3phẩm công nghiệp, nên tính khả thi cho sản phẩm thương mại sẽ tăng lên. Mặc dù có nhiều phương pháp phức tạp để nâng cao độ tinh sạch của quá tr ình lên men propionic, vẫn có 1 sự quan tâm rất lớn trong việc loại bỏ sự h ình thành acid acetic bằng công nghệ gen. Trong hầu hết vi khuẩn acetyl CoA được chuyển thành acetyl phosphate bằng phosphotransacetylase (PTA) rồi thành acetate thông qua acetate kinase (AK). Dựa vào đó, nếu vô hoạt một trong hai gen trên, sẽ loại trừ được sự hình thành acetate trong quá trình lên men propionic, tập trung nguồn cacbon cho quá tr ình tạo sản phẩm propionic. Nhờ đó có thể đạt gần đến hiệu suất lí thuyết : lượng propionic/ lượng glucose = 0,822 (g/g) thông qua chu tr ình EMP, nếu sự tạo thành acetate và sinh trưởng tế bào đạt mức thấp nhất. Nguyên tắc vô hoạt : chèn một DNA lạ vào giữa gen cần biến đổi. Sau đó đoạn n ày sẽ được dùng để biến đổi đoạn gen chủ, do đó sự sao chép b ình thường của gen này trên nhiễm sắc thể sẽ thay thế bằng đoạn gen đã biến đổi, gây rối loạn sự sinh tổng hợp các enzyme PTA v à AK. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 28 Hình 5.1 Đồ thị biểu diễn khả năng lên men của vi khuẩn P. acidipropionici tự nhiên (A) và vi khuẩn P. acidipropionici đã qua biến đổi gen (B). 5.2 LÊN MEN ACID PROPIONIC B ẰNG THIẾT BỊ FIBROUS BE D BIOREACTOR – FBB Một trong những trở ngại lớn nhất trong việc sản xuất acid propionic l à sự ức chế của acid sinh ra đến các tế bào vi khuẩn khi nồng độ acid đến một giới hạn nhất định. Có nhiều ph ương pháp đã được nghiên cứu để hạn chế sự ức chế của ac id lên vi khuẩn cũng như tăng khả năng chịu đựng môi trường acid của vi khuẩn. Một trong những ph ương pháp đó là sử dụng FBB- fibrous bed bioreactor. FBB có những ứng dụng rất quan trọng, đang được phát triển và mở rộng sử dụng cho việc cải tiến việc sản xuất số lượng lớn những acid carboxylic nh ư acid propionic, acid butyric, acid lactic và acid acetic. Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 29 Hình 5.2 Nguyên lý hoạt động của thiết bị FBB FBB bao gồm một ống hình trụ bọc bằng thủy tinh, bên trong có một mạng lưới dạng xoắn có cấu trúc ba chiều được làm từ polyethylene terephthalate (PET) với độ rỗng hơn 95%. Chính nhờ cấu trúc này nên FBB tạo ra nhiều lỗ hổng để nhốt và diện tích bề mặt lớn để tế bào vi khuẩn bám lên. Bên trong mạng lưới có những rãnh dọc để lượng khí sinh ra trong quá trình lên men có thể thoát ra và những tế bào vi khuẩn yếu rơi xuống đáy của bình lên men. Khi sử dụng FBB, ta cũng có thể dễ d àng loại bỏ những tế bào già yếu và thay thế bằng những tế bào mới có hoạt tính mạnh hơn, do đó có thể duy trì sự ổn định của quá trình lên men trong thời gian sản xuất dài. Đầu tiên, người ta sẽ bơm khí nitơ đã qua tiệt trùng vào bình lên men để đảm bào điều kiện kỵ khí. Sau đó cho môi trường và vi khuẩn vào bình và để một khoảng thời gian cho vi khuẩn thích nghi và tự bám và bề mặt mạng lưới. Tiếp đó, canh trường trong bình lên men sẽ được hút ra và bơm tuần hoàn liên tục nhờ một bơm chân không với tốc độ tương đối chậm để vi sinh vật tiếp tục cố định v ào mạng lưới. Sau một thời gian, khi lượng vi sinh vật đã cố định hầu hết, tiếp tục tăng tốc độ tuần hoàn lên một giá trị cố định. Trong quá trình tuần hoàn, người ta sẽ bổ sung thêm cơ chất, vi sinh vật mới vào bình, đồng thời tháo sản phẩm ra từ đáy b ình. Ưu điểm: + Nguyên liệu và cấu trúc cùa FBB không đắt tiền dễ trang bị. + FBB có khả năng kiểm sóat được sự tập trung tế bào sống dẫn đến cải thiện sản Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 30 xuất acid hữu cơ với khả ngăng sản xuất ổn định trong thời gian dài. + FBB không gây ô nhiễm môi trường khi họat động. Ngoài những ưu điểm chung, theo nghiên cứu của S. Suwannakham và S.-T.Yang (2005), trong quá trình cố định tế bào vi khuẩn bằng FBB, người ta thu nhận được một chủng vi khuẩn đột biến mới có tính chất khác biệt với chủng nuôi cấy ban đầu. Qua các kết quả phân tích, ng ười ta nhận thấy chủng đột biến mới này có khả năng chịu được sự ức chế bởi acid sinh ra cao h ơn, sản xuất ra lượng sản phẩm chính nhiều hơn và lượng các sản phẩm phụ ít hơn nhiều so với phương pháp lên men tự do thông thường và ngay cả phương pháp cố định tế bào bằng calci aginate. Khi phân tích các tế bào thu nhận sau khi lên men bằng FBB, người ta nhận thấy các tế bào đã xuất hiện đột biến để thích nghi với nồng độ acid trong môi tr ường cao. Trong thí nghiệm này, quá trình lên men được thực hiện bằng nhiều ph ương pháp khác nhau trong môi trường cơ chất giống nhau với glucose là nguồn cacbon chính. Kết quả thí nghiệm thu được cho thấy lượng acid propioinc sinh ra nằng ph ương pháp FBB khoảng 71,8g/l , cao hơn nhiều so với lên men tự do thông thường, và cao hơn lên men bằng phương pháp cố định tế bào bằng calci alginate (57g/l), đồng thời l ượng sản phẩm phụ sinh ra trong quá tr ình lên men giảm đi rất nhiều. Tế bào vi khuẩn đột biến thu được sau thí nghiệm cho thấy sự đột biến về h ình thái, cấu trúc màng lipid và hoạt tính những enzyme then chốt trong con đường chuyển hóa. Do khả năng chịu được nồng độ acid cao hơn và khả năng sinh tổng hợp propionic h àm lượng cao cũng như sinh ra ít sản phẩm phụ hơn, việc phân lập được các tế bào đột biến này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các chủng mới trong công nghiệp sản xuất acid propionic bằng phương pháp lên men. A Sản xuất acid propionic GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 31 Hình 5.3 Hình thái của vi khuẩn cấy ban đầu (A) và vi khuẩn đột biến sau khi lên men bằng FBB(B) Sự khác nhau về hình thái giữa vi khuẩn cấy ban đầu và vi khuẩn đột biến : vi khuẩn ban đầu có dạng que ngắn, còn vi khuẩn đột biến có dạng que dài và mỏng hơn. B