Đề tài Sản xuất các peptide có hoạt tính sinh học

Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 5 1. GIỚI THIỆU Peptide có hoạt tính sinh học (bioactive peptide/ biologically active peptide) là những peptide mà ngoài giá trị dinh dưỡng chúng còn có một số ảnh hưởng đặc biệt đến chức năng sinh lý của cơ thể. Tính chất này được quy định bởi thành phần và thứ tự của các amino acid trong peptide. Mellander (1950) là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các các peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein hoạt động như chất mang các chất khoáng. Những nghiên cứu về peptide đã có những bước tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây. Những hiểu biết về tác dụng và cơ chế tác dụng của peptide đã làm cho nó ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm lĩnh vực trong y dược. Ngoài ra, peptide có hoạt tính sinh học còn được sử dụng trong các loại thực phẩm chức năng, nhất là các thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ sữa. Hình 1. Ảnh hưởng của các peptide có hoạt tính sinh học lên cơ thể Người ta có thể thu nhận một số peptide bằng cách tách từ các nguyên liệu tự nhiên, ví dụ: lấy insulin từ tuyến tụy của bò, heo…. Tuy nhiên việc này gặp rất nhiều khó khăn, ví dụ: hàm lượng peptide mong muốn ở trong mô thì rất nhỏ; khó khăn trong vấn đề thu gom và xử lý nội tạng động vật (bò, heo…); trong quá trình tách lấy các peptide từ mô có thể nhiễm hoặc chứa những virus nguy hiểm…. Hiện Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 6 nay, người ta có thể thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học- bằng nhiều phương pháp: thủy phân protein (dùng enzyme trực tiếp hoặc thông qua quá trình lên men của vi sinh vật), tổng hợp hóa học, kỹ thuật gen. Trong số đó, các peptide có hoạt tính sinh học từ sữa thường được thu nhận bằng phương thuỷ phân và lên men của vi sinh vật. Gần đây, những cơ sở dữ liệu về trình tự của các amino acid trong peptide có hoạt tính sinh học ngày càng được phát triển, từ đó ta có thể xác định những peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn trong protein. Ngoài ra, do chúng ta đã biết được vị trí thủy phân của các enzyme thủy phân protein như pepsin, trypsin, chymotrypsin, do đó sự giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học trong quá trình thủy phân nói chung là có thể dự đoán được.Việc nghiên cứu hệ thống thuỷ phân của vi sinh vật cũng mở ra hướng mới trong sản xuất các peptide có hoạt tính sinh học. 2. CÁC PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NHÓM SẢN PHẨM SỮA LÊN MEN Mặc dù protein của các động vật và thực vật khác đều có chứa các peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn (nằm trong protein), nhưng hiện nay protein từ sữa vẫn là nguồn cung cấp peptidee có hoạt tính sinh học chính. Sữa có nhiều chất có hoạt tính sinh học và có tác động có lợi nhiều mặt lên cơ thể. Hầu hết protein của sữa có rất ít hoặc không có hoạt tính sinh học khi ở trạng thái ban đầu, tuy nhiên qua quá trình tiêu hóa hoặc thủy phân thì nó giải phóng ra rất nhiều peptide có hoạt tính sinh học. Trong thành phần của tất cả các casein có hàm lượng các amino acid không phân cực khá cao (35-45%) như Val, Leu, Ile, Pro, Phe. Trong số đó hàm lượng proline là khá cao: 17, 10, 35, 20 gốc proline trong một mol 1S , 2S ,  ,  -casein (mỗi loại casein này có 199, 207, 209, 169 gốc amino acid trong phân tử). Sự có mặt một lượng lớn proline trong phân tử casein làm cho phân tử casein có rất ít Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 7 cấu trúc xoắn  và cấu trúc lá xếp  . Điều này làm cho casein dễ bị thủy phân mà không cần phải làm cho nó bị biến tính trước (ví dụ bằng nhiệt hay acid). Tuy nhiên casein lại chứa rất ít các amino acid chứa lưu huỳnh, điều này làm giảm đi giá trị sinh học của nó. 1S và  -casein không chứa cysteine hay cystine, trong khi đó 2S và  -casein chứa 2 gốc cysteine trong phân tử mà thông thường tồn tại dưới dạng cầu disulphide. Casein, mà đặc biệt là 2S -casein có rất nhiều Lys, đây là amino acid rất cần thiết mà trong nhiều protein thực vật có rất ít. Bảng 1. Những peptide có hoạt tính sinh học từ potein sữa Tên Protein tiền thân Hoạt tính sinh lý Casomorphins α-Lactorphin β-Lactorphin Lactoferroxins Casoxins Casokinin Lactokinins Antihypertensive peptides Immunopeptides Lactoferricin Casocidin Isracidin Casoplatelins Phosphopeptides α-, β-Casein α-Lactalbumin β-Lactoglobuli Lactoferrin κ-Casein α-, β-Casein β-Lactalbumin β-Casein α-, β-Casein Lactoferrin αS2-Casein αS1-Casein κ-Casein α-, β-Casein Giảm đau cơ vận chủ Giảm đau cơ vận chủ Giảm đau cơ vận chủ Giảm đau cơ đối vận Giảm đau cơ đối vận Kháng ACE (Angiotensin I converting enzyme) Kháng ACE Chống chứng tăng huyết áp. Ảnh hưởng lên hệ thống miễn dịch Kháng vi sinh vật Kháng vi sinh vật Kháng vi sinh vật Kháng vi sinh vật Giữ khoáng 2.1 Sự hình thành các peptide có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình lên men Các amino axit có mặt trong sữa giới hạn sự cung cấp dinh dưỡng cho LAB (lactic acid bacteria) phát triển. Vì thế, LAB dựa vào hệ thống phân giải protein phức tạp để đảm bảo sự phát triển tối ưu trong môi trường sữa. Hệ thống protein Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 8 phân giải được tạo nên do các proteinase, peptidase và hệ thống vận chuyển. Những tế bào LAB điều khiển: 1. Proteinase nằm trong vỏ bao tế bào vi khuẩn phân hủy casein thành oligopeptide. 2. Hệ thống vận chuyển cho phép duy trì sự giải phóng oligopeptide 3. Peptidase trong tế bào thủy phân oligopeptide thành peptide và axit amin và được tế bào sử dụng. Bước đầu tiên trong phân giải protein bao gồm proteinase giải phóng peptide từ casein. Sau đó những peptide được giải phóng này sẽ được thủy phân bởi peptidase tạo thành các axit amin và các peptide có mạch ngắn hơn và chúng sẽ được vận chuyển vào trong tế bào bởi hệ thống vận chuyển. 2.1.1 Proteinase Hầu hết proteinase có mặt trong vỏ bao tế bào. Proteinase Lactococcal là protein rất lớn với phân tử lượng la 140.000 kDa và pH tối thích là 5.5-6.5. Chúng được phân lọai thành những chất kìm hãm proteinase serin . Proteinase được xếp peptide loại là PI ( khi ß_casein là protein chính bị thủy phân bởi enzyme) hay là PIII (khi không chỉ β-casein bị thủy phân mà αs1- casein cũng bị thủy phân bởi enzyme). Khi được tinh sạch, những enzyme này có thể làm giảm một lượng casein và giải phóng ra rất nhiều oligopeptide. Khoảng 20% oligopeptide được giải phóng với kích thước và hàm lượng đủ nhỏ để hệ thống vận chuyển của Lactococcus lactis di chuyển đi. Các gen Proteinase được tìm thấy đã được mã hóa trên plasmid. Sự sinh sản vô tính của proteinase gene ở Lactococcus và nó được chuyển thành Prt- L.lactis. Sự biến hình của Lactis lại dẫn tới kết quả là nó được chuyển thành hình dạng Prt+. Gen Proteinase prtP và prtM được mã hóa tương thích với protein 200 kDa và lipoprotein 32kDa. Loại 2 bao gồm sự chuyển từ proteinase không hoạt hóa thành sang dạng hoạt hóa trong suốt và sau khi di chuyển qua màng. Mã gen PrtP Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 9 cho tiền proteinase với một peptide ở cuối đoạn N, và một dãy màng bám chặt ở cuối đoạn C. Cuối đoạn C của protein bao gồm lớp màng với cấu trúc xoắn anpha kị nước. Nhiều aminoacid cơ bản tạo thành vùng cấu trúc xoắn cuối đầu C, và có thể tin rằng vai trò của các amino axit liên quan tới sự tương tác với những nhóm chỉ thị phosphate của lớp phospholipid tạo nên như một dấu hiệu ngừng vận chuyển. Lactobacillus helveticus và Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus có hoạt tính enzyme mạnh hơn Lactococcus. Hoạt tính của thành tế bào từ Lb. helveticus L89 được nghiên cứu bởi Martín-Hernández et al. Foucaud and Juil-lard đã minh họa rằng cấu trúc peptide được tìm thấy sau 24 giờ lên men sữa. Giai đoạn cuối của thời kì phát triển, hoạt tính của proteinase vẫn tồn tại ở pH thấp nhưng ở pH thấp thì hệ thống vận chuyển không hoạt động nên những peptide ngừng được tiếp nhận bởi tế bào. Hoạt tính proteinase khác nhau rõ rệt trên từng mẩu của LAB và cũng gây nên tác động chủ yếu lên mẫu peptide. Mỗi enzyme probiotic đều có đặc tính riêng khác nhau giữa các loài, cũng như từ chuỗi này đến chuỗi khác trong cùng một loài, góp phần giải phóng ra những peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng. Vì vậy bằng hoạt tính và những đặc điểm của proteinase nên chúng đã đóng vai trò trong giai đoạn phát triển của những peptide trong sữa lên men và sự giải phóng của những peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng. 2.1.2 Peptidase Vi khuẩn lactic điều khiển toàn bộ phạm vi rộng lớn của những enzyme proteolytic bao gồm endopeptidase, dipeptidase. Đặc điểm hóa sinh của peptidase này phản ánh vị trí trong tế bào của chúng. Aminopeptidase hoạt động trên những oligopeptide được giải phóng bởi một proteinase bằng cách phân hủy phần còn lại cũa những a.a ở cuối đoạn N. Aminopeptidase được cấu thành bởi PepN và PepC. Mặt khác như PepA thì giải phóng ra phần còn lại glutamate cuối amino thì ít đặc biệt hơn. Dipeptide và tripeptide có thể được phân hủy bởi peptidase đặc trưng. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 10 Sự có mặt của peptidase từ proline thì cần thiết cho sự phát triển tối ưu của LAB nhờ khả năng giảm bớt những oligopeptide giàu proline từ casein. Aminopeptidase proline PIP và PepI đặc biệt cho dipeptide và tripeptide với phần còn lại proline ở cuối đầu N được tách ra từ 2 chuỗi của LAB. 2.1.3 Sự vận chuyển peptide Những oligopeptide và những peptide nhỏ thì được tiếp nhận bởi tế bào bằng một hệ thống vận chuyển oligopeptide (OPP), hệ thống vận chuyển dipeptide và tripeptide (PtpT và PtpP). Hệ thống OPP bao gồm 2 ATP gắn với những protein (OppD và OppF); 2 protein OppB và OppC; và 1 protein làm môi trường kết dính là OppA. Chỉ một số lượng giới hạn peptide được tạo ra nhờ proteinase được vận chuyển bởi hệ thống vận chuyền oligopeptide. Focaud và Juillard đã chú ý rằng dưới 25% casein (bắt nguồn từ những peptide) được sử dụng để cung cấp cho sự phát triển LAB. Hầu hết những oligopeptide này không thúc đẩy sự phát triển của LAB bởi vì chúng không được vận chuyển vào tế bào. Thêm vào đó, kênh dẫn những peptide nhỏ thông qua OPP được giới hạn bởi những kích cỡ của những peptide. Hệ thống vận chuyển của LAB có thể khiến chúng tiếp thu được những oligopeptide có chiều dài lên tới 18 a.a, mặc dù ta chỉ tìm thấy những peptide có chiều dài 11 a.a là được vận chuyển. Vì vậy, những peptide không được vận chuyển đã được xếp vào nhóm những peptide có hoạt tính sinh học. Để làm tăng lượng peptide có hoạt tính sinh học trong các sản phẩm sữa lên men thì người ta cho lên men hoặc đồng lên men với chủng vi khuẩn lactic thủy phân protein mạnh. Việc lựa chọn chủng vi khuẩn có ảnh hưởng tới việc giải phóng peptide có hoạt tính sinh học. Chủng vi khuẩn không nên thủy phân protein quá mạnh (nó có thể phá hủy sản phẩm) và cần có tính đặc hiệu phù hợp để có thể giải phóng peptide có hoạt tính sinh học mong muốn. Các protease ở thành tế bào vi khuẩn lactic có tính đặc hiệu rộng, nó thủy phân protein sữa, làm giải phóng nhiều loại oligopeptide. Vi khuẩn lactic có thể vận chuyển các peptide có từ 18 Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 11 amino acid trở xuống đi vào tế bào để sử dụng làm nguồn nitơ. Các peptide có mạch dài hơn thì không được vận chuyển vào tế bào. Sau khi tế bào vi khuẩn bị phân hủy thì những peptide này sẽ được thủy phân tiếp bởi các peptidase nội bào của vi khuẩn lactic. Nhiều vi sinh vật có hệ enzyme thủy phân protein mạnh, ví dụ 1 số loài đã được nghiên cứu như: Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, Lb plantarum, Lb rhamnosus, Lb acidophilus, Streptococcus thermophilus và Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus… Hệ enzyme này bao gồm các enzyme ở thành tế bào và các enzyme bên trong tế bào ví dụ: endopeptidase, aminopeptidase, tripeptidase và dipeptidase (Christensen, Dudley, Pederson, & Steele, 1999). Hiện đã có nhiều nghiên cứu báo cáo về sự giải phóng của các peptide có hoạt tính sinh học từ protein của sữa nhờ vi sinh vật thủy phân (Gobbetti et al., 2004; Gobbetti, Stepaniak, De Angelis, Corsetti, & Di Cagno, 2002; Korhonen & Pihlanto-Leppa la, 2001, 2004; Mataret al., 2003), tuy nhiên hầu hết những báo cáo này đều tập trung vao việc thu nhận các peptide có tác dụng làm giảm chứng cao huyết áp, điều hòa hệ miễn dịch, chống oxi hóa. Hai trong số những peptidee ức chế ACE được biết đến nhiều nhất là VPP và IPP, 2 peptide này đã được tìm thấy trong sữa lên men bởi Lb.helveticus (Nakamura, Yamamoto, Sakai, Okubo et al., 1995; Sipola, Finckenberg, Korpela, Vapaatalo, & Nurminen, 2002). So với các vi khuẩn lactic khác thì khi lên men sữa với Lb.helveticus thì sản phẩm cho thấy hoạt tính ức chế ACE cao và tác động làm giảm huyết áp rõ rệt. Gobbetti, Ferranti, Smacchi, Goffredi, and Addeo (2000) đã chứng minh có sự tạo thành peptidee ức chế ACE khi sử dụng 2 loài Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus và Lc. lactis ssp.cremoris sau khi lên men sữa trong 72 giờ. Hai peptidee ức chế ACE được tìm thấy Ser-Lys-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly Pro-Ile và Ser-Lys-Val-Tyr-Pro cho thấy khả năng bền vững trong môi trường tác động bởi acid, kiềm, enzyme thủy phân của hệ tiêu hóa hoặc trong điều kiện bảo quản ở 5-10oC trong 4 ngày. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 12 Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự thủy phân nhờ vi sinh vật có thể làm sinh ra các peptide có khả năng điều hòa hệ miễn dịch (Gill, Doull, Rutherfurd, & Cross, 2000). Khi sử dụng enzyme được tách ra từ Lactobacillus GG var. casei để thủy phân casein, sau đó tiếp tục cho thủy phân bằng pepsin và trypsin, sản phẩm thu được có tính chất điều hòa hệ miễn dịch, khả năng này thể hiện mạnh nhất khi sử dụng 1S -casein. Matar (2001) đã cho Lb.helveticus vào sữa, sau đó lấy sữa này cho chuột ăn trong 3 ngày thì phát hiện lượng IgA tăng rất cao trong chất nhầy ở ruột. Bảng 2. Một vài ví dụ về các peptidee có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ protein của sữa đƣợc giải phóng ra nhờ vi sinh vật 2.2 Phân loại theo chức năng Dựa vào chức năng, người ta có thể chia peptide có hoạt tính sinh học từ sữa thành nhiều loại: Peptide ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn Peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 13 Peptide liên kết với khoáng Peptide điều hòa hệ miễn dịch Ngoài ra còn có các peptide có các chức năng khác (ví dụ như làm co cơ, chống đông máu…) nhưng các peptide này chỉ chiếm hàm lượng rất nhỏ hoặc có ảnh hưởng không đáng kể nên không được đề cập đến trong bài. Có những peptide có nhiều chức năng (ví dụ vừa ảnh hưởng lên hệ tuần hoàn, vừa ảnh hưởng lên hệ thần kinh), nên sự phân loại trên cũng chỉ mang tính chất tương đối. 2.2.1 Các peptide ảnh hƣởng lên hệ tuần hoàn Trong loại peptide này, người ta thường quan tâm đến các peptide có khả năng làm giảm huyết áp do hiện nay có rất nhiều người mắc bệnh cao huyết áp. Angiotensin I converting enzyme (ACE- peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1) có liên quan đến hệ rennin-angiotensin, có liên quan đến huyết áp và cũng liên quan đến cân bằng muối và nước. ACE chuyển angiotensin I thành angiotensin II (một chất có khả năng làm co mạch máu (vasoconstrictor), đồng thời phân hủy bradykinin (một chất có khả năng làm giãn mạch máu (vasodilator). Chính vì vậy việc ức chế enzyme này sẽ dẫn đến việc chống lại hiện tượng cao huyết áp. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 14 Hình 2. Hệ renin-angiotensin, sự tương tác giữa các peptide có hoạt tính sinh học với các cơ quan thụ cảm và những ảnh hưởng. ACE hoạt động như một dipeptidyl carboxypeptidase, nó loại dipeptide từ đầu C của cơ chất (có đầu C tự do). Nó ưu tiên kết hợp đối với cơ chất có các amino acid kị nước ở 3 vị trí cuối, và có 1 ít ái lực đối với cơ chất có amino acid có 2 nhóm carboxy ở đầu C (Glu, Asp) hoặc có Proline ở vị trí áp chót. Người ta thấy rằng ACE có Glu, Tyr và Arg ở tâm hoạt động. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 15 Hình 3. Mô hình tâm hoạt động của ACE và tương tác của nó với cơ chất peptide (Bunning, 1987) Chất ức chế ACE đầu tiên được phát hiện trong nọc rắn Bothrops jararaca vào năm 1970. Trong nọc rắn này có các peptide ức chế ACE có từ 5-13 gốc amino acid trong phân tử, trong số đó có peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile- Pro-Pro là có hoạt tính cao nhất in vivo. Một peptide khác là bradykinin- potentiating peptide 5a (BPP5a) Glu-Lys-Trp-Ala-Pro có thứ tự 3 amino acid cuối ở đầu C rất phù hợp cho việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE, tuy nhiên peptide này lại dễ bị phân hủy trong điều kiện in vivo. Do đó, người ta đã thay thế gốc Trp trong phân tử bằng gốc Phe để có được phân tử bền hơn nhưng vẫn có hoạt tính ức chế ACE mạnh. Và cũng từ đó, hầu hết các thuốc ức chế ACE được sử dụng đều có cấu trúc tương tự hay liên quan đến tripeptide Phe-Ala-Pro. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 16 Hình 4. Giả thuyết về sự tương tác của peptide với tâm hoạt động của ACE Hình 5. Giả thuyết về sự tương tác của Captopril với tâm hoạt động của ACE Hình 6. Giả thuyết về sự tương tác của Enalaprilat với tâm hoạt động của ACE Hai hình trên cho thấy 2 loại thuốc ức chế ACE có cấu trúc tương tự như peptide Ala-Pro và Phe-Ala-Pro. Captopril tương tự như Ala-Pro, trong đó Alanin ứng với peptide được thay thế bởi nhóm có –HS (sulfhydryl) có khả năng tương tác mạnh hơn ion Zn2+ trong enzyme. Còn đối với Enalaprilat thì tương tự như Phe-Ala-Pro nhưng Enalaprilat liên kết mạnh hơn với ACE nhờ nhóm carboxyl so với nhóm carbonyl trong tripeptide. IC50 của Enalaprilat và Captopril lần lượt là 2.8 và 9.7 nM, tức là hoạt tính rất mạnh. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 17 Các peptide ức chế ACE có nguồn gốc từ casein gọi là “casokinin” và từ whey gọi là “lactokinin” . Tính chất Như trên đã nói, peptide ức chế ACE thường có 3 amino acid kị nước ở vị trí cuối và nhất là gốc amino acid cuối cùng(đầu C). Gốc amino acid cuối cùng ở đầu C thường là Pro, tuy nhiên nó cũng có thể là Lys hoặc Arg, 2 amino acid này (ưa nước) tích điện dương ở nhóm  -amino. Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa cấu trúc của peptide với khả năng ức chế ACE là hoạt tính ức chế ACE của dipeptide có Pro ở đầu C thì cao hơn so với khi đầu C là Tyr, và Tyr > Phe. Khi được đưa vào cơ thể thì peptide có Tyr ở đầu C có tác động chậm hơn nhưng kéo dài hơn so với peptide có Phe ở đầu C (Suetsuna, 1998). Việc có các amino acid kị nước trong phân tử và nhất là protein làm cho các peptide này có khả năng chống lại sự thủy phân tốt hơn. Trp-Ala-Pro là peptide có cấu trúc thích hợp nhất cho việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE. Bảng 3. Một số peptide có tác dụng làm giảm huyết áp đã được nghiên cứu in vivo Sản phẩm, nguồn Peptide Tham khảo Sữa chua  -casein,  -casein, Val- Pro-Pro /Ile-Pro-Pro Hata et al. (1996) Sữa chua Val-Pro-Pro /Ile-Pro-Pro Seppo et al. (2003) Sữa chua Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro Mizushima et al. (2004) Sữa chua (Dahi)  -casein Ashar and Chand (2004) Bảng 4. Ảnh hưởng ức chế ACE và giảm huyết áp của một số peptide thu nhận từ quá trình thủy phân whey protein bởi một số enzyme Mẫu ACE inhibitory activity (%) Decreased SBP (mm Hg) Whey protein (ban đầu) 0.0 -38 ± 2 pepsin 83.7 -47 ± 3 trypsin 56.7 -51 ± 4  - chymotrypsin 76.0 -40 ± 4 proteinase K 95.7 -55 ± 3 Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 18 actinase E 55.7 -55 ± 4 thermolysin 98.6 -42 ± 4 papain 86.5 -47 ± 4 Mức độ giảm huyết áp sau 6 giờ sử dụng 2.2.2 Các peptide ảnh hƣởng lên hệ thần kinh 2.2.2.1 Khái niệm Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác về các peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh (neuropeptide – NP). Người ta gọi tên các peptide này chủ yếu là dựa vào kết quả những quan sát về ảnh hưởng của nó lên các hoạt động sinh lý của cơ thể (tên gọi có tính chất lịch sử) hơn là do những hiểu biết chi tiết về cơ chế tác động của chúng. Ví dụ, trong một thời gian khá dài, người ta biết CCK (cholecytokinin) như là hormon ở hệ tiêu hóa, nhưng đến năm 1975 người ta lại phát hiện nó có trong não của chuột, tác động đến hệ thần kinh chuột. Những NP có tính chất tương tự như morphin (morphin có tác dụng làm giảm đau, tạo cảm giác dễ ngủ) được gọi là “opioid peptide / opiate peptide – OP”. Các OP có nguồn gốc từ protein thực phẩm được gọi là “exorphin”. Các OP có nguồn gốc từ casein được gọi là “casomorphin”. Ví dụ: - OP có nguồn gốc từ β-casein gọi là β-casomorphin, đây là một trong những OP từ sữa đầu tiên được phát hiện (Smacchi, 1998). - OP có nguồn gốc từ α-LA gọi là α-lactorphin. - OP có nguồn gốc từ serum albumin gọi là serorphin. Tuy nhiên, người ta cũng tìm thấy trong protein sữa một số peptide có tính chất ngược lại (đối với hệ thần kinh) với các OP trên; những peptide này có từ sự thủy phân 1S -casein và  -casein và được gọi là “casoxin”, nó ảnh hưởng lên chất thụ cảm loại  và  , nhưng khả năng ức chế của chúng thì kém hơn naloxone. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 19 2.2.2.2 Tính chất Trong các exorphin thường có gốc tyrosine ở đầu N và có các gốc amino acid chứa vòng thơm (như tyrosine và phenylalanine) ở vị trí thứ 3 hoặc thứ 4 (đối với  -casein và 1 vài  -cn thì có 1 gốc arginine đứng trước tyrosine ở đầu N), cấu trúc này giúp cho peptide kết hợp tốt với các cơ quan thụ cảm (receptor). Ví dụ: -  -casomorphin: peptide đoạn 60-69 trong  -cn (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly- Pro-Ile-His-Asn-Ser-OH) kích thích cơ quan thụ cảm kiểu  ( -type receptor) (có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc, mất cảm giác đau, hạn chế vận động của ruột và hệ hô hấp). -  -casomorphin: peptide đoạn 90-96 trong 1S -cn (Arg-Tyr-Leu-Gly- Tyr-Leu-Glu-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu  (có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc và sự mất cảm giác đau). Ngoài ra còn có các đoạn khác như 90-95, 91-96. -  -lactorphin: đoạn 50-53 của  -LA (Tyr-Gly-Leu-Phe-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu  . Các OP này có tác dụng điều hòa các hành vi cư xử, làm gia tăng hiện tượng mất cảm giác đau, kéo dài thời gian vận chuyển của thức ăn trong ruột, gia tăng sự hấp thụ các amino acid, chất điện ly và nước; kích thích tiết insulin và somastotatin (Meisel 1997b; Xu 1998). -  -lactorphin: đoạn 102-105 của  -LG (Tyr-Leu-Leu-Phe-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu  . Tính chất tương tự  -lactorphin. - Casoxin: các đoạn peptide từ 25-34, 35-41, 57-60 và 58-61 của  -cn . Khi được đưa vào máu, những peptide này có thể đi tới não hay các cơ quan khác và thể hiện những tính chất tương tự như thuốc phiện hoặc morphine. Đó có thể là lý do khiến cho những đứa trẻ sơ sinh trở nên dễ ngủ sau khi uống sữa. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 20 Người ta đã làm thí nghiệm với các con bê sơ sinh cho thấy  - casomorphin được vận chuyển nguyên vẹn qua thành ruột vào máu, sau đó nó gây ảnh hưởng lên hệ thần kinh gây nên hiện tượng buồn ngủ và trầm tĩnh (Clare 2000). 2.2.3 Các peptide liên kết với khoáng Phospho trong sữa có khoảng 900mg/lít, có thể phân thành các loại:  Vô cơ: phosphate hòa tan và ở dạng dung dịch keo.  Hữu cơ: trong phospholipid, casein và đường phosphate, nucleotide. Casein chứa khoảng 0.85% phospho; trong đó 1S ,  và  -cn chứa tương ứng là 1.1, 0.6, 0.16% phospho. Nếu tính theo mol thì 1S , 2S ,  và  -cn chứa tương ứng 8(9), 10-13, 5(4), và 1(2,3) mol phospho trong 1 mol phân tử protein. Phospho có vai trò rất quan trọng trong sữa:  Về mặt dinh dưỡng, nó có thể kết hợp với các chất khoáng như Ca2+, Zn 2+…  Làm tăng tính hòa tan của casein.  Làm tăng tính bền nhiệt cho casein.  Có ảnh hưởng tới quá trình đông tụ để sản xuất phô mai. Ở đây chúng ta quan tâm đến khả năng liên kết với khoáng của phospho trong sữa. Phospho liên kết hóa trị với protein khá bền vững. Liên kết này chỉ bị phá vỡ khi có chế độ xử lý nhiệt cao, pH cao và sử dụng phosphatase. Phosphate chủ yếu tạo liên kết ester với serine (và một ít với threonine) tạo monoester: Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 21 Sự phosphoryl hóa xuất hiện trong màng membrane của thể Golgi của tế bào động vật hữu nhũ, được xúc tác bởi serine-specific casein kinase. Sau khi được giải phóng, những peptide được phosphoryl hóa này (casein phosphopeptide) liên kết với các ion, chủ yếu là Ca2+, một ít Zn 2+, Fe2+, Cu2+, Mn 2+. Từ thứ tự các amino acid trong phân tử protein (casein) và từ các thí nghiệm thực tế, người ta nhận thấy hầu hết CPP (calcium-binding phosphopeptides) có chứa 3 nhóm serine phosphate và theo sau bởi 2 gốc glutamic (Ser-Ser-Ser-Glu-Glu). CPP là 1 trong những chất bền vững nhất đối với sự thủy phân của enzyme trong ruột, và hầu hết nó được tìm thấy dưới dạng phức với canxi phosphate. Sự kết hợp với Ca2+ tạo nên khả năng hòa tan cao hơn và do đó Ca 2+ dễ dàng được hấp thu hơn. Từ đó, CPP có thể có tác dụng có ích cho việc giúp xương cứng chắc. Ngoài ra, CPP cũng giúp làm giảm hiện tượng sâu răng thông qua việc tái tạo canxi cho men răng và ức chế sự bám dính của các vi khuẩn hình thành bựa răng. Do có tính chất này, chúng được ứng dụng để điều trị các bệnh về răng và được cho vào trong kem đánh răng (Darragh 2002). 2.2.4 Các peptide ảnh hƣởng lên hệ miễn dịch của cơ thể Cho đến nay thì người ta vẫn chưa hiểu rõ ràng cơ chế làm cho các peptide có ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể (immunopeptide-IP). Một số peptide từ sữa có thể ảnh hưởng đến cả hệ miễn dịch và sự sinh sản của tế bào. Bảng 5. Một số peptide ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể có trong sữa Nguồn gốc Peptide  -cn Đoạn 191-193: Leu-Leu-Tyr-OH; đoạn 63-68: Pro-Gly-Pro-Ile-His (Pro)- Asn-OH, đoạn 193-209 Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 22 1S -cn Đoạn 194-199: Thr-Thr-Met-Pro- Leu-Trp-OH  -LG Đoạn 22-25: Leu-Ala-Met-Ala-OH; đoạn 25-40, 78-83, 92-100  -LA Đoạn 51-53: Gly-Leu-Phe-OH; đoạn 1-5, 61-68, 75-80, 17-31, 104-109, Ta nhận thấy trong các peptide này có chứa rất nhiều gốc amino acid không phân cực (ưa béo) như: Leu, Phe, Ala, Val, Pro,Trp, Ile. Các  -casokinin cũng có ảnh hưởng lên hệ miễn dịch (ngoài việc ức chế ACE). Năm 1989, Migliore-Samour và cộng sự đã phát hiện ra một số peptide có nguồn gốc từ protein hòa tan (whey) khả năng kích thích thực bào ở người và đại thực bào ở chuột bảo vệ cơ thể chuột chống lại việc nhiễm Klebsiella pneumoniae. Chuột sử dụng các peptide từ sữa lên men bởi Lactobacillus helveticus cho thấy rằng có sự gia tăng của IgA và giảm kích thước các khối u dưới da (Leblanc 2002). Kefir và tế bào tự do của nó (KF) có nhiều chất có thể phát huy tác dụng có lợi trên hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa một số loại ung thư. Quan sát cho thấy chuột nhận được 2 ngày cho ăn với chu kỳ toàn bộ kefir đã làm giảm tăng trưởng khối u, và cho ăn theo chu kỳ với KF cung cho thấy sự chậm trễ của sự phát triển ung thư. Số tế bào IgA + không biến đổi ở chuột được tiêm với một dòng tế bào khối u (khối u điều khiển) trong một nghiên cứu gần đây (Bảng 6). Hai ngày của chu kỳ chính của kefir hoặc KF gia tăng sản sinh các tế bào IgA + trong tuyến vú sau khi tiêm khối u. Sự tăng không được quan sát thấy ở các loài động vật được nuôi bằng sữa lên men mà không được tiêm khối u, chứng tỏ rằng việc tăng cường các tế bào IgA + trong tuyến vú cần một sự kích thích mạnh mẽ như những kích thích gây ra bởi các tế bào khối u. Vai trò sinh học của các tế bào IgA + đáp lại sự phát triển Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 23 khối u chưa được hiểu rõ. Nó đã được gợi ý rằng người ta có thể có thể ràng buộc độc chất chuyển hóa sản xuất trong khi khối u phát triển. Bảng 6. Ảnh hưởng của việc tiêm khối u, kefir và KF lên các tế bào IgA+, CD4+ và CD8+ tế bào lympho T ở tuyến vú Một số IP từ sữa cũng có khả năng làm giảm sự nhiễm trùng ở các bệnh nhân giai đoạn đầu của bệnh AIDS (Meisel, 1998). Gần đây người ta đã chứng minh được rằng trong quá trình thủy phân bởi các enzyme của hệ tiêu hóa, các IP được giải phóng từ whey protein isolate (Mercier và cộng sự 2004). GMP và một số peptide có từ nó đã được biết là có khả năng điều hòa hệ miễn dịch, ví dụ như nó điều hòa việc sản xuất ra kháng thể IgG (Monnai và cộng sự 1998; Manso & Lo pez-Fandino, 2004). Trong nhóm peptide này, ta có thể nói đến một số peptide có khả năng kháng khuẩn. Casecidin là một trong những peptide đầu thuộc loại này mà người Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 24 ta đã phát hiện được (có được khi cho thủy phân casein bởi chymosin ở pH trung tính, là thành phần của 1S -cn và  -cn, có phân tử lượng khoảng 4000-6000 Da). Peptide này có khả năng ức chế một số vi khuẩn Gram (+) như Staphylococcus, Sarcina, Bacillus subtilis, Diplococcuspneumoniae, và Streptococcus pyogenes [10]. Peptide casocidin-I (đoạn 165-203 của 2S -cn) có khả năng ức chế Staphylococcus carnosus và E.coli. Peptide isracidin (đoạn 1-23 của 1S -cn có được nhờ thủy phân bởi chymosin và chymotrypsin) có khả năng ức chế Staphylococcus aureus và Candida albicans. 3. HƢỚNG PHÁT TRIỂN Hóa học tổ hợp đã đóng góp rất nhiều cho vấn đề nghiên cứu các peptide có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên có một hạn chế rất lớn đối với những peptide có giá trị sinh học vì nhu cầu cuộc sống đòi hỏi một số lượng lớn. Và Primm đã giải quyết được vấn đề này: từ các peptide sinh học có nguồn gốc tự nhiên, bằng phương pháp sinh học và nhiều phương pháp khác, ông đã phát triển chúng với qui mô công nghiệp áp dụng trong các lĩnh vực như y dược, hóa học chuẩn đoán và thực phẩm nông nghiệp. Bằng cách đó, các peptide tiếp tục được cải tiến để đạt được những tính chất tốt nhất dùng để chữa bệnh. Lợi thế lớn khi dùng peptide cải tiến là do nó có giá trị sinh học rất cao và hạn chế được tính độc. Bên cạnh đó chi phí tổng hợp cũng thấp hơn. Primm đã đưa ra các bước lựa chọn như sau:  Phát hiện ra chuỗi nhỏ nhất gây ra ảnh hưởng sinh học bằng cách kiểm tra và tổng hợp từ đoạn bắt đầu của chuỗi peptide.  Phát hiện ra cấu hình hoạt động sinh học bằng cách xác định cấu tạo và cấu trúc hoạt động liên quan.  Sự sắp xếp của peptide chứa trong cấu hình đó bằng sự hỗ trợ của máy tính.  Tổng hợp hóa học Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 25  Định giá giá trị sinh học và dược lý, sau đó lập lại bước 3 – 5. Primm đã khai thác từ những hiểu biết về peptide hóa học hiện tại để phát triển, sản xuất và bán độc quyền những peptide được áp dụng trong nhiều lĩnh vực chữa bệnh như tìm được phân tử peptide mới dùng chữa bệnh HIV hay sự phát triển các chất đối kháng neurokinin… Hiện nay, người ta có thể thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học bằng nhiều phương pháp: thủy phân protein (dùng enzyme trực tiếp hoặc thông qua quá trình lên men của vi sinh vật), tổng hợp hóa học, kỹ thuật gen. Gần đây, những cơ sở dữ liệu về trình tự của các amino acid trong peptide có hoạt tính sinh học ngày càng được phát triển, từ đó ta có thể xác định những peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn trong protein. Ngoài ra, do chúng ta đã biết được vị trí thủy phân của các enzyme thủy phân protein như pepsin, trypsin, chymotrypsin, do đó sự giải phóng các peptidee có hoạt tính sinh học trong quá trình thủy phân nói chung và tiêu hóa nói riêng là có thể dự đoán được. 3.1 Phƣơng pháp tổng hợp peptide dùng enzyme Trong phương pháp này, người ta sử dụng enzyme protease làm xúc tác cho việc kết hợp các amino acid. Quá trình hình thành liên kết peptide nhờ xúc tác protease có thể được phân thành 2 loại dựa trên thành phần nhóm carboxyl được sử dụng:  Tổng hợp điều khiển cân bằng (equilibrium – controlled synthesis – ECS): nhóm carboxy tự do (ở trạng thái bình thường)  Tổng hợp điều khiển động học (kinetically – controlled synthesis – KCS): nhóm carboxy ở trạng thái được hoạt hóa, thông thường người ta sử dụng dạng alkyl ester. Về cơ bản, 2 phương pháp này khác nhau về năng lượng cần thiết để hình thành liên kết peptide. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 26 3.1.1 Tổng hợp điều khiển cân bằng Quá trình tổng hợp này ngược lại với quá trình thủy phân liên kết peptidee, do đó, tất cả protease đều có thể được sử dụng. Tuy nhiên nó có nhược điểm là cần lượng lớn enzyme và tốc độ phản ứng chậm. Trong quá trình thao tác thì cần phải điều chỉnh sao cho cân bằng dịch chuyển theo hướng tạo ra liên kết peptide. Ta có thể thêm dung môi hữu cơ (có thể hòa tan vào nước), tuy nhiên điều kiện này có thể làm giảm hoạt tính của enzyme. Khi hằng số điện môi của môi trường giảm thì nó làm giảm tính acid của nhóm carboxy và tính base của nhóm amino. ECS xảy ra theo chiều hướng tăng dần nồng độ sản phẩm theo thời gian rồi sau đó phản ứng đạt trạng thái cân bằng (như hình minh họa bên dưới). Hình 7. Quá trình tổng hợp peptide điều khiển cân bằng 3.1.2 Tổng hợp điều khiển động học So với ECS thì KCS cần ít enzyme hơn, thời gian để đạt được năng suất sản phẩm tối đa được rút ngắn hơn và năng suất sản phẩm phụ thuộc vào tính chất của enzyme được sử dụng và tính đặc hiệu của cơ chất. Trong khi ECS kết thúc ở trạng thái cân bằng thì đối với KCS, nồng độ của sản phẩm đạt đến cực đại rồi sau đó bị thủy phân dần. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 27 Hình 8. Quá trình tổng hợp peptidee điều khiển động học. Trong đó, R1-CO-X: nhóm carboxy được hoạt hóa Hình 9. Mô hình của quá trình tổng hợp peptidee điều khiển động học dùng xúc tác protease EH: enzyme tự do; Ac-X: chất cho nhóm acyl (nhóm carboxy được hoạt hóa); HX: nhóm bị loại đi; Ac-E: phức hợp acyl-enzyme; Ac-OH: sản phẩm thủy phân; HN: chất nhận nhóm acyl; Ac-N: sản phẩm peptide Hoạt tính amidase của hầu hết các protease thì thấp hơn hoạt tính esterase. Enzyme có tác dụng như chất vận chuyển nhóm acyl tới nhóm amino hình thành liên kết peptidee Ac-N, phản ứng này có sự cạnh tranh của nước. Tỷ lệ giữa tốc độ phản ứng tổng hợp liên kết peptidee và thủy phân nó thì có ý nghĩa quan trọng tới sự thành công của phương pháp này. Phương pháp này thường sử dụng serine và Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 28 cystein protease. Tuy nhiên, serine và cystein protease thì không phải là những acyltransferase hoàn hảo, những phản ứng không mong muốn có thể xảy ra do sự giới hạn của tính đặc hiệu của chúng. Một yếu tố quan trọng làm hạn chế ứng dụng của KCS là sự thủy phân của Ac-X ngay tại thời điểm bắt đầu phản ứng (như hình minh họa phía trên cho thấy) và sự thủy phân của peptide sản phẩm. Những phản ứng không mong muốn này có thể được hạn chế nhờ việc thực hiện một số biện pháp như: thay đổi môi trường phản ứng (làm giảm hàm lượng nước trong môi trường bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ), enzyme, cơ chất…. Khác với phương pháp tổng hợp hóa học, phương pháp tổng hợp sử dụng enzyme có thể bắt đầu từ đầu amino hoặc đầu carboxy bởi vì xúc tác enzyme tránh được hiện tượng racemic hóa. Ngoài ra, phương pháp này còn có một số ưu điểm như: không tốn nhiều thời gian; không có quá trình bảo vệ và khử các nhóm bảo vệ; giảm việc sử dụng các dung môi và các chất hóa học (gây độc); có thể tái sử dụng enzyme. Hiện nay, lượng peptide tạo sản xuất ra nhờ phương pháp này vẫn còn rất ít; hầu hết các peptidee được sản xuất nhờ phương pháp tổng hợp hóa học. Một vài di- và tripeptidee có thể được tổng hợp với quy mô lớn bằng phương pháp tổng hợp dùng enzyme, thậm chí là quá trình tổng hợp có thể được tiến hành liên tục. Các di- và tripeptide này được sử dụng làm chất trung gian trong quá trình sản xuất các loại dược phẩm. Ưng dụng trong công nghiệp của phương pháp ECS là việc tổng hợp Z-Asp-Phe-Ome là tiền chất của aspartame. 3.2 Phƣơng pháp tái tổ hợp gen DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài hoặc của các loài khác nhau. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 29 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:  Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho (ví dụ: tế bào của người) để cung cấp DNA.  Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn gọi là phân lập gen.  Bước 3: Cắt cả hai loại DNA ( DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng một loại enzym giới hạn (restriction enzym – RE).  Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi một loại enzym giới hạn như đã nêu trên.  Bước 5: Bổ xung enzym nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh.  Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E.coli) và nhân dòng.  Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy rừ tế bào cho. 3.3 Phƣơng pháp tổng hợp hóa học Liên kết peptide được hình thành từ sự kết hợp giữa nhóm carboxy của amino acid thứ nhất với nhóm amino của amino acid thứ hai và loại đi một phân tử nước. Sự hình thành liên kết peptidee dưới điều kiện ôn hòa chỉ có thể xảy ra khi nhóm carboxy của amino acid được hoạt hóa; đồng thời, amino acid còn lại tấn công vào nhóm carboxy này (theo cơ chế ái nhân) và từ đó hình thành dipeptide. Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 30 Khác với nhiều loại hợp chất hữu cơ khác, các phản ứng tổng hợp (điều chế) peptidee rất phức tạp. Không thể tổng hợp được peptidee mong muốn nhờ phản ứng trùng ngưng các phân tử aminoacid khác nhau vì sẽ tạo ra hỗn hợp các peptide. Ví dụ trường hợp đơn giản nhất là ngưng tụ 2 phân tử amino acid sẽ tạo ra tới 4 dipeptide: Gly + Ala 2H O Gly-Gly Gly + Ala 2H O Ala-Ala Gly + Ala 2H O Gly-Ala Gly + Ala 2H O Ala-Gly Do vậy để tổng hợp một peptide có trật tự xác định các đơn vị amino acid trong phân tử thì cần phải “bảo vệ” nhóm amino hay nhóm carboxyl nào đó khi không cần chúng tham gia phản ứng tạo ra liên kết peptide. Do đó, quá trình tổng hợp peptide thì cần phải trải qua 3 bước:  Bước 1: Bảo vệ nhóm amino hay carboxyl nào đó mà chúng không cần tham gia phản ứng tạo liên kết peptide.  Bước 2: Hình thành liên kết peptide. Gồm 2 bước nhỏ:  Amino acid mà có nhóm amino được bảo vệ phải được hoạt hóa nhóm carboxyl để có thể chuyển thành dạng trung gian có hoạt tính cao.  Hình thành liên kết peptide Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 31 (Hai bước nhỏ này có thể diễn ra liên tục hay tách rời thành 2 bước)  Bước 3: Tách rời các nhóm bảo vệ (một phần hoặc toàn bộ). Mặc dù cần phải tách các nhóm này sau khi toàn bộ chuỗi peptidee được hình thành, nhưng người ta thường tách chọn lọc trong quá trình tổng hợp để có thể tiếp tục quá trình trùng ngưng. Nhóm bảo vệ cần phải thỏa mãn một số tiêu chuẩn sau:  Dễ gắn vào phân tử amino acid  Bảo vệ được nhóm chức trong điều kiện hình thành các liên kết peptide  Trong quá trình thực hiện không xảy ra hiện tượng racemic hóa  Dễ loại ra mà không ảnh hưởng đến sự tồn tại của các liên kết peptide và các nhóm bảo vệ bán vĩnh viễn 4. ỨNG DỤNG VÀ MỘT SỐ SẢN PHẨM THƢƠNG MẠI 4.1 Ứng dụng 4.1.1 Dƣợc phẩm Do có những tính chất đặc biệt, ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể nên các peptide có hoạt tính sinh học có thể được ứng dụng trong dược phẩm và trong thực phẩm (thực phẩm chức năng). Nếu tính cả aspartame và peptide kháng sinh vào, thì peptide cũng chỉ chiếm khoảng 0.0025% (khối lượng) dược phẩm được sản xuất hàng năm, tuy nhiên nó vẫn đóng vai trò rất quan trọng trong việc điều trị bệnh. Liệu pháp chữa bệnh dùng peptide có một tiềm năng rất lớn, nó có thể ứng dụng trong các vấn đề: huyết áp, thần kinh, tăng trưởng, tiêu hóa, sinh sản, điều hòa sự trao đổi chất trong cơ thể…. Ví dụ : - Hormone tăng trưởng cho người (Human Growth Hormone –HGH) dùng chữa bệnh lùn do rối loạn tuyến yên. Trước kia, hormone này được lấy từ tuyến Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 32 yên của người chết, số lượng rất nhỏ, không đáp ứng đủ yêu cầu. Người ta đã tạo dòng cDNA HGH, gắn vào một protomer mạnh (giúp tăng cường biểu hiện gen) rồi đưa vào pBR322. Vectơ tái tổ hợp sau đó được đưa vào E.coli và HGH sẽ được thu nhận sau quá trình nuôi cấy vi khuẩn - Nhân tố VII của quá trình đông máu dùng cho các bệnh nhân bị chứng máu không đông. Hiện nay, nhiều loại tế bào động vật chuyển gen có mang gen mã hóa cho nhân tố VII được sử dụng để sản xuất nhân tố này. - tPA (tissue-type Plasminogen Activator): chất hoạt hóa Plasminogen theo loại mô, dùng trong điều trị chứng nghẽn mạch máu. Ngày nay, tPA được sản xuất bằng kỹ thuật sau: Gen tPA người được gắn vào promotor và các trình tự điều hòa biểu hiện gen của chuột; vectơ tái tổ hợp này được đưa vào phôi chuột, sau đó phôi chuột được cấy vào chuột cái tạo thành chuột chuyển gen (transgenic)có khả năng tiết tPA người qua sữa. Nhiều hormone và đặc biệt là các polypeptide dược phẩm có nhiều hơn 40 amino acid trong mạch có thể được sản xuất nhờ kỹ thuật tái tổ hợp. Insulin của người, hormone tăng trưởng cho người, corticotropin (ACTH), relaxin, somatostatin, renin, corticoliberin, atrial natriuretic peptide, β-endorphin, cholecystokinin, chorionic gonadotropin, và follicle-stimulating hormone là những ví dụ về peptide có thể được tổng hợp bằng kỹ thuật tái tổ hợp. Tuy nhiên, hiện nay chúng vẫn chưa được sản xuất thương mại. Insulin là một trong những dược phẩm sinh học đầu tiên, hiện nay nó được bán khoảng 2000 kg/năm. Insulin tái tổ hợp đầu tiên được tổng hợp bởi Eli Lilly (thuộc Huminsulin®) năm 1982. Riêng các peptide có hoạt tính sinh học từ sữa chỉ mới được sử dụng gần đây trong dược phẩm nhưng do khả năng có thể sản xuất ở quy mô lớn nên trong tương lai sẽ góp phần đáng kể trong thành phần dược phẩm. 4.1.2 Thực phẩm Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 33 Như đã nói, các peptide có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ thực phẩm (đặc biệt là sữa) cho thấy nhiều chức năng đáng chú ý như: làm giảm huyết áp, ảnh hưởng đến hệ thần kinh (làm giảm căng thẳng, dễ ngủ…), vận chuyển khoáng trong cơ thể, tăng cường hệ miễn dịch (chống vi sinh vật, chống ung thư…), chống đông máu…. Do những tính chất này mà người ta đã tiến hành sản xuất những thực phẩm giàu peptide có hoạt tính sinh học ở qui mô công nghiệp, ta có thể xem đây là những thực phẩm chức năng. Bảng 7. Một số sản phẩm từ sữa trên thị trường có các tính chất có lợi cho sức khỏe dựa vào tính chất của peptide có hoạt tính sinh học Tên sản phẩm Loại sản phẩm, cách thu nhận sản phẩm Peptide có hoạt tính sinh học Chức năng có lợi Nhà sản xuất Calpis Sữa chua Val-Pro-Pro, Ile-Pro- Pro, Có từ  -casein và  - casein Giảm huyết áp Calpis Co., Japan Evolus Sữa lên men uống giàu Ca. Lên men nhờ vi khuẩn L. helveticus Val-Pro-Pro, Ile-Pro- Pro, Có từ  -casein và  - casein Giảm huyết áp Valio Oy, Finland Biozate Sản phẩm thủy phân whey protein isolate Sử dụng enzyme thủy phâm Các đoạn của  - lactoglobulin Giảm huyết áp Davisco, USA BioPURE- GMP Whey protein isolate Có được từ Sản phẩm chứa tối thiểu 90%  -casein (đoạn 106-109) (glycomacropeptide) Ngừa sâu răng, ảnh hưởng tới sự đông Davisco, USA Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 34 whey trong quá trình sản xuất phô mai. máu, bảo vệ cơ thể khỏi virus và vi khuẩn PRODIET F200/Lactium Sữa uống, vi bao 1S -casein f (91–100) (Tyr- Leu-Gly Tyr-Leu-Glu- Gln- Leu-Leu-Arg) Giảm stress Ingredia, France Festivo Phômai cứng ít béo 1S -casein đoạn (1–9), 1S -casein đoạn (1–7), 1S -casein đoạn (1–6) Chưa công bố MTT Agrifood Research Finland Cysteine Peptide Sản phẩm thủy phân và các thành phần của sữa. Peptide từ protein sữa Giúp dễ ngủ Tăng cường sự tiết glutathione DMV International, the Netherlands C12 Sản phẩm thủy phân và các thành phần Peptide từ casein Giảm huyết áp DMV International, the Netherlands Capolac Thành phần của sữa. Sữa gầy  siêu lọc  kết tủa  lọc  cô đặc  sấy phun  đóng gói. Caseinophosphopeptide Tăng hấp thu khoáng Arla Foods Ingredients, Sweden PeptoPro Sản phẩm thủy Peptide từ casein Cơ bắp DMV Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 35 phân và các thành phần nhanh chóng phục hồi khỏi mệt mỏi International, the Netherlands Vivinal Alpha Sản phẩm thủy phân và các thành phần Peptide từ huyết thanh sữa Dễ ngủ, thư giãn. Borculo Domo Ingredients (BDI), the Netherlands 4.2 Một số sản phẩm thƣơng mại Hình 10. Sản phẩm sữa lên men chứa peptide có hoạt tính sinh học của Evolus®. Hình 11. Sản phẩm nước giải khát PeptoPro® Sản phẩm này chứa các di-, tripeptide có nguồn gốc từ casein sữa, có khả năng làm tăng lượng insulin Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 36 Hình 12. Sản phẩm có bổ sung LactiumTM Sản phẩm lactiumTM được bổ sung vào một số thực phẩm như chocolate, nước giải khát, sữa, bánh… sản phẩm này có khả năng làm giảm stress, giúp dễ ngủ. 4.3 Một số ứng dụng khác Dựa vào khả năng liên kết với khoáng của peptide, người ta đã cho vào trong kem đánh răng và chewing gum, nó có tác dụng làm chắc răng, chống sâu răng Hình 13. Sản phẩm chewing gum ngừa sâu răng. Hình trên là ví dụ về loại sản phẩm này. Thành phần của sản phẩm chewing gum Recaldent: Maltitol (495), Hydrogenated corn syrup, Cpp-ACP (Casein Phosphopeptide-Amorphous Calcium Phosphate), Xylitol (967), Aspartame L- Phenylalanine compounds (967), Gum Base, Gum arabic, Chất tạo mùi, Mannitol (421), Vegetable wax, Lecithin (322), Milk Casein Derived Lactose Free. Trong thành phần này có peptide liên kết với Ca có nguồn gốc từ casein sữa Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 37 Hình 14. Sản phẩm kem đánh răng Sản phẩm này (của Recaldent) có thành phần như sau: nước, Glycerol, Cpp-ACP, D-sorbitol, Silicon dioxide, CMC-Na, Propylene glycol, Titanium dioxide, Xylitol, Phosphoric acid, Guar gum, Zinc oxide, Sodium saccharin, Ethyl p-hydroxybenzoate, Magnesium oxide, Butyl p-hydroxybenzoate, Propyl p- hydroxybenzoate. Ứng dụng khả năng kháng khuẩn của một số peptide, người ta đưa peptide này vào trong nước súc miệng.