Đề tài Sản xuất phân vi sinh cố định đạm

hất mang than bùn mới được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 doanh đã tham gia nghiên cứu lĩnh vực này. Việt Nam và nước ngoài cho thấy, phân bón hữu cơ vi sinh có tác dụng tốt đến sự sinh trưởng, phát triển, năng suất cây trồng, giảm giá thành nâng cao hiệu quả trồng trọt và cải tạo môi trường đất canh tác. Chính phủ Việt Nam đã sớm nhận thấy được vai trò của phân bón vi sinh, vì vậy từ năm 1994, Thủ tướng Chính phủ đã ra Chỉ thị số: 644/TTg ngày 05 tháng 11 năm 1994 chỉ đạo việc quản lý: sản xuất, kinh doanh và chất lượng phân bón vi sinh, trong đó đã nhấn mạnh:” Để tiến đến một nền nông nghiệp sạch, giữ cho đất màu mỡ cần sử dụng hợp lý các loại phân và thuốc trừ sâu hóa học dựa trên nguồn tài nguyên dồi giàu về than bùn và photphosrit ở nước ta cần khuyến khích sử dụng các nguyên liệu này làm chất nền và chất phụ gia để sản xuất phân bón vi sinh, chế phẩm vi sinh, dùng chúng để thay thế dần các loại phân hóa học trong nông nghiệp theo xu hướng chung của thế giới” 3.3 Thành phần các vi sinh vật cố định đạm: Vi sinh vật cố định đạm được chia làm 2 nhóm: Vi khuẩn cộng sinh: chủ yếu thuộc về vi khuẩn nốt sần Rhizobium Vi khuẩn tự do: Azotobacter, Azospirillum 3.3.1 Vi khuẩn cộng sinh Rhizobium: v Đặc điểm: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 19 Năm 1886, Beijerinck đã phân lập đuợc chủng vi khuẩn nốt sần rễ đậu từ rễ của một số cây đậu. Thuộc loại hiếu khí không bào tử. Hình dạng: là giống vi khuẩn nốt sần của cây họ đậu có hình dạng và kích thước thay đổi phụ thuộc vào giai đoạn phát triển. Khi vi khuẩn còn non, tế bào có dạng hình que ngắn , chuyển động được Khi vi khuẩn già, tế bào có kích thước lớn, không chuyển động và phân nhánh, được gọi là thể giả khuẩn. Giai đoạn này thường trùng với giai đoạn ra hoa của thực vật, lúc đó cường độ cố định đạm của chúng cũng là cực đại. Có loại đơn mao, có loại chu mao cũng có loại tiêm mao mọc thành chùm ở đầu Khuẩn lạc: Trên môi trường đặc tạo khuẩn lạc trơn bóng , nhày, vô màu. Chất nhày là một polysaccharide cấu tạo bởi hexose, pentose và acid uronic v Phân loại Rhizobium có những loài quan trọng như: - R. phaseoli (ở đậu nành, đậu tây, đậu ngựa) - R. leguminosarum (đậu Hà Lan) - R. trifolli (cỏ ba lá) Trong đó có một số chủng mọc chậm không làm acid hoá môi trường nuôi cấy ( như R. phaseoli) và các chủng mọc nhanh làm acid hoá môi trường nuôi cấy ( như R. leguminosarum). v Định hoạt tính và khả năng cố định đạm: Ta có thể tính và định lượng Enzyme Nitrogenase thông qua sắc ký với enzyme chuẩn có hàm lượng nhất định. Nếu thấy xuất hiện những vạch tương đương với enzyme chuẩn thì xác định chúng có Enzyme Nitrogenase hay có khả năng cố định đạm. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 20 Nuôi cấy Rhizobium trên môi trường Dobereiner và sử dụng để định đạm tổng số với đối chứng (môi trường không nuôi cấy) nếu có sự gia tăng hàm lượng đạm chứng tỏ chúng có khả năng cố định đạm. 3.3.2 Vi khuẩn tự do: Azotobacter, Azospirillum 3.3.2.1 Vi khuẩn tự do: Azotobacter: v Đặc điểm: Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, gram âm nhạy cảm với độ ẩm của đất và hàm lượng các nguyên tố khoáng trong đất; P, K, Mo, B. nếu đảm bảo điều kiện hiếu khí tốt thì chủng Azotobacter có thể cố định đạm từ 10- 30mg N, khi sử dụng 4g đường, ở nhiệt độ, thích hợp 25- 30oc, pH 7,2-8,2. Trong môi trường axit không có hoặc có ít Azotobacter. v Phân loại: Azotobacter phổ biến nhất là ba loài dưới đây: Azo.chroococum: khi tế bào còn non có hình que, chuyển động được, kích thướt tế bào từ 3-7micromet. Khi tế bào già thì có hình cầu, tế bào xếp thành từng đôi hay hình khối có vỏ nhày. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn lạc nhày không có màu hoặc màu nâu Azo.agile: dạng hình cầu hoặc oval có kích thướt từ 3- 5 micromet đứng riêng lẻ hoặc kết đôi, khuẩn lạc nhẵn, tiết sắc tố vàng hay lục vào môi trường Azo.vinelandii: trong môi trường mới cấy có hình que, kích thướt tế bào từ 2-3 micromet. Khi tế bào già thì có hình cầu, bào tương rất đậm khuẩn lạc nhẵn, trong suốt thường không có màng nhày. Chúng thường tiết sắc tố huỳnh quang vào môi trường Do Azotobacter có màng lipoprotein bên ngoài là những emzym hô hấp hoạt động sử dụng oxi để hình thành ATP và làm cho oxi không thấm vào trong màng, nơi có nitrogennase tiến hành cố định đạm ở điều kiện kỵ khí NH3 được hình thành đến một mức độ nào đó sẽ kiềm hãm nitrogenase, nó chính là hoạt tính điều hòa nitrogenase. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 21 v Định tính và khả năng cố định đạm Định tính: khuẩn lạc Azotobacter lồi, đàn hồi, hơi nhày, khi còn non có màu trắng dần về già có màu nâu sẫm. Quan sát thấy những khuẩn lạc có đặc tính như trên đem nhuộm nang bằng cách nuôi trên môi trường Ashby. Sau 2 tuần tiến hành nhuộm nang, nhuộm đơn để quan sát sự tạo nang. Sau khi xác định được sơ bộ những khuẩn lạc Azotobacter đem xác định hoạt tính cố định đạm. Xác định khả năng cố định đạm bằng phương pháp đạm tổng số. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong các bình chứa 100 ml môi trường Ashby vô đạm. Sau 7 ngày lấy 10 ml dịch nuôi cấy đem vô cơ hoá và xác định đạm tổng -> xác định được lượng đạm cố định được trong 7 ngày nuôi cấy ở Azotobacter. Chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm mạnh mẽ nhất. 3.3.2.1 Vi khuẩn tự do Azospirillum Hiện nay chủng này đang được chú ý nhiều vì chúng có những đặc điểm sau: Ngoài khả năng cố định đạm khi ở trạng thái cộng sinh thì còn tồn ở trạng thái tự do Có thể cộng sinh với nhiều loài thực vật khác nhau không chỉ riêng ở cây họ đậu. Kích thích hấp thu dinh dưỡng khoáng của thực vật như NO3-, PO43-, K, Fe Sản sinh một số hormone ngoại tiết có khả năng điều hoà sinh trưởng thực vật như IAA (Indole-3-acetic acid), ILA (Indole-lactic acid) v Đặc điểm: Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Spirillaceae, di chuyển mạnh. Tế bào có dạng xoắn từ nữa vòng đến vài vòng. Khuẩn lạc phát triển một loại KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 22 sắc tố màu hồng trên môi trường có bổ sung đỏ cong-go còn các vi sinh vật đất khác không có khả năng này. Bề mặt khuẩn lạc rắn và khô sau vài ngày trong tủ ấm Trong môi trường bán lỏng, Azospirillum hình thành một lớp váng mỏng màu trắng bên dưới bề mặt thoáng của môi trường 2-4mm (đây là đặc điểm đặc trưng nhất của loài này). Tế bào khuẩn Azospirillum thuộc loại đơn mao và cũng có chủng thuộc đa mao. v Phân loại: Đến nay chưa có sự phân loại nào rõ ràng đối với Azospirillum. Theo Sampaio và cộng sự của ông (1978), dựa theo các đặc điểm sinh lý đã chi thành 3 nhóm: - Nhóm 1: Có khả năng khử nitrat và tạo ra thể khí từ nitrat amon, không cần Biotin trong sinh trưởng và cố định đạm, không sử dụng được glucose. Hoạt tính Catalase dương. Chịu được các loại kháng sinh như: streptomicine, Tetraciline, Genlamicine, Cloramphenicol - Nhóm 2: Bao gồm những chủng không cần nitrat nhưng cần Biotin để phát triển trên môi trường có N2 và NH4. Phát triển trên môi trường có Glucose. Hoạt tính Catalase dương. Mẫn cảm với các lại kháng sinh ở nhóm 1. - Nhóm 3: Giống nhóm 1 nhưng có khả năng khử Nitrat cao hơn và rất nhạy với Tetraciline. Theo bảng phân loại của Bergey, Azospirillum được chia thành 5 nhóm: · Azospirillum lipoferum: Được mô tả chi tiết đầu tiên bởi Tarrand. Khuẩn lạc màu hồng, gồ cao, có rìa. Khi nuôi cấy trên môi trường khoai tây, tế bào có kích thước trung bình 1.3-5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 23 µm. Azospirillum lipoferum có hình xoắn, di động bằng đơn mao, có khả năng sử dụng glucose, α-cetoglutamate, citrate làm nguồn C khi nuôi cấy trên môi trường vô đạm, không sử dung được nguồn C là saccharose, cần Biotin cho sự phát triển. Tế bào trở nên dạng đa hình khi ở môi trường kiềm. · Azospirillum brasilense: Có đặc điểm hình thái giống Azospirillum lipoferum, không có khả năng sử dụng glucose, saccharose, α-cetoglutamate, có khả năng sử dụng nguồn C từ citrate trên môi trường vô đạm. Tế bào không hình thành dạng đa hình trên môi trường kiềm. · Azospirillum irakense: Tế bào có chiều rộng 0.6-0.9µm có khả năng sử dụng glucose, saccharose. Trên môi trường dịch thể không sử dụng được myo-inosytol, có khả năng phân giải pectin, phát triển trên môi trường có áp suất thẩm thấu cao. · Azospirillum halopraeferense: Tế bào có chiều rộng 0.7-1.4µm, có khả năng sử dụng α-cetoglutamate làm nguồn C. Trên môi trường vô đạm không sử dụng được glucose, saccharose, cần biotin cho sự phát triển trên môi trường có áp suất thẩm thấu cao. · Azospirillum amzonense: Khuẩn lạc màu trắng, lớn 5µm, gồ cao, nhẵn. Tế bào có chiều rộng 0.8- 1µm, có khả năng sử dụng glucose saccharose trên môi trường vô đạm. v Định hoạt tính và khả năng cố định đạm: Ta có thể tính và định lượng Enzyme Nitrogenase thông qua sắc ký với enzyme chuẩn có hàm lượng nhất định. Nếu thấy xuất hiện những vạch tương đương với enzyme chuẩn thì xác định chúng có Enzyme Nitrogenase hay có khả năng cố định đạm. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 24 Nuôi cấy Azospirillum trên môi trường Dobereiner và sử dụng để định đạm tổng số với đối chứng (môi trường không nuôi cấy) nếu có sự gia tăng hàm lượng đạm chứng tỏ chúng có khả năng cố định đạm. CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP, GIỮ GIỐNG VÀ NHÂN SINH KHỐI 4.1 Phân lập 4.1.1 Phân lập sơ bộ 4.1.1.1 Vi khuẩn cộng sinh Rhizobium: Nguồn phân lập: các cây họ đậu như đậu nành, đậu xanh, Đối tượng phân lập : Rhizobium Môi trường phân lập: Môi trường Fred: - Mannit 10g - K2HPO4 0.5g - NaCl 0.2g - MgSO4 0.2g - CaCO3 0.3g - Nước nấm men 10%/100ml - Tím kết tinh 0.01g - (có thể dùng đỏ congo 1/400: 10ml) - Agar 20g - Nước 900ml v Quá trình tiến hành: Chọn nốt sần lớn, màu hồng, nằm trên rễ chính của cây họ đậu vào giai đoạn bắt đầu ra hoa, rửa sạch cả chùm rễ nhiều lần. Sau đó dùng dao cắt lấy các nốt sần ra khỏi rễ (Lưu ý : Phải cách nốt sần ra xa một chút) Gắp nốt sần vào becher đựng HgCl 0.1% và ngâm 1-5 phút, sau đó dùng cồn rửa sạch và rửa lại nhiều lần với nuớc cất KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 25 Nghiền nát nốt sần trong cối Lấy phần dịch tách ra từ nốt sần pha loãng với nước cất vô trùng Cấy dịch pha loãng này vào môi trường Fred Ủ ở 24 – 26oC trong 3 –4 ngày Chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, trơn bóng , không màu, khi quan sát dưới kính hiển vi có các tế bào phân nhánh chứa nhiều glycogen và volutin Nhân giống qua nhiều giai đoạn trung gian để thu được sinh khối , sử dụng để bổ sung vào các chế phẩm nitragin 4.1.1.2 Vi khuẩn Azotobacter: Môi trường phân lập: môi trường Ashby, trong môi trường này một số vi khuẩn khác cũng phát triển được như Baccillus oligonitrophilus, B. muciliginosus sống ký sinh trên khuẩn lạc của Azotobacter. Vì thế ta có thể thay thế đường bằng Natri benzoate (0,15%) Môi trường Ashby: - Manit 20 g ( benzoate natri 0,15%) - K2HPO4 0,2 g - MgSO4 0,2 g - NaCl 0,2 g - K2SO4 0,2 g - CaCO3 5 g - Thạch 20 g - Nước vô đạm 1000 ml Môi trường nhân giống: nước chiết đậu tương 10% có bổ sung thêm các chất vi lượng, đường 1%. v Quá trình tiến hành: Lấy một muỗng cà phê đất nghiền nhỏ, pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Cấy các nồng độ khác nhau trên các đĩa petri có chứa môi trường riêng rẽ. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 26 Nuôi chúng trong tủ ấm ở nhiệt độ 25-30oC từ 4-5 ngày. Lấy mẫu ra quan sát có thể thấy những khuẩn lạc nhầy, đó là Azotobacter ( thời gian ủ có thể lâu hơn cần cho sự tạo bào nang). 4.1.1.3 Vi khuẩn tự do: Azospirillum Nguồn phân lập: đất trồng hoặc rễ lúa bắp, mía Môi trường tăng sinh: Bán rắn NFb (Nitro free base, môi trường cơ bản không chứa N) Môi trường phân lập: trong quá trình nuôi cấy ta dùng các môi trường: NFb bán rắn và rắn, môi trường thu sinh khối (Dobereiner và cộng sự). Nguyên tắc: dựa vào đặc tính khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu hồng khi bổ sung màu đỏ cong-go vào môi trường. v Quá trình tiến hành: Cân khoảng 10g đất cho vào erlen chứa 100 ml nước cất, lắc 2h, để lắng 15 phút, hút 1ml dịch nỗi bên trên cho vào 50 ml môi trường NFb bán rắn, ủ khoảng 5 – 7 ngày. Sau 5 – 7 ngày, lấy ra quan sát thì thấy có váng trắng nỗi lên sát bề mặt môi trường. Dùng que cấy lấy một ít tế bào từ váng này cấy lên đĩa Petri chứa môi trường NFb có bổ sung 15% đỏ cong-go. Ủ các đĩa Petri này ở 30 35oC, từ 3 – 5 ngày để các khuẩn lạc này mọc riêng lẻ. Nhận diện sơ bộ các lạc khuẩn Azospirillum. Sau khi ủ 3 – 5 ngày, lấy các đĩa Petri quan sát có các khuẩn lạc màu trắng, có số màu đỏ. Khuẩn lạc Azospirillum thường có màu đỏ. Nguồn phân lập: đất trồng hay đất ở ao hồ. Môi trường tích lũy: Augier Thành phần của môi trường Augier: Dung dịch Vinogradaski: 1000 ml Thành phần dung dịch Vinogradaski: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 27 - K2HPO4 0,5 g - MgSO 0,5 g - FeSO4 0,05 g - MnSO4 0,05 g - Nước cất 1000 ml - Manit: 10 g - Nước chiết đất: 10 ml Lấy 500g đất đã làm khô + 100 ml NaCO3 0,1% hấp ở 80oC /1h -> lọc bằng giấy lọc -> lấy dịch và thêm nước 1000 ml. Hỗn hợp nguyên tố vi lượng: 1ml Hỗn hợp này có thành phần như sau: - K2HPO4 0,5 g - NaB4O4 0,2 g - CoSO4 0,1 g - CuSO4 0,1 g - CdSO4 0,1 g - KI 0,1 g - NaB2 0,1 g - ZnSO4 0,05 g - Nước cất 1000 ml - Thạch: 20 g 4.1.2. Phân lập thuần khiết: 4.1.2.1 Vi khuẩn rhizobium v Làm thuần: Tách 1 tế bào riêng lẽ pha loãng trong nước cất vô trùng, trải trên mặt thạch đến khi quan sát được dang khuân lạc có màu sắc và kích thước tương đối giống nhau KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 28 v Kiểm tra: Nhuộm đơn để xem hình dạng Nhuộm Gram 4.1.2.2 Vi khuẩn azotobacter: Huyền phù hóa tế bào vi khuẩn vào nước muối sinh lý vô trùng, sau đó pha loãng dịch huyền phù đến 104- 105 lần và trải trên các petri có môi trường nuôi cấy khô mặt thạch, gạt đều, ủ ở 28-30oC trong 4-7 ngày. Sau khi ủ chọn các đĩa petri có ít hơn 10 khuẩn lạc, thuần nhất và đem quan sát dưới kính hiển vi bằng cách nhuộm đơn xem giống thuần chưa. Ta thực hiện thêm 2-3 lần nữa cho đến khi nào được giống thuần thì ngưng ( thoả mãn những trạng thái ban đầu và đồng nhất). 4.1.2.3 Vi khuẩn azospirillum: Giống vi sinh vật thuần khiết là giống được tạo thành từ một tế bào, một bào tử hay một khuẩn ty duy nhất. Vì Azospirillum không có khả năng tạo bào tử nên để thuần khiết chúng, bắt đầu từ một tế bào, chọn khuẩn lạc riêng lẻ trong huyền phù nước cất vô trùng, pha loãng với nhiều nồng độ khác nhau. Mỗi nồng độ quan sát dưới kính hiển vi có số tế bào ít (khoảng 10 tế bào). Trãi trên đĩa Petri và quan sát độ thuần nhất của lạc khuẩn. v Kiểm tra độ thuần: Trích khuẩn lạc đặc trưng đã chọn, pha loãng và trãi trên môi trường đỏ cong-go. Nhận định sơ bộ là sự đồng nhất về hình dáng va màu sắc lạc khuẩn. Tiến hành kiểm tra hiển vi bằng cách quan sát hình dạng và nhuộn Gram. Tiến hành kiểm tra các đặc tính về hình thái, sinh lý, sinh hóa của giống. Nếu thỏa mãn mọi điều kiện trên thì ta tiến hành cấy chuyền để giữ giống. 4.2 Phương pháp giữ giống: 4.2.1 Vi khuẩn Rhizobium: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 29 Do Rhizobium có khả năng sống trong điều kiện thoáng khí thấp nên có thể bảo quản chúng trong thạch dưới lớp dầu khoáng. Dưới lớp dầu khoáng, chủng vẫn có thể phát triển được ở tốc độ chậm, do oxi vẫn khuếch tán ít qua lớp dầu khoáng. Khi cấy giống hây cấy chuyền, ta có thể dùng que cấy cắm xuyên qua lớp dầu khoáng để lấy sinh khối mà không làm hư điều kiện bảo quản. 4.2.2 Vi khuẩn Azotobacter Vì chủng không tạo được bào tử nên không thể sử dụng được phương pháp cát còn phương pháp dưới lớp dầu khoáng thì lâu và không thuận tiện nên phương pháp bảo quản tốt nhất là đông lạnh và đông khô. Phương pháp này dựa trên cơ sở ức chế vi sinh vật để giữ các chủng trong thời gian dài. Sự phân chia tế bào không xảy ra trong điều kiện đông lạnh hay tốt hơn là đông lạnh kết hợp với sấy khô. v Phương pháp đông lạnh: Nhũ tương hoá vi sinh vật: các chất nhũ hoá là dung dịch glycerol 15% trong nước + huyết thanh ngựa + dung dịch saccarose 10% với gelatin 1%, pH 6,7-7,0 hoặc các dung dịch chứa glucose, lactose và 10-15% sữa. Cho 1-2% nhũ dịch vào ống nghiệm để bảo quản lạnh, khi làm lạnh đến âm 20-25oC hoặc thấp hơn, phải giữ tốc độ làm lạnh không qua 1-2oC /phút. Giữa các ống đông lạnh cần phải qui định thời gian cấy truyền. Bảng 4.1 Nhiệt độ và thời gian giữ giống Nhiệt độ ( oC) Thời gian giữ giống -30 6-9 tháng -40 1 năm KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 30 -50 ÷-60 3 năm -70 ÷ -80 10 năm Khi làm tan băng cần thực hiện nhanh chóng bằng cách đặt một ống nghiệm vào nồi cách thủy 37oC, không nên thực hiện nhiều lần sẽ làm giảm sức sống của chủng. v Phương pháp đông khô: Làm tan băng phần nước có trong mô trường, nhũ hoá trong điều kiện chân không. Những nguyên liệu đông lạnh: giống đông khô dễ dàng cấy truyền trong khi bảo quản, sự biến tính protein của tế bào sinh vật và sự phá huỷ hệ thống enzyme là rất ít vì quá trình làm khô rất nhanh. Nồng độ muối và các chất hoà tan khác được nhũ hoá và sơ bộ làm đông khô cần phải: Bảo đảm đông lạnh cho môi trường khi đông khô là 1 khối đặc Có chất bảo vệ cho giống khỏi bị khô quá mức (< 1%) Có chất trung hoà nhóm -COOH Chất nhũ hoá có thể dùng môi trường Mist- Desscans huyết thanh ngựa 10%, saccarose và gelatin 1% hoặc môi trường có pepton, acid amincũng như chất bảo vệ chống khô quá mức saccharose, glucose. Chủng đông khô là chủng trưởng thành nhưng không già, nhiệt độ lạnh tức thì từ 10-20oC thời gian 1-3 phút, sau đó có thể tăng đến 10oC /phút. Khi làm khô cần giữ của nguyên nhiệt độ âm 30- 40oC. Chú ý: không thể tan băng khi sấy khô. Phục hồi giống: giống bảo quản trong ống đông khô, mỗi lần đập ống phải giữ hoạt tính, giữ ở tủ lạnh 1-5oC để sử dụng dần trong sản xuất. 4.2.3 Vi khuẩn azospirillum: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 31 Đối với Azospirillum ta tiến hành bảo quản như sau: Bảo quản trên thạch dưới lớp dầu khoáng, do Azospirillum có khả năng sinh sống trong điều kiện không khí thấp, chủng trong giai đoạn log phase dễ bảo đảm đặc tính giống. Sử dụng môi trường phù hợp để nuôi cấy chủng sau đó phủ lên bề mặt một lớp dầu khoáng, bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4-70C Dưới lớp dầu khoáng, chủng vẫn có thể phát triển được ở tốc độ chậm, do oxi vẫn khuếch tán ít qua lớp dầu khoáng. Khi cấy giống hây cấy chuyền, ta có thể dùng que cấy cắm xuyên qua lớp dầu khoáng để lấy sinh khối mà không làm hư điều kiện bảo quản Cấy chuyền trong 12 tháng 4.3 Cơ chế cố định Nitơ 4.3.1 Cơ chế cố định Nitơ phân tử Quá trình cố định nit ơ là quá trình khử N2 thành NH3 nhờ enzyme nitrogennase với sự có mặt của ATP (adenozin triphotphat) N2+ AH2 + ATP -> NH3 + A + ADP + P (AH2 là chất cho e) ADP: adenozin photphat. ATP cấu tạo thành 3 nhóm base nitro adenine, đường ribose và 3 nhóm phosphate Bằng phương pháp sắc ký trên máy ICC “120” BIP (Pháp) với coat sắc ký poropak, ta nhận được và xác định được cường độ cố định nit ơ phân tử theo hoạt tính của nitrogenase Sau một thời gian nghiên cứu các nhà khoa học dần hoàn thiện cơ chế cố định nit ơ phân tử. Theo cơ chế mới nhất (1992) thì quá trình cố định nit ơ phân tử được chia theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con đường oxi hóa. Con đường khử theo chuỗi tiến hóa: N2 → HN=NH → H2N - NH2 → NH3 → NH4OH N2 + 6e- +12ATP + 12H2O nitrogenase, Mg2+ 2NH4+ + 12ADP +12P + 4H+ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 32 Nitrogenase là một phức gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe(nitrogense, MW 220.000) liên kết với 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 64.000) Fe phân tử có khối lượng phân tử khoảng 6.104 Mo- Fe- protein có khối lượng phân tử khoảng 2,2.105 Mo- Fe- protein chứa 2 nguyên tử Mo (molipden) và 28- 32 nguyên tử Fe và 25- 30 nguyên tử sắt không bền với axit Fe và Mo của protein Mo-Fe được chứa bên trong cột cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N2 diễn ra cofactor này 4.3.2 Quá trình khử Trước hết protein Fe được khử bởi ferredoxin sau đó liên kết với ATP làm thay dổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này(từ 100mV- 400mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thủy phân khi diễn ra sự chuyển electron này. Cuối cùng protein MoFe khử chuyển các electron tới nitrogen nguyên tử Electron của các chất khử (ferredoxin,ditionit) đi vào trung tâm có chứa Fe của thành phần II(protein- Fe) và tiếp tục chuyển thành phần enzyme (protein- Mo- Fe) Electron đã hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo, ở bên trong “hạt”, Mo sẽ bị khử, nhờ đó có khả năng phản ứng nhanh với N2 Phân tử N2 đi qua khe có kích thướt khoảng 4- 5Ao, tức là tương đương với chiều dài phân tử N2 vào bên trong enzyme và được hoạt hóa ở đây Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nit ơ sẽ làm đứt hai dây nối trong số day nối cực phân tử N2 năng lượng tiêu phí là 7,8.105 J/mol. Day nối thứ 3 sẽ bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydro đã được hoạt hóa nhờ các enzyme dihydrogenase và hệ thống hydrogenase. Sau đó NH3 hoặc sản phẩm khử sinh ra sẽ liên kết axit để tạo thành axit amin v Con đường oxi hóa: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 33 N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH Qua hai hướng đó người ta thu được kết quả sau: Nếu nồng độ oxi nhiều sẽ ức chế quá trình tạo nit ơ phân tử Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn vi sinh vật hiếu khí Tìm thấy hợp chất loại khử khi nuôi các vi sinh vật cố định nit ơ phân tử Qua đó cho ta thấy con đường khử có nhiều khả năng hơn Cơ chế cố định nito nhờ vi khuẩn nốt sần Vi khuẩn nốt sần khi gặp cây họ đậu thích hợp nó sẽ xâm nhập vào tế bào rễ, kích thích rễ tạo thành nốt rễ, nốt rễ thường bằng hạt gạo, trong nốt rễ chứa đầy vi khuẩn sau khi làm thành một thể cộng sinh có lợi cho hai bên. Ngoài các cây họ đậu các cây khác cũng có thể cộng sinh với vi khuẩn cố định nit ơ Vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua lông hút đôi khi thông qua vết thương. Một số cây họ đậu tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích thích những vi khuẩn tương ứng với mình phát triển mạnh hơn (để có thể nhiễm vào thực vật, vi khuẩn phải đạt mật độ tế bào 104/gram đất). Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn nốt sần, cây họ đậu tiết ra enzyme polygalacturonase làm phá vỡ thành lông hút,giúp cho vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào rễ. Ơû trong lông hút, vi khuẩn nốt sần sẽ tạo thành ”dây xâm nhập” đó là một khối chất nhày dạng sợi bên trong chứa đầy vi khuẩn hình que,”dây xâm nhập” tiếp tục đi vào bên trong với tốc độ 5- 8 micromet/s. Sự vận động của” dây xâm nhập” được thực hiện với áp lực sinh ra do sự phát triển của vi khuẩn nốt sần bên trong. Vi khuẩn sau khi tiếp xúc với thực vật tạo thành dây xâm nhập đi dần vào bên trong của rễ và xâm nhập vào nhu cầu kích thích của tế bào thực vật bị phân chia chuyển thành thể giả khuẩn. Giả khuẩn không phân chia được nhưng phát mạnh tăng nhiều ribosome, nốt sần xuất hiện. 4.4 Phân loại phân vi sinh cố định đạm KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 34 Phân bón vi sinh cố định đạm được chia thành nhiều loại khác nhau, tùy theo công nghệ sản xuất, tính năng, tác dụng của vi sinh vật chứa trong phân bón hoặc thành phần các chất tạo ra phân bón. Một số cách phân loại phân bón vi sinh như sau: phân loại theo công nghệ sản xuất Tùy theo công nghệ sản xuất người ta chia phân vi sinh thành hai loại khác nhau: + Phân vi sinh trên nền chất mang khử trùng có mật độ vi sinh vật hữu ích >109 vi sinh vật/g(ml) và mật độ vi sinh tạp nhiễm thấp hơn 1/1000 so với vi sinh hữu ích. Phân bón loại này được tạo thành bằng cách tẫm nhiễm sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào các cơ chất đã xử lý vô trùng bằng các phương pháp khác nhau. Phân bón vi sinh trên nền chất mang đã khử trùng được sử dụng dưới dạng nhiễm hạt hồ rễ hoặc tưới phủ với liều lượng 1-1,5 kg(lít)/ha canh tác +Phân vi sinh vật không sử dụng nền chất mang vô trùng được sản xuất bằng cách tẫm nhiễm trực tiếp sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào cơ chất không cần thông qua công đoạn khử trùng cơ chất. Phân bón dạng này có mật độ vi sinh vật hữu ích là 106 vi sinh vật/g(ml) được sử dụng với số lượng lớn từ vài trăm đến vài nghìn kg(lít)/ha. Đối với phân bón vi sinh trên nền chất mang không khử trùng tùy theo thành phần các chất chứa trong chất mang mà phân bón vi sinh được phân biệt với các loại: - Phân hữu cơ chứa các loại vi sinh vật sống theo sự tuyển chọn đúng tiêu chuẩn hiện hành. - Phân hữu cơ khoáng vi sinh vật là một dạng của phân bón hữu cơ vi sinh vật, trong đó có chứa một lượng nhất định dinh dưỡng khoáng. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 35 Phân loại theo trạng thái vật lý: căn cứ vào trạng thái phân bón, có thể chia các loại phân thành các loại sau. · Dạng bột là loại phân bón vi sinh, trong đó sinh khối của vi sinh vật được tuyển chọn trong đó chất mang chuyển thành dạng boat. · Dạng viên được tạo thành khi sinh khối vi sinh vật được phối trộn và xử lý chất mang để tạo thành dạng phân bón có chứa vi sinh vật sống đã được tuyển chọn · Dạng lỏng là loại phân bón vi sinh trong đó sinh khối các vi sinh vật tuyển chọn được chế biến thành dung dịch có chứa các tế bào sống của chúng. 4.5 Nhân sinh khối Từ các chủng vi sinh vật được lựa chọn (chủng gốc) người ta tiến hành nhân sinh khối vi sinh vật bằng phương pháp lên men chìm hoặc lên men xốp. Sinh khối vi sinh vật cố định nit ơ được nhân qua cấp 1, 2, 3 trong các điều kiện phù hợp với từng chủng vi sinh vật và mục đích sản xuất. Các sản phẩm phân vi sinh sản xuất từ vi khuẩn được tạo ra chủ yếu bằng phương pháp lên men chìm (Submerged culture). v Các chế phẩm phân vi sinh Trong chế phẩm phân vi sinh, ngoài nguyên liệu là vi sinh vật có khả năng cố định đạm, người ta còn sử dụng chất mang. Chất mang là vật liệu cố định vi sinh vật tạo nên hình dạng cho chế phẩm để dễ nhận thấy và bảo quản. Thường khi làm chế phẩm phân vi sinh, người ta sử dụng chất mang là than bùn. Vì phân bón sản xuất từ than bùn có nhiều ưu điểm và có tác dụng tốt với đất đai, cây trồng. Đặt biệt có hiệu quả tốt đối với đất xám bạc màu, các loại đất có thành phân cơ giới nhẹ (tỉ lệ cát cao). Tính chất này là do than bùn có chứa acid hữu cơ (chủ yếu là acid humic) khi kết hợp với nguyên tố vi lượng tạo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 36 thành humate. Chính các thành phân humate này đã tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dinh dưỡng tốt. Tránh hiện tượng rửa trôi của các nguyên tố dinh dưỡng. Ngoài ra humate cũng có tác dụng kích thích bộ rễ của thực vật phát triển tốt. Đặc biệt ở Việt Nam có trữ lượng than bùn cao và chất lượng tốt. Các bước thực hiện chất mang: Than bùn phơi khô, nghiền nhỏ, đều. Chỉnh pH trung tính bằng CaCO3 hay NH4OH Cho vào lọ thủy tinh hấp khử trùng ở 0,5 atm trong 2 giờ Bổ sung dinh dưỡng vào môi trường loãng Dobereneir với tỉ lệ 1ml/10g chất mang Cấy và kiểm tra số lượng vi sinh vật trên than bùn. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 37 4.6 Quy trình sản xuất: Quy trình chung trong sản xuất phân vi sinh cố định đạm: v Thuyết minh quy trình: Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật Tùy theo mục đích sản xuất của từng loại phân mà ta phân lập các chủng vi sinh cho phù hợp GIỐNG GỐC CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CẤP 2 CẤY GIỐNG LÊN MEN CẤP 2 SINH KHỐI VSV CHẤT MANG PHỐI TRỘN CHẾ PHẨM DẠNG LỎNG XỬ LÝ KIỂM TRA CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CẤP 1 CHẾ PHẨM TRÊN NỀN CHẤT MANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 38 Muốn có chế phẩm phân vi sinh cố đinh đạm tốt nhất phải có chủng vi sinh vật có cường độ cố định đạm cao, sức cạnh tranh lớn, thích ứng ở pH rộng, phát huy được nhiều vùng sinh thái khác nhau. Vì vậy công tác phân lập tuyển chọn chủng vi sinh cố định đạm và đánh giá đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn là việc làm không thể thiếu được trong quy trình sản xuất phân vi sinh cố định đạm Thông thường đánh giá một số chỉ tiêu: thời gian mọc, kích thướt khuẩn lạc và kích thướt tế bào vi sinh vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển (nhu cầu dinh dưỡng, nhu cầu oxi, pH và nhiệt độ thích hợp) khả năng cạnh tranh và cường độ cố định nitơ phân tử. Chủng vi sinh vật sau khi tuyển chọn được bảo quản phù hợp với yêu cầu của từng loài và sử dụng cho sản xuất chế phẩm ở dạng chủng giống gốc. 4.7 Các loại phân bón vi sinh cố định đạm: 4.7.1 Sản xuất nitragin từ vi khuẩn nốt sần rhizobium: Chế phẩm vi khuẩn nốt sần rễ đậu có tên là nitragin đã được sản xuất và sử dụng rộng rãi ở Liên Xô cũ, Trung Quốc , Ba Lan, Pháp, Bỉ. Nitragin có hiệu quả khá rõ rệt và phổ biến Tuỳ từng nhà máy, từng nuớc mà nitragin được sản xuất với nhiều hình thức khác nhau: trên thạch, trong dịch thể, hấp thụ vào than bùn, vào đất vườn Khó khăn lớn nhất hiện nay là việc đảm bảo chất lượng từ khi sản xuất cho đến khi sử dụng do Rhizobium là loại không có bào tử nên dễ dàng bị chết đi. Để khắc phục khó khăn này ta có thể sản xuất chế phẩm đông khô nhưng rất tốn kém và khó khăn trong việc mở rộng sản xuất Khi sử dụng Nitragin bón cây đậu cần chú ý đến điều kiện môi trường . Để đảm bảo cho vi khuẩn nốt sần sau khi vào đât phát huy tác dụng thì phải đảm bảo một hàm lương nitơ rộng khoảng nhất định nhất là nitơ dễ tiêu. Khi hàm lượng nitơ đạt đến mức nhất định sẽ kìm hãm quá trình cố định nitơ của Rhizobium. Vì thế người ta chỉ bón ít phân đạm trong giai đoạn đầu để kích thích giai đoạn phát triển. Hàm lượng P và K dễ tiêu trong đất cũng rất quan trọng đối KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 39 với hoạt động của vi khuẩn nốt sần. Nếu thiếu P và K, Rhizobium sẽ phát triển yếu. Ngoài ra còn cần chú ý đến nhiệt độ và pH của đất khi sử dụng Nitragin Trong hoàn cảnh nước ta hiện nay, nghiên cứu cho biết hình thức đơn giản nhất là rước mùa gieo một loại đậu nào đó thì các phòng thí nghiệm nhỏ ở các tỉnh lẻ sản xuất ra các giống thạch nghiên cấy vi khuẩn nốt sần và chuyển trực tiếp xuống hợp tác xã, nông trường. Sau đó, giống được nhân lên trong môi trường đơn giản và sau 72 giờ nuôi cấy có thể đạt được mật độ 3800.1016 tế bào Sử dụng nitragin không những làm nâng cao rõ rệt sản lượng cây trồng thuộc bộ đậu mà còn có thể làm tăng phẩm chất của sản phẩm thu hoạch. 4.7.2 Phân vi sinh của Azotobacter Nhân giống chủng Azotobacter thuần khiết qua nhiều giai đoạn trung gian, thu được sinh khối cấy vi khuẩn vào chất mang vừa làm môi trường sống của giống: thường là than bùn đã khử trùng. Cần tạo độ ẩm thích hợp trên giống và lượng tế bào trên than bùn sao cho lượng tế bào chết không cao (7%) và sinh khối đạt khoảng 30% so với môi trường. Sau đó, giữ độ ẩm môi trường khoảng 10% đóng gói cần kiểm tra hoạt tính chất lượng sản phẩm trước khi sử dụng. Azotobacter có tác dụng tăng cường nguồn thức ăn N cho cây trồng, trung bình khi tiêu thụ 1g các chất sinh năng lượng, Azotobacter có khả năng đồng hoá được khoảng 10-15 mg N phân tử. Bón rơm rạ, hay phân xanh vào ruộng là cung cấp nguồn năng lượng cho Azotobacter và hoạt động của Azotobacter sẽ làm giàu N cho đất. Các biện pháp kỹ thuật như bón vôi để trung hoà đất, bón lân tưới nước làm tơi xốp đất, phơi đấtđều làm tăng cường rõ rệt sự phát triển và cố định N của Azotobacter trong đất. Tác động của Azotobacter đối với cây trồng còn được chứng minh ở khả năng kích thích sinh trưởng của chúng. Những thí nghiệm nhiễm dịch nuôi cấy Azotobacter lên hạt cho thấy có khả năng làm nâng cao rõ rệt tỷ lệ nảy mầm cũng như tốc độ phát triển của hạt. Người ta cho rằng Azotobacter có khả năng làm tích luỹ trong môi trường nuôi cấy nhiều loại chất hoạt tính sinh học có giá KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 40 trị . Trong nghiên cứu cho thấy 1g tế bào Azotobacter thì tích luỹ được 50-100 mi tiamim, 240-600 mi acid nicotine. Azotobacter còn có khả năng tổn hợp các chất sinh trưởng giberellin. Azotobacter còn có khả năng tiết ra chất chống nấm -> tác dụng có lợi của Azotobacter được giải thích chủ yếu là khả năng ức chế nấm hoặc tạo hàng loạt chất sinh trưởng, vitamin (B1, B2, B6, B12),auxin, nicotic acid, 4.7.3 Phân vi sinh azospirillum: v Chế phẩm Rizolu: Quy trình sản xuất chế phẩm này như sau: cấy dịch nuôi vi khuẩn azospillum vào môi trường xốp than bùn với tỉ lệ 1ml : 80g. Sau 7 ngày ủ, chế phẩm đạt 109 tế bào/g. Có thể bảo quản sản phẩm 6 tháng ở nhiệt độ phòng. Phương pháp sử dụng chế phẩm: 4g/l sào mạ cấy, xử lý qua 2 bước: trộn vào lúa ngay trước khi gieo và hồ vào rễ mạ ngay trước khi cấy. v Chế phẩm Azogin: Môi trường dobereiner cải tiến phân phối vào các erlen 250-500 ml ở mức 1/3 thể tích bình. Thanh trùng bằng hơi nước ở 1atm trong 30 phút. Lượng giống cấy vào chiếm 1-5% thể tích môi trường, sau 48-72 giờ nuôi cấy trên máy lắc hoặc các thùng lên men có sục khí, nhiệt độ là 30-470C, mật độ có thể đạt 109-1010 tế bào/ml các chủng vi sinh khác nhau được nuôi cấy riêng lẻ rồi chuyển một cách vô trùng vào bồn chứa. Từ đây chúng ta cấy vào các chất mang đã được thanh trùng trước để tạo sản phẩm. Chất mang sử dụng trong quy trình này là than bùn và chất hữu cơ với tỉ lệ 1:1, nghiền mịn qua ray 0.1mm và thanh trùng bằng tia gamma. v Giải pháp HI0103: Đây là quy trình sản xuất phân đạm sinh học từ Azospirillum lipoferum: môi trường phân sinh khối được cho vào các chai thủy tinh chứa khoảng 1/3 thể tích mỗi chai, sau đó thanh trùng bằng nồi áp suất 60 phút kể từ lúc sôi. Sau khi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 41 thanh trùng, để nguội, cấy vào chai ½ lọ giống azospirillum và để vào nơi thoáng mát trong nhà. Sau 24 giờ lấy ra lắc mạnh để trộn đều môi trường nuôi cấy.tiếp tục ủ sau 24- 48 giờta thu được sinh khối với mật đạt 198-109 tế bào/ml. dùng sinh khối này trộn vào mạ trước khi cấy, hoặc trộn với đất phân chuồng đã ủ chín với tỉ lệ 1:1 để tạo chế phẩm. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 42 CHƯƠNG 5 :HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CỦA PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM 5.1 Tình hình nước ngoài Đến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất các chế phẩm phân vi sinh theo nhiều hướng khác nhau. Phụ thuộc vào nền kinh tế xã hội, khoa học công nghệ, trình độ dân trí và điều kiện tự nhiên của mỗi nước khác nhau mà khác nhau. Nhưng tất cả sản xuất theo hướng đó là: tiện cho người sử dụng và cho hiệu quả kinh tế cao nhất. Các nghiên cứu từ các nước Mỹ, Canada, Nga, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, cho thấy sử dụng chế phẩm phân vi sinh cố định đạm có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30 -60 kg N/ha/năm. Ngoài ra, thông qua các hoạt động sống của vi sinh vật, cây trồng đươc nâng cao khả năng trao đổi chất, khả năng chống chịu bệnh tật và nâng cao năng suất, chất lượng nông sản. Ơû Ấn Độ nhờ sử dụng phân bón vi sinh cố định đạm cho các cây bộ đậu (lac,đâu tương), lúa, cao lương đã mang lại lợi nhuận là 1204, 1015, 1149 và 343 rupi/ha tương đương với sự tăng năng suất lạc, đậu tương là 13,9%, lúa 11,4%, cao lương 18,2% và bông 6,8% (JUWARKA 1994) Bảng 5.1 Hiệu quả sử dụng phân vi sinh cố định đạm trên một số cây trồng Cây trồng/phân bón Tỷ lệ tăng năng suất (%) Lợi nhuận (R/ha) Đậu, lạc/Rhizobium Lúa/Tảo lam Cao lương/azopirillum Bông /azotobacter 13,9 11,4 18,2 6,8 1204 1015 1149 343 (Nguồn :Juwarka 1994) Tại Thái Lan lợi nhuận đem lại họ đậu tương 126,7-144 USD/ha, lạc 36,2- 91,5 USD/ha, hay một gói chế phẩm/200g có thể thay thế 26,8 kg ure Tại Trung Quốc phân vi sinh cố định đạm làm tăng năng suất cây trồng 7- 15% tiết kiệm 20% phân khoáng Hiện nay, phân bón vi sinh cố định đạm đã được sử dụng tại nhiều quốc gia trên thế giới. Riêng vi khuẩn nốt sần, hàng năm đem lại 25 triệu USD, trong đó tại Mỹ sản phẩm này được bán ra với doanh số 19 triệu USD. Tại Thái Lan tỷ lệ tăng trưởng của phân vi khuẩn nốt sần từ năm 1980-1993 cho đậu tương là 199%, lạc 280%. Tổng giá trị sản phẩm này 1995 đạt 406,571 USD (Cong ngoen 1997) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 43 Ngoài phân vi khuẩn nốt sần các loại, phân vi sinh vật khác như cố định Nitơ tự do azotobacter, clostridium, tảo lam, cố định nitơ hội sinh từ azopirillum, phân giải phốt phát chậm từ Bacillus, PseudomonasPhòng trừ vi sinh vật gây bệnh vùng rễ từ Steptomuces, Bacilllus cũng được sản xuất với số lượng lớn. Với tính hiệu quả cao của phân vi sinh vật đã thúc đẩy các nước phát triển không ngừng sản xuất không ngừng cả về lượng và chủng loại. Theo số liệu thống kê của Ấn Độ (1993). Từ năm 1992-1993 tổng hợp các dạng phân vi sinh bón trực tiếp cho cây trồng là 2.584 tấn và năm 2000 là 818.000 (tăng trên 3 lần) tương đương 2 tỷ USD Bảng 5.2 Các loại phân vi sinh được sản xuất tại Ấn Độ Loại phân bón Số lượng Rhizobium Azotobacter Azospirillum Tảo lam Phân giải lân 35,0 162,61 77,16 267,72 275,51 Tổng cộng 818,000 5.2 Tình hình trong nước Trong gần vòng 20 năm qua các công trình nghiên cứu và thử nghiệm phân vi khuẩn nốt sần tại Việt Nam cho thấy phân vi khuẩn nốt sần có tác dụng nâng cao năng suất lạc vỏ 13,8-17,5% ở miền Bắc và miền Trung, 22% các tỉnh miền Nam (Ngô Thế Dân và CTV 2001) Các kết quả cũng cho ta thấy sử dụng phân vi khuẩn nốt sần kết hợp với lượng phân khoáng tương đương 30-40 kg N/ha mang lại hiệu quả kinh tế cao, năng suất lạc đạt trong trường hợp này có thể tương đương như bón 60-90 kg N/ha. Hiệu lực của khuẩn nốt sần thể hiện rõ nét trên vùng đất nghèo dinh dưỡng và vùng đất mới trồng lạc. Lợi nhuận do vi khuẩn nốt sần được Võ Minh Kha và CTV (1995) xác định 442.000 VND/ha tỷ lệ lãi/l đồng chi phí đạt 9,8 lần. Lợi nhuận tương tự cũng được Nguyễn Thị Liên Hoa và CTV (1997) tại các vùng trồng lạc ở các tỉnh phía Nam. Bảng 5.3 Lợi nhuận của phân bón vi sinh cố định đạm trên một số cây trồng KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 44 Đất và cây trồng Công thức bón phân Năng suất (tạ/ha) % tăng so với đối chứng Lúa trên đất phù sa sông Hồng Nền (NPK:90.90.60+8t PC) 80% nền+Phân VSCĐĐ Nền+Phân VSCĐĐ 51,60 53,73 57,86 - 4,0 12,0 Lúa trên đất bạc màu Hà Bắc(cũ) Nền (NPK:90.90.60+8t PC) 80% nền+Phân VSCĐĐ Nền+Phân VSCĐĐ 37,76 39,86 44,59 - 6,0 18,0 Ngô trên đất phù sa sông Hồng Nền (NPK:180.120.90+8t PC) Nền+Phân VSCĐĐ 41,45 41,73 46,85 - 1,0 13,0 Ngô trên đất bạc màu Hà Bắc(cũ) Nền (NPK:90.90.60+8t PC) 80% nền+Phân VSCĐĐ Nền+Phân VSCĐĐ 36,98 37,42 39,88 - 1,0 8,0 Chè trên đất đỏ Thái Nguyên Nền (NPK:120.90.60+8t PC) 80% nền+Phân VSCĐĐ Nền+Phân VSCĐĐ 142,90 155,34 178,21 - 9,0 25,0 (Nguồn đề tài KHCN.02.06) Phân vi khuẩn nốt sần không chỉ có tác dụng làm tăng suất lac, tiết kiệm được phân đạm khoáng mà tăng cường sức đề kháng cho lạc đối với một số bệnh vùng rễ. Ngoài ra với tác dụng của vi khuẩn nốt sần, lạc có sinh khối chất xanh nhiều hơn. Tàn dư thực vật sau thu hoạch nếu được vùi trả lại cho đất trở thành nguồn dinh dưỡng đạm và chất hữu cơ quan trọng cho cây trồng các vụ sau. Kết nghiên cứu đề tài cấp nhà nước KC.08.01 (1991-1995) và KHCN. 02.06 (1996-2000) cho biết vi sinh vật cố định nitơ có thể tiết kiệm được lượng phân khoáng nhất định, từ 10,08-22,4 kg N/ha/vụ tùy theo từng loại đất và thời vụ gieo trồng. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 45 Bảng 5.4 Khả năng tiết kiệm đạm khoáng của phân vi sinh vật cố định nitơ Đất trồng Khả năng tiết kiện khoáng theo thời vụ cây trồng kgN/ha Vụ xuân Vụ mùa Phù sa sông Hồng 14,28 10,80 Phù sa sông Mã 15,28 12,12 Đất bạc màu 22,4 16,6 Đất ven biển 17,46 17,8 Trung bình 13,76 14,51 (Nguồn đề tài KC.08.01) Kết quả: đánh giá hiệu lực phân bón vi sinh vật đối với cây trồng đã xác định phân bón vi sinh không chỉ cung cấp một phần chất dinh dưỡng cần thiết cho cây mà còn có tác dụng năng cao hiệu quả sử dụng phân khoáng. Đồng thời có nhiều phân bón vi sinh cố định đạm có khả năng hạn chế một số bệnh vùng rễ cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cho người sử dụng và tác động tích cực đến môi trường sinh thái đất KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 46 CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1 Kết luận - Các vi sinh vật có khả năng cố định đạm có thể phân lập trong tự nhiên - Quy trình giữ giống và nhân sinh khối khá đơn giản. Nhiều loài đã được sản xuất thành chế phẩm thương mại ở Việt Nam. - Sử dụng phân bón vi sinh cố định đạm cho hiệu quả tương đương hoặc cao hơn phân hóa học nhưng thân thiện và an toàn cho môi trường sống. 6.2 Kiến nghị: Mở rộng nghiên cứu ứng dụng một số chủng vi sinh cố định đạm KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM GVHD : Nguyễn Thị Hai SVTH : Thái Sơn Nam Trang 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình phân bón của trường đại học Khoa Học và Tự Nhiên Đề tài: nghiên cứu ảnh hưởng của một số phân hữu cơ vi sinh tới năng suất, hàm lượng NO3- của rau bắp cải và hóa tính đất trồng đất trồng rau tại xã Hà Giang của Th.s Phạm Xuân Lân. Đề tài: ảnh hưởng của việc sử dụng phân đạm đến khả năng tích lũy hàm lượng NO3-, NH4+ trong nước mặt và nước ngầm tại xã Đặng Xá-Gia Lâm-HN của ks Võ Thị Loan. Và một số trang wed www.agroviet.gov www.cuctrongtrot.gov.vn www.hutech.edu.vn www.vaas.org.vn PHỤ LỤC Bảng 1.1 Tình hình sử dụng phân hóa học của các nước Bảng 1.2 Nhu cầu phân bón trên thế giới Bảng 1.3 Số lượng phân hóa học được sử dụng qua các năm Bảng 4.1 nhiệt độ và thời gian giữ giống Bảng 5.1 Hiệu quả sử dụng phân vi sinh cố định đạm trên một số cây trồng Bảng 5.2 Các loại phân vi sinh được sản xuất tại Ấn Độ Bảng 5.3 Lợi nhuận của phân bón vi sinh cố định đạm trên một số cây trồng Bảng 5.4 Khả năng tiết kiệm đạm khoáng của phân vi sinh vật cố định nitơ