Đề tài Sản xuất sinh khối vi sinh vật giàu protein cho gia súc

n thiết Đặc tính kỹ thuật: Nồng độ huyền phù sau ly tâm: 20-25% chất khô Đặc điểm sinh khối nấm men sau ly tâm Sinh khối nấm men thu được ở dạng sệt có 75-80 % nước, 20-25 % chất khô trong đó cacbon chiếm 40-50 %, nitơ 7-10 % tương ứng với 40-60 % protein, hydro 5-7 %, oxy 25-30 %, các nguyên tố vô cơ 5-10 % ( phospho và kali chiếm 95-97 % tổng lượng tro, số còn lại là canxi, magie, nhôm, lưu huỳnh, clo, sắt, một lượng rất nhỏ các nguyên tố mangan, kẽm, molipden, bo, coban…), Ngoài ra,trong tế bào nấm men còn chứ hầu hết các chất cần thiết cho sự sống như glucid, lipid, enzym, các acid nucleic … Cô đặc Mục đích: chuẩn bị Chuẩn bị cho quá trình sấy dễ dàng hơn bằng cách tăng nồng độ chất khô, làm giảm chi phí về thời gian sấy. Giết men và tất cả các vi sinh vật tạp nhiễm để hạn chế các mầm bệnh có thể nhiễm từ vi sinh vật Phá vỡ tế bào nấm men nhằm tăng hệ số hấp thu nấm men cho động vật . Các biến đổi Vật lý: Tính chất dung dịch thay đổi, hệ số dẫn nhiệt, nhiệt dung giảm, khối lượng riêng, nhiệt độ sôi tăng. Hóa lý: độ nhớt của huyền phù tăng lên Hóa sinh: một số enzym bị biến tính. Sinh học: hệ vi sinh vật tốn tại trong nấm men bị tiêu diệt. Phương pháp thực hiện: Có thể tiến hành phương pháp bằng các thiết bị cô đặc bằng thiết bị dạng màng hoặc tấm bản. Nồng độ cuối cùng của nấm mên lên đến 40%. Phương pháp thường được sử dụng với sản phẩm sấy phun. Thiết bị Hình 7. Thiết bị bốc hơi dạng màng rơi Chất lỏng được phân phối một cách đều đặn ở mặt trong của ống, chảy xuống tạo thành một màng mỏng. Quá trình bốc hơi sẽ diễn ra tại đây nhờ nhiệt được cung cấp bởi hơi nước. Hơi nước ngưng tụ và chảy xuống ở mặt ngoài của ống. Có nhiều ống được lắp đặt cạnh nhau tạo thành một chùm ống. Hai đầu của chùm ống được cố định bởi 2 vỉ ống và toàn bộ chúng được bao bọc bởi một lớp vỏ áo. Bộ phận như thế được gọi là calandria. Hơi nước được đưa vào bên trong lớp vỏ áo. Khoảng không gian giữa các ống gọi là vùng gia nhiệt, mặt trong của ống được gọi là vùng bốc hơi. Chất lỏng đã được cô đặc và hơi nước ra khỏi calandria tại phần đáy. Tại đó, phần lớn chất lỏng cô đặc sẽ được tháo ra. Phần được giữ lại sẽ đi vào bộ phận tách hơi cùng với hơi nước. Sau khi tách hơi, phần chất lỏng này cũng được tháo ra (thường sử dụng bơm giống như phần chính của dịch cô đặc tháo ra từ calandria). Còn hơi sẽ rời khỏi bộ phận tách hơi tại đỉnh. Hơi gia nhiệt ngưng tụ tại mặt ngoài của ống và được tập trung dưới dạng nước ngưng tại đáy của vùng gia nhiệt và cũng được tháo ra bằng bơm. Vì hơi thứ tạo ra từ dung dịch cô đặc còn chứa rất nhiều năng lượng, cho nên người ta tận dụng nó để làm tác nhân gia nhiệt. Điều này được thực hiện bằng cách thêm một calandria khác vào thiết bị bốc hơi. Calandria mới này có nhiệt độ bốc hơi thấp hơn, làm việc như là một bình ngưng tụ hơi thứ từ calandria thứ nhất. Để đạt được sự khác nhau về nhiệt độ giữa sản phẩm và hơi nước trong calandria thứ hai, vùng bốc hơi trong calandria được vận hành ở điều kiện chân không cao hơn tương ứng với nhiệt độ thấp hơn đó. d. Thông số công nghệ: Huyền phù sau ly tâm đưa qua thiết bị cô đặc chân không. Nhiệt độ: 75oC. Ap suất : 360mmHg., Nồng độ chất khô sau cô đặc 40% khối lượng chất khô. Sấy Mục đích:chế biến, bảo quản Huyền phù sinh khối nấm men sau quá trình cô đặc có nồng độ chất khô 40% . Quá trình sấy nhằm mục đích tách ẩm ra khỏi men, đưa độ ẩm của chúng về dưới 8% để kéo dài thời gian bảo quản của nấm men. Đồng thời, quá trình sấy cũng làm đa dạng hóa sản phẩm nhằm thuận tiện cho quá trình vận chuyển và sử dụng Các biến đổi trong quá trình sấy. Vật lý: hàm ẩm giảm nhanh chóng. Hóa lý: sự bay hơi nước và các chất dễ bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao. Có sự chuyển pha từ dạng lỏng ( dịch lên men ) sang dạng rắn. Hóa sinh: một số enzym bị biến tính. Sinh hoc: tế bào nấm men và một số vi khuẩn bị tiêu diệt. Tuy nhiên do thời gian sấy rất ngắn nên biến đổi về hóa sinh và sinh học không lớn lắm. Thiết bị sấy phun Thiết bị sấy phun đáy hình nón Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động Hình 8. Máy sấy phun đáy hình nón Sấy phun gồm một buồng sấy hình trụ, đầu dưới hình nón (đường kính buồng hình trụ 8-10 m, phần trụ cao 5,5-7 m, phần nón cao 6,6-8,7 m). Phần bên trong trên đỉnh buồng sấy lắp hệ thống phun. Hỗn hợp không khí nóng theo ống ở trung tâm buồng phía dưới đĩa phun làm nóng buồng sấy. Khí thừa sẽ theo xyclon lọc khí ra ngoài. Thành phẩm ở dạng bột được đẩy ra dưới tác động của lực ly tâm. Dung dịch đẩy vào sấy bị phun ra nhờ cơ cấu ly tâm (13) có đĩa (10). Đĩa phun (10) quay với tốc độ 10000 vòng/phút từ động cơ qua hộp giảm tốc. Để bôi trơn cơ cấu phun, ở phần trên của thiết bị có lắp cơ cấu cơ học và bộ lọc mỡ (14). Vô lăng điện (15) dùng để nâng cơ cấu phun. Tác nhân sấy đưa vào phần trên của thiết bị theo ống dẫn (7). Ở cuối ống dẫn (7) lắp cơ cấu phun hình nón (8). Nhờ cơ cấu (8), tạo ra dòng xoáy của khí đưa vào. Các giọt sản phẩm được phun bằng đĩa bị bao phủ bởi dòng không khí và chuyển xuống dưới. Ẩm được bốc hơi, các phần tử bột nhỏ còn lại lắng xuống ở đáy hình nón và tháo đến cơ cấu (1) để chuyển sản phẩm vào hệ băng tải khí động học. Lắp máy rung (17) để tẩy sạch các tiểu phần của sản phẩm bám trên tường,. Tác nhân sấy bị thải có mang theo các tiểu phần nhỏ của sản phẩm ra khỏi thiết bị sấy qua ống dẫn (2) vào xyclon để tách bột. Vỏ trụ (9) có đáy hình nón để tháo bột khô. Để tránh cháy sản phẩm trong máy sấy, người ta đặt các cơ cấu bảo hiểm 3 và 18. Để khảo sát bên trong, có xe nâng (4), nguồn chiếu sáng (6) và cửa (5). Tấm ngăn máy sấy (11) có các van bảo hiểm ở dạng các đĩa chồng nhau và dạng đường ống (12) để xả khí sấy khi tăng áp suất đáng kể. . Hình 8. Hệ thống sấy phun tổ hợp. Bộ sấy gồm thùng chứa dung dịch chất lỏng canh trường 2, các bơm ly tâm 3 và 9, thiết bị lọc khí 1, phòng sấy 4, cơ cấu tháo dỡ để đẩy bột khô vào băng tải khí động 10, các bộ lọc vi khuẩn 7, quạt hai chiều 6, calorife 8, thùng chứa sản phẩm khô 12, các bộ lắng bằng xyclon 11, bộ tháo dỡ xyclon 13, bộ lọc không khí 5 để đẩy vào calorife 8. Các thông số. Tốc độ đĩa phun 10000 vòng/phút Nhiệt độ vào của tác nhân sấy: 180-200oC. Nhiệt độ ra ở cửa ra buồng sấy : 85-95oC. Nồng độ nguyên liệu vào: 40% chất khô Độ ẩm sau khi sấy: ≤ 8% Nhiệt độ nguyên liệu trong quá trình sấy ≤ 60-70 oC Thời gian tiếp xúc với tác nhân sấy ngắn, chỉ khoảng vài giây. Nấm men được đưa nóng lên không quá 95oC làm cho chất lượng của các chất thành phần trong nấm men như protein, vitamin, màu sắc và cấu trúc không bị biến đổi, được hoàn thiện hơn cũng như dễ tiêu hóa hơn. Quá trình bao gói Mục đích: hoàn thiện sản phẩm Phương pháp tiến hành: Sản phẩm sau khi sấy khô được bọc trong các gói bằng giấy và bằng polietylen theo từng lô từ 0,3 đến 1,6 kg. Công đoạn bao gói sản phẩm được tiến hành trên dây chuyền tự động B6-BPA, dây chuyền khảo sát khả năng biến đổi kích thước của hộp theo chiều cao từ 150 đến 300 mm với đường kính không đổi bằng 242 mm, và định lượng sản phẩm trong giới hạn 0,4-0,5 kg. Dây chuyền được sử dụng để hoạt động trong phân xưởng chia gói ở nhiệt độ từ 18 – 30oC và độ ẩm tương đối của không khí đến 60%. Thiết bị Cấu tạo Hình 9 Sơ đồ của dây chuyền tự động định lượng phân chia bao gói Bộ định lượng sản phẩm tự động Cơ cấu cấp liệu màng mỏng Bộ tạo ống Máy hàn mối dọc của ống Cơ cấu căng ống Máy hàn đáy và nắp gói Cơ cấu cắt túi Cầu chuyển để tải hộp rỗng Cơ cấu để đặt gói thành phẩm vào hộp 10, 11 Cơ cấu nén đôi các túi vào các hộp Máy tự động ghép nắp Bộ đảo hộp Máy dán nhãn Nguyên tắc hoạt động Nạp sản phẩm vào ống làm bằng màng polyetylen đã được hàn từ bộ định lượng 1. Sau khi kết thúc hàn mỏ cặp dọc nhả ra. Ống được hàn cùng sản phẩm hạ xuống dưới nhờ các băng tải kéo của cơ cấu hạ ống 5 xuống một khoảng bằng chiều dài của gói, sau đó hàn gói, cắt gói dưới, nạp sản phẩm cho gói tiếp theo. Gói đựng đầy sản phẩm rơi xuống hộp kim loại qua phễu nhận nằm trong băng tải xung của cơ cấu xếp. Nạp các hộp kim loại rỗng tới băng tải xung được tiến hành bằng phuơng pháp gạt hộp qua cầu chuyển. Từ băng tải xung của cơ cấu xếp hộp, các gói được chuyển đến băng tải kiểu tấm của máy ghép mí tự động để ghép đáy và chuyển đến máy dán nhãn qua máy lật hộp. Hộp được đưa vào máy dán nhãn ở vị trí nằm ngang rồi dán vòng tròn và tải hộp tới máng nghiêng của máy dán nhãn. Sau đó hộp theo băng tải vào kho thành phẩm. Đặc tính kỹ thuật của dây chuyền tự động định lượng phân chia bao gói Năng suất: 480 gói/h Khối lượng một lần định lượng: 0,4 – 0,5 kg Phương pháp định lượng: Cân Độ chính xác định lượng: ± 1% so với liều lượng định mức Công suất thiết kế của động cơ: 9,16 kW Kích thước cơ bản: 6820x2370x3210 Khối lượng: 4850 kg Chương 4 SẢN PHẨM SINH KHỐI NẤM MEN SẢN PHẨM SINH KHỐI NẤM MEN YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG CỦA MEN THƯƠNG PHẨM Tiêu chuẩn của sinh khối nấm men thương phẩm dùng cho chăn nuôi như sau: Chỉ tiêu cảm quan: Dạng bột Màu sắc: xám, trắng, vàng, nâu. Mùi vị: đặc trưng của nấm men, không được có mùi vị lạ. Kích thước: hiệu suất qua rây 3mm trên 95% Chỉ tiêu hóa học: Độ ẩm: không quá 8 % Protein: không nhỏ hơn 45% (tính theo chất khô), với men ở lọai khô là 56,0 % Lizin, metionin và tryptophan tương ứng không dưới 0,5; 1,4; 1,1 % của protein khô Độ tiêu hóa của protein không dưới 75- 80 % Giá trị sinh học của protein khô không dưới 55 % Các vitamin B1, B2, B5 tương ứng không dưới 10, 30 và 300 mg/kg. Hàm lượng tro: đối với men rượu từ rỉ đường không quá 14% men khô tuyệt đối, còn men rượu từ bã rượu ngũ cốc thì không quá 10 %. Tạp chất kim loại sau khi tách sắt có thể còn có trong chế phẩm men ở dạng các mẫu vảy nhỏ là kim loại bắt từ hoặc không bắt từ. Những tạp chất kim loại là thể mảnh kim loại không bắt từ phải có kích thước mảnh, miếng kim loại không quá 2mm. Hàm lượng kim loại mảnh có kích thước<2 mm (mg/ 1kg men khô):< 20 Các kim loại từ tính: không quá 0,003% (chì và asen không quá 5 mg/kg) Chỉ tiêu vi sinh: - Tổng vi sinh vật hiếu khí không quá 7500 cfu/kg men khô - Vi khuẩn thương hàn: không được có - Nấm mốc: không quá 50 cfu/kg men khô Chương 4 THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN VI SINH VẬT TỪ DẦU MỎ VÀ KHÍ ĐỐT Sơ lược Từ lâu người ta đã biết nhiều vi sinh vật sống dựa vào dầu mỏ và khí đốt, ở các bể chứa dầu, ở các mặt đường nhựa … Năm 1925, con người đã phát hiện thấy khả năng oxy hoá hidrocacbua của một số vi sinh vật. Năm 1940, nhiều công trình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật vào việc tìm kiếm dầu mỏ và khí thiên nhiên gần mặt đất đã được tiến hành.Tới năm 1962, phương pháp sản xuất protein từ dầu mỏ và triển vọng của nó đã được trình bày tại hội nghị dầu mỏ quốc tế lần thứ VI. Sau đó, một số nước trên thế giới đã xây dựng nhà máy sản xuất sinh khối nấm men mà sản phẩm chưa tới 70% protein nhằm mục đích thu protein. Sản phẩm thu được khi nuôi vi sinh vật ( chủ yếu là nấm men ) trên dầu mỏ rất giàu dinh dưỡng có thể coi là 1 loại protein-vitamin đậm đặc, không mang mùi vị gì của nguyên liệu và không có độc tố. Các sản phẩm này rất giàu protein nhóm B cũng như ecgostenn (tiền vitamin D2).Chính vì vậy chúng được dùng rộng rãi vào chăn nuôi và một phần để được tách protein tinh khiết làm thức ăn cho người. Sản phẩm của Pháp có tên là Toprina chứa tới 70% protein, của Liên Xô là BVK có trên 52% protein, của Anh là BP chứa khoảng 40% protein. Vi sinh vật sử dụng Hydrocacbua dạng khí thường được vi khuẩn Mycobacterium và Pseudomonas đồng hoá. Khả năng này còn thấy ở một số vi khuẩn khác và xạ khuẩn: Streptomyces, Flavobacterium, Chromobaterium, Acremonium, Corynebacterium, Micrococus, Staphylococus, Methylococus. Đồng hoá tốt các hydrocacbua lỏng là các chủng thuộc giống Candida: C.tropicalis, C.maltosa, C.lypolitica, C.rubusta, C.pelliculosa, C.scotti, C.rugosa, C.olophila. Ngoài ra còn có các giống khác cũng đồng hoá được hydrocacbua dầu mỏ như: Torulopsis, Rhodotorula – T.colliculosa, T.sake, T.dattila, T.famata, Rh.glutinis, Rh.gracilis. Mọc tốt trên môi trường này còn có nấm men Lodderomyces enlongisporus, vi khuẩn Pseudomonas ovalis. Vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại hydro cacbua hơn nấm men và nấm mốc. Nấm men chỉ phát triển trên n-alkan và alken. Nấm mốc phát triển trên n- alkan, còn trên alkan mạch nhánh sinh trưởng kém hơn.Vi khuẩn phát triển tốt trên các dãy alkan mạch thẳng, mạch nhánh, trên các hydro cacbua thơm và khí thiên nhiên. Quá trình thâm nhập của hydrocacbua vào tế bào cho tới nay cũng chưa được làm sáng tỏ đầy đủ. Có giả thuyết cho rằng, quá trình đó thực hiện nhờ có sự tham gia của lipit ở màng tế bào. Cơ chế phân giải hydrocacbua tuy có nhiều giả thuyết và được nghiên cứu nhiều nhưng cũng chưa hoàn toàn rõ ràng ở các đối tượng khác nhau. Vấn đề chọn lựa các chủng vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng hợp cao để dùng trong sản xuất rất có ý nghĩa quan trọng. Trong công nghiệp sản xuất protein từ khí đốt và dầu mỏ phải chọn các chuẩn sao cho đáp ứng các nhu cầu sau: Có khả năng sử dụng tốt nguồn hidrocacbua dùng làm nguyên liệu sản xuất. Sinh trưởng nhanh chóng, cho sản lượng cao trong thời gian ngắn, không đòi hỏi các yếu tố sinh trưởng bổ sung. Có thành phần hóa học và điều kiện nuôi cấy ổn định có hàm lượng protein cao, chứa đầy đủ các acid amin cần thiết, không có độc tố và phải được động vật đồng hóa tốt. Hiện nay người ta đang đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất sinh khối vi khuẩn giàu protein, tuy nhiên mức độ áp dụng rộng rãi thì chưa có vì vi khuẩn có những ưu và nhược điểm sau: Tốc độ sinh trưởng nhanh. Dùng được nhiều loại cơ chất. pH cần được giữ ở 5-7, nếu không sẽ có nguy cơ nhiễm các vi khuẩn lây bệnh. Thu hồi bằng li tâm khó. Hàm lượng protein thô có thể rất cao (tới 80%) song hàm lượng bình thường của các axit nucleic, đặc biệt là ARN cũng cao (tới 20%) và cần phải được loại bỏ Thành phần các axit amin cân đối nhưng hàm lượng các axit amin chứa S hơi thấp. Khi dùng các vi khuẩn Gram âm để sản xuất SCP cần lưu ý khả năng sinh sản độc tố của chúng. Phần lớn các chủng nấm men có sản lượng cao trên cơ chất là hidrocacbua được phác lập từ những mẫu đất và bùn ở những nơi có mỏ dầu hoặc quanh các nhà máy chế biến dầu.Viện sinh tổng hợp các hợp chất protein ở Liên Xô năm 1967 đã chọn hơn 500 chủng nấm men phân lập từ các mẫu trên có khả năng đồng hóa được hidrocacbua trong đó có chủng Candida cho sản lượng cao nhất. Từ kết quả nghiên cứu ở phòng thí nghiệm cho thấy: nuôi cấy chúng trên môi trường là n-parafin sẽ cho hiệu suất sinh khối khô từ 85-100% trọng lượng men khô so với trọng lượng parafin được dùng , hàm lượng protein trong sinh khối thì khoảng trên dưới 50%. Ví dụ: Tên nấm men Hiệu suất nấm men khô % Hàm lượng protein % chất khô Candida tropicalis 94.4 58.8 Candida intermedia 87.1 51.0 Quá trình đồng hoá cacbon từ dầu mỏ và khí đốt có thể đề ra ở dạng tổng quát như sau: (1) Hydrocacbua à rượu bậc 1 hay rượu bậc 2 à aldehyt à axit béo. (2) Đối với n-alkan có thể là: (3)Đối với các hợp chất không no ( thí dụ: loại 1 – olefin), người ta cho rằng quá trình oxy hoá nhờ vi sinh vật có thể đi theo con đường sau: Các vi sinh vật có khả năng phân giải khí metan thành CO2 và H+ hoạt động. Sau đó chúng sử dụng H+ này để khử CO2 và tạo thành các hợp chất hữu cơ: Các quá trình sinh hoá trong tế bào vi khuẩn với metan đại thể như sau: Các axit béo được lôi cuốn vào quá trình đồng phân hoá tiếp theo oxy hoá đến axetyl – CoA rồi đi vào vòng Krebs. Một phần các axit amin hữu cơ được tạo thành sẽ kết hợp với NH3 cho các aminoaxit. Nhờ các dây chuyền amin mà số loại amin ngày càng phong phú và cuối cùng dưới sự điều khiển của AND trong tế bào vi sinh vật các axit amin này sẽ được tổ hợp với nhau để hình thành các phân tử protein. Quy trình sản xuất sinh khối vi sinh vật từ hidrocacbua: Men thành phẩm Dầu thô Xử lý Tạo môi trường Lên men Ly tâm Rửa nước Làm khô Xử lý bằng dung môi Rửa nước sạch Muối dinh dưỡng Men giống Oxi Làm khô Đóng gói Nhân giống Men thành phẩm Parafin Xử lý Tạo môi trường nuối cấy Lên men Ly tâm Rửa nước Làm khô Muối dinh dưỡng Men giống Oxi Đóng gói Nhân giống Một số vấn đề cần lưu ý Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, người ta bổ sung octofosforic hoặc supephosphat, NaCl, MgSO4, vào hỗn hợp hidrocacbua với H2O, nguồn nitơ thường dùng là nước amomiac có 20-25% NH3 và 1 lượng nhỏ (NH4)2SO4 để acid hóa môi trường ban đầu. Nước amoniac được dùng với 2 mục đích vừa là nguồn dinh dưỡng nitơ vừa là chất điều chỉnh pH trong thời gian nuôi cấy. Nguyên liệu ban đầu là hidrocacbua không có các nguyên tố vi lượng, vì vậy phải cho vào môi trường chất dinh dưỡng các muối sau: MnSO4, ZnSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KI, NaMoO.H2O, FeCl3.6H2O. Cùng với n-parafin, dầu mỏ thô cũng được dùng làm nguyên liệu sản xuất protein từ nấm men, phương pháp dùng dầu thô chưa tách parafin tương đối dễ, nhưng đòi hỏi quy trình công nghệ phức tạp hơn. Nếu dùng parafin thì khi tách nấm men có thể bỏ bớt khâu tẩy rửa dung môi hữu cơ vì thực tế parafin được nấm men sử dụng hoàn toàn. n-parafin 12.5 kg Supephosphat 2.7 kg Amonsunphat 0.45 kg Nước NH3 25% 4.0 kg KCl 0.56 kg MgSO4 0.28 kg Nước 1000 ml SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT TỪ NGUYÊN LIỆU CHỨA TINH BỘT VÀ CELLULOSE. Sơ lược Cellulose là chất hữu cơ thường gặp nhất trên trái đất và hàng năm được tái tạo với một số lượng khổng lồ. Các loại rơm rạ chứa tới 30-40% cellulose. Cellulose cũng gặp nhiều trong nước thải của công nghiệp gỗ, công nghiệp dệt , bã mía và các chất thải của ngành công nghiệp thực phẩm. Sản xuất protein đơn bào từ cơ chất cellulose là một hướng có nhiều triển vọng song 2 vấn đề cần đặt ra là sự phụ thuộc vào mùa vụ và những khó khăn trong vận chuyển. Vi sinh vật sử dụng Các vi sinh vật thích hợp cho việc sử dụng cellulose là xạ khuẩn ưa nhiệt, vi khuẩn từ dạ cỏ của động vật nhai lại, các loài Cellulomonas, Alcaligenes faecalis, Tricôderma reesei và nhiều nấm sợi khác như Myrothecium verrucaria, Humicula grisea, Sporotrichum thermophilum, Chaetomium thermophilum, nấm sợi chiụ nhiệt Chaetomium cellulolyticum kể cả khi được nuôi hỗn hợp với Trichoderma reesei và nhiều loài khác. Ngoài nấm men và nấm sợi, người ta còn sử dụng rộng rãi vi khuẩn để sản xuất protein từ nguyên liệu cellulose vì protein vi khuẩn có hàm lượng axít amin cân đối hơn ở nấm men, tỷ lệ protein trong tế bào vi khuẩn lại rất cao, trung bình là 60 -70%, có loài tới 87%. Nhiều nhà nghiên cứu đã thành công rực rỡ trong việc nuôi vi khuẩn tạo protein từ cây cỏ, rơm rạ. Srunivaan và Han (1969) đã phân lập được hai loài vi khuẩn có khả năng cộng sinh rất lý thú là Cellulonas và Alcaliges. Trong môi trường cellulosea, nếu chỉ riêng một mình Alcaligens thì hầu như vi khuẩn không phát triển được, nếu chỉ một mình Cellulomonas thì vi khuẩn phát triển rất kém. Nhưng nếu nuôi cấy cùng một lúc cả hai vi khuẩn này thì sinh khối tăng vọt lên. Các nhà bác học Mỹ ơ’trường đại học Luisiana đã phân lập từ bã mía một loại vi khuẩn phân hủy mạch cellulosea của nguồn nguyên liệu này. Công trình nghiên cứu này đang được ứng dụng có kết quả ở Mỹ và Cuba và cứ 113-136 kg bã mía, người ta có thể sản xuất được 18-23 kg protein. Đây là một thành tựu có nhiều ý nghĩa thực tiễn, nó cho phép sử dụng bã mía, lỏi ngô, rơm rạ … để sản xuất protein một cách trực tiếp mà không phải qua khâu thuỷ giải bằng H2SO4. Hai nhà bác học người Austrayllia là Roper và Moss đã đưa ra một phương pháp sản xuất protein vi khuẩn từ rơm, cỏ, bã mía, vỏ đậu, mùn cưa, dăm bào, …với hiệu suất rất cao, có thể đạt đến 35% so với lượng rơm, cỏ … sử dụng. Đặt biệt, protein do Roper và Moss thu được từ rơm rạ có chất lượng tương đương với lòng đỏ trứng gà. Giáo sư Macmilan, người lãnh đạo phong trào chống đói ở Austraylia gọi công trình của hai nhà phát minh này là “một tiếng nổ kỳ dịêu trong cuộc chiến đấu với nạn đói protein của thế giới “. Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối vi sinh vật từ cellulose Men thành phẩm Nguyên liệu Thủy phân Tạo môi trường nuôi cấy Lên men Ly tâm Rửa nước Sấy khô Muối dinh dưỡng Men giống Oxi Đóng gói Nhân giống Một số lưu ý khi sản xuất sinh khối vi sinh vật từ cellulose Trong tự nhiên ít gặp cellulose thuần khiết mà nó thường năm ở dạng liên kết với các polime khác nhau như linhin, pectin, hemicellulose… linhin là 1 polime 3 chiều được tạo nên nhờ sự ngưng tụ của các gốc rượu coniferil. Linhin bao quanh các sợi cellulose bằng 1 mạng lưới 3 chiều và như vậy ngăn cản sự phân giải cellulose nhờ enzym. Riêng việc làm giảm độ lớn của hạt đã cho phép tăng đáng kể sự phân giải cellulose. Dung dịch kiềm sunfit là các phế phẩm của công nghiệp cellulose: gỗ được nấu với canxi bisunfit. Ở đây lignin được hoà tan vào dung dịch ở dạng muối canxi của axit ligninsunforic; hemicellulosea thuỷ phân thành đường. Trong dung dịch kiềm sunfit có cả đường pentoza và hexoza. Phần chủ yếu của dung dịch kiềm sunfit là muối canxi của axit ligninsunforic (khoảng 60% các hợp chất hữu cơ) không được nấm men sử dụng. Tất cả các đường có trong dịch kiềm sunfit và các axit axetic được nấm men Candida sử dụng với hiệu suất cao: sinh khối tạo thành (tính theo vật chất khô) tới 50% so với nguồn cacbon có trong môi trường. Người ta tính thấy rằng, khoảng 5 tấn bột cellulosea dùng sản xuất giấy sẽ thải ra một lượng kiềm chứa tới 180 kg đường. Dịch này hấp phụ nhiều oxy cho nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thường. Muốn sử dụng được dung dịch kiềm sunfit để nuôi nấm men thì khi dung dịch còn nóng đã phải thổi khí mạnh để đuổi S02, furfurol ra khỏi dịch (các chất này kìm hãm sinh trưởng của nấm men). Dùng bột ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất nấm men rất tốt. Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trước tiên phải tiến hành thuỷ phân bằng axit hay enzim của mầm mạ hoặc enzim vi sinh vật để biến các polysaccarit thành các dạng đường mà nấm men đồng hoá được. SẢN XUẤT SINH KHỐI TẢO Ngoài ra với môi trường nuôi cấy dùng bể ở ngoài trời phải có điều kiện về ánh sáng và diện tích cuả bể thì việc nuôi cấy tảo là chiếm phần lớn hơn cả. Các giống tảo được chú ý nhiều nhất vẫn là: Chlorella, Scenedesmus và Spirulina. Với 3 phương pháp: sinh dưỡng quang hợp, hoá tổng hợp hay là dị dưỡng, trong đó phương pháp sinh dưỡng quang hợp là được áp dụng rộng rãi hơn cả. Tảo tuy trong thành phần của nó ngoài hàm lượng protein cao còn có chứa nhiều nguyên tố vi lượng và rất giàu vitamin B, cũng chưa được áp dụng nhiều vì trong sản xuất tảo cần có những yêu cầu về kĩ thuật cao hơn. 1. Đặc điểm chung của tảo. Để sử dụng tảo vào điều kiện cho thích hợp hơn, người ta đi sâu vào nghiên cứu và phát hiện ra chúng có một số đặc điểm nổi bật. Đặt biệt là khi sử dụng chúng vào sản xuất qui mô lớn cần phải có sự tuyển chọn các chủng giống có những đặc điểm thích hợp cho việc nuôi trồng cũng như cho năng suất tạo sinh khối cao. Và khi sử dụng chúng vào sản xuất thì chúng có một số đặc điểm sau: Tốc độ sinh trưởng nhanh Năng suất quang hợp cao. Có sức chống chịu tốt với sự dao động của điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ chiếu sáng, nồng độ muối cao, một số bệnh tật… Sinh khối có thành phần hóa học thích hợp, không chứa độc tố, dễ tiêu hóa, hàm lượng protein rất cao. Có chất diệp lục, chất đóng một vai trò quan trọng trong việc hấp thụ ánh sáng mặt trời của tảo, chính vì vậy tảo có khả năng quang hợp mà hầu hết giới vi sinh vật không có. Chu kì sinh sản ngắn, trong điều kiện tối ưu có thể thu hoạch tảo trong một ngày và trong điều kiện bán tự nhiên khoảng từ 3-5 ngày tùy theo thời tiết, vì vậy có thể thu hoạch quanh năm. Tảo sinh trưởng trong môi trường nước, cho phép ta dễ dàng tạo được các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được sinh khối đậm đặc. Về công nghệ Tế bào luôn ở trạng thái huyền phù, không dính kết vào thánh bể nuôi hoặc lắng xuống đáy. Dễ tách bằng các cách vớt, lọc, li tâm. Công nghệ đơn giản, dễ thực hiện. 2. Giá trị dinh dưỡng của tảo. Hàm lượng protein của tảo nói chung khoảng 40-55%, riêng tảo Spirunila có chứa tới 70%. Hàm lượng các axit amin của những protein này gần với quy định của protein tiêu chuẩn, đặc biệt hàm lượng lizin trong protein của tảo cao hơn hẳn so với protein lúa mạch. Điều đáng chú ý là tổng số các axit amin không thay thế trong protein rất cao, có khi lên tới 42%. Giá trị dinh dưỡng của tảo còn thể hiện rất rõ ở chất lượng và số lượng các vitamin có trong đó. Tảo Cholorella có nhiều vitamin A, vitamin B, trong tế bào tươi có rất nhiều vitamin C. Ngoài ra, người ta còn thấy vitamin B, K, axit nicotinic, axit pantoneic, biotin, lencophorin…trong các loại tảo. Tảo Spirullina chứa vitamin B12 nhiều hơn hẳn tảo Chorella. Không những thế, Spirulina còn chứa nhiều xantophyl, nhiều loại kháng sinh chống vi khuẩn và các loại nấm, vì vậy mà cất giữ tảo ở dạng khô rất lâu mà vẫn không bị mốc. Trước đây người ta sản xuất nhiều Chorella, nhưng dần dần, do những yêu điểm nổi bật tảo Spirulina đã chiếm vị trí chủ yếu. Và kèm theo đó là hàm lượng vitamin của spirulina rất đa dạng: Vitamin. Hàm lượng(mg/kg khối lượng khô). Bêta Carotene( tiền vit. A) 1700 Cyanocobalamine (vit.B12) 1,6 D-Ca pantothenate 11,0 Acid folic 350,0 Inositol 118,0 Niacine( vit.B3) 118,0 Pyridoxine( vit. B6) 3,0 Thiamine( vit.B1) 55,0 Tocopherol( vit. E) 190,0 Tảo Spirulina sinh sống ở những điều kiện và địa phương khác nhau có khác nhau về hình thái, song những đặc điểm về chất lượng nói chung tương tự nhau: Hàm lượng protein cao (65-70% trọng lượng khô), hàm lượng các axit amin không thay thế trong protein này bằng hoặc cao hơn tiêu chuẩn do FAO quy định, trừ xistein. Giàu các loại vitamin nhất là vitamin B12. Các axit nucleic chiếm khoảng 4% chất khô. Tổng số chất béo khoảng 6-7%. Trong đó các axit béo và các chất không xà phòng hoá chiếm tỉ lệ: 83% và 17%, Nhìn chung các axit béo của Spirulina là palmetic và C18 không no. Không có các axit béo với mạch cacbon lẻ. Kết quả thí nghiệm trên chuột cho thấy: độ sử dụng protein thuần (NPU) =61-63; độ hữu hiệu (PER) =2,3 (PER của cazein là 2,5). Hệ số tiêu hoá là 84%, hệ số này rất cao s với giống tảo khác, ví dụ tảo đơn bào Chlorella có hệ số tiêu hoá chỉ trên 50% do vỏ tế bào cứng bền vững đối với enzim tiêu hoá. Về độc tính, thí nghiệm 90 ngày trên chuột không thấy các biểu hiện của độc tố. 3. Phương pháp nuôi cấy. Trong việc phát triển nuôi tảo thì các tảo lục đơn bào hoặc tảo có một số tế bào, như Chlorella, Scendesmus và được chú ý hơn cả là Spirulina. Sản lượng protein tảo trên một hecta có thể đạt được 10-15 tấn năm, cao hơn nhiều lần so với cây nông nghiệp. Muốn đạt được sản lượng này cần có nhiều điều kiện thuận lợi, trước hết là một thời kì có ánh sáng mặt trời mạnh và kéo dài để có đủ năng lượng ánh sáng. Ngoài ra việc nuôi tảo đòi hỏi những thiết bị nuôi đặc biệt. Thông thường người ta dùng những bể phẳng (bể tròn) hoặc những máng phẳng uốn khúc. Những thiết bị này có các hệ thống lật đảo nhằm hạn chế sự lắng của tế bào và đưa tế bào luôn luôn trở lại bề mặt được chiếu sáng. Để đạt được nồng độ CO2 tối ưu khoảng 4-5% thì việc cung cấp CO2 là cần thiết. Nhằm mục đích này có thể sử dụng các khí thải công nghiệp. Để làm giảm sự tiêu hao năng lượng cần cho việc ly tâm tế bào từ những dịch huyền phù không đậm đặc lắm (5-10 mg/l) người ta đang nghiên cứu tách tế bào bằng phương pháp tuyển nổi và phương pháp kết bông tế bào. Vì có nhu cầu cao về ánh sáng nên việc nuôi tảo hiện nay chỉ có thể được thực hiện với hiệu quả kinh tế ở những nơi có nguồn ánh sáng mặt trời mạnh và kéo dài. Việc nuôi bằng nồi lên men được chiếu sáng nhân tạo là quá đắt và quá phiền phức về mặt kỹ thuật. Việc nuôi dị dưỡng hay tạp dưỡng trong nồi lên men (dưới ánh sáng yếu) với axetat hay glucoza làm nguồn C được tiến hành ở quy mô công nghiệp, tuy nhiên chỉ có hiệu quả kinh tế đối với phạm vi sử dụng đặc biệt trong công nghiệp dược. Trên thế giới tuỳ hoàn cảnh của từng nước người ta tổ chức sản xuất tảo theo nhiều phương thức khác nhau. Có thể sản xuất thủ công ở các ao hồ tự nhiên. Cách nuôi thủ công đơn giản ở Nhật Bản như sau: trộn phân, nước tiểu súc vật với bã cá, thêm photphat, canxi, đất, rồi đậy thật kín, ủ từ 10-20 ngày. Sau đó gạn lấy nước trong, pha thêm 20-30 lần nước cho loãng để làm môi trường nuôi cấy, có khi thêm ít sắt, lưu huỳnh. Nuôi Chlorella công nghiệp được thực hiện đầu tiên ở Hoa Kỳ. Tại đây người ta nuôi tảo trong các ống trong suốt bằng chất dẻo hình chữ U dài 21m, đường kính 1,2m với độ cao tối đa của môi trường trong ống là 6,25cm. Khí CO2 được bơm vào môi trường. Khối môi trường luôn luôn được tuần hoàn nhờ một bơm khác. Năng lượng mặt trời được biến thành nhiệt năng ở trong ống để duy trì nhiệt độ 26oC. Phương pháp này, lúc thời tiết tốt có thể đạt năng suất 11g/m /ngày. Ở CHLB Đức, tảo Scenedesmus được nuôi trong những bể tròn ngoài trời khuấy trộn môi trường bằng cơ khí. CH Sec cũng nuôi loài tảo Scenedesmus ở vùng Trabon trên diện tích 900 m2. Năng suất đạt 15 g/ m2/ ngày. Năm 1967, Viện dầu mỏ Pháp kết hợp với Viện dầu mỏ Angieri cũng bắt đầu xây dựng những cơ sở sản xuất tảo Spirulina khá lớn (diện tích 5000 m2) theo kiểu ở Sosa Texcoco. 4. Một số lưu ý khi sản xuất sinh khối tảo Làm đặc sơ bộ à Lọc bằng trọng lực và chân không. à Phá vỡ tế bào à Sấy khô à Nghiền (đối với sản phẩm tảo đã sấy khô bằng máy sấy tống quay hình trụ) à Đóng gói. Những khâu công nghệ trên đây thuộc lĩnh vực hoá công nghệ cổ điển. Tuy nhiên, trong quy trình sản xuất tảo Spirulina có nhiều đặc điểm riêng. Ví dụ, để làm đặc sơ bộ cần phải có một màng lưới đặc biệt để chọn lọc, làm đậm đặc một sinh khối từ 0,1g/ l đến 10g/l, để phục vụ cho mục đích này người ta chọn phương pháp trọng trường, đây là một phương pháp kinh tế hơn cả (tốn kém năng lượng ít hơn phương pháp li tâm). Khâu phá vỡ tế bào có ý nghĩa quan trọng, nhờ đó mà độ dính của sản phẩm giảm đi, tạo thành một dòng sinh khối có thể vận chuyển dễ dàng qua những bơm tông thường. Công đoạn sấy được thực hiện bằng máy sấy trống quay hình trụ. IV. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU MỚI 1. Nghiên cứu khả năng sử dụng nước chiết cải bắp làm cơ chất để sản xuất sinh khối vi sinh vật giàu protein. Người ta tiến hành thí nghiệm với 4 loài nấm men: Candida utilis, Pichia stipitis, Kluyveromyces marxianus, và Saccharomyces cerevisiae. Khi được nuôi cấy trên môi trường nước cải bắp thì trừ loài Candida utilis ra 3 loài còn lại đều cho lượng protein tổng nhiều hơn so với khi được nuôi trên môi trường là nước luộc thịt chứa cùng một lượng đường. Trong môi trường được lọc bằng membrane nấm men phát triển tốt hơn trong môi trường được tiệt trùng. Chỉ cần bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ là ammonium sulfate vào môi trường nước cải bắp nồng độ nitơ 0.5g/l. Bổ sung bột bắp như nguồn nitơ hữu cơ làm tăng sinh khối tế bào khoảng 11%. Bổ sung thêm chất vi lượng là 0.5 mM kẽm. Tóm lại nước cải bắp sau khi xử lý nhiệt sơ bộ với điều kiện xử lý thấp hơn tiệt trùng thì có thể dùng làm môi trường trong sản xuất sinh khối vi sinh vật giàu protein mà không cần bổ sung thêm cơ chất. 2. Sản xuất sinh khối vi sinh vật từ bã khoai tây Người ta đã tiến hành nghiên cứu sản xuất sinh khối vi sinh vật giàu protein dựa trên cơ chất là bã khoai tây. Giống vi sinh vật sử dụng ở đây là nấm koji được lên men trên môi trường rắn. Tiến hành: Trộn hỗn hợp gồm 35 kg bã khoai tây (75-78% ẩm), 5.9 kg bột khoai tây (bã khoai tây đã được làm khô, 10-15% ẩm), 0.4 kg ammonium phosphate, calcium carbonate. Tạo điều kiện hiếu khí thích hợp. Sục hơi nước ở áp suất 0.8 kg/cm2 vào hỗn hợp trong 10 phút. Sau khi làm nguội trộn thêm 1.2 kg bột khoai tây, 0.4 kg ure và 0.18 kg giống koji vào hỗn hợp. Hỗn hợp đựng trong các khay koji đặt trong phòng lên men và được ủ ở 30oC trong 2 ngày. Hàm lượng protein trung bình đạt 15%. Hàm lượng lysine methionine and isoleucine gần như trong đậu nành và thịt. Độ tiêu hóa của protein thực là 56.8. Chất dinh dưỡng tổng 60.9% chất khô và năng lượng cung cấp khoảng 2.72 Mcal/kg 3. Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm giàu protein từ nước thải của nhà máy rượu bằng cách sử dụng vi nấm. Ba giống nấm sử dụng là Trichoderma viride WEBL0702, Aspergillus niger WEBL0901 and Aspergillus oryzae WEBL0401. Sử dụng các giống này ngoài khả năng tạo sinh khối cao còn giúp làm giảm COD trong nước thải. Trong đó, giống T. viride có hiệu suất tạo sinh khối cao nhất và cần nguồn nitơ ít nhất. Có thể tạo ra 5g/l sinh khối nấm, nếu sử dụng T. viride thì không cần bổ sung cơ chất còn nếu dùng A. oryzae và A. niger thì phải bổ sung (NH4)2SO4 0.5 – 1.0 g/l. Nếu dùng T.viride thì sinh khối nấm thu được có hàm lượng protein là 19.8%, còn nếu dùng 2 loài còn lại thì hàm lượng protein khoảng 36%. T.viride cho lượng sinh khối nhiều nhất sau 24h còn A. oryzae và A. niger thì sau 48h 4. Sản xuất sinh khối vi sinh vật giàu protein và enzym a- Amylaza từ nước thải nhà máy sản xuất tinh bột sử dụng nấm mốc Aspergillus oryzae. Sử dụng thiết bị lên men có thổi khí air lift bioreactor, điều khiển quá trình lên men ở điều kiện tối ưu cho vi sinh vật: pH=5.0, to = 35oC. Năng suất quá trình:sau 1 mẻ (thời gian nuôi 12h) thu được 6-10g sinh khối/1 lít nước thải, trong đó chứa 38% protein và 55 EU/ml emzym a- Amylaza Sinh khối thu được đem di xử lý để loại bỏ 95% COD, 93% BOD và 98% các tạp chất rắn lơ lửng. Sinh khối vi sinh vật này được sử dụng cho nong nghiệp nên quá trình xử lý nguyên liệu không cần thanh trùng và cũng không cần thiết bổ sung thêm chất dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy. Sản phẩm sinh khối protein từ nấm men này chứa tới hơn 45% protein với hàm lượng đáng kể các acid amin thiết yếu và hy vọng nó sẽ trở thành thức ăn giàu chất dinh dưỡng mà gia súc có thể sử dụng được. Mặt khác, ta còn loại bỏ hơn 95% COD và BOD, 75% các hợp chất nitơ và phốt pho và các huyền phù còn lại trong nước thải của quy trình sản xuất tinh bột. Nước thải được cải tạo và phù hợp để có thể tưới tiêu trong nông nghiệp. Nếu phương thức mới này ra đời và mang tính khả thi thì nó sẽ mang lại lợi ích rất lớn cho ngành công nghiệp thực phẩm, ngành nông nghiệp và có thể bán được dưới dạng một sản phẩm sinh học giá trị gia tăng. 5. Sản xuất SCP bằng cách lên men dịch quả chanh Nuôi cấy hệ nấm mốc Aspergillus niger và Trichoderma viride trong các bình lên men, nguyên liệu là dịch lọc từ quả chanh đã được đem nghiền. 6. Sản xuất SCP từ chất thải giàu cellulose : Sử dụng hệ 2 vi sinh vật Cellulomonas flavigena và Xanthomonas sp được nuôi cấy kết hợp với nhau. Tận dụng lợi thế của từng loài vi sinh vật tạo ra được sinh khối có chất lượng cao từ chất thải giàu cellulose. 7. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi Mở đầu Hàng năm công nghiệp chế biến hoa quả nước ta thải ra hàng trăm ngàn tấn bã thải. Lượng bã thải này hiện nay vẫn chưa được xử lý riêng rẽ mà vẫn được đổ chung với nguồn rác thải thành phố vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Nếu lượng bã thải này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì sẽ là một nguồn lợi lớn. Một khó khăn của việc xử lý bã thải hoa quả đó là pH của chúng rất thấp (3-5). Lấy ví dụ bã thải dứa trong công nghiệp sản xuất rượu vang, đồ hộp, bã thải này vừa có pH thấp vừa chứa một lượng lớn cellulose. Ở pH này thông thường nhóm vi khuẩn và xạ khuẩn không hoặc kém sinh trưởng và phát triển nhưng nhóm nấm men lại hoàn toàn có thể. Đã có một số nghiên cứu sử dụng nấm sợi trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn gia súc với mục đích bổ sung protein đơn bào. Nhóm nấm sợi cũng có khả năng chịu pH nhưng với đặc tính dễ tạo thành bào tử nếu chúng được dùng trong chế biến thức ăn gia súc có thể sẽ gây ra các bệnh về đường hô hấp. Nấm men phân giải cellulose khi phát triển trên nguồn cơ chất bã thải dứa có pH thấp và giàu cellulose sẽ chuyển hoá cellulose thành nguồn protein đơn bào, nếu được dùng làm thức ăn gia súc sẽ rất tốt. Tuy nhiên trong thực tế, số lượng các loài nấm men phân giải cellulose lại ít hơn nhiều so với nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn có cùng chức năng. Nghiên cứu này tập trung vào phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose với hy vọng các chủng được lựa chọn sẽ có triển vọng ứng dụng trong việc xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn gia súc. 7.2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứuVi sinh vật : 343 chủng nấm men bao gồm các chủng phân lập được từ các mẫu bún, gỗ đang phân huỷ, từ bánh men rượu ở xung quanh Hà nội và bộ nấm men phân lập từ trước thuộc Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật.Các phương pháp nghiên cứu:-     Phương pháp xác định khả năng phân giải một số nguồn cacbon bằng phương pháp khuếch tán trên thạch -     Các phương pháp xác định đặc tính nuôi cấy của các chủng nấm men -     Phương pháp lên men xốp xác định hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm men7.3 Kết quả và thảo luậna/ Tuyển chọn các chủng nấm men phân giải cellulose: Các chủng nấm men phân lập được từ các mẫu bún, gỗ đang phân huỷ, từ bánh men rượu ở xung quanh Hà nội và bộ giống nấm men thuộc Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật được phân lập từ trước và sơ tuyển bằng phương pháp cấy vạch trên môi trường Hansen với nguồn cacbon là CMC(carboxymethylcellulose) (10g/l). Hoạt tính phân giải CMC của các chủng được dựa vào khả năng tạo vòng phân giải xung quanh vạch sau 2 ngày nuôi cấy khi thử với Lugol Những chủng nấm men có vòng phân giải CMC tiếp tục được kiểm tra khả năng phân giải CMC. Trong thí nghiệm này, tiến hành đồng thời nuôi cấy các chủng nấm men trên môi trường Hansen có nguồn đường saccharose và trên môi trường nguồn đường được thay thế bằng CMC để chiết dịch enzym cellulase. Một số công trình nghiên cứu đã cho thấy cellulase là một enzym cảm ứng, một số nguồn cacbon như glucose, saccharose, axetat, succinat lại chính là tác nhân ức chế quá trình tổng hợp enzym này. Mục tiêu tuyển chọn tiếp theo là chọn ra các chủng vừa sinh trưởng trên nguồn đường saccharose vừa có khả năng sinh enzym phân giải cellulose. Điều này gắn liền với mục tiêu chọn ra các chủng vừa có khả năng sinh trưởng trên bã thải hoa quả với hàm lượng đường còn khá cao vừa có khả năng phân giải cellulose chứa trong các bã thải này. Hoạt tính cellulase được xác định bằng phương pháp đục lỗ, khuếch tán trên thạc Kết quả cho thấy rõ ràng có những chủng có hoạt tính cellulase cao khi nuôi cấy trên môi trường có chứa CMC nhưng hoạt tính này lại rất thấp hoặc thậm chí không có hoạt tính khi nuôi trên môi trường có chứa saccharose. Điều này phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trước đây. Những chủng có hoạt tính cellulase khi nuôi cấy trên 2 loại môi trường trên và 7 chủng khác không có hoạt tính cellulase khi nuôi trên môi trường có chứa saccharosea nhưng lại có hoạt tính cao khi nuôi trên môi trường có chứa CMC tiếp tục được thử khả năng phân giải một số nguồn cacbon khác: Avicel, cellulose Những chủng nấm men có hoạt tính phân giải Avicel và cellulose cao nhất được chọn để tiếp tục các thử nghiệm sau này.b/ Nghiên cứu một số đặc điểm nuôi cấy của các chủng nấm men được lựa chọn Các thí nghiệm này phục vụ cho mục đích nghiên cứu tạo dạng “giống khởi động” (starter culture) cho quá trình xử lý bã thải hoa quả giàu cellulose từ các chủng nấm men được lựa chọnẢnh hưởng của pH nuôi cấy ban đầu Các chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường chứa CMC với các thang pH từ 3 đến 6. Nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, ở 300C. Sau 3 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính CMC-aza của các chủng nấm men Kết quả cho thấy các chủng đều có khả năng tổng hợp enzym cellulase trong dải pH môi trường nuôi cấy là 4,0 - 6,0 nhưng pH tối ưu nhất là 5,0.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Các chủng nấm men được nuôi cấy lắc trong môi trường chứa CMC, pH 5,0; 220 vòng/phút ở các thang nhiệt độ từ 200C - 450C. Sau 3 ngày xác định hoạt tính CMC-aza. men. Kết quả cho thấy các chủng nấm men được chọn để nghiên cứu đều không phải là các chủng nấm men ưa nhiệt. Chúng phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 30 - 350C tùy từng chủng. Ở nhiệt độ cao (40 - 450C), hoạt tính của các chủng đều giảm. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Vài chủng được nuôi cấy lắc ở 300C ,vài chủng khác được nuôi ở 350C; pH 5,0. Sau mỗi ngày xác định hoạt tính phân giải CMC, đồng thời xác định sinh khối tế bào thông qua hàm lượng protein Sau ngày nuôi cấy đầu tiên, các chủng được nuôi ở 350C đã đạt được hoạt tính lớn nhất. Các chủng được nuôi ở 300C đạt được hoạt tính cao nhất bắt đầu từ ngày nuôi cấy thứ hai. Qua ngày thứ ba, hoạt tính của tất cả các chủng đều giảm dần có thể do sinh trưởng của nấm men giảm dần, nguồn dinh dưỡng cạn dần hoặc do cellulase bị thủy phân. Như vậy thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tổng hợp enzym cellulase. Các kết quả nghiên cứu trên đây đã lần lượt trả lời được các câu hỏi: ở điều kiện nhiệt độ, pH nào, thời gian nuôi cấy bao lâu để hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm men cao nhất đồng thời đạt được sinh khối tế bào cao nhất. Các kết quả này rất quan trọng trong việc sản xuất “giống khởi động”, là tập hợp của các chủng nấm men được tuyển chọn, dùng trong chế biến thức ăn gia súc từ phế thải của các nhà máy chế biến hoa quả, đặc biệt là nhà máy chế biến dứa. c/ Khả năng phân giải cellulose tự nhiên Thăm dò khả năng phân giải cellulose trong bã thải dứa của các chủng nấm menCác chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường có nguồn cellulose tự nhiên là bã thải dứa. Sau 3 ngày nuôi cấy, kết quả thu được như sau: Hoạt tính phân giải nguồn cellulose tự nhiên của các chủng nấm men Trong thực tế, rất nhiều chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose hòa tan (CMC) nhưng lại không có khả năng phân giải nguồn cellulose tự nhiên hoặc phân giải rất kém nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy cả 5 chủng nấm men được tuyển chọn đều có khả năng phân giải nguồn cơ chất tự nhiên là bã dứa tuy hoạt tính không cao như khi nuôi cấy trên môi trường có chứa cellulose hòa tan. Mặc dù vậy, đây là một kết quả có ý nghĩa bởi nó giúp khẳng định rằng các chủng nấm men được tuyển chọn có thể được ứng dụng trong xử lý bã thải dứa giàu cellulose làm thức ăn chăn nuôi. Khả năng tích lũy sinh khối và hoạt tính cellulase của các chủng nấm men khi nuôi trên nguồn cơ chất bã dứa “Giống khởi động” là hỗn hợp của các chủng nấm men trên được tạo ra dưới dạng bột khô. Sử dụng dạng bột khô này cấy vào bã thải dứa với các tỷ lệ 1/100, 1/1000, 1/10.000 nhằm tìm ra tỷ lệ giống cấy thích hợp sao cho vừa đạt được sinh khối tế bào lớn nhất vừa có hoạt tính phân giải cellulose trong bã dứa cao nhất. Kết quả sự biến đổi sinh khối tế bào theo thời gian trong các mẫu bã dứa được khởi động với các tỉ lệ khác nhau Để ứng dụng các chủng nấm men này trong thực tế xử lý bã thải dứa làm thức ăn chăn nuôi còn cần tiến hành rất nhiều nghiên cứu sâu hơn nữa ở quy mô trong và ngoài phòng thí nghiệm. 4. Kết luận Từ 343 chủng nấm men phân lập được kết hợp với bộ giống nấm men của Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, 5 chủng nấm men có hoạt tính phân giải cellulose cao nhất với ký hiệu 9B1, 30B1, 97m, VTCC 2.0243, 4B2 đã được tuyển chọn. Đã xác định được các điều kiện nuôi cấy thích hợp như pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy cho các chủng nấm men được tuyển chọn Bước đầu thử nghiệm nuôi các chủng nấm men trên nguồn cơ chất tự nhiên là bã dứa cho thấy các chủng đều có hoạt tính cellulase và sinh trưởng mạnh trên nguồn cơ chất này tạo ra lượng sinh khối tế bào đáng kể. Kết quả này mở ra một hướng nghiên cứu tiếp, đó là ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn chăn nuôi. 8. Nghiên cứu công nghệ và thiết bị tận thu, làm sạch và chế biến sinh khối nấm men bia trong quá trình sản xuất bia Nấm men bia là một phụ phẩm trong quá trình sản xuất bia - một chế phẩm sinh học giàu chất dinh dưỡng, có giá trị kinh tế cao và được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, dược phẩm. ở nhiều nước trên thế giới, sinh khối nấm men được tận thu một cách triệt để, chế biến thành các chế phẩm có giá trị kinh tế cao. Một số nước có ngành công nghiệp phát triển còn đầu tư các nhà máy sản xuất sinh khối nấm men đơn bào với công suất rất lớn để chế biến thành các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu khác nhau của nền kinh tế quốc dân. Hiện nay ngành sản xuất bia ở Việt Nam đang ngày càng phát triển. Với sản lượng 800 - 900 triệu lít hiện nay và 2,1 tỷ lít đến năm 2020. Trung bình thu được 12 - 23 kg men sệt/ 1000 lít bia (tương đương khoảng 1,5 - 2,8 kg men khô). Như vậy hàng năm ta có thể thu được hàng ngàn tấn sinh khối nấm men khô. Hiện nay, tại các nhà máy bia phần lớn lượng nấm men này được xả cùng nước thải gây ô nhiễm môi trường. Tận thu sinh khối nấm men trong quá trình sản xuất bia, nghiên cứu chế biến thành các sản phẩm có giá trị kinh tế cao là một việc làm cần thiết để tận dụng ưu thế của nguồn lợi này, khép kín dây chuyền sản xuất, tránh ô nhiễm môi trường. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 1. Nguyên liệu - Chủng nấm men: Saccharomyces carlsbergensis - Hoá chất: H2SO4, NaCl, ... ở dạng tinh khiết. 2. Các phương pháp nghiên cứu Xác định hình dạng và kích thước của tế bào nấm men, xác định độ sạch cơ học, xác định số lượng tế bào nấm men, xác định tỷ lệ tế bào men chết, xác định glycogen, volutin trong tế bào nấm men bằng một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thường áp dụng tại các phòng thí nghiệm Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldal 3.Kết quả và thảo luận 3.1 Phương pháp làm sạch nấm men 3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nước rửa đến khả năng lắng kết của tế bào nấm men - Nhiệt độ nước rửa quá cao hay quá thấp chỉ số OD800 cao, tức là khả năng kết lắng của tế bào nấm men kém. - Nhiệt độ nước rửa nấm men thích hợp là: 40C. 3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian đến sự kết lắng của nấm men Từ các kết quả ở bảng 2 cho thấy thời gian để nấm men kết lắng tốt và có thể chấp nhận được là 40 phút. 3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/nấm men đến khả năng kết lắng của tế bào nấm men Kết quả thí nghiệm cho thấy nếu tỷ lệ giữa nước rửa và nấm men quá cao trên 6/1 hay nhỏ hơn 4/1 thì khả năng kết lắng của nấm men kém. Tỷ lệ nước rửa thích hợp nhất là: 5 - 6lít nước/1lít men sệt, với tỷ lệ này chỉ số OD thấp nhất. 3.1.4 ảnh hưởng của số lần rửa đến chỉ số OD800 Từ kết quả cho thấy: sau 5-6 lần rửa sinh khối nấm men có độ sạch cao nhất, OD800 thấp nhất. Vậy số lần rửa nấm men thích hợp là 5 - 6 lần. 3.2. Nghiên cứu sử dụng dung dịch axit H2SO4 và NaCl để xử lý nước rửa, nâng cao chất lượng nấm men * Nghiên cứu sử dụng dung dịch axit H2SO4 để xử lý nước rửa nấm men Nếu dùng dung dịch axit H2SO4 1% để xử lý thì mức độ tạp nhiễm của sinh khối nấm men đã giảm từ 5% xuống 1,3%. Tỷ lệ tế bào chết so với mẫu đối chứng tăng, giá trị OD800 ở các mẫu thí nghiệm lớn hơn mẫu đối chứng. Thời gian đạt đến mức độ lên men tới hạn của mẫu đối chứng ngắn hơn các mẫu thí nghiệm. Như vậy sử dụng H2SO4 1% để xử lý có tác dụng giảm mức độ tạp nhiễm và làm tăng tỷ lệ tế bào sống. * Nghiên cứu sử dụng dung dịch NaCl để xử lý nước rửa nấm men Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ NaCl thay đổi từ: 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55 %; kết quả được trình bày ở bảng 6 Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy các mẫu có sử dụng NaCl trong xử lý sinh khối nấm men so với mẫu đối chứng có tỷ lệ tế bào sống tăng lên rõ rệt và chỉ số OD800 thấp. Nồng độ muối NaCl quá thấp 0,2 - 0,25%, hay quá cao 0,5% tỷ lệ tế bào sống tăng không cao. Nồng độ muối NaCl thích hợp nhất để xử lý tế bào nấm men là: 0,40%. Bảo quản nấm men Trong quá trình bảo quản có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sinh khối nấm men. Trong đó 2 yếu tố quan trọng nhất là: nhiệt độ và thời gian bảo quản. Nhiệt độ bảo quản thích hợp: là 2 - 40C và thời gian bảo quản không quá 6 ngày. Với nhiệt độ và thời gian này tỷ lệ tế bào nấm men chết ít nhất, chỉ số AP thay đổi không đáng kể. Từ các kết quả trên cho thấy số lượng tế bào nấm men chết giảm mạnh sau khi rửa từ 8% xuống 3%, và tăng lên 15% sau 5 ngày bảo quản. Hàm lượng glycogen, volutin giảm hẳn sau khi rửa, và tiêu hao gần hết sau 5 ngày bảo quản. Độ tạp nhiễm sinh học giảm mạnh sau khi rửa và có chiều hướng tăng lên trong quá trình bảo quản. Kết luận Từ các kết quả thí nghiệm người ta rút ra một số kết luận sau: - Xác định được phương pháp làm sạch sinh khối nấm men với nhiệt độ nước rửa : 2 - 40C, thời gian kết lắng: 40', tỷ lệ nước rửa và sinh khối nấm men: 5nước/ 1nấm men, số lần rửa: 5 - 6 . - Để nâng cao chất lượng sinh khối nấm men trong quá trình rửa có thể sử dụng dung dịch H2SO4 1% và dung dịch NaCl 0,4% - Để bảo quản sinh khối nấm men: nhiệt độ bảo quản thích hợp 2 - 40C, thời gian bảo quản không quá 6 ngày. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật [2] Lê Xuân Phương, Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản xây dựng Hà Nội, 2001. [3] Lương Đức Phẩm, Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 2005, 331 trang. [4] M. T. ĐENSIKOV, Tận dụng phế liệu của công nghiệp thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1977, 249 trang. [5] Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh ( Tập 2 ) [6] Nguyễn đức Lượng, Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2002, 371 trang. [7] PGS.TSKH Lê văn Hoàng, Các quá trình và thiết bị công nghệ sinh học trong công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2004, 355 trang. PGS.TS Trần Minh TâmCông nghệ vi sinh vật ứng dụng [8] Min Ho Choi and Yun Hee Park Production of yeast biomass using waste Chinese cabbage Department of Molecular Science and Technology, Graduate School, Ajou University, 5 Wonchon-dong, Suwon 442-749, South Korea, 2002 [9] Hidenori ABE Microbial Biomass Protein Production from Potato Waste by Solid State Fermentation of Koji Fungi and This Nutritive Value in Sheep Hokkaido Animal Research Center, 2002. [10] Zhan Ying Zhanga, Bo Jina, b, , , Zhi Hui Baia, c and Xiao Yi Wanga Production of fungal biomass protein using microfungi from winery wastewater treatment aSchool of Earth and Environmental Sciences, The University of Adelaide, Adelaide, SA 5005, AustraliabAustralian Water Quality Centre, Bolivar, SA 5095, AustraliacResearch Centre for Eco-Environmental Sciences, Beijing 100085, China 2006