Đề tài Sản xuất threonine

Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 1 MỤC LỤC Trang 1 . Mở đầu ………………………………………………………………………………3 1.1 Giới thiệu chung về threonine……………………………………………………….3 1.2 Các phương pháp sản xuất threonine………………………………………………..4 2. Nguyên liệu …………………………………………………………………………..4 2.1 Nguồn nguyên liệu dùng trong công nghiệp………………………………………...4 2.2 Nguyên liệu phụ .........................................................................................................5 2.3 Giống Vi sinh vật........................................................................................................7 3. Quy trình công nghệ......................................................................................................9 4. Giải thích quy trình công nghệ......................................................................................9 4.1 Xử lý rỉ đường.............................................................................................................9 4.2 Chuẩn bị môi trường ………………………………………………………………..11 4.3 Nhân giống và cấy giống.............................................................................................12 4.4 Lên men ......................................................................................................................12 4.5 Ly tâm........................................................................................................................15 4.5 Trao đổi ion.................................................................................................................15 4.7 Cô đặc chân không .....................................................................................................18 4.8 Sấy phun…………………………………………………………………………….19 4.9 Đóng gói……………………………………………………………………………..20 5. Sản phẩm……………………………………………………………………………...21 5.1 Chỉ tiêu cảm quan……………………………………………………………………21 5.2 Chỉ tiêu hóa lý………………………………………………………………………..21 5.3 Chỉ tiêu vi sinh…………………………………………………………………….....21 6.Thành tựu công nghệ......................................................................................................22 Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 2 Danh Mục Hình Hình 1.1.1.1 Công thức cấu tạo Threonine…………………………………………......3 Hình 2.3.1 Vi khuẩn E.coli...............................................................................................7 Hình 3.1 Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất L – Threonine...................................9 Hình 4.1.1.1 Thiết bị nồi phản ứng...........................................................................10 Hình 4.1.3.1 Thiết bị ly tâm lọc.......................................................................................11 Hình 4.4.3.1 Con đường tổng hợp threonine...................................................................14 Hình 4.4.4.1 Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học.......................................................15 Hình 4.6.6.1 Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion....................................................18 Hình 4.7.4.1 Thiết bị cô đặc chân không dạng màng rơi hai cấp.....................................19 Hình 4.8.3.1 Thiết bị sấy phun kết hợp với sấy băng tải..................................................20 Hình 5.1 Sản phẩm L- Threonine thương mại…………………………………………..21 Danh Mục Bảng Bảng 1.1.2.1 Lượng axit amin cần thiết trong thức ăn………………………………….3 Bảng 2.1.1 Thành phần các chất trong mật rỉ…………………………………………...5 Bảng 2.2.1 Tiêu chuẩn của nước.......................................................................................6 Bảng 2.2.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men................................7 Bảng 5.3.1 chỉ tiêu vi sinh của Sản Phẩm L- Threonine...................................................21 Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 3 1 . Mở đầu : 1.1 Giới thiệu chung về threonine: 1.1.1 Cấu tạo: Hình 1.1.1.1 Công thức cấu tạo Threonine - Tên hóa học: (2S,3R)-2-Amino-3-hydroxybutanoic Acid - Công thức hóa học: C4H9NO3 - Mã di truyền: ACU, ACC, ACA, ACG - Khối lượng phân tử : 119.12 g/mol - Nhiệt độ nóng chảy: 2560C 1.1.2 Ứng dụng của threonine: - Trong thực phẩm hằng ngày: Trong những 20 acid amine đươc tìm thấy thì threonine là một trong 10 acid amine không thay thế ( histidine, isoleucine, lysine, methionine, leucine, phenylamine, threonine, triptophan, Arginine và valine ) rất cần thiết cho bữa ăn hằng ngày. Bảng 1.1.2.1 Lượng axit amin cần thiết trong thức ăn (Số mg axít amin trong 1g N trong protein, số trong dấu ngoặc là lấy sữa bằng 100 để so sánh) Tên Isoleucine Leucine Valine Phenylalanine Methionine Threonine Tryptophan Lysine Sữa người 320 (100) 620 (100) 370 (100) 580 (100) 220 (100) 270 (100) 100 (100) 420 (100) Sữa bò 320 (100) 590 (97) 410 (111) 630 (109) 200 (91) 270 (100) 92 (92) 480 (114) Trứng 330 (103) 530 (87) 410 (111) 660 (114) 380 (173) 290 (107) 100 (100) 440 (105) Thịt bò 300 (94) 550 (90) 340 (92) 600 (103) 215 (98) 280 (104) 81 (81) 570 (136) Gạo 280 (88) 520 (85) 370 (100) 670 (116) 270 (123) 220 (81) 80 (80) 210 (50) Ngô 240 (75) 780 (128) 340 (92) 650 (112) 260 (118) 240 (89) 240 (89) 47 (47) Bột mì 260 (81) 440 (72) 270 (73) 480 (83) 210 (95) 170 (63) 69 (69) 150 (36) Chức năng chính của threonine là hỗ trợ hình thành collagen và elastin - hai chất liên kết tế bào trong cơ thể. Ngoài ra, nó rất tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch và thúc Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 4 đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất.Tuy nhiên, những người ăn chay cần phải cân nhắc loại acid amin này vì nó tồn tại chủ yếu trong thịt. Và để bổ sung threonine, bạn có thể ăn phó mát làm từ sữa đã gặn kem, gạo tấm, đậu tươi, lạc, hạt điều. Thế nhưng hàm lượng amin này trong các nguồn trên lại rất thấp, nên buộc phải dùng sinh tố bổ sung. - Trong công nghệ hóa học: ứng dụng làm chất hoạt động bề mặt, làm mỹ phẩm… - Trong Y học, dược học: dùng làm thành phần hòa tan trong thuốc chứa bệnh, hồi sức… 1.2 Các phương pháp sản xuất threonine: 1.2.1 Thủy phân Protein: - Cơ chất là bột mì, bột đậu nành, Protein từ máu, keratin… - Đây là phương pháp cổ điển, hiệu suất rất thấp, khó thực hiện, và khó điều khiển các thông số . - Sản phẩm tạo ra sẽ nằm dưới dạng D - Sản xuất threonine theo phương pháp này thì giá thành sản phẩm sẽ cao . 1.2.2 Tổng hợp hóa học: - Ưu điểm là sản xuất ổn định, có thể chuẩn hóa điều kiện sản xuất và hiệu suất. - Nhược điểm là vấn đề tinh sạch khó khăn do sản phẩm tạo ra dưới dạng hỗn hợp( dạng L và dạng D). - Ứng dụng trong công nghệ hóa học hay là làm thức ăn cho 1 số loài gia cầm. 1.2.3 Chuyển hóa sinh học: - Dùng những sinh khối của vi sinh vật để chuyển hóa 1 cơ chất thành sản phẩm thông qua 1 hay 2 phản ứng . - Vấn đề tinh sạch và điều khiển thông số khó hơn phương pháp lên men, - Khó thực hiện vì phản ứng có thể là nội bào hay ngoại bào nên không có cơ chế điều hòa của vi sinh vật. - Cơ chất tham gia phải có cấu tạo tương tự như sản phẩm. Nên phạm vi ứng dụng bị hạn chế . - Để khắc phục người ta kết hợp với phương pháp hóa học: tổng hợp ra các tiền thân của các acid amine sau đó dùng vi sinh vật để chuyển thành L- threonine. 1.2.4 Phương pháp lên men: - Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thức ăn để lấy acid amine - Đây là phương pháp thông dụng nhất, sản lượng và sản phẩm tạo ra có chất lượng cao hơn, giá thành sản phẩm rẻ hơn . - Tận dụng được những nguồn cơ chất rẻ tiền, đơn giản.Phương pháp tiến hành và điều khiển thông số dễ dàng 2. Nguyên liệu : 2.1 Nguồn nguyên liệu dùng trong công nghiệp: Trong công nghiệp nguồn nguyên liệu được sử dụng là dịch thủy phân tinh bột và mật rỉ đường. Trong bài này ta sẽ khảo sát quá trình sản xuất threonine từ nguyên liệu là mật rỉ. Mật rỉ đường: - Rỉ đường là phế liệu chứa đựng nhiều đường không kết tinh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường. Rỉ đường là nguồn nguyên liệu phổ biến, tương đối lớn, giá thành rẻ. - Thông thường tỉ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm khoảng 3-5% trọng lượng mía Ưu điểm : - Giá rẻ - Khối lượng lớn , dồi dào - Sử dụng tiện lợi - Nguồn cung cấp khá phổ biến Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 5 Bảng 2.1.1 Thành phần các chất trong mật rỉ Thành phần Mật rỉ từ củ cải đường Mật rỉ từ mía Chất khô (% kl mật rỉ) 76 – 84 75 – 83 Sucrose (% kl chất khô) 58 – 64 32 – 45 Raffinose 0 – 4,2 - Glucose - 5 – 11 Fructose - 6 – 15 Đường nghịch đảo 0 – 1,2 - Chất hữu cơ phi đường -Chứa ni tơ -Không chứa ni tơ 19 5 5 10 Nitơ tổng 1,7 – 2,4 0,4 – 1,5 Tro 8,5 – 17,1 7 – 11 pH 6,2 – 8,4 4,5 – 6,0 Thành phần tro của rỉ đường mía( % tổng khối lượng tro): K2O 30 – 50; Na2O 0,3 – 9,0; CaO 7 – 15; MgO 2 – 14; P2O5 0,5 – 2,5; SiO2 1 – 7 và các chất khoáng khác. Lượng vitamin ( µg/ 1g rỉ đường ) : - Thiamin : 8,3 - Biotin : 12,0 - Pyridoxine : 6,5 - Riboflavin : 2,5 - Axit nicotinic : 21,0 - Axit folic : 0,038 - Axit pantothenic : 21,4 Bảo quản: - Thiết bị chứa citern. - Trong rỉ đường luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn,thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua,dẫn đến làm giảm chất lượng của rỉ đường.Vì vậy, trong sản xuất ta hay dung fluosilicat natri để bảo quản. Tiêu chuẩn lựa chọn nguyên liệu: - Chất khô >= 75% - Hàm lượng saccharose : 50 - 51% lượng đường. - Hàm lượng N không ít hơn 1.4% - Số lượng vi sinh vật không quá 15000 cfu/1g nguyên liệu. - Khi sử dụng rỉ đường, có thể dùng những con số sau để tính toán pha môi trường(%) - Saccharose = 50% - Đường khử: 6 - 9% Cần bổ sung thêm : Nguồn N là ure hoặc amoni sulfat. Nguồn P là supephosphat (khoảng 1% so với rỉ đường). Rỉ đường trước khi đem sử dụng cần phải được xử lý: pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1, acid hóa bằng H2SO4 tới pH=2.8-3.0 và ly tâm thu dịch trong. 2.2 Nguyên liệu phụ : Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 6 Tiêu chuẩn các nguyên liệu dùng trong lên men: MgSO4.7H2O : KH2PO4 : - Độ tinh khiết : 99,5% - Độ tinh khiết : 98% - Fe : ≤ 0.0015% - P2O5 : ≥ 40% - Pb : ≤ 0.0005% - K2O : ≥ 53% - Cl : ≤ 0.01% - Pb : ≤ 0.001% - As : ≤ 0.0004% - As : ≤ 0.0003% L – Methionine : MnSO4.8H2O: - Màu trắng - Độ tinh khiết: 98% - Độ tinh khiết : 99.6% - Mn: ≥ 31.8% - Fe: < 30ppm - Fe: ≤ 0.004% - Pb: ≤ 15ppm - As: ≤ 5ppm - Cd: ≤ 10ppm CaCO3: - Độ tinh khiết: ≥ 98% - Fe2O3 : ≤ 0.012% - MgO : ≤ 0.2% - Al2O3: ≤ 0.04% - SiO2 : ≤ 0.02% - Na2O: ≤ 0.02% Nước: tiêu chuẩn nước dùng trong công nghệ thực phẩm Bảng 2.2.1 Tiêu chuẩn của nước Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Chỉ tiêu vật lý Mùi vị Độ trong (ống Dienert) Màu sắc (thang màu coban) Không có 100 mL 5o Chỉ tiêu hóa học pH CaO MgO Fe2O3 MnO BO4 3- SO4 2- NH4 + NO2 - NO3 - Pb As Cu Zn F 6.0 - 7.8 50 - 100 mg/L 50 mg/L 0.3 mg/L 0.2 mg/L 1.2 - 2.5 mg/L 0.5 mg/L 0.1 - 0.3 mg/L không không 0.1 mg/L 0.05 mg/L 2 mg/L 5 mg/L 0.3 - 0.5 mg/L Chỉ tiêu vi sinh Tổng số vi sinh vật hiếu khí < 100 cfu/mL Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 7 Chỉ số Coli (số Coli/1 lít nước) Chuẩn số Coli (số mL nước có 1Coli) Vi sinh vật gây bệnh < 20 >50 Không có Yeast extract Bảng 2.2.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men Thành phần Hàm lượng Protein 27.8g Cacbohydrate 11.8g Nước 37g Tro 23.4 Vitamin Khoáng Thiamin 9.7mg Ca 86mg Riboflavin 14.3mg Fe 3.7mg VitaminB6 1.3mg Mg 180mg Folate 1010mcg P 104mg Vitamin B12 0.5mcg K 2600mg Choline 65.1mg Na 3600mg Zn 2.1mg Cu 0.3mg 2.3 Giống Vi sinh vật: Để tổng hợp ra threonine có thể dùng các giống vi khuẩn sau: Escherichia coli, serratia marcescens, Brevibacterium flavum and corynebacterium glutamicum. Hình 2.3.1 Vi khuẩn E.coli Trong số các loại này, thì E.coli và các chủng đột biến của nó có những ưu điểm là tốc độ sinh trưởng cao. Trong năm 2002, sản lượng sản xuất threonine của thế giới đạt khoảng 30000 tấn, với tốc độ tăng trưởng hàng năm khoảng 15%/năm . Qua đột biến tạo được các chủng tổng hợp threonine cao như là: E. coli H-7256, E. coli H- 7729, E. H-8311, E. coli H-8460, E. coli TF427, B. flavum BD122, B. flavum AJ12314. Trong bài này ta sử dụng giống: E. coli TRN212 Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 8 Vi khuẩn E. Coli - Phân loại khoa học - Vực (domain): Bacteria - Ngành (phylum): Proteobacteria - Lớp (class): Gamma Proteobacteria - Bộ (ordo): Enterobacteriales - Họ (familia): Enterobacteriaceae - Chi (genus): Escherichia - Loài (species): E. coli - Tên hai phần: Escherichia coli Đặc tính chung: - Là loại trực khuẩn hình que, kích thước (1,1 - 1,5) x (2 - 6)μm, Gram (−) và yếm khí tùy tiện. - Loài vi khuẩn này có bộ gen di truyền giống như Shigella spp. Chúng được xếp loại theo tính kháng nguyên của chúng, chủ yếu là kháng nguyên loại O và H. - Loài vi khuẩn này chịu được môi trường axit và nhiệt độ lạnh tốt hơn hẳn các vi khuẩn khác. - Vi khuẩn này tồn tại rất lâu trong môi trường và nhạy cảm với việc thanh trùng. Tiêu chuẩn chọn giống: - Khả năng sinh tổng hợp threonine càng cao càng tốt - Khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng: dễ nuôi cấy, thích nghi tốt với môi trường, tốc độ sinh sản nhanh. - Điều kiện nuôi cấy: môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền. - Khả năng sinh độc tố: không có - Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản. Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 9 3. Quy trình công nghệ: Hình 3.1 Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất L – Threonine 4. Giải thích quy trình công nghệ: 4.1 Xử lý rỉ đường: 4.1.1 Pha loãng sơ bộ: 4.1.1.1 Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình acid hóa. 4.1.1.2 Các biến đổi: - Hóa học: giảm nồng độ chất khô. Mật rỉ Xử lý rỉ đường Lên men Ly tâm Trao đổi ion Cô đặc chân không Sấy phun Bã Chuẩn bị môi trường Nhân giống Vi khuẩn E. coli Cấy giống Bao gói Sản phẩm Bao bì Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 10 - Vật lý: giảm độ nhớt. - Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất. 4.1.1.3 Phương pháp thực hiện: pha loãng với nước theo tỉ lệ Vmật rỉ : Vnước = 1 : 1 4.1.1.4 Thiết bị: Nồi phản ứng Nồi phản ứng làm bằng thép không rỉ dùng để tiến hành các quá trình hoá - lý khác nhau. Nồi phản ứng là một thiết bị dạng xilanh đứng có thể tích từ 0,1 ÷ 100 m 3 hoặc hơn, có áo hơi. Bên trong thiết bị có cơ cấu đảo trộn dạng tuabin hở. Nồi phản ứng - máy trộn có thể tháo rời hay hàn cố định với các bộ phận đáy elip và nắp. Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm, để nối ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để nạp và thải chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế. Sau khi nạp vào thiết bị một lượng nước nhất định.Tiến hành đun nóng môi trường đến một nhiệt độ đã cho bằng phương tiện điều chỉnh tự động. 1- Ống nối để nạp chất tải nhiệt; 2- Ống chảy tràn sản phẩm; 3- Ống quá áp; 4- Đầu nối ống nạp nguyên liệu; 5- Cửa quan sát; 6- Cửa thoát chất tải nhiệt; 7- Cửa vào của chất tải nhiệt; 8- Cửa ra của sản phẩm; 9- Cửa thoát chất tải nhiệt. Hình 4.1.1.1 Thiết bị nồi phản ứng 4.1.1.5 Thông số công nghệ: - Tần số trộn của máy khuấy 0,2 ÷ 0,33 vòng/s, phụ thuộc vào dạng cơ cấu trộn và các tính chất của các cấu tử đem trộn. - Khi thiết kế máy trộn dạng tuabin, số vòng quay 3 ÷ 3,3 vòng/s, dạng khung 0,33 ÷ 1 vòng /s. - Dẫn động máy trộn được thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc. 4.1.2 Xử lý dịch pha loãng: Acid hóa Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 11 4.1.2.1 Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật 4.1.2.2 Các biến đổi: - Hóa học: đường saccharose chuyển thành glucose và fructose dưới sự xúc tác của acid; pH giảm về 2.8-3.0 - Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ - Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt do nhiệt độ cao và pH thấp. 4.1.2.3 Phương pháp thực hiện: Lượng acid sunfuric đậm đặc thêm vào là 5% khối lượng dung dịch. Trong giai đoạn này, ta đun dung dịch đến 90-95oC trong 6 giờ. Sau đó ta tiến hành ly tâm thu dịch trong. 4.1.2.3 Thiết bị : (hình 4.1.1.1) 4.1.3 Ly tâm thu dịch trong: 4.1.3.1 Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men 4.1.3.2 Các biến đổi: - Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan - Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng - Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lượng riêng dung dịch 4.1.3.3 Thiết bị và thông số công nghệ: Hình 4.1.3.1 Thiết bị ly tâm lọc 4.2 Chuẩn bị môi trường : 4.2.1 Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men 4.2.2 Các biến đổi: - Hóa học: nồng độ đường đạt 15-22% khối lượng dung dịch, pH tăng - Vật lý: nhiệt độ giảm 4.2.3 Thực hiện: Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 12 - Tiếp tục thêm nước để đạt được dung dịch có nồng độ đường từ 15-22%. Đây là nồng độ đường thích hợp cho quá trình lên men. - Thêm dung dịch NaHCO3 đến khi dung dịch đạt pH = 6.8 -7.2 - Hạ nhiệt độ dung dịch về 30-32oC 4.2.4 Thiết bị và thông số công nghệ: Nồi phản ứng (hình 4.1.1.1). Môi trường lên men: thành phần môi trường lên men - Glucose: 70g/L - (NH4)2SO4: 28g/L - KH2PO4: 1g/L - MgSO4.7H2O: 0.5g/L - MnSO4.8H2O: 5mg/L - FeSO4.7H2O: 5mg/L - CaCO3: 30g/L - L – methionine: 0.15g/L - Yeast extract: 2g/L - PH: 7.0 4.3 Nhân giống và cấy giống: 4.3.1 Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men 4.3.2 Các biến đổi: - Sinh học: số lượng tế bào tăng lên nhanh chóng. - Hoá sinh: xảy ra các phản ứng trao đổi chất - Vật lý: nhiệt độ tăng - Hóa học, hóa lý: các biến đổi không đáng kể 4.3.3 Phương pháp thực hiện: Từ giống gốc, ta hòa vào nước lấy 5ml dung dịch chứa giống cần dùng sau đó tiến hành nuôi cấy trong môi trường như gần giống với môi trường sản xuất. Sơ đồ nhân giống: - Trong phòng thí nghiệm: 5mL– 50mL – 500mL – 5L - Trong phân xưởng : 5L – 50L – 500L – 5 m3 – 50 m3. Lưu ý: Trong quá trình nhân giống ta nên cho môi trường tối thích để vi sinh vật phát triển ở những cấp nhân giống đầu. Sau đó, nên pha loãng với môi trường sẽ nuôi cấy để lên men nhưng tăng từ từ để vi sinh vật thích nghi dần với môi trường mới. Nên sản phẩm thu được sau này sẽ cao hơn, hoạt tính vi sinh vật mạnh hơn. 4.4 Lên men : 4.4.1 Bản chất : Nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các sản phẩm trao đổi chất là threonine. Trong đó treonine là chất trao đổi bậc 1. 4.4.2 Mục đích công nghệ : Khai thác Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 13 Quá trình lên men nhằm thu nhận threonine từ nguồn nguyên liệu và vi sinh vật ban đầu. 4.4.3 Các biến đổi: - Vật lý: + Xuất hiện gradient nhiệt độ trong dung dịch + Khối lượng dung dịch bị thay đổi + Tỷ trọng dung dịch bị thay đổi + pH thay đổi - Hóa sinh: Các phản ứng trong con đường tổng hợp Threonine Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 14 Hình 4.4.3.1 Con đường tổng hợp threonine Để tạo ra lượng Threonine nhiều , ta nên ức chế con đường L – aspartate – β seminal dehyde tạo ra Lysine - Những phương pháp hiệu chỉnh: + Tạo ra những chủng có biệt hóa sinh hóa để tạo ra lượng Threonine nhiều hơn . Phương pháp là gây đột biến hoặc là tái tổ hợp gen. + Làm thực nghiệm để lựa chọn hàm lượng yếu tố sinh trưởng thích hợp bổ xung vào môi trường. + Liên tục kiểm tra các thông số công nghệ trong suốt quá trình lên men để tạo ra là tối đa. Luôn giữ các điều kiện tối ưu cho vi khuẩn phát triển như: pH = 6.8 – 7.2, nhiệt độ từ 30– 320C. 4.4.4 Thiết bị: Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 15 1- Động cơ; 2- Hộp giảm tốc; 3- Khớp nối; 4- Ổ bi; 5- Vòng bít kín; 6- Trục; 7- Thành thiết bị ; 8- Máy khuấy trộn tuabin; 9- Bộ trao đổi nhiệt kiểu ống xoắn; 10- Khớp nối; 11- Ống nạp không khí; 12- Máy trộn kiểu cánh quạt; 13- Bộ sủi bọt; 14- Máy khuấy dạng vít; 15- Ổ đỡ; 16- Khớp để tháo; 17- Ao; 18- Khớp nạp liệu; 19- Khớp nạp không khí Hình 4.4.4.1 Thiết bị lên men có bộ đảo trộn cơ học 4.4.5 Thông số công nghệ: Cấy giống vi sinh vật vào thiết bị lên men có đảo trộn cơ học, tiến hành lên men bề sâu trong điều kiện yếm khí. - Nhiệt độ lên men: 30 - 32oC - pH = 7 - Thời gian lên men: 2 ngày - Lượng giống cấy : 5% thể tích dung dịch - Lượng threonine tạo thành: 27g/L 4.5 Ly tâm: 4.5.1 Mục đích công nghệ: - Chuẩn bị: Loại bỏ sinh khối vi sinh vật sau quá trình lên men, chuẩn bị cho quá trình sấy phun. - Khai thác: quá trình ly tâm nhằm mục đích phân riêng huyền phù. Thu nhận dịch lên men. 4.5.2 Các biến đổi: - Vật lý: giảm thể tích và khối lượng của bán thành phẩm - Hóa lý: thay đổi trạng thái từ dạng huyền phù sang dung dịch. - Hóa học: tổn thất một số chất theo bã. 4.5.3 Phương pháp thực hiện: Quá trình ly tâm có thể dùng máy ly tâm lọc ( Hình 4.1.3.1) 4.6 Trao đổi ion: 4.6.1 Nguyên lý : Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự tương tác giữa điện tích của các acid amine trong mẫu và các nhóm tích điện được cố định trên bề mặt trao đổi. Acid amine được gắn vào các bề mặt nhờ các liên kết tĩnh điện. Sự bền vững của liên kết được xác định bởi trị số điện tích của acid amine, mà trị số này lại phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ muối (của dung dịch đệm). Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các acid amine đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách acid amine. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 16 Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những acid amine này, có thể dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn. Khi đó, phân tử acid amine sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient. Các phân tử acid amine nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những acid amine nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại acid amine. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại acid amine khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết acid amine sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Ngoài việc dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta có thể dùng các loại muối khác như KCl, Na3PO4, ta tăng nồng độ ion của pha động (dung dịch rửa giải) (sử dụng gradient, những ion này sẽ thay thế phân tử acid amine tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion âm, ta thêm muối natri clorua trong dung dịch tách giải bởi vì ion Cl- sẽ tranh bám vào cột với các acid amine có điện tích âm, do đó, những acid amine mang điện tích âm được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Điện tích của acid amine phụ thuộc vào pH của môi trường: - Nếu pH lớn hơn pI thì acid amine tích điện âm - Nếu pH nhỏ hơn pI thì acid amine tích điện dương - Nếu pH bằng pI thì acid amine không tích điện. Trong trường hợp threonine có pI = 5,64 nên nếu pH của dung dịch đệm lớn hơn 5,64 thì acid amine sẽ tích điện âm. Độ mạnh của tương tác tĩnh điện giữa acid amine và chất trao đổi phụ thuộc vào sự hác biệt giữa pI của và pH của dung dịch đệm. Vì thế, threonine có pI = 5,64 sẽ được gắn chặt hơn trên cột trao đổi anion nếu acid amine ở trong dung dịch đệm có pH bằng 8 hơn tại pH bằng 7. Để acid amine có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó (cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit). pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp. 4.6.2 Mục đích công nghệ: Khai thác Bằng phương pháp trao đổi ion, ta thu được threonine tinh khiết hơn, nên mục đích của quá trình trao đổi ion là khai thác. 4.6.3 Các biến đổi của nguyên liệu: - Vật lý: khi ta cho các hạt nhựa trao đổi ion vào trong một dung dịch, chúng sẽ trương nở và gia tăng thể tích. Kèm theo đó là sự solvate hóa xảy ra. Các cấu tử tích điện trong mẫu lỏng sẽ thế chỗ cho các ion trên pha rắn, ngược lại các ion trên pha rắn sẽ dịch chuyển vào mẫu lỏng. Đồng thời các phân tử dung môi và chất tan sẽ dịch chuyển vào bên trong cấu trúc xốp của các hạt nhựa theo nguyên tắc thẩm thấu. - Hóa học: làm thay đổi thành phần hóa học trước và sau xử lý. - Hóa lý: một số cấu tử không tích điện sẽ bị hấp phụ trong mao dẫn của các hạt nhựa. - Hóa sinh và sinh học: trao đổi ion không làm biến đổi các quá trình hóa sinh và sinh học. Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 17 4.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng: - Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ thì sự khuếch tán của các cấu tử trong dung dịch tăng lên. Tuy nhiên, khi nhiệt độ cao có thể gây ra những phản ứng phụ không mong muốn đồng thời làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình xử lý. - Thời gian: đây là một thông số quan trọng. Nếu thời gian xử lý của mẫu với ionit quá ngắn thì phản ứng trao đổi ion xảy ra không hoàn toàn. Ở đây ta cần chú ý đến tính chất cân bằng của ionit. 4.6.5 Các thông số vận hành : - Threonine thu nhận từ canh trường sau lên men có pI = 5,64. Chọn pH vận hành là pH=7 thì threonie sẽ tích điện âm. Khi đó ta thực hiện trao đổi anion. - Dung dịch đệm sử dụng là đệm phosphate 0,05M có pH=7 - Dung dịch rửa giải là hỗn hợp gồm đệm phosphate 0,05M có pH=7 và dung dịch NaCl 0,5 - 1M (tỉ lệ thể tích 1:1) - Nhiệt độ : 25-300C - Sau quá trình trao đổi ion: hiệu suất thu hồi threonine từ 70 – 75% 4.6.6 Thiết bị: Thiết bị có dạng hình trụ đứng, đáy cầu và được chế tạo bằng thép không rỉ. Phía trên đáy là tấm lưới đỡ. Người ta sẽ cho các hạt nhựa trao đổi ion lên tấm lưới này. Khi cho ionit tiếp xúc với dung dịch, các hạt nhựa sẽ trương nở. Chiều cao của lớp hạt nhựa trong quá trình hoạt động thường dao động từ 1-2m. ở phía dưới tấm lưới người ta thường cho các chất mang dạng hình cầu. Vai trò của các chất mang này là để hạn chế sự xáo trộn của các cấu tử trong dòng ra và để bào toàn gradient nồng độ trong quá trình hoạt động của thiết bị. Dưới cùng tại cửa thoát là một tấm lưới lọc để ngăn cản sự cuốn trôi các hạt nhựa trao đổi ion ra khỏi thiết bị. Ở phía bên trên các hạt nhựa là ống để phân phối mẫu nguyên liệu. Nguyên liệu sẽ được bơm vào thiết bị qua ống phân phối. Tại đây, nguyên liệu sẽ được phân bố đều trên hình tròn của mặt cắt thân trụ rồi chảy xuống bên dưới. Sản phẩm được lấy ra tại cửa đáy . Người ta thường sử dụng quá trình trao đổi ion để gắn cấu tử cần thu nhận lên cột ionit. Như vậy, khi cho mẫu nguyên liệu qua thiết bị trao đổi ion thì sản phậm cần thu nhận sẽ bị giữ lại trên cột. Sau đó, người ta dùng một dung dịch đệm có pH hoặc lực ion thích hợp đế tách sản phẩm ra khỏi cột.dung dịch rửa giải cũng sẻ cho vào cột qua bộ phận phân phối rồi di chuyển theo chiều tử trên xuống dưới. Tùy theo bản chất của các ion gắn trên hạt nhựa mà người ta sẽ chọn “dung dịch tái sinh” phù hợp. Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 18 1. Tấm lưới đỡ các ionit 6. Cảm biến định mức dịch lỏng trong thiết bị 2. Hạt nhựa trao đổi ion 7. Cửa nạp nguyên liệu cần xử lý 3. Chất mang làm giá đỡ 8. Cửa tháo sản phẩm 4. Lưới lọc 9. Cửa tháo nước vệ sinh (sử dụngchế độ chảy ngược) 5. Ống phân phối nguyên liệu Hình 4.6.6.1 Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion Hình 4.6.6.2 Thiết bị trao đổi ion 4.7 Cô đặc chân không : 4.7.1 Bản chất : nâng cao nồng độ chất khô các sản phẩm bằng phương pháp bay hơi nước. - Cô đặc chân không là cô đặc mà áp suất làm việc trong buồng bốc hơi nước rất thấp nhờ sự hoạt động của 1 bơm chân không. - Nhiệt độ cô đặc chân không thấp, khoảng 60oC nên ít làm biến đổi sản phẩm. 4.7.2 Mục đích công nghệ: Chuẩn bị Quá trình cô đặc làm tăng hàm lượng chất khô, tiết kiệm chi phí cho quá trình sấy phun tiếp theo. 4.7.3 Các biến đổi: Vật lý: - Nồng độ chất hòa tan tăng, độ ẩm giảm - Nhiệt độ, độ nhớt, khối lượng riêng tăng - Thể tích, khối lượng giảm - Hệ số truyền nhiệt giảm Hóa lý: Sự bốc hơi nước Sinh học: - Hạn chế khả năng hoạt động của vi sinh vật do nồng độ chất khô cao - Tiêu diệt 1 số loại vi sinh vật do nhiệt độ cao Hóa sinh: vô hoạt các enzyme. 4.7.4 Phương pháp thực hiện: - Thiết bị: sử dụng hệ thống cô đặc chân không dạng màng rơi hai cấp Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 19 Hình 4.7.4.1 Thiết bị cô đặc chân không dạng màng rơi hai cấp 4.7.5 Thông số công nghệ: - Nồng độ sau khi cô đặc đạt được từ 40 – 50%. - Nhiệt độ cô đặc: 55 - 60oC - Thời gian cô đặc: 1- 2giờ - Áp suất chân không: 700 - 720mmHg 4.8 Sấy phun: 4.8.1 Mục đích công nghệ: - Chế biến : Quá trình sấy tạo ra chế phẩm dạng bột - Bảo quản : giảm lượng ẩm vì vậy sẽ ức chế được sự phát triển của vi sinh vật 4.8.2 Các biến đổi nguyên liệu: - Vật lý: giảm khối lượng do tách bớt nước ra khỏi sản phẩm - Hóa học: Nồng độ chất khô tăng - Hóa lý : xảy ra sự bay hơi nước và các chất dễ bay hơi - Sinh học và hóa sinh: không đáng kể vì thời gian ngắn và qúa trình cô đặc đã làm vô hoạt enzyme và tiêu diệt hầu hết vi sinh vật. 4.8.3 Thiết bị: Trong công nghiệp thường sử dụng hệ thống thiết bị sấy phun kết hợp với sấy băng tải Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 20 1- bơm đưa nguyên liệu vào buồng sấy; 2- đầu phun; 3- buồng sấy phun; 4- màng lọc khí 5- bộ phận gia nhiệt hoặc làm nguội không khí; 6- bộ phận phân phối không khí nóng cho buồng sấy phun; 7- băng tải lưới; 8, 9- buồng sấy kết thúc; 10- buồng làm nguội; 11- bộ phận tháo sản phẩm; 12- cyclone thu hồi sản phẩm; 13- quạt; 14- hệ thống thu hồi bột từ cyclone; 15- bộ phận xử lý sản phẩm; 16- bộ phận thu hồi nhiệt từ dòng khí thoát. Hình 4.8.3.1 Thiết bị sấy phun kết hợp với sấy băng tải 4.8.4 Thông số công nghệ : - Nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào 200 - 2700C - Thời gian lưu trong buồng sấy: 10 – 30 giây - Sản phẩm sau khi sấy có độ ẩm: 3 – 5% Sản phẩm sau khi sấy phun được đưa qua bộ phận rây để phân loại kích thước trước khi vào thiết bị đóng gói. 4.9 Đóng gói: 4.9.1 Mục đích công nghệ: - Bảo quản: đảm bảo ổn định chất lượng sản phẩm. - Hoàn thiện sản phẩm 4.9.2 Phương pháp tiến hành: Sử dụng hệ thống thiết bị đóng gói theo nguyên tắc liên tục và tự động hóa Lựa chọn vật liệu bao bì : - Bao bì lựa chọn để đóng gói threonine dạng sản phẩm bột là bao bì plastic - Bao bì plastic có thể là bao bì một lớp hay là bao bì được ghép nhiều lớp từ những vật liệu khác nhau. - Ưu điểm : + Nhẹ hơn tất cả các loại bao bì khác, thuân tiện cho việc chuyên chở. + Bao bì có đạt độ mềm dẻo tốt + Có những loại bao bì plastic có độ cứng vững cao, chống qua chạm cơ học hiệu quả. + Chống thấm khí, hơi + Có thể in ấn nhãn hiệu dễ dàng . Cách đóng gói: Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 21 - Các màng plastic sẽ được ghép bằng phương pháp hàn nhiệt, - Màng sẽ được ghép mí ở hai bên và đáy trước. - Sản phẩm sẽ đươc đưa vào ở phần đỉnh của bao - Cuối cùng sẽ ghép mí ở phần đỉnh bao. Chú ý : - Để tăng hiệu quả cho đóng gói có thể đóng gói có hút chân không, hoặc là nạp khí N2, CO2. 5. Sản phẩm: Hình 5.1 Sản phẩm L- Threonine thương mại 5.1 Chỉ tiêu cảm quan: - Màu sắc: vàng nâu - Trạng thái: dạng bột mịn, đồng nhất, không vón cục 5.2 Chỉ tiêu hóa lý: - Hàm lượng threonine: 94 - 96% - Độ ẩm: 3 - 5% 5.3 Chỉ tiêu vi sinh: Bảng 5.3.1 chỉ tiêu vi sinh của Sản Phẩm L- Threonine Chỉ tiêu Hàm lượng cho phép Tổng số vi khuẩn yếm khí cfu/g (ml) ≤ 50.000 Coliform ≤30 E.Coli Không phát hiện Salmonella Không phát hiện Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 22 6.Thành tựu công nghệ: Ngày nay xuất hiện nhiều bằng phát minh về các loại giống vi sinh vật khác nhau để sản xuất threonine, hướng phát triển công nghệ đến những nguồn nguyên liệu sử dụng khác nhau, rất kinh tế: metanol, các nguồn hydrocabon… Và sản lượng và hiệu suất lên men threonie cũng tăng lên đáng kể. Theo thư mục bằng sáng chế quốc tế thì hàm lượng và năng suất L-Threonine thu được gia tăng liên tục trong 20 năm qua trong quá trình lên men L-threonine. Quá trình lên men thông thường tiến hành cho đến khi hàm lượng của L-threonine hay của sản phẩm mong muốn đạt đến một cực đại. Ngoài việc gây đột biến gen, người ta còn sử dụng các biện pháp như là tái tổ hợp gen để nâng cao sản lượng threonine cần thu nhận. Theo bằng sáng chế của Mỹ số US007378267B1 thì lượng L- threonine được tạo ra từ vi khuẩn E.coli được tái tổ hợp gen là 112g/L với hiệu suất là 45.2% trong 77 giờ nuôi cấy. Sản xuất threonine GVHD: PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn SVTH: Nhóm 5 Page 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Ái , Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP.HCM-2005 [2] Lê Văn Việt Mẫn ,Công nghệ sản xuất các loại sản phẩm từ sữa và thức uống (tập 1 ) ,Nhà xuất bản Đại Học QuốcGia TP.HCM-2004 [3]Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự,Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản Đại Học QuốcGia TP.HCM-2009 [4] Trần Thị Thu Trà,Công nghệ bảo quản và chế biến lương thực ( tập 1 ), Nhà xuất bản Đại Học QuốcGia TP.HCM-2007 [5] Lương Đức Phẩm,Công nghệ vi sinh vật,Nhà xuất bản Nông Nghiệp-2001 [6] Phạm Văn Bôn, Nguyễn Đình Thọ. Quá trình và thiết bị truyền nhiệt . Nhà xuất bản Đại Học QuốcGia TP.HCM-1992 [7] Võ Văn Bang, Vũ Bá Minh. Quá trình và thiết bị ( tập 3 ) . Nhà xuất bản Đại Học QuốcGia TP.HCM-2000 [8] Nguyễn Lâm Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty . Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục-1998 [9]Đống Thị Anh Đào,Kỹ thuật bao bì thực phẩm,Nhà xuất bản Đại Học QuốcGia TP.HCM.2008 [10]. Trương Văn Lung , Công nghệ sau thu hoạch , Tủ sách khoa học Đại học Huế.-2002 [11]Rehm H.J., Reed G. Biotechnology ( volume 6 ). VCH Publisers, Weinheim, 1996 [12] Sahm H., Eggeling L., Eikmanns B., Kramer R. Construction of L-lysine-, L- threonine-, or L-isoleucine-overproducing strains of Corynbacterium glutamicum. Ann New York Acad Sci 1996. www.freepatentsonline.com/ www.tcvninfo.org.vn/ www.remco.com/ www.pic.uk.net/ www.novasep.com/Technologies/Ion-exchange.asp/ www.niroinc.com/ www.apv.com