Đề tài Sarratia mescescens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ((
Serratia mercescens GVHD: Nguyễn Minh Nhật NHÓM SVTH: 1.Nguyễn Phan Ngọc Tuyền 2.Trần Lê Hà Tuyên 3.Lương Ngọc Tuấn Anh -2011- Mục lục Trang Chương I: Tổng quan tác nhân gây độc 2 Lịch sử phát hiện 2 Phân loại 3 Đặc điểm 3 Đặc điểm chung 3 Đặc điểm sinh hoá 3 Cấu trúc 4 Cấu trúc tế bào 4 Cấu trúc phân tử 4 Cơ chế gây bệnh 4 Bệnh và các triệu chứng 5 Các biện pháp phòng và xử lý bệnh 5 Chương II: Các phương pháp xác định 7 Các phương pháp truyền thống 7 Các phương pháp hiện đại 12 Chương III: Kết luận và đề nghị 13 Tài liệu tham khảo Lời mở đầu Thời gian gần đây, tại nhiều nước trên thế giới, từ Mỹ, Anh, Đức, Thụy Sĩ đến Trung Quốc, Thái Lan... đâu đâu cũng thấy cảnh báo về sự lây nhiễm các loại vi khuẩn kháng kháng sinh (MRSA methicilline-resistant staphylococcus aureus) dẫn đến tử vong trong các bệnh viện. Cho dù các biện pháp vệ sinh hiện đại nhất đã được áp dụng song số người chết vì nhiễm khuẩn bệnh viện vẫn ngày một gia tăng. Sự hoành hành của các chủng siêu vi khuẩn trong bệnh viện đang khiến giới y học đặc biệt quan tâm. Chương I: Tổng quan về tác nhân gây ngộ độc Lịch sử phát triển:  Năm 1819, Bartolomeo Bizio, một dược sĩ từ Padua, Italia, phát hiện và đặt tên Serratia mercescens khi ông xác định được vi khuẩn là nguyên nhân của một sự đổi màu máu kỳ diệu của polenta. Bizio Serratia tên trong danh dự của một nhà vật lý người Ý tên là Serrati, người phát minh ra chiếc tàu hơi nước, và Bizio chọn marcescens (từ chữ Latin) bởi vì các sắc tố máu đã được tìm thấy nhanh chóng biến mất. Trước đây nó được biết dưới nhiều tên khác nhau: Chromobacterium prodigiosum, Gaughran et al. Và 1823 được Bizio đặt là S. marcescens.Ban đầu nó được xem là vi khuẩn vô hại, và được thường sử dụng như một dấu ấn trong ngành sinh học vì có thể dễ dàng nhận ra màu đỏ khuẩn lạc của nó1896. Mãi cho đến sau năm 1950, chính phủ Hoa Kỳ đã làm thử nghiệm với Serratia marcescens và thấy những ảnh hưởng bất lợi do vi khuẩn này gây ra. Trong "Chiến dịch Sea Spray" Quân đội Hoa Kỳ đầy bóng bay với Serratia marcescens và phát nổ chúng trên San Fransisco. Marcescens Serratia đã được lựa chọn bởi vì nó đã được dễ dàng theo dõi do sản xuất sắc tố của nó.  Mặc dù Serratia marcescens đã được phân loại như là một tác nhân gây bệnh của con người vào những năm 1960, nhưng nhà khoa học vẫn còn sử dụng nó như là một loại vi khuẩn tốt vào những năm 1970. Phân loại: Ngành: Proteobacteria.Lớp: Gamma Proteobacteria.Bộ: Enterobacteriales. Họ: Enterobacteriaceae. Chi: Serratia. Loài: Serratia marcescens. Hình 1.1 S. marcescens trên thạch XLD Đặc điểm: Đặc điểm chung: Serratia là một giống trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi, thuộc họ Enterobacteriaceae. Chủng phổ biến nhất, S. marcescens, đồng thời là mầm bệnh duy nhất thường gây ra những trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện. Đặc điểm sinh hóa:- Enzyme Catalase.- Enzyme Gelatinease.- Enzyme Esculinase.- Enzyme Dnase. Cấu trúc: Cấu trúc tế bào: Màng cấu trúc đặc trưng của vi khuẩn G- ,di động, sinh bào tử. Phát triển ở 5 – 400C, nhiệt độ tối ưu là 370C, pH trong khoảng 5 -9. Có thành tế bào mỏng làm bằng một lớp duy nhất là peptidoglycan được bao bọc bởi một lớp màng bên ngoài. Các màng ngoài có lipopolysaccharides (LPS), là một loại đặc biệt của phospholipid gồm các axit béo được gắn vào một dimer phosphate glucosamine. Một glucosamine gắn liền với một polysaccharide cốt lõi mà mở rộng đến các polysaccharides O. Các màng ngoài cũng là một phương tiện để điều tiết sự hấp thu chất dinh dưỡng và loại trừ các độc tố. Cấu trúc phân tử: Các bộ gen của chủng Serratia marcescens Db11 được lập trình tự từ Viện Sanger với sự cộng tác của Dr.Jonathan Ewbank của Trung tâm d'Immunologie de Marseille Luminy. Các bộ gen hoàn thành bao gồm một nhiễm sắc thể tròn đơn 5.113.802 bp có chứa một hàm lượng G + C của 59,51%. Cơ chế gây bệnh:
Enzyme Lactamase. Khi xâm nhập vào cơ thể S.mercescens tiết ra 1 loại enzyme Lactamase. Đây là loại enzyme có khả năng kháng sinh có cấu trúc vòng
(đa phần là các chủng loại kháng sinh cũ). Vì vậy khi điều trị cần phải có phác đồ thật chính xác, dùng loại kháng sinh thế hệ mới và có cấu trúc sai khác
. Ngoại ra còn có sự giúp sức của enzyme Proteas. Chính ezyme này có nhiệm vụ phá huỷ các cấu trúc ptotein trong đại thực bào cũng như là hệ thống phòng nhiễm của cơ thể làm cơ thể suy giảm sức đề kháng và cộng với sự kháng kháng sinh của enzyme Lactamase đã tạo nên sự khó khăn trong công tác điều trị và phòng ngừa. Bệnh và các triệu chứng: Serratia marcescens là phổ biến. Nó thường được tìm thấy trong đất, nước, thực vật và động vật. Phương thức lây truyền của vi sinh vật này bằng cách liên hệ trực tiếp, hoặc bằng ống thông . Có nhiều bệnh có liên quan với Serratia marcescens: viêm phổi bệnh viện, nhiễm trùng huyết, viêm màng não và áp xe não, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng mắt….Sau đây là 2 bệnh đặc trưng do Serratia marcescens gây ra. Viêm phổi bệnh viện: là bệnh viêm phổi được phát hiện sau khi bệnh nhân nhập viện sau 48 giờ.( Triệu chứng: như sốt, ho, khạc đờm nhầy mủ, khó thở, hội chứng đông đặc. Triệu chứng của viêm phổi thường bị che lấp bởi bệnh lí khác ví dụ như: nhiễm độc, dị ứng thuốc, xẹp phổi, nhồi máu phổi, suy hô hấp, suy tim sung huyết, viêm khí phế quản. Ngoài ra, viêm phổi do hít sặc phải dịch dạ dày rất khó phân biệt với viêm phổi do vi khuẩn. Nhiễm trùng huyết:( Triệu chứng: thân nhiệt tăng, tim đập nhanh, thở nhanh. Cộng thêm ít nhất một thông số chứng tỏ có tình trạng giảm tưới máu cơ quan hoặc rối loạn chức năng cơ quan hay thay đổi trạng thái tinh thần:- PaO2 ≤ 75mm Hg ( không khí phòng ).- Tăng Lactate huyết thanh.- Thể tích nước tiểu < 30ml/h. Ở trẻ em nước tiểu < 0,5ml/kg/h). Các biện pháp phòng và xử lí bệnh: Các biện pháp phòng tránh:- Thực hiện tốt vệ sinh bệnh viện.- Vệ sinh các dụng cụ y tế đặc biệt là các dụng cụ trong thao tác đặt ống thông.- Hạn chế sự lây chéo từ nhân viên y tế qua bệnh nhân.- Giảm tải các phòng bệnh.- Thực hiện rửa tay sau khi thăm khám cho bệnh nhân. Điều trị: Có nhiều phương pháp điều trị khác nhau. Nhưng thông dụng nhất là dùng một số loại kháng sinh liều cao để khống chế và lấn át, tránh hiện tượng kháng thuốc.( Sau đây là một số loại kháng sinh dùng điều trị viêm phổi bệnh viện do vi khuẩn gây ra:- Ceftriaxon.- Aztreonam.- Vancomycin.- Ciprofloxacin IV.- Clindamycin.( Điều trị bệnh nhiễm trùng huyết:- Điều trị bằng kháng sinh: Ampicilline, Aminoglycoside.- Protein C hoạt hóa.- Hồi sức bồi phụ dịch.- Thuốc vận mạch và trợ tim.- Liệu pháp Insuline tích cực.- Liệu pháp Corticosteroide.- Liệu pháp thay thế chức năng thận và lọc máu.- Dinh dưỡng điều trị. Chương II: Các phương pháp xác định. Phương pháp truyền thống ( phương pháp nuôi cấy ): _ Bước 1: Cân 25g mẫu, thêm vào 225 ml Buffer Pepton Water. Đồng nhất mẫu trong 1 phút. _ Bước 2: Cấy trang mẫu trên môi trường MacconKey. Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ. _ Bước 3: Đọc kết quả: khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi, bóng, có màu sắc đỏ do sắc tố Prodigiosin tạo thành.
Hình 2.1: Hình thái khuẩn lạc đặc trưng của S.mercescens. Phản ứng test sinh hoá khẳng định S.mercescens: Phản ứng dương tính với Esculine: (Mục đích: Xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. (Cơ sở sinh hóa: - Esculin là hợp chất nhân tạo. - Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen.
Hình 2.2: Phản ứng dương tính của S.mercescens với Esculine. Phản ứng dương tính với thử nghiệm Catalase: ( Cơ sở sinh hoá: Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý. H2O
H2O + O2 (bọt khí).( hydrogen peroxide) ( Thực hiện: - VSV lấy từ môi trường nuôi cấy- Đặt lên lam kính sạch.- Nhỏ H2O2 30%.- Quan sát sau 1 -2 giây.Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện.Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện.
Hình 2.3: Thử nghiệm dương tính của S.mercescens với Catalase. Phản ứng chỉ thị màu biểu hiện khả năng lên men:( Môi trường: Phenolred brothbase bổ sung 0.5 – 1 % đường lactose.( VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH ( thay đổi màu chất chỉ thị phenolred.( Phản ứng dương (+): môi trường chuyển vàng.( Phản ứng âm (-): môi trường có màu đỏ.
Hình 2.4: Thử nghiệm dương tính của S.mercescens với thử nghiệm lên men. Phản ứng dương tính với thử nghiệm Gelatine:( Cơ sở sinh hóa:Gelatine
polypeptide + acid amin.Gelatine trong môi trường dinh dưỡng ( môi trường đông đặc.VSV phân hủy gelatine( môi trường lỏng.( Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine.( Dạng ống nghiệm thạch sâu.( Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.( Đọc kết quả.(+) môi trường tan chảy.(-) môi trường không tan chảy.
Hình 2.5: Thử nghiệm dương tính của S.mercescens với Gelatine. Phản ứng dương tính với thử nghiệm Lipase: ( Cơ sở sinh hoá: Lipit
thành các mảnh nhỏ hơn, tạo thành quầng sang rõ ràng xung quanh vùng có Lipase.
Hình 2.6: Thử nghiệm dương tính của S.mercescens với Lipase. Phản ứng dương tính với thử nghiệm Dnase: ( Cơ sở sinh hóa: DNA
các mảnh nhỏ hơn làm mất liên kết với Cation Methyl blue tạo thành quầng sáng nơi có vi sinh vật có DNase phát triển. 
Hình 2.7: Thử nghiệm dương tính của S.mercescens với DNase. Phản ứng âm tính với Indol:( Cơ sở sinh hóa: Cấy VSV vào môi trường canh trypton. Thuốc thử là Kovac’s. Đem ủ 370C trong 24 giờ.Phản ứng (+): Xuất hiện vòng đỏ trong môi trường.Phản ứng (-): Không đổi màu.
Hình 2.8: Thử nghiệm dương tính giả của S.mercescens với Indol. Bảng tổng kết các thử nghiệm sinh hóa: Stt  Thử nghiệm sinh hóa  Kết quả   1  Thử nghiệm Esculine  (+)   2  Thử nghiệm Catalase  (+)   3  Thử nghiệm lên men  (+)   4  Thử nghiệm Gelatine  (+)   5  Thử nghiệm Lipase  (+)   6  Thử nghiệm Dnase  (+)   7  Thử nghiệm Indol  Dương tính giả   Bảng 2.1: Tổng kết các thử nghiệm sinh hoá. Phương pháp hiện đại: Phương pháp PCR DNA đích được tách ra như được mô tả ở trên hoặc chuẩn bị trực tiếp từ các khuẩn lạc của vi khuẩn. Ba khuẩn lạc được chọn từ môi trường dinh dưỡng cho vào 50
l nước cất vô trùng và đun sôi trong 15 phút và sau đó ly tâm trong 5 phút 13.000vòng. Các chất lơ lửng bề mặt được chuyển đến một ống nghiệm và sử dụng như nguồn gốc của DNA đích, lưu trữ ngay ở -20 ° C cho đến khi cần. Chiết xuất DNA (0,1,
) hoặc chất lỏng bề mặt (1,
) đã được phủ lên một hỗn hợp phản ứng với dầu khoáng sản. Các phản ứng hỗn hợp và dầu trước đây đã được chạy qua ánh sáng tia cực tím bước sóng ngắn trong 10 phút để ngăn sự gây nhiễm cho DNA Mồi được dùng là ERIC1 (5'-GTGAATCCCCAGGAGCT TACAT-3 ') và ERIC2 (5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGA GCG-3 ') (16). Phản ứng hỗn hợp (100
l khối lượng) có chứa 1 U của Taq polymerase, 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,01% (wt / vol) gelatin, 250 uM deoxynucleoside triphosphate, và 1 uM mồi đơn. Khuếch đại được thực hiện trong PHC chu kỳ-3, với tất cả đều thực hiện với nhiệt độ như sau: 95°C trong 5 phút để biến tính mẫu; 94°C trong 1 phút, 26oC trong 1 phút, và 72°C trong 2 phút, 40 chu kỳ 94°C trong 30s, 40°C trong 30s, và 72°C trong 1 phút, và cuối cùng, 72oC trong 10 phút. Những mẫu âm đã được chuẩn bị, không có bổ sung các mẫu DNA. Sản phẩm khuếch đại (10
l) được tách bằng điện di gel agarose trong gel agarose 1,6% trong Tris-borat-EDTA ethidium bromide đệm chứa (1 PLG / ml), ở 30 V trong 6 giờ, và định hình bởi UV transillumination. Tất cả các mẫu đã được chuẩn bị và kiểm tra ít nhất ba lần. Các mẫu PCR được coi là giống hệt nhau trên cơ sở các số tương tự và các vị trí phù hợp ở tất cả các hàng. Sự khác biệt nhỏ trong cường độ của các hang mờ đã được bỏ qua. 

Hình 2.9: Kết quả điện di của S.mercescens.Chương III: Kết luận và đề nghị Theo nhận định của nhiều chuyên gia y tế, hơn 1/3 số trường hợp nhiễm trùng mắc phải ở bệnh viện có thể tránh được nếu như tuân thủ nghiêm các biện pháp thực hành chống nhiễm khuẩn đơn giản là phòng ngừa phổ cập. Phòng ngừa phổ cập ở đây được hiểu là các biện pháp nhằm ngăn chặn sự lây truyền HIV, HBV, HCV và những tác nhân gây bệnh theo đường máu khác trong bệnh viện như rửa tay hoặc sát khuẩn tay thường quy, thực hiện tiêm an toàn, xử lý khử khuẩn dụng cụ y tế, vệ sinh môi trường bệnh viện, xử lý chất thải y tế mà đặc biệt là vật sắc nhọn...Thực tế cho thấy, qua hoạt động chỉ đạo thực hiện điểm về chống NKBV của ngành y tế Hà Nội tại một số bệnh viện, tỷ lệ bác sỹ tuân thủ vệ sinh bàn tay đã tăng lên đáng kể, từ đó giảm rõ rệt tỷ lệ NKBV. Đơn cử tại BV Hà Đông, tỷ lệ NKBV giảm từ 14,8% (trước can thiệp) xuống còn 1,28% sau can thiệp; BV Đan Phượng, giảm từ 2,3% (trước can thiệp) xuống còn 0% sau can thiệp.NKBV đem lại hậu quả rất lớn nên trách nhiệm phòng, chống không chỉ của riêng bệnh nhân, nhân viên y tế mà còn là của cả xã hội, trong đó có ý thức thực hiện và việc đầu tư đầy đủ cơ sở vật chất cho đơn vị y tế.