Đề tài So sánh các chủng nấm men đang được sử dụng trong các nhà máy sản xuất cồn êtylic ở Việt Nam từ nguyên liệu rỉ đường

sinh lí cũng như điều kiện nuôi cấy. Men ép chứa trung bình 75% nước và 25% chất khô. Các chất khô của nấm men bao gồm thành phần sau: Protit 30-50% Gluxit 24-40% Chất béo 2-5% Chất khoáng 5-11% Gluxit của nấm men chủ yếu là glucogen (C6H10O5)n, đây là chất dự trữ của tế bào. Theo thành phần cấu tạo thì glucogen giống như amylopectin nhưng khác là khối lượng phân tử lớn hơn. Hàm lượng của nó trong tế bào men có thể từ 20-40% và tuỳ thuộc trước hết vào môi trường dinh dưỡng. Trong môi trường dư đường, lượng glucogen tăng đáng kể. Trong giai đoạn đầu của lên men nồng độ đường còn cao nên nấm men chứa nhiều glucogen. Khi lượng đường giảm, nấm men sẽ sử dụng glucogen để duy trì sự sống. Dưới tác dụng của a-amylaza, glucogen sẽ biến thành maltoza và dextrin. Protit chứa trong nấm men rượu thường vào khoảng 35-40% và có đủ các axit amin không thay thế được. Về giá trị dinh dưỡng thì protit nấm men tương đương protit động vật nhưng giá trị hơn protit thực vật. ở nhiệt độ cao và bình thường, dưới tác dụng của proteazacó sẵn trong nấm men, protit sẽ biến thành pepton, peptit và axit amin. Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất, hàm lượng khoảng 2-5% khối lượng chất khô. Trong nấm men còn chứa các chất tương tự chất béo như lơxitin và sterin. Trong số đó quan trọng hơn cả là ecgosterin, chất này dễ biến thành vitamin D dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời và còn gọi là tiền vitamin D. Hàm lượng vào khoảng từ 0,3-1,4% chất khô của nấm men. Chất khoáng chiếm từ 5-11%. Tuy với số lượng ít nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của tế bào nấm men, đặc biệt là photpho. Photpho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của photphatit, nucleoproteit cũng như axit nucleic. Trong tế bào nấm men có chứa các ion Kali, canxi, magie, sắt, lưu huỳnh và axit silic. Lưu huỳnh có trong thành phần protit ở dạng –SH hoặc –S-S-. Lưu huỳnh và sắt đều tham gia phản ứng oxy hoá khử. Sắt cùng với các hợp chất vô cơ khác như kẽm, mangan, đồng, magie... là những chất không thể thiếu đối với nhiều enzim oxy hoá (oxydaza, katalaza, peroxydaza). Magie cũng như lưu huỳnh và photpho còn có tác dụng làm hoạt hoá photphataza trong quá trình lên men. Caxni giúp và loại bỏ các chất độc thải ra khi lên men, đồng thời giúp cho tổng hợp protit, làm tăng quá trình oxy hóa và có tác dụng tạo thành một số vitamin. Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin B1 có trong thành phần của coenzim cacboxylaza. vitamin B2 có ở dạng este photphoric, axit nicotin có trong cozymaza... Biotin và axit paraaminobenzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của nấm men. trong tế bào nấm men chứa nhiều loại vitamin và với hàm lượng khá lớn nên hiện nay nấm men được coi là nguồn nguyên liệu quí trong sản xuất một số vitamin. Trong điều kiện sản xuất rượu, nguồn thức ăn của nấm men như gluxit và chất khoáng thường có sẵn và đủ trong môi trường. Vitamin với số lượng rất ít thường được cung cấp từ chế phẩm amylaza đưa vào khi đường hoá. Riêng nguồn nitơ thường không đủ, phải được bổ sung từ ure hoặc amon sulphat. Theo nghiên cứu của Cônôvalôp, lượng nitơ hoà tan cần có trong môi trường lên men rượu phải vào khoảng 0,35-0,4g/l. Nếu thiếu nitơ nấm men sẽ phát triển chậm, thời gian lên men kéo dài, hiệu suất lên men giảm. II.3.4 Đặc điểm sinh lí sinh hoá của tế bào nấm men Nấm men giống như các vi sinh vật khác cần nguồn năng lượng để phát triển và sinh sản. Chúng phân huỷ các chất dinh dưỡng bằng các phản ứng oxy hoá khử để giải phóng năng lượng và tạo nên các chất chuyển hoá để tổng hợp nên các thành phần cấu trúc tế bào. Nấm men là vi sinh vật hô hấp tuỳ tiện. Trong điều kiện đủ oxy chúng sẽ chuyển các chất có trong môi trường để cung cấp năng lượng và bộ xương cacbon cho việc xây dựng cơ thể theo phương trình sau: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 34ATP aC6H12O6 + bO2 + cNH4OH dCxHyOzNt + eCO2 + fH2O Trường hợp này nấm men sử dụng các hợp chất nitơ, photpho và các muối khoáng để tạo sinh khối. Các axit amin tạo ra được hoạt hoá và liên kết với ARN hoà tan rồi chuyển vào Riboxom. ở đây diễn ra sự tổng hợp các mạch peptit và protit. Ngược lại trong điều kiện yếm khí nấm men phân giải đường thành rượu và các sản phẩm khác: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Saccharomices Cerevisiae có thể lên men các loại đường như: glucoza, fructoza, saccharoza, tiếp theo là đường maltoza và cuối cùng là đường maltotrioza. Nấm men này chỉ có thể sử dụng 1/3 phân tử Rafinoza. Các loại hợp chất nitơ thích hợp nhất đối với nấm men là các axit amin, rồi đến các nitơ vô cơ như (NH4)2HPO4, ure, amonsunfat II.3.5. Sinh sản và phát triển của nấm men Trong môi trường dinh dưỡng đầy đủ, nấm men sinh sản và phát triển rất nhanh. Nấm men có thể sinh sản theo phương pháp nẩy chồi, phân chia, vừa nảy chồi vừa phân chia, và trong điều kiện không thuận lợi nấm men có tạo bào tử để duy trì sự sống. Có thể khẳng định nẩy chồi là phương pháp sinh sản chủ yếu của nấm men. Bản chất của phương thức nảy chồi: Khi tế bào nấm men phát triển đến một giới hạn nhất định thì bắt đầu xảy ra hiện tượng nẩy chồi. Đầu tiên nhân dài ra và bắt đầu thắt lại thành mấu nhỏ. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Nhân một phần chuyển vào tế bào con và một phần ở lại tế bào mẹ. Đồng thời một phần nguyên sinh chất cũng được chuyển sang tế bào con. Chồi con lớn dần, khi gần bằng tế bào mẹ nó được tách ra và sống độc lập. Một tế bào mẹ có thể tạo một lúc một hay nhiều chồi con. Sau mỗi lần nẩy chồi trên, tế bào mẹ có một vết sẹo. Sự sắp xếp chồi con ở trên tế bào mẹ không nhất thiết phải ở một nơi cố định. ii.3.6. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nấm men Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật tuân theo một quy luật nhất định. Sinh khối (g/L) Biểu thị quy luật sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bằng một đồ thị người ta gọi là đồ thị sinh trưởng hay đường cong sinh trưởng. Thời gian (h) Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn Giai đoạn thứ nhất: Giai đoạn này gọi là pha tiềm phát, giai đoạn này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến lúc bắt đầu thấy sự sinh trưởng và phát triển nhanh. ở giai đoạn này, nấm men chỉ làm quen với môi trường nuôi cấy mà chưa tiến hành sinh sản. Kích thước của tế bào bắt đầu tăng dần do sự trao đổi chất với môi trường mạnh. Thời gian pha này ngắn hay dài phụ thuộc rất nhiều vào sinh lý của giống vi sinh vật đưa vào nuôi cấy và chất lượng của thành phần môi trường. Giai đoạn thứ hai: Còn gọi là pha cấp số hay pha logarit. Pha này biểu hiện rõ nét bởi tốc độ sinh sản của vi sinh vật đạt cực đại. Tế bào vừa sinh sản mạnh, vừa tăng sinh khối. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật tăng theo cấp số nhân theo phương trình sau: N1 = N0 x 2n Trong đó: N0 : số tế bào lúc đầu N1: số tế bào đạt được n : số thế hệ Trong giai đoạn này nồng độ các chất dinh dưỡng giảm nhanh do vi sinh vật sử dụng chúng rất mạnh. ở giai đoạn này vi sinh vật tổng hợp enzim với số lượng và chất lượng cao. Do vậy mục đích của quá trình nuôi cấy là thu nhận các chất có hoạt tính sinh học cao hoặc tế bào có khả năng hoạt động mạnh người ta thường kết thúc ở giai đoạn này. Giai đoạn thứ ba: là giai đoạn cân bằng hay ổn định,tổng số tế bào sinh ra gần bằng số tế bào chết đi nên số tế bào vi sinh vật trong giai đoạn này không thay đổi. Các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy giảm một cách rõ rệt. Các chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất được tích luỹ trong môi trường rất lớn. Giai đoạn thứ tư: Gọi là pha suy vong. ở giai đoạn này số lượng tế bào sinh ra và chết đi không cân bằng nhau. Số tế bào chết tăng nhanh. Sở dĩ như vậy là do: Chất dinh dưỡng trong môi trường giảm và dẫn đến hết nên vi sinh vật không đủ chất dinh dưỡng để duy trì quá trình trao đổi chất, bên cạnh đó tế bào lại già, sản phẩm trao đổi chất trong môi trường quá nhiều gây ức chế cho quá trình trao đổi chất của tế bào. ii.3.7. Cơ chế vận chuyển chất dinh dưỡng của tế bào Trong điều kiện nuôi cấy thuận lợi nấm men sinh sản và phát triển nhanh. Đường và các chất dinh dưỡng từ môi trường lên men, trước tiên được hấp thụ vào trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua màng bề mặt bán thấm đó mà thấm vào trong tế bào. Sự khuyếch tán qua vỏ tế bào và màng nguyên sinh chất này tuân theo những quy luật chung của sự khuyếch tán. Trong khi nước được vào ra tế bào một cách tự do thì đường và các chất dinh dưỡng khác chỉ được cho đi vào mà không cho quay ra. Thông qua các hoạt động sống của tế bào nấm men mà trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men liên tục xảy ra những phản ứng sinh hoá phức tạp để tổng hợp chất này và phân huỷ chất kia. Vì vậy, đường được đưa vào tế bào nấm men rồi bị chuyển hoá qua một chuỗi các phản ứng enzim để tạo thành sản phẩm cuối cùng là rượu etylic và CO2. Rượu etylic và CO2 được tạo thành liền thoát ra khỏi tế bào và khuyếch tán ra môi trường xung quanh. Vì rượu hoà tan vào nước theo tỷ lệ bất kỳ nên nó có thể khuyếch tán vào môi trường một cách nhanh chóng. Khí CO2 cũng có thể hoà tan được trong dịch thể song độ hoà tan của nó trong nước không lớn lắm (ở nhiệt độ 25-30oC và áp suất 760 mmHg, một lít nước hoà tan được 0,865-0,837 lit CO2). Độ hoà tan của khí CO2 trong rượu lớn gấp 3 lần trong nước. Do vậy mà trong môi trường lên men nhanh chóng được bão hoà khí CO2. Khi môi trường lên men bão hoà CO2, liền đó CO2 hấp thụ lên bề mặt nấm men và những vật thể rắn khác của môi trường. Khi khí CO2 thoát ra khỏi dung dịch liền tạo thành các bọt và kết hợp vững chắc với các tế bào nấm men. Khi các bọt đạt đến độ lớn nào đó thì lực nâng của chúng vượt quá trọng lượng của tế bào, bọt cùng tế bào nổi lên trên bề mặt. Đến bề mặt bọt bị vỡ ra, khí bay vào khí quyển còn tế bào nấm men chìm xuống. Như vậy, tế bào nấm men vốn dĩ không di động trở thành chuyển động được trong môi trường lên men khiến cho sự trao đổi chất ở trong tế bào trở nên mạnh mẽ hơn và sự lên men cũng được tăng lên một cách tương ứng. ii.4. Quá trình lên men rượu etylic [5] Lên men là một quá trình trao đổi chất qua đó các hợp chất hữu cơ trước hết là đường bị biến đổi dưới tác dụng xúc tác của enzim thành các sản phẩm tích tụ trong môi trường. Trong tế bào nấm men có chứa những enzim thực hiện các quá trình sinh hoá khác nhau trong đó có các quá trình lên men rượu. II.4.1. Cơ chế của phản ứng lên men rượu Lên men rượu là quá trình sinh học rất phức tạp, biến đổi các chất có đường thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác dưới tác dụng của nhiều enzim của vi sinh vật. Nấm men là vi sinh vật tạo lên sự lên men rượu điển hình. Nấm men có đặc điểm là trong điều kiện yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành rượu và khí cacbonic một cách hợp thức và không có khả năng chuyển hoá tiếp các ethanol đã được tạo thành,như vậy là sự lên men dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích luỹ rượu etylic. Các enzim của nấm men thuỷ phân đường phức tạp thành đường đơn giản. Đường Glucoza và fructoza là những loại đường đơn giản dễ lên men và lên men nhanh, đường Maltoza lên men chạm,đường Glactoza lên men chậm hơn. Trong rỉ đường có nhiều đường Glucoza và Fructoza nhờ enzim invertaza. Cơ chế của phản ứng lên men rượu rất phức tạp, bao gồm một chuỗi các phản ứng: -Giai đoạn 1: Phôtphoril hoá monosacarit dưới tác dụng của glucokinaza C6H12O6 + ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP -Giai đoạn 2: Đồng phân hoá: Tiếp đó Gluco-6 photphat do tác dụng của enzym đồng phân gluco photphat- izomeraza sẽ biến thành fructôphtphat : CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH -Giai đoạn 3: Photphoril hoá Fructoza 6 photphat: Dưới tác dụng của enzim photphofructokinaza, phân tử ATP thứ hai sẽ đính thêm một gốc photphat nữa vào fructo-6-photphat để tạo thành fructo-1,6-diphotphat và phân tử ADP thứ 2: CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH +ATP CH2O(H2PO3)COCH2O(H2PO3) -Giai đoạn 4: Phân huỷ fructoza 1-6 diphotphat: Phân cắt mạch cacbon của fructodiphotphat thành hai phân tử trioza : gồm aldehyt photphoglyxeric và photphodioxyaxeton CH2O(H2PO3)COCH2O(H2PO3) CH2O(H2PO3)CHOHCHO + CH2O(H2PO3)COCH2OH -Giai đoạn 5: Đồng phân hoá dưới tác dụng của triozaphotphattizomeraza Di hydroxyaxeton – photphat Glyxeraldehyt – 3photphat CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO -Giai đoạn 6: Hai phân tử aldehyt photphoglyxeric bị oxy hoá. Phản ứng này có sự tham gia của axit photphoric trong canh trường nhờ xúc tác của enzim triphotphatđehdronazacoenzim của nó là NAD(Nicotinamit-Adenin-Dinucleotit). 2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 +2NADH+ 2CH2O(H2PO3)CHOHCOO ~H2PO3 + 2NAD.H2 -Giai đoạn 7:Tiếp theo với sự tham gia của photphoglyxeratkinaza, gốc photphat chứa cao năng của axit1,3-diphotphoglyxeric sẽ chuyển vào phân tử ADP. Kết quả 3-photphoglyxeric được tạo thành, còn ADP nhận thêm năng lượng và biến thành ATP. 2CH2O(H2PO3)CHOHCOO ~H2PO3 + 2ADP 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP -Giai đoạn 8: Dưới tác dụng của enzym photphoglyxeromutaza, gốc axit photphoric sẽ chuyển từ vị trí cacbon thứ ba sang cacbon thứ hai. Kết quả là 3-photphoglyxeric biến thành axit 2-photphoglyxeric theo phản ứng: 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH -Giai đoạn 9:Dưới tác dụng của enolaza, axit 2-photphoglyxeric sẽ mất nước và biến thành axit photphopyruvic: 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH + H2O -Giai đoạn 10: axit photphopyruvic rất không bền nên dễ bị mất gốc axit photphoric do enzym pyrovatkinaza và do đó axit pyrovic được tạo thành: 2CH2=CO~(H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO-COOH + 2ATP -Giai đoạn 11: Tới đây axit pyrovic bị decacboxyl để tạo thành aldehyt axetic: 2CH3CO-COOH 2CO2 + 2CH3CHO -Giai đoạn 12:Giai đoạn cuối cùng của lên men rượu là aldehyt axetic bị khử bởi NAD.H2 2CH3CHO + 2NAD.H2 2CH3CH2 OH + 2 NAD Phương trình tổng quát của quá trình lên men : C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy các phản ứng oxy hoá khử có các enzim trong tế bào nấm men tham gia. Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucoza sẽ giải phóng ra khoảng 50 kcal. Năng lượng này được nấm men sử dụng chừng 20 kcal. Số còn lại sẽ thải ra canh trường, do đó làm tăng nhiệt độ dịch lên men. Theo Euler, nhiệt này chiếm 28 kcal/phân tử glucoza II.4.2. Sự tạo thành các sản phẩm phụ trong quá trình lên men rượu: Ngoài sự tạo thành rượu và CO2 từ đường, trong quá trình lên men rượu còn xuất hiện nhiều hợp chất khác được gọi là sản phẩm thứ cấp. Đồng thời còn tạo ra các sản phẩm phụ có nguồn gốc từ protein, chủ yếu là axit amin và các hợp chất khác. Bằng phân tích sắc kí khí người ta phát hiện ra trên 50 chất khác nhau có thể xếp thành 4 nhóm chính : axit, este, aldehyt, và alcol bậc cao II.4.2.1 Sự tạo thành axit Chủ yếu là axit axetic chiếm 70 – 75% tổng lượng axit, được tạo thành như sau : CH3CHO + CH3CHO + H2O Û CH3COOH + C2H5OH Ngoài ra, trong quá trình này còn tạo axit lactic, axit xitric, axit succinic: II.4.2.2 Sự tạo thành alcol cao phân tử Các alcol có số nguyên tử cacbon trong phân tử lớn hơn 2, quen gọi là alcol cao phân tử. Các alcol này tuy ít: hàm lượng 0,1-0,55% nhưng lại để lại những mùi khét khó chịu, gọi là dầu fusel hay dầu khét. Chúng được tạo thành do nấm men sử dụng nitơ của các axit amin. Quá trình lên men sục khí nhiều tạo nhiều rượu cao phân tử và rượu cao phân tử chủ yếu được tạo ra trong quá trình sinh trưởng nấm men. Qua thực tế, lên men rượu từ tinh bột thì hàm lượng rượu cao phân tử nhiều hơn so với lên men rượu từ rỉ đường. II.4.2.3 Sự tạo thành este : Do axit tác dụng với rượu: CH3COOOH + C2H5OH ắđ CH3COOC2H5 + H2O Axetat etyl là sản phẩm nhiều nhất trong số các este Dựa vào các kết quả thu được trong các phòng thí nghiệm cũng như trong thực tế sản xuất, người ta nhận thấy rằng, lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo ra trong quá trình lên men phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. II.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm men và quá trình lên men rượu Hoạt động sống của vi sinh vật nói chung và của nấm men nói riêng đều có quan hệ mật thiết với các yếu tố ngoại cảnh. Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như sau: nồng độ rượu etylic, pH, nhiệt độ, lượng men giống, chủng men giống, thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường lên men II.4.3.1 ảnh hưởng của nồng độ dịch đường Đường cung cấp năng lượng và cacbon cho tế bào nấm men đồng thời nó cũng là nguyên liệu để tế bào nấm men chuyển thành rượu. Đường glucoza và fructoza là thích hợp cho nấm men hơn cả. Nồng độ đường trong môi trường không những ảnh hưởng đến quá trình lên men mà còn ảnh hưỏng trực tiếp đến nấm men. Nồng độ đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lí của nấm men. Kết quả là đường nhiều sẽ ức chế không chỉ tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác nếu đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nồng độ đường thấp sẽ không kinh tế vì làm giảm năng suất thiết bị, nồng độ rượu trong dấm chín sẽ thấp làm hao tổn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải. Do đó để nấm men có thể hoạt động được tốt, tế bào nấm men phải nằm trong dung dịch có áp suất thẩm thấu nhỏ hơn áp suất có thể giữ được của tế bào. Thường người ta khống chế nồng độ chất khô khoảng 220g/l, tương ứng với nồng độ dịch đường khoảng 14-15%. II.4.3.2 ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trong ảnh hưởng đến hoạt động sống của nấm men, quá trình lên men và chất lượng sản phẩm. Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với lên men rượu etylic, sử dụng nấm men Saccharomyces, người ta khống chế nhiệt độ lên men khoảng 28-32oC. Nếu nhiệt độ khi bắt đầu lên men thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8-10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28-300C, tiếp đó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Tuy nhiên nhiệt độ lên men thấp sẽ dẫn đến thời gian lên men kéo dài ảnh hưởng tới năng suất thiết bị. Ngược lại, nếu nhiệt độ cao sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men, làm giảm mạnh hoạt tính của nấm men, nhưng lại rất dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. ở 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2-3 lần, còn ở 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este aldehit và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. Vì thế, trong quá trình lên men càng giữ nhiệt độ ổn định càng tốt vì nấm men hoàn toàn thích nghi mà không phải thay đổi để phù hợp với sự biến đổi của nhiệt độ. II.4.3.3 ảnh hưởng của pH Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định- trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh trường. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo acol etylic là 4,5-5,2, nhằm kết hợp giữ cho amylaza tiếp tục chuyển hoá tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men. Chính vì vậy khi gây men giống trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,8-4,0 để hạn chế phát triển vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. II.4.3.4 ảnh hưởng của hàm lượng và chất lượng men giống Tác nhân chính của quá trình lên men là nấm men vì thế hàm lượng men giống có ảnh hưởng đến quá trình lên men. Lượng men giống tăng thì quá trình lên men tăng nhưng đến một giới hạn nào đó thì sự tăng lượng men giống không làm tăng quá trình lên men nữa mà khi đó sẽ xẩy ra sự cạnh tranh của nấm men trong việc sử dụng môi trường dinh dưỡng. Trong sản xuất rượu etylic lượng men giống thường chiếm 10% tổng thể tích dịch lên men. Bên cạnh việc sử dụng lượng men giống thích hợp thì vấn đề chất lượng men giống cũng cần phải đưọc quan tâm. Chất lượng men giống tốt (tế bào trẻ, khoẻ, % tế bào nảy chồi vừa phải, số lượng tế bào chết ít) sẽ dẫn tới quá trình lên men xẩy ra nhanh chóng và hiệu suất cao. Cuối quá trình lên men trọng dịch dấm chín còn một lượng lớn sinh khối nấm men có khả năng hoạt động tốt (50 – 70% tế bào sống). Lượng sinh khối này có thể tái sử dụng nhằm tăng lượng nấm men trong quá trình lên men, tiết kiệm được nguyên liệu, khả năng nấm men quen với môi trường có nồng độ chất khô và độ cồn cao. II.4.3.5 ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng khác của dịch đường Ngoài nguồn cacbon từ đường nấm men còn rất cần nitơ và photpho để tạo nên protein của tế bào trong quá trình nấm men phát triển. Người ta thường bổ sung nitơ và photpho dưới dạng muối vô cơ vì chúng dễ giải phóng dưới dạng muối NH3 mà nấm men có thể sử dụng trực tiếp như : (NH2)2CO, (NH4)2HPO4. Nếu nitơ và photpho bị thiếu thì ảnh hưởng đến quá trình phát triển của nấm men. Nếu thừa, một mặt gây lãng phí, mặt khác làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường. Vì vậy cần nghiên cứu để xác định hàm lượng nitơ và photpho trong nguyên liệu từ đó tiến hành bổ sung cho thích hợp. Ngoài ra cũng cần chú ý đến chất kích thích sinh trưởng của nấm men là vitamin, nếu thấy nấm men kém phát triển cần bổ sung thêm các vitamin nhóm B, Biotin và các nguyên tố vi lượng. II.4.3.6 ảnh hưởng của hàm lượng Ôxy Chủng Saccharomyces Cerevisiae là nhóm vi sinh vật hô hấp tuỳ tiện. Trong môi trường đủ oxy nấm men sẽ sử dụng các chất dinh dưỡng làm nguồn năng lượng để tăng sinh khối: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O +34ATP Trong môi trường yếm khí nấm men sẽ chuyển đường thành rượu và các sản phẩm phụ khác: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 +2ATP ở giai đoạn đầu của quá trình lên men cần cung cấp đủ một lượng oxy để nấm men sinh sản tạo sinh khối. Lượng sinh khối nhiều sẽ tạo ra quá trình lên men xảy ra nhanh chóng và mạnh mẽ. Nhưng sau giai đoạn này sự có mặt của oxy không khí sẽ làm hạn chế quá trình lên men, làm giảm hiệu suất lên men. II.4.3.7 ảnh hưởng của các chất ức chế khác - Các chất sát trùng: Trong sản xuất rượu cần phải dùng một số chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. Lượng chất sát trùng ít hay nhiều cốt sao hạn chế được nhiều nhất sự phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm men. Thường dùng formalin hay fluosilicat natri nồng độ không quá 0,02% so với dịch lên men. - Nồng độ rượu etylic: Khi lên men, nhờ tác dụng của hệ enzim trong nấm men đường được chuyển thành rượu, nhưng khi rượu tạo ra nhiều nó lại làm ức chế hoạt động của nấm men làm cho chúng ngừng sinh trưởng, lên men kéo dài và tiêu thụ đường không hoàn toàn. - Khí CO2: Khi lên men khí CO2 thoát ra khuyếch tán vào môi trường làm cho dịch lên men được khuâý trộn, tăng cường quá trình trao đổi chất của tế bào nên tốc độ lên men cao hơn. Tuy nhiên CO2 thoát ra cũng cuốn theo một lượng nhỏ rượu etylic làm giảm hiệu suất lên men. - Các chất gây độc hại cho nấm men: Những hoá chất dùng trong quá trình nuôi cấy và lên men có nhiều chất gây độc hại cho nấm men: + Chất độc đối với nguyên sinh chất của tế bào: toluen, các hợp chất cacbon thơm, dẫn xuất parafin, ete, este + Chất độc đối với enzim của tế bào nấm men: Là những kim loại nặng như chì, đồng, sắt + Chất gây phản ứng oxy hoá lên thành phần protein của tế bào nấm men như: H2S, SO32-, NO3-, HCN, aldehit + Một số chất béo với nồng độ quá lớn trong môi trường sẽ tạo thành lớp trên bề mặt tế bào nấm men làm ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của tế bào do đó ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của nấm men. Phần iii Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu III.1 .Nguyên vật liệu III.1.1. nguyên liệu -Rỉ đường mía của nhà máy đường Lam Sơn- Thanh Hoá. +Đánh giá về mặt cảm quan: Rỉ đường có màu nâu đen, có mùi thơm đặc trưng caramel và một số chất cháy khác. Rỉ đường khá sánh, tan tốt trong nước, ít cặn thô. +Thành phần hoá học của rỉ đường: Bảng 3. Thành phần hoá học của rỉ đường mía Lam Sơn-Thanh Hoá Nồng độ chất khô (%) Hàm lượng đường khử, (% glucoza) Hàm lượng đường tổng, (% glucoza) Hàm lượng nitơ tổng, (%) pH 80 22 46.8 0,728 4,58 +Vi sinh vật tổng số:500.000 tế bào/g 3 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae: + Chủng 28 là chủng đã được tuyển chọn tốt nhất trong bộ sưu tập của Viện Công Nghệ Thực Phẩm + Chủng 3 là chủng đã được tuyển chọn trong bộ sưu tập của bộ môn CN Sinh học- Thực Phẩm, Viện CN Sinh học- CN Thực Phẩm, trường Đại học Bách Khoa- Hà Nội. + Chủng nấm men khô là chủng mới được sử dụng ở một số nhà máy rượu trong miền Nam. Các loại môi trường *Môi trường thạch malt Nước chiết malt là môi trường tốt để bảo quản và nuôi dưỡng nấm men vì trong nước malt có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho nấm men sinh trưởng và phát triển. Thành phần môi trường : Dịch chiết malt 100Bx- 130Bx Thạch aga-aga 2% KH2PO4 : 3g/L MgSO4.7H2O : 1g/L (NH4)2SO4 : 1g/L Thanh trùng ở 115oC trong 30’ *Môi trường hoạt hoá giống Nước malt 100Bx- 130Bx KH2PO4 : 3g/L MgSO4.7H2O : 1g/L (NH4)2SO4 : 1g/L Thanh trùng ở 115oC trong 30 *Môi trường gây men cấp I Nước malt 100Bx- 130Bx KH2PO4 : 3g/L MgSO4.7H2O : 1g/L (NH4)2SO4 : 1g/L Thanh trùng ở 115oC trong 30’ *Môi trường gây men cấp II Rỉ đường : 150Bx Urê : 0.5g/L pH : 4.5-5 Tỉ lệ giống: 10% dịch gây men cấp II Thanh trùng ở 115oC trong 30’ *Môi trường lên men Rỉ đường : 220Bx Urê : 0.5g/L pH : 4.5-5 III.1 .2. Thiết bị nghiên cứu Chiết quang kế pH meter Nồi hấp áp lực Cân phân tích, cân điện tử và cân kĩ thuật Buồng đếm hồng cầu Bình tỉ trọng Ngoài ra còn sử dụng một số dụng cụ khác như bộ cất cồn, ống lên men, máy ly tâm, máy so màu, kính hiển vi... III.2. Phương pháp nghiên cứu [6,7] III.2.1.phương pháp vi sinh vật học III.2.1.1 Xác định khả năng lên men Nấm men khi lên men trong môi trường có đường sẽ tạo thành cồn và giải phóng CO2. Dựa vào đặc điểm này ta xác định hoạt lực lên men theo nguyên tắc đo lượng CO2 thoát ra khi lên men. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phương pháp cân bình để xác định hoạt lực lên men . Nguyên tắc: Bình lên men được đậy kín bằng nút đặc biệt có chứa H2SO4 đậm đặc pha với nước theo tỉ lệ 1:4. Trong quá trình lên men H2SO4 có ở các nút lên men sẽ hấp thụ hơi nước và các chất bay hơi khác nhưng không hấp thụ CO2 và cho khí này thoát ra ngoài. Nhờ đó mà sự giảm trọng lượng bình chỉ do CO2 thoát ra. Dựa vào lượng khí CO2 thoát ra mà ta có thể biết được lượng đường đã lên men và lượng rượu tạo thành. Nấm men nào tạo được nhiều CO2 hơn sẽ có khả năng lên men lớn hơn. Thí nghiệm được tiến hành trong các bình dung tích 500ml trong có chứa 200ml dịch lên men và 20ml dịch men giống. Theo dõi sự giảm trọng lượng bình trong quá trình lên men bằng cách cân bình. Mỗi lần cân cách nhau 8h. III.2.1.2 Nghiên cứu hình thái tế bào nấm men Để chọn được chủng giống lên men tốt, đồng thời xác định và theo dõi quá trình phát triển của tế bào nấm men, ta cần nuôi cấy chúng trên môi trường lỏng, và quan sát tế bào nấm men bằng cách làm tiêu bản vi sinh vật sống có nhuộm màu đơn giản bằng xanh mêtylen 0.5%. Như vậy, ta sẽ quan sát được hình thái tế bào, vừa phân biệt được tế bào sống chết, vừa phát hiện được môi trường có bị nhiễm tạp hay không. Tiến hành: Lá kính và phiến kính được rửa sạch và sấy khô bằng đèn cồn. Nhỏ một giọt thuốc nhuộm không quá lớn lên phiến kính, lấy một giọt canh trường pha loãng hoà đều với thuốc nhuộm trên phiến kính. Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi. III.2.2 phương pháp hoá lí III.2.2.1 Xác định nồng độ chất khô của rỉ đường: Để xác định nồng độ chất khô của dịch rỉ đường gây men và lên men ta sử dụng chiết quang kế. Chiết quang kế là một dụng cụ quang học dựa trên hiện tượng khúc xạ ánh sáng khác nhau trên những môi trường có nồng độ chất khô khác nhau. Dung dịch cần đo ở 200C, đơn vị 0Bx. Tiến hành: Pha loãng rỉ đường tới nồng độ thích hợp một cách tương đối bằng tính toán. Dùng đũa thuỷ tinh lấy một giọt dung dịch cần đo chấm lên bề mặt kính, đặt nhẹ tấm kính mờ lên trên. Đọc kết quả, từ đó có thể điều chỉnh dịch rỉ đường tới nồng độ cần thiết. III.2.2.2. Xác định hàm lượng rượu Nguyên tắc: tách rượu ra khỏi dịch lên men bằng phương pháp chưng cất, từ đó suy ra hàm lượng rượu. Tiến hành : Lấy 100ml dịch lên men ở 200C0 cho vào bình chưng cất, thêm vào đó khoảng 100ml nước cất. Sau đó đem chưng cất cho đến khi thu được 100ml dịch cất. Đo tỷ trọng của dịch cất ở 20oC rồi suy ra hàm lượng rượu. Trong điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi xác định tỷ trọng của dịch cất bằng phương pháp dùng bình tỷ trọng. Tiến hành Đầu tiên ta rửa bình thật sạch, sấy khô và làm nguội. Đem cân bình ta được khối lượng bình m0. Tiếp theo rót nước cất ở 200C tới ngấn bình, lau khô phần không chứa nước ta được khối lượng bình có chứa nước cất mn. Tiếp theo đổ nước ra khỏi bình, tráng bình bằng dịch cần đo 3-4 lần, rót dịch cần đo ở 200C tới ngấn bình, lau khô phần không chứa dịch, cân bình ta được khối lượng bình chứa dịch mr. Tỷ trọng chất lỏng với nước ở cùng nhiệt độ 200C là D2020= Từ tỉ trọng của rượu với nước, tra bảng ta có được nồng độ cồn tương ứng. III.2.2.3. Xác định sinh khối nấm men Trong quá trình nuôi cấy nấm men, ta cần theo dõi sự phát triển của nấm men thông qua việc xác định lượng sinh khối tạo thành. Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phương pháp đo mật độ quang của dịch nuôi cấy. Trước hết cần xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa mật độ quang OD và nồng độ sinh khối nấm men (g/l). Li tâm dịch nuôi cấy 2 lần trong 15 phút với tốc độ 4000 vòng/phút để thu sữa men. Cân lấy 1g sữa men hòa tan vào 100 ml nước cất được dung dịch có nồng độ 10g sữa men/l. Lấy dung dịch này pha thành các dung dịch có tỉ lệ1/2, 1/4, 1/8, 1/16rồi đo OD tương ứng ở bước sóng 630nm với mẫu đối chứng là nước cất. Từ các giá trị OD thu được ứng với các nồng độ sinh khối đã biết, ta xây dựng được đường chuẩn Xác định sinh khối tạo thành trong quá trình nuôi cấy: Tiến hành đo mật độ quang trong quá trình nuôi cấy và lên men ở các thời điểm 0h, 4h, 8h. Nếu giá trị OD lớn hơn 1 thì tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi mới đo OD. Dựa vào đường chuẩn xây dựng ở trên và giá trị OD, ta suy ra được lượng sinh khối (g/l). III.2.3. Phương pháp hoá học: III.2.3.1. Xác định hàm lượng đường trong dịch lên men và trong dấm chín Để phù hợp với điều kiện trong phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phương pháp Graxianop (phương pháp Ferixianua kali). Nguyên tắc: Phương pháp này dùng chất khử dịch đường khử là Ferixianua Kali, có phản ứng chính: 2K3Fe(CN)6 + 2KOH 2K4Fe(CN)6 + H2O + O Tiếp theo oxy nguyên tử oxy hoá mạnh đường để tạo ra axit tương ứng. CH2OH(CHOH)4CHO + 2O COOH(OHOH)4COOH Phản ứng tổng quát: 4K3Fe(CN)6 + 4KOH + CH2OH(CHOH)4CHO 4K4Fe(CN)6 + COOH(CHOH)4COOH + 2H2O Khi dư một giọt dịch đường, đường sẽ khử chỉ thị màu metylen xanh làm mất màu xanh rồi chuyển sang màu tím hồng và chuyển sang màu vàng thì kết thúc định phân. Từ lượng đường tiêu hao khi định phân ta suy ra lượng đường trong dung dịch cần phân tích. Tiến hành: Dùng Pipét lấy 10 – 20 ml dung dịch ferixianua kali 1% cho vào bình tam giác 250 ml (tuỳ theo hàm lượng đường cao hay thấp trong dung dịch phân tích). Sau đó, cho vào 3 – 5 ml dung dịch KOH 2,5 N và 3 – 4 giọt metilen xanh. Lắc đều và đặt lên bếp điện đun sao cho sau 1 – 2 phút thì sôi. Tiếp theo dùng dịch đường khử cần phân tích chuẩn bằng cách nhỏ liên tục vào bình và để sôi liên tục đến mất màu của metilen xanh. (Chú ý: màu của dung dịch sẽ thay đổi từ xanh sang tím hồng và cuối cùng màu da cam là kết thúc. Nếu để nguội màu dung dịch trở lại tím hồng) Công thức tính toán: Hàm lượng đường khử trong dung dịch cần phân tích sẽ tính theo công thức: a %D = ----- . 100 (g/100ml) m Trong đó: a: lượng glucoza tương ứng với 20ml dung dịch Ferixianua Kali 1% khối lượng. m : số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn 20ml Ferixianua Kali 1%. 100: hệ số quy đổi Xác định hệ số a: Cân 0,5 g glucoza hoặc Fructoza tinh khiết sấy khô, pha với nước cất thành 100ml. Dùng dung dịch này làm chuẩn (1ml chứa 5ml đường khử) để chuẩn với 20 ml dung dịch Ferixianua Kali vừa pha xem nó tương ứng với bao nhiêu gam đường. Xác định đường tổng trong dịch lên men và trong dấm chín Lấy 20-50ml dịch cho váo bình định mức 250ml. Tiếp theo cho vào 5 – 6ml axetat chì hơi axit (350g/1000ml), lắc đều và thêm nước cất đến ngấn bình rồi lọc qua giấy lọc. Lấy 100ml nước lọc cho vào bình định mức 250ml, cho thêm 5ml dung dịch Na2HPO4 10%(100g/1000ml) và 5ml K2C2O4 5% (5g/100ml). Lắc đều, thêm nước cất đến ngấn bình, đem lọc. Các phản ứng xẩy ra khi xử lý: Protein +Pb(CH3COOH)2 Kết tủa do protein biến tính K2C2O4 + Ca2+ 2K+ + CaC2O4 ( kết tủa) N2HPO4 + Pb(CH3COO)2 (dư) PbHPO4 + 2 CH3COONa Lọc xong ta lấy 100ml cho vào bình định mức 250ml, cho 10ml HCL đậm đặc (d= 1,19) vào bình rồi lắc đều và đem đun cách thuỷ ở nhiẹt độ 700C trong 5 phút. Đun xong làm lạnh ngay đến nhiệt độ phòng, cho vào 2 – 3 giọt chỉ thị phenolptalein rồi trung hoà bằng dung dịch NaOH 30% đến đổi màu. Thêm nước cất tới ngấn bình ta được dung dịch đường khử sạch. Dùng phương pháp Graxianop để xác định hàm lượng đường. %D = Trong đó: a: hệ số đã xác định ở trên A = b: số ml dung dịch đường khử sạch dùng để chuẩn III.2.3.2 Xác định độ chua của dịch lên men và dịch dấm chín. Độ chua được biểu diễn theo độ hay số gam H2SO4 chứa trong 1L dịch Một độ chua tương ứng với số ml NaOH 1N vừa đủ dùng để trung hoà hết axit tự do có trong 20 ml dung dịch. 10chua ằ 2.45 g H2SO4/L Tiến hành: Lấy 50ml nước cất trung tính cho vào bình tam giác, xong cho vào 1ml dịch . Dùng NaOH 0,1N chuẩn tới đổi màu. Căn cứ vào sốml NaOH 0,1N ta xác định độ chua theo công thức : X= = 4,9V (g/L) Trong đó: 0,0049 : số gam H2SO4 tương ứng với 1ml NaOH 0,1N. V: Lượng NaOH 0,1N tiêu hao khi trung hoà hết axit tự do có trong 1ml dung dịch Phần IV Kết quả và thảo luận Hiện nay, tại các nhà máy sản xuất cồn từ nguyên liệu rỉ đường ở Việt Nam đang sử dụng một số chủng nấm men như: 28, 3, IA, B, L, G, men khôVới mục đích nâng cao hiệu suất thu hồi rượu để hạ giá thành sản phẩm ở các nhà máy này, vấn đề quan trọng là phải chọn được chủng có năng lực lên men mạnh, chuyển hoá đường thành rượu nhanh và hoàn toàn đồng thời phải ổn định và chịu được những biến đổi của của môi trường. Xuất phát điều kiện thực tế này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu so sánh các chủng 3, 28, nấm men khô theo các tiêu chí sau: iV.1. hình thái tế bào nấm men Việc quan sát hình thái tế bào nấm men được thực hiện theo phương pháp nêu trong mụcII.2.1.2. Kết quả được dẫn trong bảng 4.1 Bảng 4.1. Hình thái tế bào của các chủng Chủng Hình dáng tế bào 3 Hình oval, trứng 28 Hình cầu, trứng Men khô Hình cầu, trứng Quan sát về độ lớn tế bào thấy các chủng đều có kích thước lớn, đặc biệt chủng nấm men khô, tế bào to, béo hơn hẳn chủng 3 và 28. Các kết quả thu được đều phù hợp với đặc tính của chủng Saccharomyces cerevisiae. iV.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Giai đoạn nhân giống tạo điều kiện cho nấm men sinh trưởng tăng sinh khối để có một hàm lượng giống nhất định, các tế bào đang ở thời kì hoạt động sinh lí mạnhchuyển tiếp vào giai đoạn lên men. Điều kiện này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong những yếu tố quan trọng là tốc độ sinh trưởng của từng chủng nấm men. Chủng nào có tốc độ sinh trưởng lớn hơn là chủng tạo được lượng sinh khối lớn hơn. Chúng tôi tiến hành nhân giống 3 chủng trên môi trường gây men cấp II, sau đó xác định sinh khối thông qua xác định mật độ quang ở bước sóng 630 nm. Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ sinh khối (OD = f(sinh khối)), xây dựng theo phương pháp đã nêu ở III.2.2 . Kết quả biểu diễn ở đồ thị 4.1 Sữa men dùng để xác định đường chuẩn có độ ẩm W =81% Dựa vào đường chuẩn xây dựng được , rút ra nhận xét : Quan hệ OD - Sinh khối chỉ tuyến tính khi : + giá trị OD nằm trong khoảng từ 0,0 đến 1,0. + nồng độ sinh khối nhỏ hơn 2g/L Phương trình thể hiện quan hệ sinh khối = f (OD) :Y = 2,8932 . X Khi tiến hành đo OD xác định sinh khối nấm men , ta phải pha loãng dung dịch chuẩn và mẫu cần đo đến nồng độ tuyến tính . Xây dựng đường cong sinh trưởng . Tiến hành nuôi cấy nấm mên trên môi trưòng cấp II trong 48 giờ Đo OD trong toàn bộ quá trình (4h đo một lần). Dựa vào đường chuẩn tính toán lượng sinh khối nấm men (g/l) Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng . Đồ thị đường cong sinh trưởng của 3 chủng được dẫn ra ở đồ thị 4.2 K: nấm men khô 3: chủng 3 28: chủng 28 Đồ thị 4.2 cho thấy sinh khối của chủng 3 và chủng 28 đạt tối đa sau 24h nuôi cấy(15g/l và 15.6g/l), chủng nấm men khô đạt tối đa sau 32h(12,8 g/l). Tế bào của cả 3 chủng đều béo, khoẻ, đặc biệt là chủng nấm men khô. Như vậy cả 3 chủng đều có khả năng phát triển tốt, tạo lượng sinh khối lớn, có chất lượng tốt đủ cung cấp men giống cho quá trình lên men. iv.3. khảo sát sơ bộ khả năng lên men của các chủng Trong quá trình lên men, đường sẽ được nấm men sử dụng và chuyển hoá thành rượu etylic và khí CO2.Vì vậy dựa vào lượng CO2 thoát ra chúng ta có thể đánh giá được năng lực lên men của chủng nấm men đã sử dụng. Hoạt hoá nấm men : dùng que cấy lấy đúng một vòng que cấy nấm men của các chủng 3 và 28 trong các ống thạch nghiêng cấy sang ống nghiệm trong có chứa 10 ml dịch malt 110Bx. Nuôi cấy ở 300C trong 24h. Riêng nấm men khô, hoạt hoá làm 3 mẫu: mẫu 1 không hoạt hoá , mẫu 2: hoạt hoá trước 5h (0.1g men khô/10 ml nước malt), mẫu 3 hoạt hoá trước 10h Các chủng được lên men trong bình Engol, dung tích dịch 10ml. Dùng pipet hút 9 ml dịch rỉ đương 150Bx vào bình Engol, sau đó tiếp 1 ml dịch nấm men đã hoạt hoá của các chủng. Riêng mẫu men khô không hoạt hoá, tiếp giống với tỉ lệ 0.01 g/100 ml. Tiến hành lên men ở 28-300C, đánh giá thời gian để tạo 5 ml CO2 của các chủng. Kết quả ghi ở bảng 4.2 Bảng 4.2. Khảo sát sơ bộ khả năng lên men của các chủng bằng bình engol Thời gian tạo thành 5 ml CO2 (phút) Chủng Lần 3 28 K1 K2 K3 1 150 105 600 265 100 2 130 78 610 300 75 3 125 90 605 315 75 Trung bình 135 91 605 214 83 K1: men khô không qua hoạt hoá K2: men khô hoạt hoá 5h K3: men khô hoạt hoá 10h Qua bảng 4.2, ta thấy chủng 28 lên men mạnh hơn so với chủng 3 và chủng nấm men khô không qua hoạt hoá (thời gian tạo 5 ml CO2 của chủng 28 là 91 phút, của chủng 3 là 135 phút, của men khô là 605 phút). Chủng men khô sau một thời gian hoạt hoá, khả năng lên men mạnh và nhanh hơn , sau khi hoạt hoá 10h thời gian tạo 5ml CO2 của chủng men khô là nhanh hơn cả. Điều này chứng tỏ, nấm men khô cần có một thời gian hoạt hoá nhất định (5-10h) để trương nở và thích ứng với môi trường lên men IV.4. đánh giá khả năng chuyển hoá đường thành rượu của các chủng Khả năng lên men thường được đánh giá qua lượng CO2 tạo thành sau quá trình lên men. Đặc tính cần thiết của các chủng nấm men trong sản xuất rượu cồn là lên men nhanh, mạnh, lên men triệt để và ổn định. Quá trình lên men tốt khi diễn ra liên tục, không bị gián đoạn, hàm lượng đường sót thấp, cồn tạo thành nhiều, độ chua tăng trong giới hạn cho phép. Nghiên cứu về khả năng chuyển hoá đường thành rượu của các chủng bằng phương pháp cân bình và xác định các chỉ tiêu sau lên men, kết quả biểu diễn trong bảng 4.3 Qua bảng 4.3 và đồ thị 4.3 ta có thể thấy cả ba chủng đều có khả năng lên men mạnh, lượng CO2 tạo thành lớn. Các chủng cho hiệu suất lên men chênh nhau không nhiều và chủng men khô cho hiệu suất lên men cao hơn hai chủng kia. Xem xét lượng CO2 thoát ra trong quá trình lên men thấy chủng 28 có tốc độ lên men lớn hơn hai chủng kia (tại thời điểm 24h, lượng CO2 tạo thành của chủng 28 là 9.3g, của chủng 3 là 8.57g, của men khô là 3.79g). Tuy nhiên, sau 48h lên men, lượng CO2 tạo thành của men khô lại cao hơn chủng 3 và 28. Như vậy, để rút ngắn thời gian lên men, cần hoạt hoá chủng nấm men khô trước khi lên men. Bảng 4.3. Đánh giá khả năng chuyển hoá đường thành rượu của các chủng Chủng Chỉ tiêu 28 3 Men khô Trước lên men °Bx 22 22 22 Độ chua (gH2SO4/l) 2.43 2.43 2.43 PH 4.72 4.72 4.72 Đường tổng (g/l) 143.4 143.4 156 Sau lên men Độ chua (g H2SO4/l) 3.70 3.68 3.70 Đường sót (g/l) 18.80 20.25 20.32 CO2 (g/200ml) 11.78 11.63 12.97 Độ cồn (%V) 7.94 7.84 8.44 Hiệu suất lên men (%) 85.49 84.41 85.69 IV.5. ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến Khả năng lên men của các chủng Mỗi chủng vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu cho phát triển của chúng. với nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-320C. Trong quá trình lên men nhiệt độ thường tăng quá nhiệt độ tối thích, do đó cần phải làm lạnh môi trường lên men để ổn định nhiệt độ lên men trong giới hạn tối thích. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nhằm xác định khả năng chịu nhiệt độ của các chủng và nhiệt độ lên men thích hợp của mỗi chủng. Kết quả biểu diễn trong bảng 4.4. Kết quả cho thấy, ở nhiệt độ 300C các chủng đều cho hiệu suất lên men cao hơn 350C. Điều đó có thể do ở nhiệt độ cao tốc độ lên men có tăng nhanh hơn nhưng tổn thất rượu theo CO2 cũng như tạo các sản phẩm phụ khác như aldehyt, axit... cũng tăng. Ngoài ra trong sản xuất, ở nhiệt độ cao khả năng nhiễm tạp cũng cao hơn, các vi sinh vật tạp nhiễm sẽ sử dụng mất một lượng đường nhất định làm giảm lượng đường cho việc lên men- hiệu suất lên men giảm. Riêng chủng nấm men khô, hiệu suất lên men ở 350C (85.40%) giảm không nhiều so với ở 300C (83.64%). Như vậy, chủng men khô có thể thích ứng dễ dàng ở dải nhiệt độ rộng hơn so với chủng 3 và chủng 28. Bảng 4.4. ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của các chủng Nhiệt độ 30°C 35°C Chủng Chỉ tiêu 28 3 Men khô 28 3 Men khô Trước lên men °Bx 22 22 22 22 22 22 Độ chua (gH2SO4/l) 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 PH 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 Đường tổng (g/l) 143.4 143.4 156 143.4 143.4 156 Sau lên men Độ chua (gH2SO4/l) 3.72 3,68 3.70 3.78 3.76 3.73 Đường sót (g/l) 18.96 20.08 20.77 22.85 23.24 23.52 CO2 (g/200ml) 11.77 11.59 12.83 11.39 11.25 12.56 Độ cồn (%V) 7.93 7.81 8.63 7.68 7.65 8.45 Hiệu suất lên men (%) 85.38 84.11 85.40 82.67 82.42 83.64 IV.6 ảNh hưởng của ph đến khả năng lên men của các chủng Nồng độ H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Để đánh giá ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men, chúng tôi tiến hành lên men ở các giá trị pH khác nhau. Kết quả biểu diễn ở bảng 4.5. Kết quả bảng 4.5 cho thấy tại pH =4.8, 3 chủng nấm men hoạt động tốt hơn cả, đạt hiệu suất lên men cao (chủng 3-85.55%, chủng28-86.41%, chủng nấm men khô-85.52%). ở pH= 5.5 hiệu suất lên men đạt thấp nhất, độ cồn thấp , đường sót nhiều. Có thể do ở pH này khả năng tạp nhiễm cao và xảy ra tổn thất đường để tạo các sản phẩm phụ, sản phẩm trung gian (glyxerin, aldehit...) Chủng nấm men khô khá ổn định trước thay đổi của pH, từ pH=4.2-5.5, hiệu suất lên men của men khô dao động không nhiều (82.81% tại pH=4.2;85.52% tại pH=4.8; 83.45% tại pH=5.5) so với chủng 3 và 28.Bảng 4.5. ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men của các chủng pH 5.5 4.8 4.2 Chủng Chỉ tiêu 3 28 Men khô 3 28 Men khô 3 28 Men khô Trước lên men °Bx 22 22 22 22 22 22 22 22 22 Độ chua (gH2SO4/l) 2.37 2.37 2.37 2.43 2.43 2.43 2.51 2.51 2.51 pH 4.2 4.2 4.2 4.8 4.8 4.8 5.5 5.5 5.5 Đường tổng (g/l) 143.4 143.4 156 143.4 143.4 156 143.4 143.4 156 Sau lên men Độ chua (gH2SO4/l) 3.37 3.40 3.34 3.67 3.68 3.70 3.82 3.78 3.77 Đường sót (g/l) 26.40 26.01 24.83 18.72 17.48 20.62 24.48 23.45 23.89 CO2 (g/200ml) 10.96 11.06 12.32 11.89 12.10 13.04 11.03 18.23 12.58 Độ cồn (%V) 7.45 7.46 8.37 7.95 8.03 8.64 7.57 7.64 8.43 Hiệu suất lên men (%) 80.19 80.30 82.81 85.55 86.41 85.52 81.33 82.25 83.45 IV.7 ảnh hưởng của nồng độ Bx đến Khả năng lên men của các chủng Nồng độ đường ban đầu trong dịch rỉ đường có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men. Hàm lượng đường ban đầu thấp thì hiệu suất lên men cao, nhưng nồng độ rượu tạo ra sẽ thấp, hiệu suất sử dụng thiết bị thấp, không kinh tế. Tuy nhiên, nồng độ dịch đường quá cao làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lí của nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế nấm men, dẫn đến tổn thất đường và kéo dài thời gian lên men. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường tới hiệu quả lên men đối với 3 chủng. Kết quả được dẫn ở bảng 4.6 Kết quả cho thấy: Khi tăng nồng độ chất khô ban đầu của dịch lên men từ 20-300Bx thì các chủng đều cho hiệu suất lên men giảm. Khả năng chịu đựng nồng độ chất khô ban đầu trong khoảng 20-300Bx của cả 3 chủng là như nhau. Bảng 4.6. ảnh hưởng của nồng độ Bx đến khả năng lên men của các chủng Nồng độ chất khô (°Bx) 20 25 30 Chủng Chỉ tiêu 3 28 Men khô 3 28 Men khô 3 28 Men khô Trước lên men °Bx 20 20 20 25 25 25 30 30 30 Độ chua (gH2SO4/l) 2.40 2.40 2.40 2.48 2.48 2.48 2.50 2.50 2.50 pH 4.7 4.7 4.7 4.68 4.68 4.68 4.75 4.75 4.75 Đường tổng (g/l) 129 129 140 161.7 161.7 175.2 194 194 211 Sau lên men Độ chua (gH2SO4/l) 3.65 3.66 3.70 3.75 3.70 3.79 3.84 3.82 3.87 Đường sót (g/l) 11.72 13.26 14.08 23.60 25.06 26.28 45.39 48.79 49.74 CO2 (g/200ml) 11.44 11.23 12.41 13.31 13.07 14.22 14.33 14.01 15.55 Độ cồn (%V) 7.47 7.37 7.71 8.82 8.66 9.52 9.50 9.28 10.32 Hiệu suất lên men (%) 84.36 88.19 88.51 84.17 82.66 83.93 75.61 73.86 75.48 IV.8 ảnh hưởng của nồng độ chất sát trùng đến khả năng lên men của các chủng Trong điều kiện sản xuất, khó có thể đảm bảo vô trùng, vì vậy, cần dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. Mục đích của việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất sát trùng nhằm đánh giá khả năng chịu chất sát trùng của các chủng và xác định nồng độ chất sát trùng thích hợp mà ở đó ức chế được tạp khuẩn, mà không ảnh hưởng nhiều đến nấm men. Kết quả nghiên cứu được dẫn ra ở bảng 4.7. Kết quả cho thấy, ở mọi nồng độ chất sát trùng, các chủng đều cho hiệu suất lên men thấp hơn so với mẫu đối chứng (kết quả ở bảng 4.1). Điều này cũng dễ hiểu vì sự có mặt của chất sát trùng đã phần nào ức chế nấm men. Hiệu suất lên men của 3 chủng đều giảm ở các nồng độ chất sát trùng nghiên cứu, trong đó khả năng chịu đựng chất sát trùng của chủng nấm men khô thấp hơn nhiều so với chủng 3 và chủng 28 (độ cồn của nấm men khô thấp: 7-8%, hiệu suất thấp: 70-80%). Có thể vì chủng 3 và chủng 28 đã được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất rượu cồn nên chúng có khả năng thích ứng để chịu đựng với một nồng độ chất sát trùng thích hợp Bảng 4.7 ảnh hưởng của nồng độ chất sát trùng đến khả năng lên men của các chủng Nồng độ Na2SiF6 (%KL) 0.01% 0.02% 0.025% Chủng Chỉ tiêu 3 28 Men khô 3 28 Men khô 3 28 Men khô Trước lên men °Bx 22 22 22 22 22 22 22 22 22 Độ chua (gH2SO4/l) 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 2.43 PH 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 Đường tổng (g/l) 143.4 143.4 156 143.4 143.4 156 143.4 143.4 156 Sau lên men Độ chua (gH2SO4/l) 3.68 3,70 3,08 3,68 3,72 3.70 3.71 3.67 3.73 Đường sót (g/l) 23.45 22.42 28.64 24.95 23.88 36.53 26.40 25.97 42.94 CO2 (g/200ml) 11.27 11.34 12.09 11.25 10.98 11.18 10.97 11.15 10.55 Độ cồn (%V) 7.71 7.87 8.14 7.07 7.55 7.61 7.45 7.65 7.13 Hiệu suất lên men (%) 82.97 84.69 80.60 80.67 81.25 75.30 80.19 80.27 70.55 . Kết luận chung Qua quá trình nghiên cứu nhằm so sánh 3 chủng nấm men(3, 28, nấm men khô), chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Ba chủng nấm men 3, 28 và nấm men khô đều có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt. Trong khoảng nhiệt độ và pH nghiên cứu, chủng nấm men khô thích ứng với dải nhiệt độ và pH rộng hơn so với chủng 3 và chủng 28. Các chủng đều cho hiệu suất lên men cao ở nhiệt độ 300C và pH=4.8 Khả năng chịu đựng nồng độ chất khô trong khoảng 20-300Bx của ba chủng là như nhau. Khi tăng nồng độ chất sát trùng, hiệu suất lên men của 3 chủng đều giảm. ở mọi nồng độ chất sát trùng, chủng nấm men khô cho hiệu suất lên men thấp hơn nhiều so với chủng 3 và chủng 28. Tài liệu tham khảo Giang Thế Bính Luận án phó tiến sỹ khoa học kỹ thuật trường Đại học Bách Khoa Hà Nội-1996 Lê Ngọc Tú – Chủ biên Hoá sinh học công nghiệp Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật Hà Nội – 1998 Lê Thanh Mai Bài giảng công nghệ sản xuất nấm men – 2001 Nguyễn Thị Hiền Thành phần rỉ đường mía Việt Nam và ứng dụng trong ngành công nghiệp lên men, LTTP, số 9/1979. PGS-TS Nguyễn Đình Thưởng, TS Nguyễn Thanh Hằng Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật –2000 PGS-TS Nguyễn Đình Thưởng Tài liệu thí nghiệm dùng cho sinh viên ngành công nghệ lên men Trường đại học Khoa học Công nghiệp nhẹ Hà Nội - 1997 Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh Thí nghiệm hoá sinh công nghiệp Hà Nội – 1997 Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Trọng Thí nghiệm vi sinh vật công nghiệp trường Đại học Bách Khoa Hà Nội A.A.Koutinas, C.Gourdoupis, C.Psarianos, A.Kaliafas & M.Kanellaki Continuos potable alchol production by immobilized Saccharomyces cereviea on mineral kissiris Alison M.Jones and W.M.Ingledew Fuel alcohol production : optimization of temprature for efficient very-high-gravity fermentation A.Sheoran, B.S.Yadav, P.Nigam and D.Singh Continuous ethanol production from sugarcane molasses using a column reactor of immobilized Saccharomyces cereviease HAU –1 -1997 DP Bayrock and W Michael Ingledew Application of multistage continuos fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravity fermentation technology