Đề tài Theo dõi hàm lượng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae

hu được từ thực vật. 1.4.1. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Sắc ký lỏng cao áp (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ. Như vậy, độ tinh khiết của nhiều hợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng phương pháp HPLC. Kỹ thuật bao gồm một pha rắn cố định (pha tĩnh) được nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng di động (pha động) chạy qua. Việc phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện là nhờ sự khác nhau về tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha. Phương pháp HPLC, dựa trên các cơ chế của hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc kích cỡ (exclusion gel Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 permeation) tuỳ thuộc vào kiểu pha tĩnh đem sử dụng. Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu, cột sắc ký, đầu dò (detector) và hệ thống sử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính). Sơ đồ 1.1: Hệ thống sắc ký lỏng phân giải cao. Cấu tạo của hệ thống bơm đảm bảo việc duy trì tốc độ dòng của pha động không thay đổi. Thiết kế của hệ thống van bơm mẫu đảm bảo việc đưa mẫu phân tích vào cột có thể thao tác ở áp suất cao không phải ngắt dòng. Cột sắc ký dùng trong HPLC có thể thuộc một trong các kiểu phân tách dưới đây: - Cột pha thƣờng: sự phân tách dựa trên sự khác nhau về tính hấp phụ của pha tĩnh, vật liệu được sử dụng thường là hạt silica có bề mặt phân cực gây ra bởi các nhóm silanol (-Si-OH). - Cột pha đảo: sự phân tách dựa trên nguyên lý phân bố các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha tĩnh có bề mặt không phân HPLC Stationary and Mobile phase Liquid <400 bar <400 l 1 ml/min light detector <1000 C Mobile phase Pump Injector Data evaluation Detector Column Oven Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 cực. Vật liệu thường dùng là các hạt silica được biến tính hóa học thông qua phản ứng của nhóm silanol với các nhóm chức khách nhau và thường là: Octa -Si-(CH2)7CH3 C8 Octadecyl -Si-(CH2)17CH3 C18 Phenyl -Si-(C6H5)2 C6H5 Cyanopropyl -Si-(CH2)3CN CN Aminopropyl -Si-(CH2)3NH2 NH2 - Cột trao đổi ion: sự phân tách dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các phân tử chất tan mang điện tích với pha tĩnh. Vật liệu để nhồi cột là nhựa trao đổi ion (cationit hoặc anionit) dùng làm pha tĩnh. - Cột sắc ký gel (size exclusion) : pha tĩnh là các hạt polime có các lỗ hổng khác nhau. Sự phân tách được thực hiện là nhờ sự khuyếch tán của phân tử chất tan vào pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ dễ dàng vượt qua pha tĩnh và bị rửa giải chậm hơn các phân tử có kích thước lớn. Vì yêu cầu phân tách, vật liệu nhồi cột dùng làm pha tĩnh trong HPLC thường dùng là các hạt có kích thước nằm trong khoảng 5 đến 10 m có dạng hình cầu hoặc bất kỳ và cột thường dùng là thép không gỉ, có đường kính trung bình vào khoảng 2 đến 5mm, chiều cao dài 50 - 300mm. Một cách lý tưởng, nhiệt độ của pha động và cột phải giữ ổn định trong suốt quá trình phân tách. Cũng như vậy, nhiệt độ của pha động thoát ra khỏi cột cũng phải tương đương với nhiệt độ của đầu dò. Khi cột đã được lựa chọn thì thành công của việc phân tách tuỳ thuộc vào thành phần pha động, đặc biệt là trong trường hợp sắc ký đẳng dòng. Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan trong pha động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh. Nếu như Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 mẫu tan tốt trong pha động thì nó sẽ rửa giải sớm và trong trường hợp không có tương tác với pha tĩnh thì nó sẽ ra khỏi cột với tốc độ bằng tốc độ của pha động. “Độ mạnh” của pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thay thế tỷ lệ dung môi đã sử dụng. Pha động càng “mạnh” thì mẫu sẽ được rửa giải càng sớm. Với cột pha thường, do bề mặt phân cực nên độ mạnh của pha động đồng nghĩa với độ phân cực của dung môi. Độ mạnh của dung môi theo thứ tự tăng dần của độ phân cực trình bày như sau: Hexane = heptane = pentane < cyclo hexane < chloroform < toluen < dichloro methane < ethylacetate = THF < diethylete < acetone = acetonitrile < ethanol < H2O <acetic acid. Trong sắc ký lỏng pha ngược bề mặt của vật liệu nhồi cột không phân cực và nước hoặc dung dịch nước có thể dùng làm pha động. Độ mạnh của pha động tăng dần khi độ phân cực của dung môi giảm dần (nghĩa là trật tự ngược với trường hợp pha thường). Pha động yếu nhất là nước sạch, acetonitryle hoặc THF là các pha động rất mạnh. Detector UV-VIS là loại detector hay được dùng vì nó có khả năng ứng dụng rộng rãi và giá thành rẻ hơn các loại detector khác, nó có độ nhạy trung bình, tín hiệu không ảnh hưởng bởi nhiệt độ và áp suất. Tuy nhiên, detector UV-VIS chỉ sử dụng được khi mẫu có hấp thụ ánh sáng trong vùng 200 - 700nm. Detector chỉ số khúc xạ (RID) là một loại detector phổ thông, dựa trên khả năng phân biệt sự thay đổi chỉ số khúc xạ, có độ nhạy cảm với nhiệt độ và áp suất cũng như khí bị hoà tan trong pha động, nên độ nhạy phân tích không cao. Ngoài hai loại detector trên người ta còn sử dụng detector huỳnh quang, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 detector điện hoá, detector độ dẫn ... trong sắc ký lỏng cao áp. 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS). Mẫu được bơm tự động qua cột LC (pha lệch) dưới áp cao và dung môi rửa giải thích hợp. Sau đó các thành phần tách qua cột được phát hiện bằng đầu dò detector UV. Từng thành phần được đưa thứ tự vào buồng ion hóa (ESI – Electron Spray Ionization). Các ion tạo thành qua bộ phận phân tích đến Detector, các tín hiệu được chuyển qua dạng tín hiệu điện từ, qua bộ phận lọc và khuyếch đại cho các phổ khối lượng của từng phần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thuộc loại thực vật đặc hữu của Việt Nam là cây thuốc dân gian, chữa được một số bệnh phổ biến, những hiểu biết về thành phần hóa học và dược lý của cây cho biết có tác dụng chống viêm, chống ung thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực [10]. Nhiệm vụ của bản luận văn này là chiết xuất phân lập một số ent - kauran ditecpen của cây Khổ sâm cho lá và theo dõi sự biến đổi hàm lượng ent -kauran ditecpenoit chính ở một số thời gian sinh trưởng của cây trong năm. 2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là mẫu cành và lá khô. Mẫu cành, lá tươi được thu theo các tháng 1,3,4,5/2008 tại Tân Yên, Bắc Giang và các mẫu thu ở các vùng Sóc Sơn, Ninh Bình, Phú Thọ, Hưng Yên. Các mẫu nói trên đã được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định là đồng nhất về mặt thực vật và định danh là Croton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae. Ảnh 2.1: Hoa và quả cây Khổ sâm Ảnh 2.2: Lá và quả cây Khổ sâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Mẫu cây tươi lấy về được sấy ngay ở 110 C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát, hoặc sấy ở nhiệt độ 50-60 C cho tới khi khô giòn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với cloroform ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Các dịch chiết được cất kiệt dung môi ở áp suất giảm để nguội, rồi đem cân. Việc phân lập các chất ra khỏi hỗn hợp của chúng được kết hợp những phương pháp khác nhauV: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế v.v...để được chất tinh khiết. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm. 2.1.2. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết. Để theo dõi sự biến động thành phần hoá học của cây C.tonkinensis thu ở các thời điểm khác nhau đã dùng phương pháp bán định lượng bằng cách cân trực tiếp các chất phân lập được từ khối lượng ngâm chiết. Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như: - Sắc ký lớp mỏng (TLC) - Sắc ký cột thường - Sắc ký lỏng áp suất cao 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, R f, điểm nóng chảy, v.v.. khi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Đối với những chất rắn có dạng tinh thể rõ ràng, có thể dùng để ghi phổ nhiễu xạ tia X, nhờ đó biết được các thông số về cấu trúc của phân tử đem nghiên cứu. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ 120 C thời gian từ 1, 5 giờ đến 2 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554). Các hệ dung môi triển khai SKLM: 1. n-Hexan - EtOAc (8 : 1) hệ A 2. n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3. n-Hexan - EtOAc (2 : 1) hệ C 4. Cloroform - metanol (9 : 1) hệ D Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử Vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 o C để phát hiện các hợp chất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0, 040 đến 0,063 mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boởtus hoặc trên máy Electrothermal IA -9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), dạng viên nén KBr. - Phổ khối ghi trên máy MS -Engine-5989-HP (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE /WILLEY 250L. - Phổ 1 H và 13 C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE VARIAN -400MHz, Varian Unity 600 chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, DMSO-d6. - Phổ nhiễu xạ tia X trên máy Mac Science MX C18 2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây C. tonkinensis Mẫu cây tươi mới thu hái được phân loại riêng lá, thân, cành. Mẫu sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với Cloroform ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết Cloroform được cất loại dung môi ở áp suất giảm. Việc thu nhận các chiết phẩm từ mẫu nghiên cứu được tóm tắt trong sơ đồ 2.1 ngâm chiết mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Sơ đồ 2.1: Chiết tách, phân lập các ent -kauran từ cây khổ sâm Các dịch ngâm chiết nói trên được làm khô bằng Na2SO4 , lọc rồi cất kiệt dung môi ở áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân. Như vậy từ mỗi bộ phận của cây sẽ có 2 loại chiết phẩm được ký hiệu là: F1 và F2. Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho lá ở Tân Yên, Bắc Giang được nêu trong bảng 2.1 và 2.2. Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết lá cây C.tonkinensis thu theo các thời điểm khác nhau tại Tân Yên - Bắc Giang. Thời gian thu hái Bộ phận Khối lượng (g) Khối lượng cặn chiết (g) F1 F2 Tháng 1/08 Lá 240 16.4 12.1 Tháng 3/08 Lá 200 19.7 15.8 Tháng 4/08 Lá 200 25.9 12.9 1.ChiÕt CHCl3 2.Gép, cÊt lo¹i dung m«i 1. ChiÕt MeOH 2. CÊt lo¹i dung m«i Nguyªn liÖu kh« nghiÒn nhá CÆn chiÕt CHCl3 (F1) B· CÆn chiÕt MeOH (F2) B· Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Tháng 5/08 Lá 133 13.3 9.5 Bảng 2.2: Khối lƣợng cặn chiết cành cây C.tonkinensis thu theo các thời điểm khác nhau tại Tân Yên - Bắc Giang. Thời gian thu hái Bộ phận Khối lượng (g) Khối lượng cặn chiết (g) F1 F2 Tháng 1/08 Cành 200 6.0 9.4 Tháng 3/08 Cành 200 6.4 4.3 Tháng 4/08 Cành 200 8.3 5.2 Tháng 5/08 Cành 180 9.7 7.7 Bảng 2.3: Khối lƣợng cặn chiết cành và lá cây C.tonkinensis thu theo các thời điểm khác nhau tại Sóc Sơn -Hà Nội. Thời gian thu hái Bộ phận Khối lượng (g) Khối lượng cặn chiết (g) F1 Tháng 4/07 Lá 200 16,1 Cành 200 16,3 Tháng 5/07 Lá 200 23,4 Cành 200 17,1 Tháng 11/07 Lá 200 18,1 Cành 200 15,2 2.4. Phân lập và tinh chế các chất. 2.4.1.Các dịch chiết CHCl3 của cây Khổ sâm thu vào tháng 1/2008 2.4.1.1.Các dịch chiết CHCl3 của lá cây Khổ sâm (dịch chiết F1L1) Lấy 16, 4g cặn CHCl3 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. Rửa giải cột bằng hệ dung môi nR -hexan-etyl axetat (15:1) và (10:1) đã thu được khối ch?t r? n kết tinh hình kim, không màu. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu được khối kết tinh hình kim. Hỗn hợp này đem tách lại trên cột silicagel loại nhỏ, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (5:1); (3:1) và (1:1) đã thu được các chất ký hiệu D1 (Crotonkin-1) và D2 (Crotonkin-3). Kết tinh lại trong axeton cho khối chất rắn vô định hình và một số tinh thể hình kim. 2.4.1.1.1. Ent-7 -hydroxy-18-axetoxy-16-kauren-15-on (Crotonkin-1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan - etyl axetat (4:1), thu được chất kết tinh hình kim, Rf B=28, nóng chảy ở 142-143 C, Rt =23.9. Phổ FT -IR max (cm -1 ): 3482, 2933, 1744, 1717, 1642, 1466, 1253, 1043. Phổ khối EI -MS m/z (%): 360 [M] + (13); 342 [M-H2O] + (7); 332 (25); 269 (9); 225 (4); 161 (9); 135 (24); 107 (48); 91 (77); 79 (100); 55(75). Phổ 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3); (ppm): 5,94 (1H, t, J 1,0Hz, H- 17B); 5,257(1H, t, J 1,0 Hz, H-17A); 4,00 (1H, dd, J 4,5Hz, 11,7Hz, H-7 ); 3,84 (1H, d, J 11,1 Hz, HB-18); 3,62 (1H, d, J 11,1Hz, HA-18); 3,08 (1H, m, H-13); 2,03 (1H, d, J 2,3Hz, H-14); 1,955 (1H, tdd, J 2,7Hz, 6,2Hz, 13,2Hz, H-12); 1,74 (1H, ddd, J 3,2Hz, 3,1Hz, 12,8Hz, H-1 ); 1,67 (1H, ddd, J 1,9Hz, 4,7Hz, 11,8Hz, H-6 ); 1,411 (1H, q, J 12,0Hz, H-6 ); 1,36 (1H, d, J 4,3Hz, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 H-3 ; 1,25 (1H, dd, J 1,6Hz, 12,3Hz, H-5); 0,82 (3H, s, CH3-19), 1,11 (3H, s, CH3-20); 1,19 (1H, d, J 8,5Hz, H-9); 0,71 (1H, td, J 0,9Hz, 3,8Hz, 12,9Hz, H- 1 ). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3); (ppm): 209,8 (s, C-15); 171,2 (s, OCOCH3); 149,1 (s, C-16); 114,9 (t, C-17); 72,2 (t, C-18); 70,7 (d, C-7); 58,3 (s, C-8); 51,7 (d, C-9); 46,2 (d, C-5); 39,6 (s, C-10); 38,8 (t, C-1); 37,5 (d, C- 13); 36,4 (s, C-4); 35,4 (t, C-3); 32,8 (t, C-12); 27,8 (t, C-14); 27,6 (t, C-6); 21,0 (q, CH3CO); 18,1 (q, C-20); 17,9 (t, C-11); 17,5 (q, C-19); 17,5 (t, C-2). Phổ X -Ray của Crotonkin-1: 2.4.1.1.2. Ent-1 -axetoxy-7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on (Crotonkin- 2) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (4:1) đã thu được chất kết tinh hình kim, RfC=70, nóng chảy ở 97-98 C, Rt=21.6 . Phổ FT -IR (KBr) max (cm -1 ): 3272, 1727, 1651, 1464, 1373, 1243, 1178, 1154, 1118, 1095, 1028, 994, 961. Phổ khối EI -MS m/z(%):377[M+H] + (0.02), 358(0.2), 316[M- CH3COOH] + (4), 299 (4), 298 (10), 284 (2), 283 (9), 255 (1), 245 (2), 229 (3), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 227 (4), 145 (2), 121 (4), 117 (5), 107 (11), 105 (17), 79 (13), 69 (14), 55 (26), 43 (100). Phổ HREI -MS m/z (%): 376,2248 [M] + tính theo công thức C22H32O5 376,2250. Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) (ppm): 6,04 (d, 1H, J 4,9, OH); 6,16 (s, 1H, OH); 5,92 (s, 1H); 5,38 (s, 1H); 4,73 (s, 1H); 4,68 (m, 1H); 4,00 (td, 1H, J 4,9, 12,4 Hz); 1,38 (dt, J 4,1, 14,0 Hz); 2,91 (s, 1H); 1,84 (m, 1H); 1,51 (d, 1H, J 8,8Hz); 1,28 (dd, J 5,8, 16,4 Hz); 1,24 (dd, J 1,7; 12,4Hz); 0,90 (s, CH3); 0,83 (s, CH3); 1,06 (s, CH3). Phổ 13 C-NMR (150MHz, DMSO) (ppm): 207,1 (s, C=O); 169,7 (s, COCH3); 148,3 (s); 116,8 (t); 72,9 (d); 72,3 (d); 46,8 (d); 46,3 (d); 60,0 (s); 74,4 9d); 45,7 (d); 42,1 (s); 34,7 (t); 32,6 (s); 33,1 (q); 30,6 (t); 28,6 (t); 22,3 (t); 21,3 (q); 21,0 (q); 18,0 (q); 16,5 (t). Phổ X -Ray của Crotonkin-2: 2.4.1.1.3. Ent-(16S)-7 -hydroxy-18-axetoxy-kauran-15-on (Crotonkin-3) Tiếp tục rửa giải cột bằng hỗn hợp hexan -etylaxetat (3:1) đã thu được chất kết tinh, không màu, không mùi, Rf C= 63, nóng chảy ở 177-179 C, Rt = 22.4 . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Phổ FT -IR max (cm -1 ): 3489, 2934, 2868, 1732, 1707, 1461, 1380, 1291, 1253, 1056, 934. Phổ EI -MS m/z (%):362[M] + (2); 344 [M-18] + (7); 304 (21); 284 (15); 271 (11); 152 (34); 123 (70); 109 (100); 95 (53); 81 (83); 67 (75); 55 (89). Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): 3,90 (1H, dd, J 3,9, 11,6); 3,86 (1H, d, J 11,1), 3,64 (1H, d, J 11,1); 2,25 (1H, q, J 7,0 Hz); 2,07 (3H s,); 1,98 (1H, dd, J 4,2, 10,0 Hz); 1,78 (1H, td, J 13,0, 3,5Hz)); 1,65m; 1,50m; 1,46m; 1,26 (1H, dd, J 3,9, 13,4); 1,28 (1H, d, J 13,2); 1,10 (3H, d, J 7,1q); 1,12 (3H s,); 0,83 (3H s,). Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm): 223,9 (s); 171,3 (s); 72,3 (t); 71,3 (d); 58,4 (s); 51,8(d); 48,4 (d); 46,5 (d); 39,3 (s); 38,7 (t); 36,4 (s); 35,8 (t); 34, 5 (d); 28,5 (t); 28,4 (t); 25,3 (t); 21,1 (q); 18,3 (q); 17,9 (t); 17,6 (t); 17,5 (q); 10,0 (q). Phổ X -Ray của Crotonkin-3: 2.4.1.2. Các dịch chiết CHCl3 của cành cây Khổ sâm (F1C1) Làm tương tự như mục 2.4.1.1 từ 6.0g cặn F1C1 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 khoảng cách nhỏ (5 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi nT -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu được chất kết tinh hình kim nhỏ: CT4 (crotonkin-4), chất D1 (Crotonkin- 1). Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (3:1) đã thu được chất kết tinh Crotonkin -3 ở dạng hình kim. 2.4.2. Các dịch chiết CHCl3 của lá cây Khổ sâm thu vào tháng 3/2008 Cũng tương tự như trên lấy 19.7g cặn F1L3 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Khi rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu được hỗn hợp khối kết tinh vô định hình. Sau đó đem tách trên cột silicagel loại nhỏ, rồi rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat bắt đầu từ (10:1); (5:1); (3:1) thu được Crotonkin -5, Crotonkin-1, Crotonkin-2, Crotonkin-3, . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thực nghiệm và các kết quả đạt đƣợc Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen từ cây Khổ sâm (Croton tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung ent -kauran-16-ent-15-on. Theo qui tắc IUPAC, chúng tôi đề nghị gọi tên các ent -kauran này là crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 3.1), cấu trúc hoá học và một vài đặc tính vật lý của chúng (bảng 3.2). Bảng 3.1: Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis Gagnep., Thứ tự Tên chất CTPT Tên khoa học Thời gian công bố Tài liệu 1 Crotonkin-1 C22H32O4 ent-18-axetoxy-7 - hydroxykaur-16-en-15- on 25/10/1999 13/2/2003 14,16 2 Crotonkin-2 C22H32O5 ent-1a-axetoxy-7 ,14a- dihydroxykaur-16-en- 15-on 10/11/2002 28/3/2003 15,18 3 Crotonkin-3 C22H34O4 ent-16(S)-18-axetoxy- 7 -hydroxykaur-15-on 13/02/2003 01/3/2004 16,20 4 Crotonkin-4 C20H30O3 ent-7 ,14a- dihydroxykaur-16-en- 15-on 9/7/1998 28/3/2003 17,18 5 Crotonkin-5 C22H32O5 ent-18a-axetoxy- 7a,14 -dihydroxykaur- 16-en-15-on 28/03/2003 18 6 Crotonkin-6 C20H30O3 ent-7 ,18- dihydroxykaur-16-en- 15-on 09/9/2003 19 7 Crotonkin-7 C24H34O6 ent-1a,14a-diacetoxy- 7 -hydroxykaur-16-en- 01/03/2004 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 R5 O R4 R1 R2-H2C R3 15-on 8 Crotonkin-8 C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy- 14a -hydroxykaur-16- en-15-on 01/03/2004 20 9 Crotonkin-9 C22H32O4 ent-18-axetoxy-14a- hydroxykaur-16-en-15- on 01/03/2004 20 10 Crotonkin-10 C22H32O5 ent-11a -axetoxy- 7 ,14a-dihydroxykaur- 16-en-15-on Chem. Pharm.Bull . 2002,50, 808-813. 29/12/2004 . 21,24 11 Crotonkin-11 C20H28O3 ent-kaur-16-en-15-on- 18-oic acid Phytochem. 1973, 12, 2712-2723. 29/12/2004 . 22,24 12 Crotonkin-12 C20H32O ent-18- hydroxykaur- 16-en Phytochem. 1988, 27, 3209-3212. 29/12/2004 23,24 13 Crotonkin-13 C26H36O7 ent-1a,7 ,14a- triacetoxykaur-16-en- 15-on 2007 13,15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Bảng 3.2: Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các crotonkin từ cây Croton tonkinensis Gagnep., Th ứ tự R1 R2 R3 R4 R5 M mp( o C) Rt (phút) 1 H OAc OH H =CH2 360 142-143 23.9 2 OAc H OH OH =CH2 376 97-98 21.6 3 H OAc H OH CH3 362 177-179 22.43 4 H H OH OH =CH2 318 210-212 22.63 5 H OAc OH OH =CH2 376 21.39 6 H OH OH H =CH2 318 155-156 7 OAc H OH OAc =CH2 418 22.64 8 OAc H OAc OH =CH2 418 23.01 9 H OAc H OH =CH2 360 10 11-OAc H OH OH =CH2 376 11 H COOH H H =CH2 316 12 H OH H H =CH2 288 13 OAc H OAc OAc =CH2 460 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 3.2. Chiết tách, phân lập các hoạt chất chính ent -kauran từ cây Khổ sâm. Với nhiệm vụ phân lập một số ent -kauran là thành phần chính của cây Khổ sâm và dịch chiết của lá, cành. Mẫu cây đem phân loại riêng cành và lá. Nguyên liệu đã xấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm chiết theo sơ đồ 2.1. Từ mẫu cây thu vào tháng 1/2008 tại Tân Yên Bắc Giang đã phân lập được một số hợp chất sau: 3.2.1. Ent-7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-1) Từ lá và cành cây này chúng đã thu được chất crotonkin -1 [4]. Hiện màu trên SKLM với thuốc thử vanilin -H2SO4 cho màu tím đỏ, với thuốc thử Dragendorf cho màu vàng cam xỉn, sau đó chuyển sang màu nâu, dưới ánh sáng tử ngoại (254 nm) không cho huỳnh quang. Khi kết tinh lại trong hỗn hợp etylaxetat -n-hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy ở 142 0 -143 0 C. Việc so sánh đối chiếu các dẫn liệu phổ FT -IR ,MS, 1 H- và 13 C-NMR đưa ra cấu trúc ent -7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (crotonkin-1) hoàn toàn phù hợp với [4] . Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X rõ ràng và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.1. Phối cảnh không gian của crotonkin -1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 3.2.2. Ent-1a-axetoxy-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2) Chất này được phân lập từ bộ phận cành và lá. ent -kauran này dễ tan trong các dung môi hữu cơ, ít tan trong ete dầu hoả, cho phản ứng màu da cam tươi với thuốc thử Dragendorff, màu tím đen với thuốc thử vanilin - H2SO4 5%. Kết tinh lại trong axeton cho khối chất rắn vô định hình nóng chảy ở 107-108 0 C và một số tinh thể hình kim nóng chảy ở 97-98 0 C. Kết tinh lại trong hỗn hợp etylaxetat -n-hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy ở 97- 98 0 C. So sánh các đặc trưng vật lý với chất chuẩn và các dữ liệu phổ FT -IR ,MS, 1 H- và 13 C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc ent -1a-axetoxy- 7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2). Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X rõ ràng và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.2. Phối cảnh không gian của crotonkin -2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 3.2.3. Ent-16(S)-18-axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3) ent-kauran ditecpen này được phân lập từ cành cây C.tonkinensis. Crotonkin-3 hiện màu trên SKLM với thuốc thử vanilin -H2SO4 cho màu tím đỏ, không cho huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại (254 nm) và cũng không có phản ứng màu với thuốc thử Dragendorff. Kết tinh lại trong hỗn hợp etylaxetat -hexan cho những tinh thể hình kim, nóng chảy ở 177C-179 0 C. Các đặc trưng vật lý như giá trị Rf, điểm nóng chảy và các dữ liệu phổ thu được FT -IR, MS, 1 H- và 13 C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc ent -16(S)-18- axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3). Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.3. Phối cảnh không gian của Crotonkin -3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 3.2.4. Ent-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on(Crotonkin-4) Từ lá cây C. tonkinensis đã phân lập được chất Crotonkin -4. Các đặc trưng vật lý như giá trị Rf, điểm nóng chảy ở 210-212 o C các phép ghi phổ thu được so với các dữ liệu phổ chuẩn [16], [17] cho phép xác định là ent -7 ,14 a -dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-4). 3.2.5. Ent-18a-axetoxy-7a,14 -dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-5) Từ cành khổ sâm thu vào tháng 3 đã phân lập được Crotonkin -5. Những số liệu phân tích lá và cành cây khổ sâm trên máy LC -MS cho biết, trong lá thường có các ent -kauran chủ yếu là crotonkin -1, -2, -7, và -8, ở trong cành cũng có các thành phần tương tự, riêng crotonkin -3 thường trội hơn, còn crotonkin -7 và -8 lại thấp hơn rất nhiều. Sau khi xử lý khối lượng lá và cành nói trên đã thu được các ent -kauran như sau: Tên chất Khối lƣợng Tên chất Khối lƣợng Crotonkin-1 30mg Crotonkin-4 20mg Crotonkin-2 18mg Crotonkin-5 10mg Crotonkin-3 15mg Crotonkin-7 và -8 7,8mg Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số thành phần chính của hỗn hợp ent -kauran. Số liệu phân tích định tính các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho biết các ent -kauran trong lá và cành của Croton tonkinensis thường có chứa 3-4 thành phần chính, tuỳ thuộc vào bộ phận dùng (lá, cành), thời điểm thu hái và nơi sinh trưởng. Để có thể xác định một cách đồng thời hàm lượng các ent -kauran chính ở trong nguyên liệu, chúng tôi dùng phương pháp LC -MS là do phương pháp này đáp ứng được các yêu cầu nhanh, nhậy, có tính chọn lọc cao và trong cùng một mẫu phân tích. Để thực hiện phương pháp này, chúng tôi đã lựa chọn các thông số kỹ thuật đáp ứng chế độ tối ưu cho hệ thống LC -MS gồm: cột phân tích Zorbax SB-C18, RP (3.0 150mm), detector DAD ( = 254nm) và MS (ESI- Electron spray ionisation), hệ dung môi MeOH -H2O (gradien 10 :90), tốc độ dòng 0,4ml/phút, thời gian ghi 30 phút. Việc xây dựng đường chuẩn cho mẫu phân tích được thực hiện với 7 nồng độ khác nhau. Từ các số liệu về sự tương quan giữa nồng độ với diện tích tích phân trên sắc ký đồ sẽ xác định các tham số của phương trình hồi qui ở dạng y = ax + b. Nguyên tắc chung của phương pháp này là từ đám mây điểm thực nghiệm chọn đường hồi qui lý thuyết sao cho tổng bình phương các hiệu sai từ các trị số quan sát được từ mẫu yi so với trị số lý thuyết của phương trình hồi qui là nhỏ nhất [11]. Mẫu chuẩn được cân chính xác 50mg cho vào bình định mức 50ml, sau đó thêm MeOH cho đến vạch chuẩn sẽ được dung dịch gốc. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,001 ; 0,005 ; 0,01 ; 0,05 ; 0,1 ; 0, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 2 và 0,5mg/ml. Các chất Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 tinh khiết mô tả ở mục 3.2 là những ent -kauran chủ yếu của cây Khổ sâm cho lá, chúng được dùng làm mẫu chuẩn để xây dựng đường chuẩn trong phân tích định lượng theo phương pháp LC -MS. 3.3.1 Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan của Crotonkin -1 Dùng 50mg Crotonkin -1 để chuẩn bị dung dịch gốc và tạo ra 7 dung dịch với nồng độ khác nhau, bơm 1 l vào cột và chạy 30phút/ 1lần đo. Các nồng độ chất chuẩn crotonkin -1 được đo lặp lại 3 lần trên thiết bị LC -MS để lấy giá trị trung bình. Các số liệu tương quan giữa nồng độ với diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau ghi trong bảng 3.3. Bảng 3.3 : Tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau của crotonkin -1 Stt Nồng độ Diện tích thực nghiệm Diện tích lý thuyết Thời gian (phút) Khối lƣợng phân tử [M] + 1 0.001 46.01477 133.97966 23.9 360 2 0.005 93.43894 162.4191 23.9 360 3 0.01 108.5686 197.9684 23.9 360 4 0.05 448.9195 482.3628 23.9 360 5 0.1 886.9082 837.8558 23.9 360 6 0.2 1939.755 1548.8418 23.9 360 7 0.5 3521.622 3681.7998 23.9 360 Các số liệu ở bảng 3.3 chỉ ra tính ổn định cao về giá trị tích phân (S), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 khối lượng phân tử (M) và thời gian lưu (Rt = 23, 9 phút) của Crotonkin -1. Dùng phương pháp bình phương tối thiểu và từ các số liệu ở bảng 3.3 đã xác định được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -1 có: a = 7109,8596 ; b = 126, 8697 và hệ số tương quan R = 0,989908. Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -1 là: y = 7109,8596. XCT-1 + 126,8697. y: Diện tích pic thu được trên phổ LC -MS XCT-1: Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -1 §•êng chuÈn cña D1 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nång ®é (mg/ml) D iÖ n tÝc h Dien Tich LT Hình 3.1 : Đƣờng chuẩn Crotonkin -1 3.3.2 Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan của Crotonkin -2 Dùng 50mg Crotonkin -2 và làm tương tự như trên, các số liệu thu được ghi trong bảng 3.4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Bảng 3.4 : Tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau của Crotonkin -2 STT Nồng độ Diện tích thực nghiệm Diện tích lý thuyết Thời gian (phút) Khối lƣợng phân tử [M] + 1 0.001 40.21345 22.143177 21.1 376 2 0.005 42.04944 48.772285 21.6 376 3 0.01 69.21092 82.05867 21.6 376 4 0.05 363.3754 348.34975 21.6 376 5 0.1 677.5821 681.2136 21.6 376 6 0.2 1331.266 1346.9413 21.6 376 7 0.5 3349.907 3344.1244 21.6 376 Dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu và các số liệu ở bảng 3.4 đã thu được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -2 có a = 6657,277 ; b = 15, 48592 và hệ số tương quan R = 0,9999391 Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -2 là: Y = 6657,277 . XCT-2 + 15,48592 §•êng chuÈn cña CT1 0 500 1000 1500 000 2500 3000 3500 4 00 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nång ®é (mg/ml) Di en tic h Dien tich LT Hình 3.2: Đƣờng chuẩn Crotonkin - 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Tính ổn định cao trong các lần đo lặp lại cũng như sự tương quan chặt chẽ giữa các nồng độ chất chuẩn và diện tích thu được cả trên phổ LC -MS được phản ánh bởi hệ số tương quan R trong phương trình tương quan của Crotonkin -1 (0,989968) và của Crotonkin -2 (0,999939) là rất cao. Như vậy phép định lượng mỗi chất trong hỗn hợp bằng phương pháp LC -MS là ưu việt, đáp ứng các yêu cầu nhanh, nhậy và chọn lọc khi đánh giá chất lượng nguyên liệu bán thành phẩm cũng như thành phẩm trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. 3.3.3. Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan của Crotonkin -3 Dùng 50mg Crotonkin -3 và làm tương tự như trên, các số liệu thu được ghi trong bảng 3.5. Bảng 3.5 : Tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau của Crotonkin -3 Stt Nồng độ Diện tích pic Thời gian (phút) Píc phân tử [M+H-H2O] + 1 0.1 27.603 24,01 345 2 0.2 84.366 24,01 345 3 0.4 197.892 24,01 345 4 0.5 254.655 24,01 345 5 0.8 424.944 24,01 345 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 §•êng chuÈn cña D2 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Nång ®é D iÖn tÝ ch p Ýc D Hình 3.3: Đƣờng chuẩn Crotonkin - 3 Dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu và các số liệu ở bảng 3.5 đã thu được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -3 có a = 567,63 ; b = 29, 16 và hệ số tương quan R = 0,9740 Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -3 là: Y = 567,63 . XD-2 + 29,16 y: Diện tích pic thu được trên phổ LC -MS XD-2: Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -3 Cũng như Crotonkin -1 và Crotonkin -2 tính ổn định cao trong các lần đo Crotonkin -3 lặp lại cũng như sự tương quan chặt chẽ giữa các nồng độ chất chuẩn và diện tích thu được ở trên phổ LC -MS được phản ánh bởi hệ số tương quan R trong phương trình tương quan của Crotonkin -3 (0,9740) là rất cao. 3.3.4. Xác định hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cây Khổ sâm Cân lấy một khối lượng nguyên liệu (M) ngâm chiết và thu cặn chiết giàu ent -kauran (m). Cân chính xác 1mg cặn chiết và ghi trên máy LC -MS. Từ phương trình tương quan (y = ax + b) và diện tích tích phân LC -MS Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 của mỗi chất sẽ tính được khối lượng của chất đó trong 1mg cặn chiết (m) và hàm lượng (%)của Crotonkin trong nguyên liệu tính theo công thứcc: % crotonkin = m a M 100 yCT - b x x (3.1) Trong đó yCT: diện tích tích phân trên phổ đồ LC -MS ứng với Rt của Crotonkin a, b: Các hệ số trong phương trình tương quan của crotonkin Crotonkin-1 có a = 7109,85, b = 126,87 Crotonkin-2 có a = 6657,28, b = 15,48 m: cặn chiết giàu ent -kauran thu đựơc từ khối lượng M M: khối lượng nguyên liệu đem phân tích. Ví dụ cách tính: 200g (M) lá khô nghiền nhỏ thu hồi tháng 5/2007 ở Sóc Sơn - Hà Nội được ngâm chiết kiệt, làm giầu ent -kauran thu được 23, 4g cặn thô. Cân chính xác 1mg cặn chiết và đưa phân tích trên máy LC-MS thu được sắc ký đồ ký hiệu M107. Trên sắc ký đồ M107 cho biết diện tích tích phân LC -MS tương ứng với Rt của Crotonkin như sau: yCT Rt Crotonkin-1 388,463 23,96 Crotonkin-2 196,815 21,60 Thay bằng số vào công thức (3.1) ta có: % crotonkin-1 = 23,4 7109,86 200 100 388,463-126,87 x x = 0,43 % crotonkin-2 = 23,4 6657,28 200 100 196,815-15,48 x x = 0,32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 3.3.4.1. Xác định hàm lượng của crotonkin trong lá và cành Khổ sâm theo các thời điểm khác nhau 3 Theo dõi sự biến động hàm lượng các Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cành và lá cây Khổ sâm trồng ở Sóc Sơn - Hà Nội cho kết quả ghi trong bảng 3.6 Bảng 3.6: Hàm lƣợng Crotonkin chủ yếu của lá và cành Khổ sâm thu ở Sóc Sơn - Hà Nội theo một số thời điểm trong năm STT Thời gian lấy mẫu Bộ phận Hàm lƣợng (%) Crotonkin-1 Crotonkin-2 1 4/2007 Lá 0,335 0,192 2 Cành 0,062 0,048 3 5/2007 Lá 0,430 0,320 4 Cành 0,360 0,350 5 11/2007 Lá 0,520 0,560 6 Cành 0,530 0,530 3.3.4.2. Xác định hàm lượng của Crotonkin chủ yếu của lá Khổ sâm ở các vùng sinh trưởng khác nhau 3 Bảng 3.7: Hàm lƣợng một số ent -kauran chủ yếu của lá Khổ sâm thu ở một số vùng khác nhau Bộ phận cây Địa điểm Thời gian thu mẫu Hàm lƣợng (%) Crotonkin-1 Hàm lƣợng (%) Crotonkin-2 Lá Sóc Sơn 5/2007 0,43 0,32 Lá Ninh Bình 5/2006 0,74 0,50 Lá Phú Thọ 9/2007 0,73 0,78 Lá Ninh Bình 0,80 0,70 Lá Sóc Sơn 11/2007 0,52 0,56 Lá Hưng Yên 0,75 0,50 Từ cặn chiết giàu ent -kauran của các mẫu Khổ sâm theo các phổ LC - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 MS (xem phụ lục). Sau khi xử lý số liệu đã thu kết quả phân tích hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 theo các thời điểm trong năm (bảng 3.6) và theo vùng nguyên liệu (bảng 3.7). Đánh giá các số liệu trong 2 bảng này đã quan sát thấy hàm lượng các Crotonkin chủ yếu của cây Khổ sâm có sự biến động rõ rệt: Hàm lượng của các Crotonkin trong cây tăng dần từ mùa xuân hè và đạt mức cao nhất vào mùa thu hàng năm. Hàm lượng Crotonkin -1 trong mùa xuân hè luôn cao hơn Crotonkin -2 từ 1, 74 đến 1, 34 lần ở l á, và từ 1, 29 đến 1, 03 lần ở cành, nhưng sang mùa thu thì chênh lệch không đáng kể. Những số liệu phân tích ban đầu cho thấy: lá cây khổ sâm thu ở các vùng trung du (Bắc Giang, Phú Thọ, Ninh Bình) có hàm lượng ent -kauran luôn cao hơn những cây trồng ở Sóc Sơn - Hà Nội. Từ những kết quả nghiên cứu sơ bộ về sự biến động hàm lượng hoạt chất của cây Khổ sâm đã có cơ sở để nói rằng: nguyên liệu tốt nhất để chiết xuất Crotonkin -1 và Crotonkin -2 là dùng lá cây Khổ sâm ở vùng trung du thu hái vào mùa thu hằng năm. Đã xây dựng được phép định lượng đồng thời hàm lượng Crotonkin-1 vµ Crotonkin-2 trong hçn hîp. X¸c ®Þnh ®•îc thêi ®iÓm thu nguyªn liÖu ®Ó chiÕt xuÊt ho¹t chÊt chÝnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 4. KẾT LUẬN 1. Đã xác định được các điều kiện thích hợp đối với phương pháp LC /MS để phân tích một số ent -kauran ditecpen chính làm cơ sở cho việc định lượng đồng thời các ditecpen toàn phần có trong hỗn hợp nghiên cứu. 2. Đã xây dựng phương pháp định lượng Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 đáp ứng các yêu cầu nhanh, nhậy, chọn lọc và cho phép định lượng đồng thời hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong hỗn hợp. 3. Áp dụng phương pháp LC /MS để phân tích 18 mẫu nguyên liệu có chứa ent -kauran ditecpen chính là Crotonkin -1 và Crotonkin -2. 4. Các số liệu phân tích thành phần Crotokin -1 và Crotonkin -2 thu được ở một số thời điểm khác nhau cho biết nguyên liệu tốt nhất để chiết xuất là dùng nguyên liệu thu hái vào mùa thu hàng năm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 5. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH Đà CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Pham Thi Hong Minh a , Nguyen Quyet Tien a , Nguyen Ngoc Tuan a , Pham Hoang Ngoc a , Ngo Van Quang a , Nguyen Xuan Hoang b . “Quantitative Determination of two diterpenoids in Croton tonkinensis Gagnep., by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Diode Array Detector and Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry”. International scientific conference on “Chemistry for development and intergration”. 30 th Anniversary of the Institute of Chemistry Vietnam Academy of Science and Technology. Setember 12-14, 2008. Hanoi, Vietnam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc VN trang 622-623, Nhà xuất bản Y học TP Hồ Chí Minh 2. Phạm Hoàng Hộ (1991), "Cây cỏ Việt Nam", Mekong Printing. 3. Đỗ Tất Lợi (1999), "Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam", (in lần thứ 8), trang 907-908, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 4. Phạm Thị Hồng Minh “Về thành phần hoá học và các hoạt chất của cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae“. Luận án tiến sĩ hoá học, Hà Nội 12/2003. 5. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2002), "Phân lập và nhận dạng các triterpen acetat trong cây Croton tonkinensis", Tạp chí Dược học, 2002, 12, 8-9. 6. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Trần Quang Hưng, Chu Đình Kính (2003), "Phát hiện các berbin alcaloit trong cây khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis", Tạp chí Phân tích lý, hoá, sinh, 2004, 9 (1), 38-41. 7. Phạm Thị Hồng Minh, Lưu Thị Huế, Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Hữu Điển (2006), “Góp phần nghiên cứu thành phần ancaloit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) ở Tây Thiên -Tam Đảo ”. Tạp chí khoa học Trường ĐHSP Hà Nội, các KHTN 2006, 4 trang 110-114. 8. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Chu Đình Kính (2004), "Phân lập và nhận dạng một số flavonoit -C-glucosid từ cây khổ sâm cho lá (C. tonkinensis) có ở Việt nam" Tạp chí Hoá học , 2004, 42 (2), 187-190. 9. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Lan, Phạm Hữu Điển, Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Hoàng Ngọc (2007), “Nghiên cứu thành phần ancaloit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thu hái ở Ninh Bình”. Hội Nghị Hoá học Hữu cơ Toàn quốc10 /2007, 10. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc, Đái Duy Ban, Lê Kim Xuyến, Hoàng Thị Minh Châu, Lê Trung Dũng, Phan Xuân Độc, Nguyễn Văn Vũ. "Kết quả nghiên cứu khả năng tăng cường miễn dịch của các chế phẩm khổ sâm Croton tonkinensis Gagnep.," Tạp chí Y học Việt Nam, 2007, 333, 24-28 11. Chu Van Man. (2003). “Informatic applications in biology”. Tr 195- 201. National University of Hanoi Press 2003. 12. Trương Văn Như. Nghiên cứu cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) và đánh giá tác dụng trên ký sinh trùng sốt rét bằng phương pháp thực nghiệm. Luận văn PTS khoa học y dược. Hà nội 1992. 13. Nguyễn Nghĩa Thìn (1995), "Họ thầu dầu (Euphorbiaceae Juss. trong hệ thực vật Việt Nam", Tạp chí Sinh học, 17(4), 7-30. 14. Phan Tống Sơn, Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Taylor W. C (1999), "Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ câyKhổ sâm cho lá Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae". Tạp chí Hoá học, 27(4), tr. 1-2. 15. Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Đang Ngoc Quang, Hashimoto T., Takaoka S., Asakawa Y (2003), "A novel ent-1 -acetoxy- 7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on from the Croton tonkinensis", Chem. Pharm. Bull.51(5), 590-591. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 16. Phạm Thị Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2003), "ent-(16S)-7 -hydroxy- 18-acetoxy kauran-15-on - một kauran diterpen mới, phân lập từ cây khổ sâm cho lá Croton tonkinensis", Tạp chí Hoá học, 41(2), 104-109. 17. Perry N. B., Burgess E. J., Back S. H., Weavers R. T., Geis W., Manger A. B., (1999). "11-Oxygenated cytotoxic 8,9-secokauranes from a New Zealand liverwort, Lepidolarena tayloric ". Phytochemistry, 50 (9), 423-433. 18. Phan Minh Giang, Hui Zi Lin, Phan Tong Son, Jeong Hyuny Lee, Yuong Soo Hong and Jung Joon Lee. (2003). Ent-kauran diterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPS-inđuce NF -kB activation and no production. J. Nat. Prod., 66 (9), 1217-1220. 19. Pham Thi Hong Minh, Pham Hoang Ngoc, Nguyen Manh Cuong, Taylor W. C, (2004). “A new ent-kauran diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep., leaves.”. Fitoterapia, 75 (2), 552-556. 20. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee, J. J., and Otsuka, H., (2004). “ent- kauran diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep.,”. Chem. Pharm. Bull., 52 (7), 879-882. 21. Nagashima F., Kondoh M., Uematsu T., Nishiyama A., Saito S., Sato M., and Asakawa (2002). Chem. Pharm. Bull. 50, 808-813. 22. Gonzales A.G., Frega B.M., Hernandez M. G., Luis J. G., (1973). Phytochemistry, 12, 2721-2723. 23. Monte F. J. G., Dantas E. M. G., Braz F. R., (1988). Phytochemistry, 27, 3209-3212. 24. Phan Minh Giang, Hideakii Otsuka, Phan Tong Son. (2005). "The minor ent-kauran-16-en-15-on type diterpen from Croton tonkinensis". Journal of Chemistry, 43 (2), 263-264. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 25. Addae Mensah I., Achenbach H., Waibil R., and Mwangi J. W. (1992), "Epoxychiromodine and other constitutents of Croton megalocarpus" Phytochem., 31(6), 2055-2058. 26. Barbili F. E., Moulis C., Bon M. Respand M. J., Fouraste I. (1998), "Three furanoditerpenes from the bark of Croton campestris” Phytochem., 48(1), 165-169. 27. Cai Y., Chen Z. P., and Phillipson J. D. (1993), "Clerodane diterpenoids from Croton lechleri" Phytochem., 34(1), 265-268. 28. Chapman & Hall/CRC 1982-2006,From DNP on CD-ROM,Version 15:1. 29. Chatterjee A., Banerjee A., and Bohlmann F. (1978), "Isocrotocaudin, a new norclerodans-type diterpene from Croton caudatus", Phytochem., 17, 1777-1779. 30. Gelpi E., “Contributions of liquid chromatography-mass spectrometry to “highlights” of biomedical research”. J. Chromatogr. A, 1000, p. 567-581. (2000). 31. He X. G., “On-line identification of phytochemical constituents in botanical extracts by combined high-performance liquid chromatographic-diode array detection-mass spectrometric techniques”. J. Chromatogr. A, 880, p. 203-232 (2000). 32. Kapingu M. C., Guillaume D., Mbwambo Z. H., Moshi M. J., Uliso F. C., (2000), Mahunnah R. L. A. "Diterpenoids from the roots of Croton macrostachys" Phytochem., 54, 767-770. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 33. Kitazawa E., Two diterpenes alcohols from Croton sublyratus. (1981), Phytochem., 20(2), 287-289. 34. Krebs H. C., Ramiarantsoa H. (1996), "Clerodan diterpenes and other constituents of Croton hovarum" Phytochem., 41(2), 561-563. 35. LecomteH., “Flore general de L’Indochiene”, 1910-1931. Tom V., p.291. 36. Maciel M. A. M., Pinto A. C., Arruda A. C., Pamploma S. G. S. R., Vandelinde F. A., Lapa A. j., Echevarria A., ... Rao V. S. N. (2000), "Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology: a successful combination in the study of Croton cajucara" J. Ethnopharm., 70, 41-55. 37. Maciel M. A. M., Pinto A. C., Brabo S. N. and Silva M. D. A. (1998), "Terpenoids from Croton cajucara" Phytochem., 49(3), 823-828. 38. Martins A.P., Salguerio L.R., Goncalves M.J., Vila R., Tomi F., (2000). Antimicrobial activity and chemical composition of the back oil of Croton stellulifea, an endemic species from S. tome & Principe. Planta Med., 66(7), 647-650. 39. Ngadjui B. T., Folefoc G. G., Keumedjio F., Dongo E., Sondengam B. L., Connolly J. D. (1999), "Crotonadiol, a labdane diterpenoids from the stem bark of Croton zambesicus" Phytochem., 51, 171-174. 40. Nguyen Manh Cuong, Tran Van Sung, Ahn B.Z. (2002). Cytotoxic compounds from Croton Cascarilloides. Kor. J. Pharmacogn., 33(3), 207-210. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 41. Pelletier S. W. (1970). Chemistry of the alkaloids. Van. Nostrand Reihold company. Newyork/Toronto/London/Melburn., p. 31-82. 42. Peres M. T. L. P., Monache F. D., Cruz A. B., Pizzolati M. G., Yunes R. A. (1997), "Chemical composition and antimicrobial activity of Croton urucurana Baillon (Euphorbiacea) J. Ethnopharm., 56, 223-226. 43. Piacente S., Belisario M. A., Castillo H. D., Pizza C., and Feo V. D. (1998), "Croton ruizianus: Platelet proaggregating activity of two new pregnane glucoside" J. Nat. Prod., 61, 318-322. 44. Roengsumram S., Achayindee S., Petsom A., Vilaivani T. (1998), "Two new cembranoids from Croton oblongifolius" J. Nat. Prod., 61, 652-654. 45. Vigor C., Fabre N., Fourasté I and Moulis C. (2002), Neoclerodane diterpenoids from Croton eluteria J. Nat. Prod., 65, 1180-1182. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 PHỤ LỤC 1. Phổ của Crotonkin -1 ............................................................................. 1 1.1. Phổ IR.............................................................................................. 1 1.2. Phổ MS ............................................................................................ 2 1.3. Phổ 1 H-NMR.................................................................................... 3 1.4. Phổ 3 C-NMR và DEPT ..................................................................... 4 2. Phổ của Crotonkin -2 .............................................................................. 5 2.1. Phổ IR.............................................................................................. 5 2.2. Phổ 1 H-NMR.................................................................................... 6 2.3. Phổ 3 C-NMR ................................................................................... 7 2.4. Phổ DEPT ........................................................................................ 8 3. Phổ của Crotonkin -3 .............................................................................. 9 3.1. Phổ IR.............................................................................................. 9 3.2. Phổ MS .......................................................................................... 10 3.3. Phổ 1 H-NMR.................................................................................. 11 3.4. Phổ 3 C-NMR ................................................................................. 12 4. Phổ của Crotonkin -5 ............................................................................ 13 4.1. Phổ 1 H-NMR.................................................................................. 13 4.2. Phổ 3 C-NMR ................................................................................. 14 4.3. Phổ DEPT ...................................................................................... 15 5. Các số liệu phân tích phổ LC /MS và đường chuẩn của Crotonkin -1 ...... 16 6. Các số liệu phân tích phổ LC /MS và đường chuẩn của Crotonkin -2 ...... 32 7. Một số đại diện phổ LC /MS của mẫu thu tại Sóc Sơn ............................ 48 7.1. Phổ LC /MS của mẫu lá khổ sâm thu 5/2007 .................................. 48 7.2. Phổ LC /MS của mẫu cành khổ sâm thu 5/2007 ............................. 50 7.3. Phổ LC /MS của mẫu lá khổ sâm thu 4/2007 .................................. 52 7.4. Phổ LC /MS của mẫu cành khổ sâm thu 4/2007 ............................... 54 7.5. Phổ LC /MS của lá khổ sâm thu tại Ninh Bình vào tháng 5/2007 .... 56 7.6. Phổ LC /MS của cành khổ sâm thu tại Ninh Bình 5/2007 ............... 58 8. Các số liệu phân tích phổ LC /MS và đường chuẩn của Crotonkin -3 ...... 60 9. Một số đại diện phổ LC /MS của mẫu thu tại Tên Yên-Bắc Giang............72