Đề tài Tìm hiểu về protein đậu phộng

79.90C và 95.50C (Molina Ortiz & Anón, 2001) với Td là thước đo sự ổn định nhiệt, giá trị Td càng lớn thì sự ổn định nhiệt của protein dạng cầu càng cao (Tang, Sun, & Yin, 2009).Theo phân tích DSC (bảng 3.3), tỉ lệ Td của conarachin (7S) và arachin (11S) trong protein đậu phộng cao hơn protein đậu nành, có thể một phần hạn chế sự hình thành gel. Hơn nữa, không có liên kết đisunfua tham gia vào liên kết của những “subunit” trong arachin, bởi vì sự phân ly trong dung dịch urê xảy ra khi không có mặt -mercaptoethanol (Yamada, Aibara, và Morita, 1979). Điều này có nghĩa là có nhiều liên kết đisunfua hơn nữa được giấu vào bên trong. Enzym thủy phân hạn chế tạo DH 2.1% bộc lộ cấu trúc của PPI và lộ ra những liên kết sulphydryl và đisunfua bên trong các phân tử, điều đó góp phần cho sự hình thành gel rất nhiều Với sự gia tăng của DH, khối gel sẽ bị thủy phân làm phá vỡ mạng gel và giảm tương tác protein-protein. 3. Thay đổi tính chất của màng protein đậu phộng bằng phương pháp vật lý và hóa học [34] Các tính chất của màng protein đậu phộng đã được thay đổi bằng các phương pháp vật lý và hóa học, và những ảnh hưởng của nó lên màu sắc, lực cơ học, sự hòa tan vào nước và sự ngăn cản hơi nước và ôxy qua màng được nghiên cứu. Những phương pháp vật lý bao gồm phương pháp biến tính nhiệt lên dung dịch hình thành màng trong 30 phút ở 600C, 700C, 800C và 900C, tia cực tím chiếu xạ lên màng lên đến 24 h, và ba bước xử lý siêu âm dung dịch hình thành màng. Phương pháp hóa học bao gồm thêm các aldehyt và anhydric. Xử lý nhiệt ở 700C, tia cực tím chiếu xạ trong 24 h, xử lý siêu âm 10 phút trong bồn nước, và thêm formaldehyde và glutaraldehyde vào là nguyên nhân của sự gia tăng đáng kể độ bền kéo của màng. Tính thấm hơi nước(WVP) và tính thấm oxy(OP) qua màng giảm sau khi biến tính nhiệt và xử lý aldehyde. OP cũng giảm với xử lý tia cực tím. Xử lý nhiệt là phương pháp xử lý hiệu quả nhất, làm cho màng bền hơn, khả năng chống thấm nước tốt hơn và thấm hơi nước và oxy yếu hơn. Những thuộc tính của protein đậu phộng có thể thay đổi bằng những phương pháp trong nghiên cứu này. Điều đó giúp cho màng có những ứng dụng đặc biệt. làm tăng lực cơ học, giảm hòa tan trong nước và làm gia tăng những thuộc tính tiềm ẩn được cải thiện như mong muốn. Nhìn chung, những thuộc tính vật lý và hóa học của màng đã thay đổi được thay đổi đáng kể bởi sự liên kết chéo của mạng protein. Xử lý nhiệt là phương pháp hiệu quả nhất, tiếp theo là xử lý bằng tia UV và xử lý với aldehyte. Do đó, protein đậu phộng có thể sử dụng như một vật liệu sinh học trong bao gói và một số ứng dụng khác. 4. Protein đậu phộng concentrate: sản xuất và ảnh hưởng tính chất chức năng trong quá trình chế biến[33] Protein đậu phộng concentrate (PPC) được phân lập từ bột đậu phộng đã tách béo lên men và chưa lên men bằng kết tủa đẳng điện và quá trình phân ly vật lý. PPC được sấy khô bằng sấy phun hoặc sấy chân không. Bột PPC từ mỗi kỹ thuật sấy được đánh giá gần đúng thành phần và tính năng (sự hòa tan protein, năng lực liên kết hệ nước / dầu, năng lực nhũ hóa, khả năng tạo bọt và độ nhớt) cùng với bột đậu phộng tách béo và protein đậu nành isolate. PPC chứa hơn 85% protein so với 50% protein trong bột đậu phộng tách béo được sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất PPC. Khả năng hòa tan của PPC tương tự như bột đậu phộng, với độ hòa tan tối thiểu quan sát được ở pH 3.5-4.5 và độ hòa tan tối đa ở pH 10 và cao hơn. Đậu phộng rang làm giảm tất cả các tính chất chức năng của bột đậu phộng tách béo trong khi lên men có tác dụng ngược lại. Các kĩ thuật sấy ảnh hưởng đáng kể đến các tính chất chức năng của PPC. PPC sấy phun thể hiện tính chất chức năng tốt hơn so với PPC sấy chân không, đặc biệt là về khả năng nhũ hóa và khả năng tạo bọt. PPC sấy phun cũng cho thấy có thể so sánh như với protein đậu nành isolate (SPC) đã được thương mại hóa về liên kết với dầu và khả năng tạo bọt. Ở nồng độ tương đương và nhiệt độ phòng, hệ phân tán PPC biểu hiện độ nhớt thấp hơn so với hệ phân tán protein đậu nành isolate (SPI). Tuy nhiên, khi đun nóng tới 900C trong 30 phút, độ nhớt của PPC tăng mạnh. Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy PPC có thể được sử dụng trong công thức thức ăn đòi hỏi cao năng lực tạo nhũ tương, nhưng không thích hợp cho ứng dụng đòi hỏi khả năng giữ nước cao và khả năng tạo bọt. PPC có thể là một nguồn cung cấp protein cho nhiều sản phẩm thực phẩm dành cho người tiêu dùng thiếu protein ở các nước đang phát triển cũng như là một thành phần chức năng cho ngành công nghiệp đậu phộng. Sản xuất PPC làm tăng thêm giá trị cho bột đậu phộng tách béo, và là một sản phẩm phụ trong sản xuất dầu đậu phộng. Tính chất chức năng của các loại bột protein đậu phộng và đậu phộng tập trung chủ yếu ở sự hòa tan protein. Protein với những liên kết dầu- nước cao được mong muốn để sử dụng trong các loại thịt, xúc xích, bánh mì, và bánh ngọt trong khi protein có khả năng nhũ hóa cao lại tốt cho xúc xích, xúc xích xông khói, súp và salad dressing. Lên men bột protein đậu phộng và thu nhận protein concentrate cho thấy những tính chất chức năng tốt hơn protein chưa lên men và thu nhận protein concentrate, đặc biệt là khả năng giữ nước và khả năng nhũ hóa. PPC sấy phun được phát triển từ bột đậu phộng rang có khả năng giữ dầu tốt hơn và khả năng nhũ hóa tốt hơn và phù hợp để sử dụng trong các sản phẩm như thịt và xúc xích. Khả năng nhũ hóa cực kỳ tốt của loại PPC này làm cho nó trở thành ứng cử viên cho các công thức thức ăn đòi hỏi khả năng nhũ hóa cao như salad dressing và kem súp. Độ nhớt thấp của hệ phân tán PPC ở nhiệt độ phòng và độ nhớt cao hơn trong lúc gia nhiệt làm cho PPC trở thành một chất làm đặc cho súp giàu protein. Ngoài ra, một thực tế là PPC được phát triển từ bột đậu phộng rang tách béo là một lợi thế quan trọng đối với ngành công nghiệp sản xuất dầu đậu phộng vì bột đậu phộng rang tách béo là một sản phẩm phụ rẻ tiền trong sản xuất dầu đậu phộng. Vì vậy, protein đậu phộng isolate và concentrate có khả năng tăng thêm giá trị cho ngành công nghiệp đậu phộng và cung cấp nguồn xử lý thực phẩm với giá cả phải chăng từ nguồn protein thực vật với hương vị đồng nhất và đặc tính chức năng đặc trưng. CHƯƠNG 4: BỆNH DỊ ỨNG VÀ PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG ĐẬU PHỘNG BỆNH DỊ ỨNG Bệnh dị ứng [13], [3] Dị ứng là từ chung để chỉ các phản ứng khác nhau của cơ thể đối với các chất như phấn hoa, lông mèo hoặc các chất khác, mà cơ thể cho là lạ từ bên ngoài vào. Thống kê cho thấy khoảng 15% dân số hiện nay mắc bệnh dị ứng và nhiều trường hợp bị dị ứng nặng. Dị ứng là do hệ miễn dịch của cơ thể quá mẫn cảm. Hệ miễn dịch dị ứng nhận nhầm một chất vốn không có hại thành có hại, sau đó tấn công chất này với cường độ mạnh hơn mức cần thiết. Người có cơ địa dị ứng là người mà cơ thể quá mẫn cảm với một số yếu tố mà phần lớn mọi người thấy chúng lành hoặc không gây hại. Những tác nhân gây dị ứng thông thường là phấn hoa, khói thuốc lá, bụi nhà máy, lông súc vật hoặc biểu bì súc vật (gầu), một số loại thực phẩm, bụi nhà và trong một số ít trường hợp tiếp xúc với không khí hoặc nước quá lạnh cũng gây phản ứng dị ứng. Tình hình dị ứng đậu phộng trên thế giới [22], [18], [9], [8], [15], [17] Tỷ lệ dị ứng đậu phộng ở các nước phương Tây đã được tính là cứ 1000 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng, thậm chí có những nước cứ 200 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng. Người ta nhận thấy rằng tỷ lệ bị dị ứng đậu phộng đang gia tăng trong những năm vừa qua. Tỷ lệ mắc bệnh dị ứng với đậu phộng ở trẻ dưới 5 tuổi ở Mỹ được báo cáo là đã tăng gấp đôi trong 5 năm từ 1998 đến 2003 (Sampson.2003). Một nghiên cứu khác báo cáo rằng dị ứng đậu phộng chiếm 28% số ca bị dị ứng thực phẩm ở trẻ em (Moneret-Vautrin, et al., 1998). Có một điều khá thú vị là tỷ lệ mắc các bệnh dị ứng đậu phộng ở các nước khác nhau là khác nhau, thông thường những người nhập cư vào Mỹ có mức độ dị ứng thực phẩm thấp hơn so với người Mỹ, nhưng khi theo cùng chế độ ăn uống và lối sống của người Mỹ thì nhanh chóng có cùng mức độ dị ứng như dân bản địa. Nguyên nhân của hiện tượng này hiện nay vẫn đang là một câu hỏi cho các nhà nghiên cứu . Trong báo cáo năm 2001 về 32 trường hợp tử vong do phản ứng phản vệ của cơ thể với các loại thực phẩm (báo cáo thực hiện tại Mỹ), đậu phộng được xác định là nguyên nhân gây ra 14/32 số ca tử vong. Khi nghiên cứu các trường hợp tử vong này, người ta thấy hầu hết các nạn nhân đều bị dị ứng thực phẩm và bị suyễn trước khi bị tử vong (Bock, et al., 2001). Tuy nhiên ở Trung quốc thì số người bị dị ứng với đậu phộng lại thấp hơn rất nhiều so với Mỹ, mặc dù Trung Quốc là nơi tiêu thụ đậu phộng rất lớn. Trong 29 trẻ em tuổi từ 2-12 ở Trung Quốc được nghiên cứu, thì thấy chúng không có dấu hiệu dị ứng lâm sàng đối với đậu phộng. Thật thú vị, dân số người Mỹ gốc Hoa sống tại Mỹ đã có một tỷ lệ dị ứng đậu phộng tương tự với dân số Mỹ nói chung (Beyer, et al., 2001). Tại Úc tỷ lệ bị tử vong do dị ứng đậu phộng ở trẻ em dưới 5 tuổi được ghi nhận là trong vòng 30 năm thì chỉ có một ca bị tử vong, tỷ lệ trẻ em Úc có nguy cơ dị ứng với đậu phộng ở mức độ nghiêm trọng là chỉ có 0.25%, thử nghiệm trên da cho dị ứng đậu phộng trong 456 trẻ em ở Tasmanian tuổi từ 7-8 tất cả đều là âm tính (Kemp, 2005). Một báo cáo gần đây từ Đức cho thấy 103 trường hợp sốc phản vệ được báo cáo bởi bản câu hỏi của bác sĩ trong năm 2004, các loại thực phẩm là trường hợp thường xuyên nhất gây phản ứng phản vệ (chiếm 57%), tiếp theo là do côn trùng chích (chiếm 13%) và liệu pháp thuốc tiêm miễn dịch (chiếm 12%). Đậu phộng và các hạt cây là loại thực phẩm thường xuyên nhất gây ra các phản ứng phản vệ (Mehl, et al., 2005). Tại Canada, tỷ lệ dị ứng đậu phộng được xác định ở trẻ em từ lớp mẫu giáo đến lớp 3 tại trường được lựa chọn ngẫu nhiên ở Montreal là ở khoảng 1.5%-1.76%. Nghiên cứu này bao gồm một bản câu hỏi, tiếp theo là xét nghiệm trên da, đo lường kháng thể IgE đặc hiệu đậu phộng, và các bài kiểm tra thử thách đậu phộng bằng miệng (Kagan, et al., 2003). Những ví dụ này chỉ ra sự chênh lệch lớn về phản ứng phản vệ với đậu phộng ở các nước trên khắp thế giới. Chắc chắn, tỷ lệ mắc dị ứng đậu phộng ở Mỹ cao hơn ở bất kỳ nước nào khác. Nhiều ý kiến đã được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này, có ý kiến cho rằng đó là do sự khác biệt trong giống đậu phộng tiêu thụ tại mỗi nơi hoặc sự khác biệt trong phương pháp chế biến đậu phộng cung cấp tại thị trường bán lẻ, sự khác biệt trong khuynh hướng di truyền dân số. Cơ chế gây dị ứng Dị ứng được định nghĩa là những tác động xấu đến sức khỏe mà có thể là kết quả của sự kích thích của một phản ứng miễn dịch cụ thể. Bệnh dị ứng có thể có nhiều hình thức và phát triển bình thường trong hai giai đoạn. Giai đoạn đầu thường gọi là giai đoạn mẫn cảm xảy ra khi một cá nhân mẫn cảm được tiếp xúc lần đầu tiên với một chất gây dị ứng gây đủ số lượng để kích thích một phản ứng miễn dịch cơ bản. Nếu các cá nhân này tiếp xúc với các chất gây dị ứng vào một lần tiếp theo thì sau đó một phản ứng miễn dịch xảy ra, dẫn đến phản ứng quá mẫn cảm gây liên quan tới các cơ quan của người bệnh (giai đoạn II). Để có thể hiểu rõ hơn về cơ chế gây dị ứng ta hãy xem sơ đồ sau : Lần 1: tiếp xúc với chất dị ứng lần đầu Tác nhân gây dị ứng (A) Đi vào trong cơ thể người Tiếp xúc trong môi trường APC (A) bị bao bọc trong môi trường APC (A) tiếp xúc với tế bào lympho-T Giải phóng ra Cytokine Cytokine tiếp xúc với tế bào (B) hình thành tế bào Plasma Sản xuất ra kháng thể IgE Kháng thể IgE tiếp xúc với tế bào Mast Hình thành lên một tế bào mới, tạm gọi là tế bào (H) Lần 2 : tiếp xúc tác nhân gây dị ứng ở các lần tiếp theo Tác nhân gây dị ứng (A) (A) tiếp xúc với tế bào (H) Hình thành nên Histamin Histamin đi vào máu gây giãn mạch máu Xuất hiện các biểu hiện của dị ứng Ở lần đầu tiên tiếp xúc (do ăn phải, hít phải, tiếp xúc ngoài da) với các chất gây dị ứng các chất gây dị ứng sẽ đi vào bên trong cơ thể, nó đi vào trong môi trường APC, bị bao bọc trong môi trường APC sau đó chất gây dị ứng này tiếp tục đi sâu vào bên trong cơ thể và gặp tế bào lympho T, khi gặp chất gây dị ứng này thì ngay lập tức tế bào lympho T giải phóng ra một chất mà người ta gọi là cytokine, cytokine mới được sinh ra tiếp xúc với tế bào B trong cơ thể, hình thành lên tế bào Plasma, chính tế bào plasma sản xuất ra một loại kháng thể gọi là kháng thể IgE . Kháng thể IgE này khi gặp phải tế bào Mast sẽ hình thành lên một tế bào mới mà trong bài này em xin tạm gọi là tế bào (H). Ở lần tiếp xúc với chất gây dị ứng (cùng một chất gây dị ứng) tiếp theo, khi chất gây dị ứng đi vào bên trong cơ thể bệnh nhân và tiếp xúc với tế bào (H) (sinh ra do sự kết hợp của IgE và tế bào Mast) thì sẽ sinh ra histamine, khi histamine đi vào mạch máu sẽ gây giãn mạch máu khi đó bệnh nhân sẽ có dấu hiệu bị dị ứng: da bị mẩn đỏ, sưng tấy, nôn, nghẹt thở, tức ngực … Các triệu chứng của bệnh dị ứng đậu phộng Người ta đã nghiên cứu và tìm ra 4 hệ thống bộc lộ dấu hiệu dễ nhận biết nhất đó là: Da thường hay bị nổi mề đay, màu da có màu đỏ đặc biệt là vùng da ở mặt, thậm chí còn bị sưng tấy . Đường hô hấp có hiện tượng: thở khò khè, ho, khó thở, nghẹt mũi, cổ họng như bị siết chặt. Đường tiêu hóa: người bệnh bị nôn mửa, tiêu chảy và đau bụng . Hệ thống tim mạch: người bệnh bị tụt huyết áp, nhịp tim không đều thậm chí nặng hơn là tim ngừng đập. Báo cáo năm 2003 (Al-Muhsen, et al., 2003) chỉ ra rằng phản ứng dị ứng đậu phộng đầu tiên thường xuất hiện giữa 14 và 24 tháng tuổi, và thường xảy ra ở nhà. Theo một nghiên cứu tại Mỹ (Sicherer, et al 2001) nơi mà có số ca dị ứng đậu phộng lớn nhất trên thế giới thì 50% trẻ em bị dị ứng đậu phộng có triệu chứng trong một hệ thống cơ quan (một trong bốn hệ thống cơ quan đã nói ở trên), 30% có các triệu chứng trong hai hệ thống, 10-15% trong ba hệ thống, và 1% trong bốn hệ thống. Các phương pháp chẩn đoán dị ứng đậu phộng [12] Theo (Roberts, et al., 2005) thì việc chẩn đoán dị ứng đậu phộng bao gồm bốn bước chính sau : Bước 1: người ta sẽ tìm hiểu về bệnh sử của người bệnh Bước 2: người ta sẽ tiến hành các xét nghiệm với da của người bệnh Bước 3: tiến hành xét nghiệm máu để biết xem có sự xuất hiện kháng thể IgE trong máu người bệnh hay không. Kháng thể IgE đặc hiệu đậu phộng trong máu được đo bằng một bài kiểm tra gọi là radioallergosorbent (RAST) Bước 4: người ta sẽ cho bệnh nhân tiêu thụ một lượng đậu phộng (tất nhiên lượng đậu phộng này phải được cân nhắc kĩ lưỡng tránh trường hợp có thể đe dọa tính mạng cho bệnh nhân) để xem các triệu chứng của bệnh nhân Xét nghiệm RAST dùng để đo nồng độ của kháng thể IgE trong máu người bệnh, cách làm như sau: Bước 1: bệnh nhân được trích máu và mẫu máu này được tách bỏ hết hồng cầu bạch cầu, phần còn lại chính là huyết thanh (serum). Mẫu huyết thanh này sau đó được gửi đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm. Bước 2: lấy một lượng kháng nguyên KN (đã biết khối lượng là m), mà các phân tử KN liên kết với 1 chất không hòa tan cho vào ống nghiệm N. Kháng nguyên liên kết với chất không hòa tan ký hiệu là kt (kết tủa) trở thành KNkt. Sở dĩ dùng chất không hòa tan là vì cho phép ta tách riêng hỗn hợp kết tủa ra cùng với những gì liên kết với nó (sau khi xả hết dung dịch cùng với những gì hòa tan cùng trong dung dịch). Bước 3: cho huyết thanh của bệnh nhân vào N, lượng huyết thanh đã biết là m2. Trong huyết thanh của bệnh nhân có các kháng thể KT (với nồng độ chưa biết). Các kháng thể này sẽ bám vào KNkt. Nếu nồng độ kháng thể càng cao thì sẽ có càng nhiều kháng thể bám vào các các KNkt, KNkt trở thành KT-KNkt. Tách kết tủa KT-KNkt ra. Bước 4: một lượng kháng thể khác đã được đánh dấu bằng phóng xạ (px) (chất phóng xạ để đánh dấu thường là 1 đồng vị px 131 của Iốt) với khối lượng là m3 cho vào N. Các KT phóng xạ (KTpx) này sẽ bám vào các KT-KNkt. Càng nhiều KT-KNkt thì sẽ càng nhiều KTpx bám vào, và thu được KTpx - KT-KNkt. Tách kết tủa KTpx - KT-KNkt ra. Bước 5: đo độ phóng xạ của KTpx-KT- KNkt. Nếu như lượng KT trong huyết tương ban đầu càng nhiều thì rõ ràng độ phóng xạ này sẽ càng lớn. Bước 6: bác sĩ hoặc chuyên gia sẽ kết luận. PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG ĐẬU PHỘNG Các loại protein gây dị ứng trong đậu phộng [7], [11], [16], [24] Đậu phộng chứa nhiều protein khác nhau, mỗi loại có cấu trúc riêng biệt của nó. Một số protein trong số này gây dị ứng, và có thể kích hoạt các kháng thể IgE - mỗi phân tử kháng thể được đặc hiệu với một chất gây dị ứng nhất định. Các protein gây dị ứng đậu phộng đặc trưng và được đặt tên. Chúng bao gồm: • Ara h1 • Ara h7 • Ara h2 • Ara h8 • Ara h3 •Arah Agglutinin • Ara h4 • Ara h LTP • Ara h5 • Ara h Oleosin • Ara h6 • Ara h TI Hình 4.1. Cấu trúc Ara h1 Hình 4.2. Cấu trúc Ara h2 và Ara h6 Lượng tương đối của từng chất gây dị ứng đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến từng cá nhân một cách khác nhau, có thể một người mẫn cảm nhiều với một loại protein (A nào đó trong đậu phộng chẳng hạn) và người đó thì lại ít mẫn cảm với loại protein (B nào đó trong đậu phộng chẳng hạn) nhưng một người khác thì lại mẫn cảm nhiều với loại protein B trong đậu phộng và lại ít mẫn cảm với protein A trong đậu phộng.Vì vậy giả định cho rằng tất cả các protein gây dị ứng được trong đậu phộng đều có tầm ảnh hưởng như nhau trên tất cả các cá nhân là hoàn toàn sai lầm. Trong số các protein trong đậu phộng gây dị ứng kể trên thì có những protein được phát hiện thường xuyên trong việc đóng vai trò là nguyên nhân gây dị ứng cho người. Ví dụ, trong một nghiên cứu gần đây, Ara h2 đã được công nhận là chất gây dị ứng mạnh nhất trong tất cả các xét nghiệm về việc kích hoạt triệu chứng gây dị ứng, và thực sự nó gây ra một phản ứng dị ứng ở nồng độ rất thấp, trong khi Ara h1 và Ara h3 thì gây phản ứng dị ứng ở mức độ yếu hơn và phản ứng chỉ xảy ra ở nồng độ cao hơn gấp trăm lần Ara h2. Vì vậy nhà nghiên cứu kết luận dựa trên nhóm bệnh nhân mà họ nghiên cứu rằng Ara h2 là chất gây dị ứng đậu phộng quan trọng nhất, một vài loại của các protein khác cũng gây ra những phản ứng dị ứng nhưng yếu hơn và ở nồng độ cao hơn rất nhiều (Koppelman, Wensing, et al., 2004). Burks và các cộng sự ( Burks AW, et al, 1992) đã tiến hành phân lập 2 chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng đó là Ara h1 và Ara h2. Đây là các glycoprotein với điểm isoelectric và trọng lượng phân tử tương ứng là 4.55 và 63,500 Dalton và 5.2 và 17,000 Daltons tương ứng. Phân tích cấu trúc của Ara h2 thu nhận từ đậu phộng sống bằng quang phổ tử ngoại người ta xác định Ara h2 có 31% là các sợi hình xoắn ốc, 10% bằng sợi đơn và 59% là những vòng cuộn lại ngẫu nhiên, khi xử lý Ara h2 thu nhận từ đậu phộng sống với DTT ( Dithioreitol) nồng độ 50 mmol/l để qua đêm (15h) sau đó khử muối rồi đem đi phân tích cấu trúc thì thấy các sợi hình xoắn ốc đã giảm từ 5-10%. Còn ở Ara h2 thu nhận từ đậu phộng rang có 29% là sợi hình xoắn ốc, 12% là các sợi đơn và 59% các vòng cuộn lại ngẫu nhiên. Trong một nghiên cứu khác (Becker, et al, 2001.) các tác giả tính toán tỷ lệ mẫn cảm với mỗi chất gây dị ứng trong số lượng 40 bệnh nhân mẫn cảm với đậu phộng. Kết quả của họ chỉ ra rằng ngoài Ara h1 (tỷ lệ 65%) và Ara h2 (tỷ lệ 85%), Ara h4 (53%) cũng là những chất gây dị ứng chính, còn Ara h5 (13%), Ara h6 (38%) và Ara h7 (43%) là những tác nhân gây dị ứng phụ. Có một điều đáng nói ở đây là, mặc dù Ara h6 được coi là một chất gây dị ứng phụ, các tác giả thấy rằng sự mẫn cảm với Ara h6 có các triệu chứng lâm sàng nặng hơn so với hầu hết các chất gây dị ứng khác. Nghiên cứu trong tương lai chắc chắn sẽ chứng minh được rằng: có thể các protein gây dị ứng trong đậu phộng thì có những kích thích phản ứng dị ứng rất mạnh đối với một dân tộc cụ thể này nhưng lại có những kích thích phản ứng dị ứng yếu hơn đối với dân tộc khác. Một điều đáng nói nữa là những ảnh hưởng bởi các phương pháp chế biến khác nhau trong sản xuất thực phẩm của đậu phộng. Điều này có thể giải thích tại sao một số vùng dân cư người dân có nguy cơ bị dị ứng với đậu phộng cao hơn nhiều so với các vùng dân cư khác. Trong tương lai sự hiểu biết về cấu trúc phân tử của các chất chủ yếu gây dị ứng trong đậu phộng và các phản ứng miễn dịch đặc hiệu đậu phộng sẽ dẫn đến các phương pháp hiệu quả để chẩn đoán, trị liệu, và các chiến lược phòng, chống dị ứng với đậu phộng (Scurlock và Burks, 2004). Chúng ta cũng có thể dùng kỹ thuật di truyền để loại bỏ các protein gây dị ứng độc nhất. Tính chất của các protein gây dị ứng trong đậu phộng 2.1. Ảnh hưởng của quá trình chế biến (nhiệt) đến đặc tính gây dị ứng của protein[38] a) Tính gây dị ứng của protein đậu phộng tăng lên trong quá trình rang Protein đậu phộng giống như nhiều protein gây dị ứng cao trong thực phẩm, chúng không bị xuống cấp ở nhiệt độ cao và chúng vẫn duy trì khả năng kích hoạt một phản ứng dị ứng. Trong một thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phản ứng gây dị ứng người ta trích ly protein tinh khiết từ đậu phộng và chia ra làm 4 mẫu như nhau, sau đó gia nhiệt lần lượt từng mẫu lên 500C, 800C, 900C, 1000C. Các cuộc nghiên cứu đã chứng minh việc rang đậu phộng góp phần làm tăng khả năng gây dị ứng của các protein gây dị ứng so với khi chế biến bằng phương pháp khác như là luộc, nấu ăn (Maleki, et al., 2000). Điều này được chứng minh là ở Mỹ tỷ lệ người dân mắc bệnh dị ứng rất cao vì người Mỹ rất thích những sản phẩm của đậu phộng được chế biến qua quá trình rang, điển hình là bơ đậu phộng, ngược lại ở Trung Quốc nơi mà tỷ lệ người dân mắc bệnh dị ứng đậu phộng thấp nhất thế giới vì người Trung Quốc thích ăn đậu phộng luộc. Như vậy yếu tố chính ảnh hưởng đến sự gia tăng dị ứng của protein đậu phộng rang là do nhiệt độ cao đạt tới trong quá trình rang so với quá trình luộc hoặc nấu. b) Tính tan của protein đậu phộng giảm trong quá trình gia nhiệt Tuy nhiên nhiệt độ quá cao đạt được trong quá trình rang lại có những ảnh hưởng trong việc thay đổi dạng protein thành dạng không hòa tan nhiều hơn so với protein trong nguyên liệu ban đầu. Tính tan của protein đậu phộng giảm trong quá trình gia nhiệt cũng là một nguyên nhân giải thích tại sao protein đậu phộng khi được gia nhiệt lại có khả năng gây dị ứng cao hơn là khi không được gia nhiệt hoặc chỉ được gia nhiệt ở nhiệt độ thấp. Vì khi mà protein đậu phộng có độ hòa tan thấp nghĩa là chỉ có một phần protein hòa tan đi vào trong đường tiêu hóa của con người, khi đó phần còn lại không hòa tan được sẽ tránh khỏi việc bị các enzyme trong hệ tiêu hóa phân hủy. Những protein không hòa tan này đóng vai trò như là một nguồn dự trữ liên tục các chất gây dị ứng để bổ sung vào hệ tiêu hóa sau khi các protein ở dạng hòa tan trước đó đã bị phân hủy và loại khỏi cơ thể. 2.2. Phản ứng maillard làm tăng khả năng gây dị ứng của protein đậu phộng [23] Một trong những phản ứng điển hình của protein là phản ứng maillard, phản ứng này là sự kết hợp các acide amin với đường để tạo thành các hợp chất như cacboxymethyl lysine, malaneidin. Việc này có thể làm giảm giá trị dinh dưỡng gây những tác động sinh lý và thậm chí là việc gây ra chất độc ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch của con người, làm hao hụt và thay đổi các acide amin, nhóm sulfdryl tự do. Tuy nhiên đây cũng là một phản ứng quan trọng góp phần làm thay đổi hương vị và màu sắc của thực phẩm, trong một số trường hợp phản ứng maillard làm tăng tính cảm quan của thực phẩm. Người ta đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của phản ứng maillard đến khả năng gây dị ứng của protein đậu phộng. Hình 4.3: Sơ đồ chung của phản ứng maillard và sự hình thành các sản phẩm cuối Trên đây là sơ đồ hình thành phản ứng maillard, đầu tiên là sự kết hợp của protein đậu phộng để hình thành các nhóm schiffbase, schiffbase tiếp tục bị oxy hoá để tạo thành amodori. Sản phẩm amodori trải qua một phản ứng dehydrate để tạo thành glucosone (diketone), là trung gian để tạo thành AGE (advanced glycation end product). Các protein đậu phộng sau khi tham gia phản ứng maillard trở nên kháng (tồn tại lâu) trong enzyme tiêu hóa Để chứng minh điều này người ta thực hiện thí nghiệm sau: chuẩn bị 11 mẫu (từ 1 đến 11) Ara h1 tinh khiết, từ mẫu 6 đến mẫu 11 được cho thêm đường fructose, sau đó được gia nhiệt để xảy ra phản ứng maillard. Sau đó cho Gastric Secretions (GS) được lấy từ dạ dày của một người được giữ đói vào cả 11 mẫu, tiếp theo ủ ấm cả 11 mẫu ở 370C trong tủ ấm theo thứ tự thời gian như sau: Bảng 4.1: Bảng chuẩn bị mẫu thí nghiệm protein đậu phộng với enzym tiêu hóa Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Thời gian 5 phút 10 phút 30 phút 180 phút 15 giờ 0 phút 5 phút 10 phút 30 phút 180 phút 15 giờ Rồi đem ra phân tích điện di SDS-PAGE ta thu được kết quả sau: Hình 4.4: Phân tích ảnh hưởng của phản ứng maillard đến khả năng kháng enzyme tiêu hóa Nhìn trên hình phân tích ta thấy ở các mẫu từ 1 đến 3 khi mà không có phản ứng maillard và có sự có mặt của GS trong thời gian ngắn thì các Ara h1 bị phân hủy thành những protein có khối lượng phân tử trung bình (< 64kDa), còn ở các mẫu 4 và 5 khi mà khoảng thời gian là khá lâu (3h và 15h) thì hầu như các Ara h1 đã bị phân hủy thành các protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn 20kDa. Trong khi đó chúng ta quan sát thấy ở các mẫu từ mẫu 6 đến 11 (có phản ứng maillard và sự hiện diện của GS) thì Ara h1 bị phân hủy rất ít, đa số chúng có khối lượng phân tử lớn hơn 98kDa. Phản ứng maillard làm cho các protein dị ứng trong đậu phộng bền hơn khi bị tác động bởi nhiệt Người ta đã nghiên cứu và đi đến kết luận là khi protein gây dị ứng trong đậu phộng tham gia phản ứng thì chúng có khả năng tồn tại bền vững dưới tác động của nhiệt, người ta đã làm thí nghiệm như sau: Đầu tiên chuẩn bị mẫu theo bảng kê bên dưới (WPE: Whole peanut extract-dịch chiết từ đậu phộng, Allergen- các chất gây dị ứng chiết xuất từ đậu phộng). Bảng 4.2: Bảng chuẩn bị mẫu thí nghiệm protein đậu phộng với nhiệt độ Mẫu 1 2 3 5 6 7 Nguyên liệu WPE WPE WPE Allergen Allergen Allergen Đường Không có Có Không có Có Không có Có Tác động Không gia nhiệt Gia nhiệt Không gia nhiệt Gia nhiệt Gia nhiệt Không gia nhiệt Sau khi đã chuẩn bị các mẫu như bảng trên ta tiến hành mang các mẫu đi phân tích điện di và thu được kết quả như hình ảnh bên dưới: Hình 4.5: Phân tích điện di SDS-PAGE của các protein đậu phộng có và không tham gia phản ứng Maillard Quan sát trên hình 4.5 ta thấy ở mẫu 2 (gồm có WPE + đường và gia nhiệt đến khi xảy ra phản ứng Maillard), hình ảnh protein Ara h1 được thấy rõ nhất. Ở mẫu 3 (chỉ có WPE, không có đường và được gia nhiệt) thì thấy các vết protein hiện ra rất mờ, chứng tỏ protein đã bị phân hủy bởi nhiệt độ. Bây giờ ta so sánh hình ảnh ở mẫu 5 và mẫu 6. Ở mẫu 5 (gồm có Allergen + Glucose và được gia nhiệt đến khi xảy ra phản ứng Maillard) thấy hình ảnh Ara h1 hiện lên rất rõ, còn ở mẫu 6 (chỉ có Allergen và được gia nhiệt) thấy hình ảnh Ara h1 rất mờ, chứng tỏ nó đã bị phân hủy bởi nhiệt độ. Rõ ràng là phản ứng Maillard góp phần làm tăng tính bền vững của protein gây dị ứng trong đậu phộng đối với nhiệt độ. 2.3. Protein gây dị ứng trong đậu phộng có khả năng ức chế enzyme tiêu hóa Cũng giống như các protein khác, protein gây dị ứng Ara h1 và Ara h2 cũng bị các enzyme trong hệ thống tiêu hóa con người phân hủy, tuy nhiên sự phân hủy này là nhỏ hơn so với các loại protein thông thường khác vì chúng có khả năng ức chế các enzyme. Thí nghiệm thực tế cho thấy rằng các Ara được thu nhận từ đậu phộng rang thì có khả năng ức chế enzyme tiêu hóa mạnh gấp 3 lần so với các Ara thu nhận từ đậu phộng sống. Một điều thú vị mà người ta nhận thấy là Ara h2 có khả năng bảo vệ Ara h1 khỏi sự phân hủy của các enzyme tiêu hóa. Để minh chứng cho điều này người ta tiến hành thí nghiệm sau: Chuẩn bị 3 mẫu chứa Ara h1 tinh khiết, sau đó cho enzyme trypsin vào 3 mẫu này với cùng một lượng như nhau (kí hiệu 3 mẫu lần lượt là 1, 2, 3). Thêm Ara h2 vào mẫu 2 Thêm Ara h2 vào mẫu 3 nhưng với hàm lượng nhỏ hơn vào mẫu 2 Mẫu 1 là mẫu đối chứng nên ta không cho thêm Ara h2 vào mẫu 1 Sau đó cất 3 mẫu này vào tủ ấm giữ ở 370C và để qua đêm (15h). Tiếp theo mang 3 mẫu này đi phân tích điện di SDS-PAGE để xác định hàm lượng Ara h1 còn lại trong mẫu, người ta thu được kết quả như sau: - Hàm lượng Ara h1 còn lại trong mẫu 2 là lớn nhất, sau đó tới mẫu 3 và thấp nhất là mẫu 1. Như vậy, điều này đã chứng minh Ara h2 có vai trò bảo vệ Ara h1 khỏi sự phân hủy của enzyme trypsin. Sở dĩ ở mẫu 1 hàm lượng Ara h1 còn lại là thấp nhất vì nó không có Ara h2 để bảo vệ. Còn ở mẫu 3 Ara h1 còn lại ít hơn mẫu 2 là do hàm lượng Ara h2 ở mẫu 3 ít hơn so với mẫu 2, vì vậy khả năng ức chế enzyme trypsin cũng bị giảm đi. 3. Cải thiện tính chất gây dị ứng của protein đậu phộng 3.1. Rút ngắn khả năng gây dị ứng của chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng[35] Các hợp chất phenolic hình thành nên các phức hòa tan và không hòa tan với protein. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định xem các phenolic như axit caffeic, ferulic, chlorogenic có hình thành phức không hòa tan và không thuận nghịch với chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng hay không và nếu có thì phức này có làm giảm immunoglobulin (IgE) hay không. Sau khi thêm mỗi phenolic vào chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng, nguyên liệu hòa tan được phân tích bởi SDS-PAGE và ức chế cạnh tranh ELISA. Kết quả cho thấy việc bổ sung các phenolic kết tủa hầu hết các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng, Ara h 1 và Arah 2, và phức tạo thành là không thuận nghịch. Tổ hợp IgE đã giảm khoảng 10 -16 lần. Điều đó kết luận rằng việc giảm tổ hợp IgE bởi các phenolic là khả thi. Theo nghiên cứu, đã được chứng minh bởi các nghiên cứu lâm sàng, nó có thể dẫn đến sự phát triển của sản phẩm từ đậu phộng dạng lỏng nghèo chất gây dị ứng. Ảnh hưởng của phenolic lên chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng Sau khi xử lý với phenolic (acid caffeic, acid chlorogenic và acid ferulic), một số protein trong chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng đã được giảm. Trong số các protein đã được giảm là các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng, Ara h 1(63 kDa) và Ara h 2 (18-20 kDa). Ngược lại, protein giữa 27 kDa và 35 kDa và dưới 12 kDa không giảm nhưng hòa tan trở lại. Theo kết quả xử lý phenolic, ta thu được kết tủa hay phức chất. Phân tích các kết tủa bởi SDS-PAGE đã xác nhận sự hiện diện của hai chất gây dị ứng quan trọng trong đậu phộng. Theo Spencer et al.(1988) và Baxter et al. (1997), kết tủa hoặc phức của các protein có thể là không thuận nghịch thông qua tương tác đa chiều (ví dụ như nhiều phenolic có thể liên kết với một phân tử protein) hoặc một phenolic có thể liên kết với protein ở nhiều vị trí hoặc một protein. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng phức các chất gây dị ứng trong đậu phộng với phenolic không hòa tan trong NaCl 1M hoặc urê 2M là không thuận nghịch. Mặc dù xử lý với phenolic, nhưng vẫn còn xuất hiện một số chất gây dị ứng hòa tan còn lại trong các dung dịch mẫu. Do đó, chúng ta thực hiện lặp đi lặp lại việc tạo phức (xử lý 2 lần) để xác định xem nó có giúp cho kết tủa các chất gây dị ứng còn lại (Lưu ý: xử lý hơn 2 lần là không cần thiết dựa trên các dữ liệu được thảo luận dưới đây). Các mẫu đậu phộng như vậy được xử lý liên tục, sau đó được phân tích bằng SDS-PAGE so với các mẫu đã được xử lý một lần với hợp chất phenolic. Việc xử lý một protein điển hình trong mẫu bơ đậu phộng dạng lỏng ở những thời điểm khác nhau với acid cafeic được minh họa trong hình 4.7. Tổng tổn thất của protein (bao gồm cả các protein hòa tan khác ngoài các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng) với mẫu được xử lý liên tục được so sánh với các mẫu đã được xử lý một lần. Điều này cho thấy việc lặp lại tạo phức không chỉ loại bỏ chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng mà còn loại bỏ một số protein hòa tan còn lại. Trong trường hợp này, tạo phức nhiều lần có thể dùng để sản xuất một sản phẩm đậu phộng không còn là đậu phộng- một trích dẫn từ Burks (2008) đã chỉ ra, trong tham chiếu đến việcphát triển đậu phộng biến đổi gen không chứa các chất gây dị ứng, việc mà thay đổi đủ để làm biến đổi các chất gây dị ứng trong đậu phộng theo hướng giảm phản ứng dị ứng có thể dẫn đến việc sản xuất sản phẩm không còn là đậu phộng. Do thiếu protein, đậu phộng biến đổi có thể không có giá trị dinh dưỡng và mất hương vị do sự mất mát của liên kết protein trong phản ứng Maillard (Chung & Champagne, năm 2001; Cämmerer & Kroh, 2009). Với sự thiếu giá trị dinh dưỡng và hương vị đậu phộng, các sản phẩm đậu phộng biến đổi đó không được chào đón bởi người tiêu dùng. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này không sử dụng việc tạo phức nhiều lần để loại bỏ những các chất gây dị ứng trong đậu phộng. Do phức của chất gây dị ứng và phenolic là không tan nên chúng không thể được tiêu hóa bằng enzyme tiêu hóa. Nên nếu ăn phải, chúng không được tiêu hóa và hấp thụ qua cơ thể con người, và cuối cùng sẽ bài ​​tiết ra khỏi cơ thể. Điều này kết hợp với việc giảm lượng chất gây dị ứng hòa tan trong đậu phộng. Kết quả này làm chúng ta tin rằng xử lý các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng với phenolic có thể giảm gây dị ứng hoặc làm yếu tổ hợp IgE. Nhìn chung, các dữ liệu chứng minh rằng, với ba phenolic kiểm tra đã làm kết tủa các chất gây dị ứng trong đậu phộng không thuận nghịch. Trong số ba phenolic, acid caffeic có hiệu quả nhiều hơn trong việc kết tủa protein hơn so với chất khác trong bơ đậu phộng dạng lỏng(Hình 4.6). Bơ đậu phộng dạng lỏng Các chiết xuất từ đậu phộng Hình 4.6. SDS-PAGE của các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng qua xử lý phenolic và không qua xử lý. M= điểm đánh dấu, 1=xử lý ferulic, 2= xử lý chlorogenic, 3= xử lý caffeic Bơ đậu phộng dạng lỏng Hình 4.7. SDS-PAGE của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý 1 lần và 2 lần với caffeic. 1= không qua xử lý, 2= xử lý hai lần, 3= xử lý một lần Tổ hợp IgE khi xử lý chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng bằng phenolic Kết quả ở trên cho thấy rằng tổ hợp IgE có thể giảm trên cả chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng do kết tủa của các chất gây dị ứng hòa tan chủ yếu trong đậu phộng (Hình 4.6). Để kiểm tra giả thuyết này, chúng ta thực hiện phương pháp ELISA ức chế cạnh tranh (cisELISA), một trong các xét nghiệm bắt buộc là kiểm tra tổ hợp IgE trong ống nghiệm được đo như là một chỉ số đặc trưng cho khả năng gây dị ứng của các mẫu đậu phộng. Trong khảo nghiệm, xử lý phenol và không xử lý phenol trên chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng được thử nghiệm sự ức chế của nó trên tổ hợp IgE. Trong trường hợp này, các chất gây dị ứng trong mẫu càng nhiều thì sự ức chế và gây dị ứng trong mẫu càng nhiều. Kết quả (Hình 4.8) cho thấy tác dụng ức chế đã rõ nét hơn với mẫu không được xử lý (trên đường) hơn so với các chất chiết xuất từ đậu phộng hoặc bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý bằng ​​phenol. Điều này có nghĩa là tổ hợp IgE của mẫu không qua xử lý cao hơn mẫu được xử lý với phenolic. Nói cách khác, tổ hợp IgE của các chất chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng được xử lý với ​​phenol giảm xuống. Và không có sự khác biệt đáng kể trong tổ hợp IgE (P <0,05) giữa ba phương pháp xử lý (acid caffeic, acid chlorogenic và axit ferulic). Để xác định mức độ giảm tổ hợp IgE, các giá trị IC50 của mẫu xử lý phenolic và không được xử lý phenolic được tính toán. IC50 là nồng độ protein cần thiết để ức chế 50% tổ hợp IgE. Trong trường hợp này, IC50 của các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng đã xử lý phenolic và không xử lý phenolic xấp xỉ 7 g / ml và 0,7 g / ml (Bảng 4.3). Đối với bơ đậu phộng dạng lỏng đã xử lý phenolic IC50 là 5 g / ml, so với mẫu không qua xử lý là 0,3 g / ml. Trong trường hợp này, mẫu được xử lý với phenolic giảm tổ hợp IgE khoảng 10 - 16 lần so với mẫu không qua xử lý. Điều này cho thấy tổ hợp IgE hay khả năng gây dị ứng của chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng đã giảm thành công bởi phenolic. Các chiết xuất từ đậu phộng Bơ đậu phộng dạng lỏng Khả năng ức chế (%) Khả năng ức chế (%) Nồng độ chất ức chế( protein, g/ml Nồng độ chất ức chế( protein, g/ml Hình 4.8. Liên kết IgE của các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng qua xử lý phenolic và không qua xử lý Bảng 4.3. IC50a của mẫu đậu phộng xử lý và không xử lý phenolic Mẫu Không xử lý Xử lý phenolicb Giảm liên kết IgEc Chiết xuất từ đậu phộng 0.7 7 10 lần Bơ đậu phộng dạng lỏng 0.3 5 16 lần a= Nồng độ protein ức chế 50% liên kết IgE b= xử lý caffeic, chlogenic, và ferulic c= chỉ đối với xử lý phenolic Ảnh hưởng của xung ánh sáng tia UV lên chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng [30] Xung ánh sáng tia cực tím (PUV), một công nghệ phi nhiệt, đã được sử dụng để xử lý các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng. Mục tiêu là để xác định xem việc xử lý này có làm giảm thuộc tính gây dị ứng của chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng hay không. Mẫu đậu phộng được xử lý PUV bằng cách sử dụng RS Xenon-3000C theo các điều kiện sau: 3 xung / s, 14,6 cm từ trục trung tâm của bóng đèn, 4 phút (đối với chiết xuất đậu phộng) hay 3 phút (đối với bơ đậu phộng dạng lỏng). Sau khi xử lý, các mẫu đậu phộng được ly tâm và các chất lỏng nổi trên mặt được phân tích bằng SDS-PAGE và cạnh tranh ức chế miễn dịch liên kết enzyme khảo nghiệm (cisELISA). Để so sánh, phương pháp đun sôi cũng được thực hiện. SDS-PAGE cho thấy trong khi đun sôi ít tác động đến các chất gây dị ứng trong đậu phộng, thì mẫu xử lý với PUV thể hiện giảm khả năng hòa tan hay cấp độ chất gây dị ứng đậu phộng (63 kDa). Độ hòa tan của các chất gây dị ứng khác (18-20 kDa) là không bị ảnh hưởng. Kết tủa không tan hình thành làm giảm cấp độ của chất gây dị ứng trong mẫu xử lý bằng PUV. cisELISA cho thấy mẫu chưa xử lý có liên kết IgE cao hơn 7 lần so với mẫu xử lý với PUV. Do đó kết luận rằng ánh sáng PUV có hiệu quả trong việc giảm tổ hợp IgE của chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng. Các nghiên cứu hiện nay cung cấp một hướng tiếp cận với sự phát triển của sản phẩm đậu phộng ít gây dị ứng. Tuy nhiên, việc giảm dị ứng thực tế cần phải được xác nhận bởi các nghiên cứu lâm sàng. SDS-PAGE của chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV Sau khi xử lý ánh sáng PUV, cả hai chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng cho thấy có sự thay đổi trong khối lượng. Khối lượng giảm khoảng 40% là do bốc hơi nước. Các mẫu được xử lý PUV được ly tâm hoặc để lắng và các chất nổi trên mặt sau đó được đem phân tích điện di SDS-PAGE.Một tài liệu về SDS-PAGE điển hình của chiết xuất từ đậu phộng xử lý PUV thể hiện trong hình 4.9A. Dãy protein tương ứng của chất gây dị ứng 63 kDa và protein 50kDa hầu như không nhận thấy trong các chiết xuất xử lý PUV,so với mẫu chưa qua xử lý, dãy tương ứng từ chất gây dị ứng18 -20kDa còn lại xuất hiện rõ ràng. Điều này cho thấy chỉ có các chất gây dị ứng 63 kDa bị ảnh hưởng bởi PUV ánh sáng. Sự biến mất của nó trong SDS-PAGE cho thấy phần lớn các chất gây dị ứng 63 kDa không nằm trong chiết xuất xử lý PUV là protein hòa tan, nhưng chúng tồn tại như một kết tủa không tan. Hiện tượng keo tụ này đã được chứng minh bởi một số nghiên cứu có sử dụng công nghệ năng lực đỉnh cao như xung điện trường và ma trận, hỗ trợ xung laser để bốc hơi enzym bị vô hoạt(Castro và những người khác năm 2001; Jelinek và những người khác, 2007; Wei và những người khác 2007). Trong những nghiên cứu, các nhà nghiên cứu chứng minh rằng keo tụ là kết quả của sự biến tính protein. Dù PUV ánh sáng trong nghiên cứu này có gây ra sự biến tính protein hay không vẫn chưa được biết. Những điều nêu trên cho thấy việc tìm kiếm chất gây dị ứng 18-20 kDa không phải là một vấn đề cốt lõi bởi vì, như thể hiện trong hình 4.9A, đa số chất gây dị ứng 18 -20kDa vẫn còn hòa tan khi xử lý bằng PUV ánh sáng. Trong những nghiên cứu, các chất gây dị ứng không bị biến tính mà là liên kết chéo với nhau hoặc tạo thành phức không hòa tan với các hợp chất hóa học tự nhiên, kết quả cuối cùng dẫn đến việc giảm mức độ của các chất gây dị ứng và các tổ hợp IgE của các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng. Tóm lại, nghiên cứu này cho thấy mức giảm của chất gây dị ứng hòa tan trong chiết xuất từ ​​đậu phộng xử lý bằng PUV. Các tổ hợp IgE của các chất chiết xuất có lẽ sẽ được giảm. Bởi vì các protein cũng có thể keo tụ khi đun sôi(Mills và những người khác 2001), việc xác định ảnh hưởng của quá trình đun sôi đến chất gây dị ứng trong đậu phộng có như PUV ánh sáng hay không được tiến hành (thời gian xử lý là như nhau trong cả hai trường hợp). Beyer và những người khác (2001) cũng giữ thời gian xử lý như nhau cho các phương pháp nấu ăn (đun sôi, rang, và chiên) được sử dụng để xử lý đậu phộng. Thời gian xử lý lâu hơn không được thực hiện trong nghiên cứu này bởi vì nó gây nên vấn đề về tổn thất hương, đặc biệt là với bơ đậu phộng dạng lỏng . Hình 4.9A cho thấy SDS-PAGE điển hình của chiết xuất từ đậu phộng đun sôi so với xử lý PUV. Mặc dù có sự hình thành các keo tụ, nhưng xử lý bằng phương pháp đun sôi với chiết xuất từ đậu phộng cho thấy không thiếu các dãy, có nghĩa là protein 63 kDa và protein 50 kDa đã xuất hiện trước các chiết xuất xử lý với PUV, và nó tương tự như mẫu chưa xử lý. Điều này cho thấy rằng trong phương pháp đun sôi, phần lớn các chất gây dị ứng vẫn hòa tan và không tồn tại tủa. Trong trường hợp này, dường như PUV ánh sáng có hiệu quả hơn phương pháp đun sôi trong việc keo tụ chất gây dị ứng 63 kDa. Sự hình thành keo tụ rất quan trọng vì cuối cùng chúng sẽ được loại bỏ để sản xuất đậu phộng với mức độ chất gây dị ứng thấp. Do đó, khả năng gây dị ứng sẽ yếu đi. Hình 4.9B trình bày một SDS-PAGE điển hình của các phần hòa tan của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV. Kết quả cũng cho thấy sự biến mất của các chất gây dị ứng 63-kDa và protein 50-kDa . Các protein khác, ngoại trừ chất dị ứng 18 – 20 kDa cũng biến mất. Các số liệu cho thấy khả năng hòa tan hoặc cấp độ các chất gây dị ứng 63-kDa trong bơ đậu phộng dạng lỏng đã giảm sau khi xử lý PUV ánh sáng. Việc giảm chất gây dị ứng trong đậu phộng là kết quả keo tụ của chất gây dị ứng trong đậu phộng. Những keo tụ dễ dàng nhìn thấy khi gạn từ bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV giữ ở 40C. Nhưng không nên nhầm lẫn với các cryoproteins, vì chất này keo tụ trong điều kiện lạnh (ở 40C) và hòa tan thuận nghịch khi ủ ở nhiệt độ phòng. Các keo tụ từ xử lý PUV ánh sáng khác với keo tụ từ cryoproteins vì nó hình thành chất không tan không thuận nghịch ở nhiệt độ phòng. Các kết quả thử nghiệm cho thấy rằng các tủa không tan trong bộ đệm NaCl 1M, hoặc ure 2M. Việc tiêu hóa bởi các enzyme như pepsin hoặc trypsin cũng không thành công do nó không tan được. SDS-PAGE của keo tụ cho thấy các tủa chứa chủ yếu là chất gây dị ứng 63 -kDa và protein 50 kDa và rất ít chất gây dị ứng 18 -20 kDa (Hình 4.8). Tóm lại, kết quả chỉ ra rằng bơ đậu phộng dạng lỏng giảm độ hòa tan hay mức độ của chất gây dị ứng đậu phộngsau khi xử lý PUV. Tổ hợp IgE của các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng có xử lý PUV Việc chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý với PUV làm giảm các chất gây dị ứng trong đậu phộng đã dẫn chúng ta đến định đề rằng tổ hợp IgE của mẫu xử lý PUV có thể bị giảm. Để kiểm tra định đề này, người ta thực hiện phương pháp ức chế cạnh tranh ELISA (cisELISA) bằng cách sử dụng nhóm tế bào plasma từ ba bệnh nhân bị dị ứng lâm sàng với đậu phộng chứa kháng thể IgE chống lại chất gây dị ứng trong đậu phộng. Trong các khảo nghiệm, các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý và không qua xử lý cho các hiệu quả ức chế trên các kháng thể IgE. Trong trường hợp này, hiệu quả ức chế càng cao thì năng lực tổ hợp IgE của các mẫu đậu phộng càng cao. Các kết quả (Hình 4.11A) cho thấy hiệu quả ức chế ít rõ ràng hơn với đậu phộng xử lý PUV hơn là với đậu phộng không qua xử lý. Khi các chiết xuất xử lý theo phương pháp đun sôi được kiểm tra, hiệu quả ức chế trên tổ hợp IgE không khác nhau nhiều so với khi chưa qua xử lý, nhưng cao hơn so với khi xử lý PUV (Hình 4.11A). Trong trường hợp của bơ đậu phộng dạng lỏng, hiệu quả ức chế cũng ít rõ ràng khi xử lý PUV (Hình 4.11B). Tất cả điều này cho thấy rằng khả năng tổ hợp IgE của chiết xuất hoặc bơ đậu phộng dạng lỏng có xử lý PUV đã giảm. Các giá trị của IC50 của các chiết xuất có xử lý PUV và không qua xử lý (hoặc đun sôi-T) lần lượt là 4 μg /ml và 0,7 μg /ml (bảng 4.3). Tương tự thu được các giá trị tương ứng 4 μg / ml và 0,6 μg / ml) với bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV và không qua xử lý. Sự khác biệt đáng kể giữa IC50 giữa xử lý PUV và không qua xử lý cho thấy rằng tổ hợp IgE trong mẫu chưa xử lý cao gấp 6-7 lần trong mẫu xử lý PUV. Vậy xử lý PUV thực sự có hiệu quả trong việc giảm tổ hợp IgE sau phản ứng lâm sàng. Các chiết xuất từ đậu phộng Bơ đậu phộng dạng lỏng (B) (A) Hình 4.9. (A)SDS-PAGE của chiết xuất từ đậu phộng thô (pH=7) xử lý với ánh sáng PUV và phương pháp đun sôi, mỗi 4 phút. (B)SDS-PAGE của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV Hình 4.10. SDS-PAGE của keo tụ và chất nổi bề mặt của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV được so sánh với mẫu chưa qua xử lý Bơ đậu phộng dạng lỏng (A) Các chiết xuất từ đậu phộng (B) Khả năng ức chế (%) Khả năng ức chế (%) Hình 4.11. (A)Liên kết IgE của chiết xuất từ đậu phộng xử lý PUV và xử lý bằng phương pháp đun sôi. (B) liên kết IgE của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý và không xử lý PUV bằng ELISA CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua quá trình tìm hiểu về protein đậu phộng và tính chất chức năng của nó, em xin đưa ra một số kết luận về protein đậu phộng. Mong rằng đây sẽ là một tài liệu có ích cho những nghiên cứu liên quan đến vấn đề này. Protein trong đậu phộng chủ yếu là globulin (90%, tan trong dung dịch muối) và một phần nhỏ albumin (10%, tan trong nước). Globulin thì chia làm hai phân đoạn chính arachin (nằm trong lớp aleurone) chiếm 3/4 và conarachin nằm trong tế bào chất chiếm 1/4 . Các tính chất chức năng của protein đậu phộng như: Ø Tính hòa tan bị ảnh hưởng bởi: èThành phần amino acide: Khả năng hòa tan sẽ tăng khi số gốc kỵ nước giảm và ngược lại. èpH: khả năng hòa tan tăng khi pH ở dưới và trên điểm đẳng điện của protein; trong nước và dung dịch NaCl 0.2M tại các pH khác nhau khả năng hòa tan giảm xung quanh điểm đẳng điện của protein đậu phộng, cụ thể là protein đậu phộng hòa tan từ pH 2-10, hòa tan kém nhất tại điểm đẳng điện pH 4.5. Hơn 95% protein hòa tan tại pH dưới 2.5 hoặc trên 7. Ø Tính nhũ hóa bị ảnh hưởng bởi: èThời gian: khả năng nhũ hóa giảm từ phút thứ 6, phút thứ 7-18 giảm không đáng kể, phút 18 trở đi khả năng nhũ hóa không đổi. èNồng độ protein: khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng tăng dần theo nồng độ protein, khả năng nhũ hóa đạt cực đại khi có nồng độ protein là 3mg/ml. Sau đó khi nồng độ protein tiếp tục tăng thì khả năng nhũ hóa giảm xuống. è pH: mỗi protein đậu phộng có một điểm pH khác nhau mà tại đó khả năng nhũ hóa là thấp nhất, nếu ta tiếp tục tăng pH lên thì khả năng nhũ hóa tăng dần è Nồng độ NaCl: khả năng nhũ hóa của protein giảm khi nồng độ NaCl tăng và sau đó nếu tiếp tục tăng nồng độ NaCl thì khả năng nhũ hóa giảm nhẹ Ø Khả năng tạo gel, tạo nhớt của protein bị ảnh hưởng bởi pH: gel không thể được hình thành tại vùng pH gần với điểm đẳng điện của protein đậu phộng và pH kiềm làm gia tăng độ nhớt của dung dịch. Tính chất chức năng của protein đậu phộng có thể được cải thiện một phần như: Ø Sử dụng papain thủy phân một phần bột đậu phộng đã làm tăng độ hòa tan tại tất cả các giá trị pH ngoại trừ pH 2 và pH 8 cũng như khả năng tạo bọt và ổn định bọt của protein gia tăng một cách đáng kể tại tất cả các cấp độ khảo sát, đặc biệt khi pH được điều chỉnh hai lần với HCl 1N và NaOH 1N ưu tiên cho việc hình thành bọt gấp 3 lần. Ø Sử dụng enzyme thủy phân có giới hạn alcalase làm tăng độ hòa tan protein đáng kể trừ ở pH 5 và khả năng nhũ hóa của HPPI (Hydrolyzed Peanut Protein Isolate) giảm nhưng độc lập với tính kỵ nước bề mặt trong khi PPI và chất thủy phân từ nó giảm và phụ thuộc vào tính kỵ nước bề mặt. Ø Màng protein đậu phộng được sử dụng như một vật liệu bao gói sinh học sẽ bền kéo, chống thấm nước, chống thấm khí hơn khi sử dụng các phương pháp vật lý như xử lý nhiệt, chiếu tia cực tím, sóng siêu âm hay phương pháp hóa học như thêm formaldehyde và glutaraldehyde vào; Ø PPC (Peanut Protein Concentrate) sản xuất từ bột đậu phộng tách béo lên men có khả năng giữ nước và nhũ hóa tốt hơn PPC sản xuất từ bột đậu phộng tách béo chưa lên men và PPC sấy phun có khả năng giữ dầu và nhũ hóa tốt hơn. Hiện tại tình hình dị ứng đậu phộng trên thế giới đang ngày một gia tăng. Tình hình này đặc biệt nghiêm trọng tại Mỹ và các nước phương Tây, hiện nay cứ 1000 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng. Ø Protein gây dị ứng trong đậu phộng bao gồm Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, … tuy nhiên, hai protein gây dị ứng chính trong đậu phộng là Ara h1 và Ara h2. Ø Đặc tính gây dị ứng của Ara h1 và Ara h2 tăng lên trong quá trình rang (chính phản ứng maillard làm gia tăng mức độ dị ứng của các protein trong đậu phộng), tính tan của các protein đậu phộng giảm trong quá trình gia nhiệt. Ø Ara h1 và Ara h2 có khả năng ức chế enzyme tiêu hóa trong cơ thể. Ø Nghiên cứu cho thấy rằng việc bổ sung các phenolic kết tủa hầu hết các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng, Ara h 1 và Arah 2, và phức tạo thành là không thuận nghịch. Tổ hợp IgE đã giảm khoảng 10 -16 lần và xung ánh sáng tia cực tím (PUV) hình thành kết tủa không tan làm giảm cấp độ của chất gây dị ứng trong mẫu xử lý và tổ hợp IgE giảm 7 lần so với mẫu chưa xử lý với PUV. II. KIẾN NGHỊ Đậu phộng là một loại thực phẩm bổ dưỡng, có nhiều ích lợi cho cơ thể người. Hiện nay sản lượng đậu phộng trên thế rất cao, ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ đậu phộng đang rất phát triển, và những tính chất chức năng của protein đậu phộng đã có những ứng dụng quan trọng trong lĩnh vực thực phẩm nhưng bên cạnh đó thực phẩm có chứa đậu phộng tiềm ẩn mối nguy bị dị ứng đậu phộng cho con người. Để giải quyết được vấn đề này chúng ta cần nhiều đề tài nghiên cứu về phương pháp làm giảm khả năng gây dị ứng của đậu phộng đối với cơ thể con người, để đa số mọi người có thể sử dụng được loại sản phẩm này. Bên cạnh đó, những nghiên cứu cải thiện hơn nữa những điểm hạn chế trong tính chất chức năng của protein đậu phộng là rất cần thiết vì nó có những ứng dụng quan trọng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm.