Đề tài Tối ưu hoá điều kiện hoạt động xúc tác của enzim thuỷ phân tinh bột và protein

ế độ công nghệ xay xát và các kiểu thiết bị xay xát. Độ dày lớp cám vỏ hạt cũng làm thành phần của cám thay đổi khá lớn. Lớp vỏ hạt bao gồm: vỏ ngoài, vỏ trong và lớp alơron. Những hạt thóc ngắn (loại Japonica) thường có lớp alơron dày hơn loại thóc dài (loại Indica) và những loại lúa cạn có lớp alơron dày hơn loại lúa nước. Lớp alơron này chứa hạt alơron liên kết với chất béo có màu [95]. Gạo đỏ thơm có nhiều đặc điểm dinh dưỡng quý hơn các loại gạo khác, nó chứa chất màu anthoxyanin ở lớp vở cám và có mùi rất đặc trưng, có ảnh hưởng đến hương vị và màu sắc của sản phẩm rượu vang làm từ nguyên liệu này. Nhiều công trình khoa học đã nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu quý hiếm này cho sản xuất rượu vang gạo đỏ thơm [97] và [107]. 1.4.2. Hệ vi sinh vật trong sản xuất rượu vang gạo * Hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc: Hệ vi sinh vật có trong bánh men được truyền lại từ bánh men cũ. Do vậy các giống vi sinh vật trong bánh men cũng có nguồn gốc địa phương và thường không thuần khiết. Hệ vi sinh vật trong bánh men rất phong phú bao gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc phân lập được từ bánh men là R. oryzae, M. circinilloides, Penicillium và Amylomyces rouxii, nấm menlàSaccharomycescerevisiae,Hyphopichiaburtonii,Saccharomycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candida sp, và các chủng vi khuẩn lên men lactic và axetic [55], [57] và [65]. Khi sử dụng bánh men thuốc bắc để sản xuất rượu, các vi sinh vật trong bánh men sẽ phát triển nhanh chóng và sinh tổng hợp phức hệ enzim đường hoá tinh bột và lên men rượu. Các chủng giả nấm men, nấm mốc đều có khả năng sinh tổng hợp enzim a-amylaza và glucoamylaza. Quá trình chuyển hoá đường thành rượu do nấm men đảm nhiệm. Các chủng vi khuẩn có ý nghĩa tạo hương cho sản phẩm. Các vị thuốc bắc đóng vai trò quan trọng trong việc kháng khuẩn, tạo hương vị đặc trưng của sản phẩm và là thành phần không thể thiếu được của bánh men thuốc bắc [17]. 1.4.2.1. Nấm mốc Có khoảng vài trăm giống và hàng nghìn loài mốc (ít nhất 80.000) được miêu tả. Chỉ vài giống xuất hiện và có thể dễ dàng nhận ra trong đó giống thường xuất hiện là Mucor, Rhyzopus, Cephalothecium (Trichothecium),Geotrichum,Aspergillus, Penicillium, Cladosporium và Alternaria [37], [62] và [65]. + Rhyzopus: Tản phát triển bằng cách bò lan. Các loài này thường phân biệt với Mucor bởi sự có mặt của rễ giả, hình dạng của bào tử có cột hình bán cầu không tròn hoặc hình trụ, sinh sản và sinh trưởng nhanh hơn Mucor. Có nhiều loài: R. japonicoccus, R. oryzae, R. peka II, R. stokinensis có rễ giả sinh trưởng bằng cách lan rộng trên bề mặt môi trường[37] và [65]; rễ giả mọc thành chùm, tản bò phát triển và sinh ra các cuống bào tử nang chứa nhiều bào tử. Bào tử sinh ra từ nang trụ ở đầu cuống. Lúc còn non, bào tử nang trắng, lúc già màu đen, bên trong có nếp nhăn, kích thước 5-8 mm. Nhiệt độ phát triển thích hợp 32-340C. Sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp nhưng ít gặp. Chủ yếu sinh sản sinh dưỡng bằng hậu bào tử, khuẩn ty và sinh sản vô tính bằng bào tử nội sinh. Mắt thường có thể nhìn thấy khuẩn ty của chúng như những mạng nhện, bào tử nang lúc non màu trắng, khi già màu đen nhạt có chấm nhỏ. Bào tử dễ bay trong không khí, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nẩy mầm. Có khả năng sinh tổng hợp hệ amylaza và được dùng nhiều trong sản xuất rượu. Giống có 15 loài, trong đó 3 loài thường gặp và quan trọng là [37]: 1. R. oligosporus: Bào tử nhẵn, cuống bọc bào tử không quá 1mm. Có hậu bào tử . 2. R. stolonifer: Bào tử có vân, cuống bọc bào tử có thể đạt 4 mm. Hậu bào tử có hoặc không. Thân bò, không có hậu bào tử. Cuống bọc bào tử 1,5 á 4 mm. 3. R. oryzae: Tản bò với hậu bào tử, cuống bọc bào tử 1á1,5 mm. Sinh trưởng ở 370C. Tản màu nâu nhạt 1á3cm. Cuống bọc bào tử riêng hay thành 2á3 bó. Rễ giả màu nâu vàng ít phân nhánh. Bọc bào tử hình cầu với thành có gai nhỏ (50á100) x(150á200) mm. Trục giữa hình cầu hay trứng, bào tử không đều thường có góc màu xám hay màu nâu. Hậu bào tử hình cầu. Phân bố phổ biến ở đất, ở hạt, nguyên liệu thực vật đang phân giải. + Mucor. Đây là giống lớn nhất của Bộ Mucorales, thường gặp trong đất, trong phân bón và trên bề mặt hoa quả, rau, bánh mỳ và thức ăn giàu tinh bột. Hệ sợi dinh dưỡng lan sâu vào môi trường thức ăn và kéo dài lên trên không khí gọi là sợi khí sinh. Hệ sợi thường có màu trắng. Vách ngăn thường được tạo ra từ phần gần đỉnh của mỗi một sợi nấm, đầu tận cùng tế bào của sợi phồng ra một mấu tròn, hình trụ hoặc hình quả lê gọi là cột. Túi bào tử màu đen. Thành của túi bào tử khi chín dễ dàng bị vỡ, giải phóng nhiều bào tử. Mỗi một bào tử có khả năng lập lại chu kỳ phát triển của sợi nấm. Dưới một số điều kiện thuận lợi cho phép thì hai tế bào của hai sợi khác nhau có thể tiếp hợp với nhau cho ra một bào tử tiếp hợp. Bào tử tiếp hợp tiếp tục phát triển thành túi bào tử tại đỉnh. Mucor và Rhizopus rất giống nhau. Song có thể phân biệt bởi một số đặc điểm sau: Mucor không có rễ giả, cuống bọc bào tử nang có thể sinh ra ở bất kỳ chỗ nào và nang trụ không có hình bán cầu, không sát với vách bào tử nang. Khuẩn ty có hai loại (+) và (-) màu trắng, phân nhánh, giống nhau về hình thái, khác nhau về sinh lý. Từ một loại khuẩn ty có thể sinh sản vô tính. Từ hai loại khuẩn ty có thể sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp cho ra bào tử nang đa hạch, về sau là các bào tử nội sinh. Trong sản xuất người ta hay gặp các loài: M. rouxii, M. mucedo, M. javanicus, M. hydrophilus Nhưng ở nước ta thường gặp M. rouxii. M. rouxii phát triển mạnh trên môi trường thạch Czapek, khuẩn ty phân nhánh nhiều, không có vách ngăn, đa hạch, khuẩn lạc cao, không nếp nhăn, bám vào nắp hộp Petri. Cuống bào tử nang thường tròn, đường kính 60á80mm. Nang trụ 20á25mm. Bào tử tròn, đường kính 6á7mm. Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt. Bào tử nang từ màu trắng chuyển dần sang màu vàng nhạt, đỏ xám, đen, làm cho khuẩn lạc xám đen dần. Mặt dưới khuẩn lạc không có nếp nhăn, không màu. - Ngoài khả năng sinh tổng hợp amylaza còn có khả năng lên men rượu trong điều kiện thiếu khí. Hiện tượng này thường hay gặp trong quá trình sản xuất nấm mốc theo phương pháp bề mặt trên môi trường chất rắn có tinh bột, ở nhiệt độ cao 39 á 400C. Là một trong giống quan trọng của Mucorales bởi số lượng loài lớn (gần 50 loài ). Trong đó có một vài loài thường gặp là : - M. mucedo: Cuống bọc bào tử có thể mọc dài trên cơ chất tự nhiên, không phân nhánh hoặc có phân nhánh với chân phân nhánh kết thúc bởi một bọc bào tử. - M. racemosus: Hậu bào tử thường nhiều trong cuống bọc bào tử. Cuống bọc bào tử nhỏ hơn và phân nhánh - M. fuscus bainier: Tản thường có màu xám đậm. Cuống bọc bào tử phân nhánh, gốc ghép với sự phân nhánh tạo ra khoảng cách ngắn của một bọc bào tử và dựng đứng song song với trục. Trục giữa hình quả lê, đạt tới 50á80 mm. Bào tử có hình cầu 8á11mm màu nâu xám nhạt. ít hậu bào tử. - M. racemusus fresenius: Tản trắng trở nên xám, dạng bông. Cuống bọc bào tử có kích thước thay đổi, phân nhánh gốc ghép hay trục chính. Bọc bào tử hình cầu, có cuống bọc bào tử. Chúng có thể gây lên men cồn trong môi trường thiếu khí [36]. Một số loài Mucor có khả năng lên men trực tiếp tinh bột thành rượu. Loài nấm mốc sinh tổng hợp ra cả hai loại amylaza (diastaza) và zymaza. Amylaza là enzim thuỷ phân tinh bột thành đường, còn zymaza là nhóm enzim và coenzim biến đổi đường thành rượu. Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số giống khác và thường được sử dụng nhiều hơn trong sản xuất rượu. + Aspergillus: Aspergillus có thể tìm thấy dễ dàng ở khắp mọi nơi trong không khí, trên cơ chất. Loài mốc được tìm thấy trên bề mặt hoa quả thối, gạo, bánh mỳ và các thực phẩm khác. Aspergillus thường tìm thấy trên môi trường nuôi cấy thanh trùng chưa đảm bảo; Màu sắc rất thay đổi có thể xuất hiện màu xanh, màu vàng, màu da cam, màu đen hoặc màu nâu. Hệ sợi phân nhánh và có vách ngăn. Hệ sợi phình ra tại một điểm để tạo ra cuống bào tử đính. Cuống bào tử đính không phân nhánh, đa số cuống ngắn gọi là cuống đính bào tử (cuống nhỏ) phát triển từ đỉnh hoặc ở phần cuối của túi bào tử. Có hai loại khuẩn ty ký sinh phát triển trên mặt môi trường và khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường. Khuẩn ty phân nhiều nhánh, có nhiều vách ngăn tế bào, mỗi tế bào có một hạch nhân. Nang và nang bào tử là quả thể màu vàng kim. Khi Aspergillus hình thành bào tử dễ phân biệt với các nấm mốc khác [17] và [18]. - Aspergillus niger: Có màu đen, cuống đính bào tử thường nhẵn. Từ năm 1877, ở Nhật Bản người ta đã phát hiện và sử dụng Aspergillus vào việc sản xuất rượu, phân giải protit... ngoài việc sử dụng Aspergillus niger trong sản xuất axit citric. Nhưng gần đây, thành tựu khoa học lại chứng minh rằng một số nấm mốc bên cạnh khả năng sinh tổng hợp enzim có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất lại sinh độc tố gây không ít nguy hiểm cho người sử dụng, trong đó có một số là A. nige, A. flavus và nhiều chủng thuộc loại này tiết ra [10] và[19]. Các công trình nghiên cứu dịch tễ học ở các vùng khác nhau trên thế giới cho biết khẩu phần ăn hàng ngày có nhiều aflatoxin đã đẫn đến tỷ lệ dân số bị ung thư gan cao hơn các vùng khác [10]. WHO đã qui định thức ăn, thức uống cho người không được có quá 30 mg aflatoxin trong 1kg sản phẩm ăn uống, và không được có quá 0,3ppm aflatoxin trong thức ăn bổ xung cho trẻ em [10]. Từ năm 1960, các nhà khoa học đã chú ý đến vấn đề độc tố của nấm mốc và nấm mốc độc. Hiện nay trên 100 độc tố với trên 100 loài vi nấm tương ứng đã được phát hiện, trong đó chi Penicillium và chi Aspegillus chiếm nhiều nhất, đặc biệt một số Aspergillus niger sinh độc tố aflatoxin gây ung thư gan và nhiều chủng thuộc loài này tiết ra [10]. Chính vì thế khi sử dụng Aspergillus niger bên cạnh ưu thế hoạt lực thuỷ phân tinh bột cao, thì khả năng sinh axit làm rượu chua do pH của rượu giảm dẫn đến sắc tố màu anthoxyanin bị oxy hoá làm giảm cường độ màu của rượu. Đây là một trong những lý do cơ bản nhất của việc không dùng Aspergillus niger vào hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc sản xuất rượu vang cẩm của đề tài. Nấm mốc là đối tượng quan trọng của nhiều ngành sản xuất trong công nghiệp vi sinh vật: Làm bánh mỳ, làm rượu, làm bia, sản xuất các axit hữu cơ như axit citrric, axit gluconic, axit axetic..., sản xuất các chế phẩm enzim, các chất kháng sinh, sản xuất protein cho thức ăn gia súc, chế biến các phụ phẩm dầu hoả v.v... ở một số nước trên thế giới, loài mốc được sử dụng trong việc sản xuất đồ uống có cồn từ gạo. Tỷ lệ glucoza bị phân giải theo các con đường khác nhau ở các loài mốc là không giống nhau (bảng 1.8). Bảng 1.8. Khả năng phân giải glucoza bởi một số loài nấm mốc [63] Loài nấm mốc Tỷ lê (%) Glucoza bị phân giải theo các con đường khác nhau EMP* HMP* ED* Aspergillus niger 78 - - Rhizopus MX 100 - - Penicillium chrysogenum 56-70 46-30 - Trong đó : EMP là con đường Embden -Meyerhof- Parnas HMP là con đường Hexose Mono Phosphate ED Là con đường Entner- Doudoroff Nấm mốc là những vi sinh vật hiếu khí tham gia vào chuỗi hô hấp và sự thu nhận năng lượng thông qua chuỗi hô hấp năng lượng hoá học được giải phóng ra và được tích luỹ lại trong các liên kết cao năng của hợp chất ATP trong chu trình TCA và chu trình glyoxilic. Nấm mốc là những cơ thể dị dưỡng cacbon điển hình. Chúng đồng hoá các thức ăn hữu cơ có sẵn trong môi trường bằng cách chuyển hoá chúng thành đường đơn rồi hấp thụ vào tế bào. 1.4.2.2. Endomycopsis Giống Endomycopsis có cơ thể trưởng thành là hệ sợi cùng với bào tử đính nhiều chồi, bào tử phấn. Sự nhân đôi bằng cách phân cắt ngang và sự nẩy chồi nhiều phía. Nang bào tử có hình bán cầu, ô van, lưỡi liềm, nhẵn, sần sùi, hoặc có hình phóng xạ ở xung quanh, và sinh ra bằng tiếp hợp đẳng giao hoặc sinh sản vô tính. Để phân loại nấm men người ta dựa vào những đặc điểm hình thái và sinh lý. Họ Saccharomycetaceae là một họ thuộc các nấm men có bào tử nang. Các giống trong họ này có bào tử, sinh sản bằng nảy chồi. Nang thường chứa 1- 4 bào tử. Nang bào tử được hình thành bằng hình thức đẳng giao hoặc dị giao hoặc bằng hình thức sinh sản vô tính. Sinh sản sinh dưỡng bởi nẩy chồi hoặc phân đôi. Hệ sợi phong phú. Có nhiều hình thức tạo nang và bào tử có nhiều hình dạng: Bào tử có thể hình sao thổ, dạng mũ hoặc hình liềm, hình tròn hoặc hình ovan, có khoảng 11 loài. Tuy nhiên một số tác giả không đồng ý với sự phân loại trên và đã chuyển các loài tới các giống Hansenula, Pichia, Guiliermondella, và Schwanniomyces. Nhưng đến năm 1971, Van der Walt và Scott đã thay đổi tên của giống tới Saccharomycopsis. Đến năm 1972, chính tác giả và Von Arx đã chuyển nhiều loài Endomycopsis đến các giống mới. Giống Endomycopsis là giống duy nhất trong họ Saccharomycetaceae có thể sợi nấm thật và nấm giả [34] và [59]. - Từ năm 1940 Wiekerman đã nghiên cứu nhiều chủng và kết luận: Endomycopsis có khả năng sinh tổng hợp amilaza. Đó là hỗn hợp của nhiều amylaza tham gia quá trình thuỷ phân tinh bột (a- amylaza), và khả năng sinh tổng hợp glucoamylaza cao nên có khả năng dextrin hoá cao. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh được Endomycopsis sp có hoạt lực amylaza cao [61]. ở Việt Nam nhiều tác giả đã phân lập tuyển chọn được Endomycopsis fibuliger có hoạt lực sinh amilaza cao [4] và [34]. Năm 1977, một số tác giả phân lập được từ bánh men thuốc bắc, chọn được chủng Endomycopsos fibuliger 119 có khả năng phân giải tinh bột cao. Tác giả đã so sánh chủng này với 9 chủng Endomycopsis nhận từ nước ngoài và thấy rằng chủng Endomycopsis fibuliger 119 có khẳ năng sinh tổng hợp glucoamilaza cao [4], [34] và[61]. Một số công trình nghiên cứu của Nhật Bản (1997) đã phân lập Endomycopsis fibuliger từ bánh men thuốc bắc và xác định được hoạt lực glucoamylaza của chúng [68]. Endomycopsis fibuliger được nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi [4] và [34]. Từ các kết quả đó, chúng ta có thể khẳng định Endomycopsis có khả năng sinh tổng hợp glucoamylaza. Chúng ưu việt hơn nấm mốc là không chứa nhiều transglucozidaza. Đó là ưu điểm nổi bật cho phép sử dụng chế phẩm glucoamylaza của Endomycopsis sẽ không có mùi lạ từ nấm mốc tạo hương vị thơm ngon [4], [76] và [77]. 1.4.2.3. Nấm men Nấm men dùng trong sản xuất rượu thuộc giống Saccharomyces có tính lịch sử nhất của thế giới vi sinh vật. Những đặc tính sinh học: Tế bào nấm men Saccharomyces có hình tròn, ovan hay hình trụ và sinh sản theo lối nẩy chồi. Chúng thường phân bố rộng trong tự nhiên, được tìm thấy trong đất, không khí, nước, trên bề mặt quả, và lá của nhiều loại thực vật. Đặc biệt chúng có trong đất của vườn trồng cây ăn quả và vườn trồng nho. Nấm men có mặt trên bề mặt hoặc lớp dưới cặn dày của nước hoa qủa ép, dịch malt, và dịch đường trong sản xuất đường. Đặc tính sinh lý quan trọng nhất của Saccharomyces là khả năng lên men để sản sinh ra etanol và CO2 [1], [3], [4], [59] và [105]. Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân chuẩn, kích thước tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Ví dụ: S. cerevisiae có kích thước thay đổi trong khoảng 2,5 á 10 mm x 4,5 á 21 mm. Tuỳ loại nấm men mà tế bào có hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình quả chanh, hình elip, hình mũ phớt, hình sao thổ, hình cái liềm, hình thuôn, hình thoi, hình ong, hình cung nhọn, hình kéo dài, hình bán cầu, hình thận, hình quả lê, hình elip dài v.v... Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào có chứa các enzim thuỷ phân, poly photphat, lipit, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian. Ngoài tác dụng là một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu. Nảy chồi là phương pháp sinh sản vô tính phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện thuận lợi hầu hết tế bào nấm men đều có khả năng nảy chồi. Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipit nấm men, các enzim như amylaza, invertaza, lactaza, uricaza, polygalacturonaza, sản xuất ergosterol, axit ribonucleic, riboflavin (vitamin B2), các axit amin như lizin, metionin... S. cerervisiae hiện đang được sử dụng phổ biến trong việc sản xuất ra những sản phẩm thế hệ mới bằng phương pháp sinh học phân tử. Nấm men là một điển hình của vi sinh vật hiếu khí nhưng có thể lên men ở điều kiện thiếu khí . Trong điều kiện đủ oxy, nấm men sẽ sinh sản và sinh trưởng để tăng sinh khối là chủ yếu, còn rượu không tạo thành hoặc tạo thành rất ít [8]. C6 H12O6 + 6O2 đ 6CO2 + 6H2O +Q Khi không đủ oxy, nấm men lên men sinh rượu là chủ yếu, theo con đường EMP, rượu sinh ra từ quá trình khử axetaldehit. C6H12O6 đ 2C2H5OH + 2CO2+Q Trong quá trình trao đổi chất, nấm men đồng hoá các monosacarit ở điều kiện thiếu khí, sản phẩm của quá trình dị hoá là rượu etylic và CO2 được thải ra môi trường. Tế bào nấm men có khả năng tạo ra các enzim nội bào nghĩa là những enzim xúc tác ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 được tạo thành sẽ đi ra khỏi tế bào và tích tụ ở môi trường [4]. Dựa vào những đặc điểm trên trong sản xuất rượu vang bằng phương pháp cấy giống thuần chủng, người ta phải thực hiện hai giai đoạn: Nhân giống và lên men. ở giai đoạn nhân giống, cần tạo điều kiện về thành phần dinh dưỡng, đủ oxy... cho nấm men tăng sinh khối để có một lượng tế bào cần thiết đang ở thời kỳ hoạt động sinh lý mạnh đưa vào lên men. Giai đoạn lên men, thời kỳ đầu nấm men phát triển tăng sinh khối, thời kỳ sau là quá trình lên men thực sự để chuyển đường thành rượu. Nồng độ rượu sinh ra sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và các hoạt động khác của nấm men. Khả năng chịu nồng độ cồn cao tuỳ thuộc vào từng chủng nấm men. Khi các nguồn cơ chất trong môi trường lên men cạn dần và sản phẩm rượu của quá trình lên men sinh ra cao sẽ ức chế hoạt động của nấm men. + S. cerevisiae được dùng trong công nghệ lên men chế biến thực phẩm và đồ uống lên men như: bánh mỳ, bia, rượu, Sake của Nhật, rượu nếp cái hoa vàng, rượu vang cẩm... [1], [3], [4], [6], [18] và [96]. Tuy nhiên bên cạnh các nấm men có ích cũng có không ít các nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc các thực phẩm chế biến. Có khoảng 13 - 15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người và gia xúc. Đáng chú ý nhất là loài : Candida albicans, Cryptococcus neoformans ... Các yêu cầu để chọn chủng nấm men trong sản xuất rượu vang gạo: Để chọn được chủng có khả năng thích hợp với điều kiện và mục đích sản xuất, người ta cấy chủng đó trên môi trường thích hợp và đánh giá theo một số chỉ tiêu sau: - Có khả năng lên men tốt trong môi trường có nồng độ đường cao, cho độ cồn cao. - Có thể lên men triệt để, chịu được nồng độ cồn cao - Có thể lên men tốt trong những khoảng pH nhất định. - Có khả năng kết lắng tốt, làm trong rượu nhanh. - Góp phần tạo hương thơm ngon đặc trưng cho rượu. 1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzim của vi sinh vật 1.4.3.1. Chủng giống vi sinh vật Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu. Muốn nhận được chế phẩm có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, tìm những chủng có khả năng sinh tổng hợp và tích tụ nhiều enzim có hoạt động lên men mạnh, tạo ra sản phẩm có độ rượu cao và có hương vị đặc trưng, thơm ngon mà ta mong muốn, người ta phải luôn tìm cách tạo ra những giống tốt hơn bằng nhiều phương pháp: Phương pháp lai tạo, gây đột biến... 1.4.3.2. Môi trường dinh dưỡng Khi nuôi cấy có thể sử dụng nhiều chất khác nhau để chuẩn bị môi trường dinh dưỡng. Sử dụng chất này hay chất khác là tuỳ thuộc điều kiện thực tế sản xuất. Có nhiều loại môi trường là môi trường rắn và môi trường lỏng thường được sử dụng để nuôi mốc, nhưng chỉ một vài loại được dùng. Rau quả và nước chiết rau quả thường được dùng làm môi trường nuôi cấy. Có thể hoặc không bổ sung thêm đường. Môi trường rắn có thể là hợp chất của chất rắn như khoai tây, cà rốt và đậu hoặc môi trường rắn làm từ chất lỏng rồi bổ sung thêm thạch hoặc gelatin. Mốc có thể chịu được môi trường axit cao hơn vi khuẩn, trong sản xuất thường dùng môi trường có độ axit cao (pH 2á5). Môi trường rắn thường được dùng là môi trường Sabouraud bao gồm: glucoza 2%, pepton 1%, thạch 2%, pH=5,6. Chọn nguyên liệu để nuôi cấy vi sinh vật còn phải chú ý tới tính chất cảm ứng của enzim mà ta muốn thu nhận. Mặt khác phải tính đến khả năng cung cấp và hiệu quả kinh tế [64]. Trong sản xuất chế phẩm amylaza theo phương pháp bề mặt người ta hay dùng nhất là cám lúa mỳ. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp nhiều chế phẩm enzim khác nhau. ở nước ta thường dùng bột ngô, cám gạo và trấu trộn lẫn với các tỷ lệ khác nhau. Kết quả đã cho phép nhận được chế phẩm amylaza cao nhất là cám gạo. Song về chất lượng cám gạo ở thị trường có thành phần không ổn định nên gây nhiều khó khăn cho sản xuất. Nếu cám có hàm lượng trên 30% tinh bột thì có thể trộn theo tỷ lệ 85 á 90% cám cùng với 15 á 10% trấu nhỏ. Nếu hàm lượng tinh bột là 25 á 30% thì không cần trộn. Ngược lại nếu hàm lượng tinh bột trong cám chỉ 15 á 20% thì nên dùng 70 á 80% cám cộng với 20 á 30% bột ngô. Ngoài tinh bột môi trường cần chứa maltoza và dextrin. Sự có mặt của glucoza, fructoza và saccaroza có tác dụng giúp cho phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ amylaza. Ngược lại khi thêm lactoza và MgO vào môi trường thì nấm mốc phát triển kém hơn nhưng lại tích tụ nhiều amylaza [71] và [72] Nitơ vô cơ cũng có ảnh hưởng đến khả năng tạo ra enzim. Ví dụ: với A. awamorii có thể phát triển tốt trên môi trường chứa 0,05% nitơ vô cơ nhưng để tạo a-amylaza thì phải tăng lên 0,15%, để tạo glucoamylaza thì cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn nitơ hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng lại ít hiệu quả về phương diện tích tụ enzim. Nguồn nitơ là axit amin tham gia trực tiếp vào quá trình tạo thành các enzim và một số vitamin. Ví dụ: một trong những axit amin quan trọng trong việc tạo thành amylaza là axit glutamic. Sự tạo thành và tích tụ amylaza còn gắn liền với sự có mặt của một số ion Mg2+, Ca2+ và photpho đặc biệt là Mg. Trong môi trường thiếu sunphát magiê amylaza hầu như không được tạo thành, tuy nhiên hàm lượng sunphát magiê chỉ vào khoảng 0,05% . Sau Mg là phốtpho, ion này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành axit nuclêic. Hàm lượng của muối phốtphát axit kalium (KH2PO4) vào khoảng 0,1 á 0,2% [39] và [54]. Ion Ca+2 quyết định tính chịu nhiệt của enzim a-amylaza. Ngoài ra một số nguyên tố khác như lưu huỳnh và các nguyên tố vi lượng như Cu, Mn, Mo, Fe... cũng làm tăng hoạt độ của nhiều enzim 1.4.3.3. Điều kiện nuôi cấy Chủng giống và môi trường dinh dưỡng là tiên đề quan trọng - bảo đảm cho phát trỉên của vi sinh vật và tích luỹ enzim nhưng đó chỉ mới là khả năng. Khả năng này trở nên hiện thực còn tuỳ thuộc vào chủ quan của người thực hiện - có nắm bắt và đủ khả năng tạo ra những điều kiện tối ưu cho phát triển của vi sinh vật và tích luỹ enzim hay không. Các điều kiện đó là: Nhiệt độ: Nấm men và nấm mốc có nhiệt độ sinh truởng tối ưu là 280C, vi khuẩn 34 á 380C. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật đồng hoá chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn. Do đó trong sản xuất cần phải có những thiết bị để khắc phục hiện tượng tăng nhiệt này. Ví dụ bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào phòng nuôi. Nếu nuôi cấy ở môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí. Độ ẩm môi trường Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu nằm trong giới hạn 65 á70% [59], [61] và [62] Trong thực tế sản xuất mức độ vô trùng không thể đạt như trong phòng thí nghiệm nên người ta thường nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Tuỳ điều kiện mỗi nước và ở từng nhà máy độ ẩm có thể trong khoảng 60 á 50%. ở các nước tiên tiến độ ẩm của môi trường là 58 á 60%, ở nước ta các nhà máy rượu khống chế ở 50%. Độ ẩm môi trường thấp hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn những vi sinh vật phát triển chậm và tích luỹ enzim ít, do đó phải kéo dài thời gian nuôi cấy. Trong quá trình phát triển canh trường bị nóng và làm giảm độ ẩm do toả nhiệt. Vì thế cần quạt không khí ẩm vào phòng nuôi và tìm cách duy trì nhiệt độ vào khoảng 28 á 320C và hạn chế mức giảm nhiệt độ của canh trường. Muốn vậy không khí đi vào phòng nên có nhiệt độ 26 á 280C và độ ẩm tương đối 95 á 98%. Các cơ sở sản xuất chế phẩm enzim ở Việt Nam chưa chú ý đến vấn đề này. Đây chính là một trong những nguyên nhân dẫn đến hoạt lực thấp của chế phẩm. pH môi trường Khi nuôi cấy trên môi trường rắn theo phương pháp bề mặt thì pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Thường áp dụng pH của môi trường tự nhiên vào khoảng 5,5 á 6 thì hạn chế được tạp khuẩn nhưng ảnh hưởng xấu đến tích tụ enzim. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng pH ban đầu thường cao hơn vào khoảng 6 á 7. Đối với A. oryzae sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 á 6,0. Ngược lại khi nuôi cấy A. awamori để nhận glucoamylaza sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 á 7,8 [43]. Thực tế pH có những ảnh hưởng tới tích tụ enzim vì thế trong sản xuất thường sử dụng axit hoặc amoniăc để điều chỉnh pH, giữ cho pH luôn trong khoảng tối ưu [43]. Điều kiện cung cấp oxy Oxy rất cần cho quá trình phát triển và tích tụ enzim. Trong sản xuất rượu bia, tuy là quá trình lên men nhưng giai đoạn đầu nấm men vẫn cần oxy để sinh trưởng tới mức cần thiết. Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nấm men và nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy không khí do sợi nấm và hệ sợi; nhờ đó nhận được oxy từ không khí. Vì thế môi trường nuôi cấy phải xốp, lúc cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ enzim. Nếu môi trường sính bết, không khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra lên men, ảnh hưởng xấu tới tổng hợp enzim [47]. Giai đoạn đầu của sự phát triển nấm mốc chưa cần nhiều năng lượng. Bào tử bắt đầu hút ẩm để phát triển, nhiệt toả ra chưa nhiều. Do đó lượng không khí quạt vào phòng chỉ chiếm 4 á 5 lần thể tích phòng nuôi. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 á 12 giờ và cũng phụ thuộc vào chủng giống, độ ẩm và tỷ lệ giống trộn vào [12]. Giai đoạn 2 nấm mốc phát triển mạnh, toả nhiều nhiệt cần cung cấp oxy và thải nhiệt để canh trưởng đỡ bị nóng và khô. Lượng không khí cần cung cấp trong 1 giờ khoảng 30 á 60 lần thể tích phòng nuôi. Lượng oxy thực tế cần cho giai đoạn này chỉ khoảng 8m3/tấn canh trường/giờ (tương đương 40m3 không khí) nhưng vì vi sinh vật chỉ có khả năng kịp sử dụng 6 á 7% oxy trong không khí. Mặt khác cần giảm nhiệt độ canh trường nên yêu cầu lượng không khí cần cấp cho 1 tấn canh trường ở giai đoạn phát triển mạnh nhất là 600 m3/h. Nếu tính cả lượng không khí cần cho thải nhiệt thì phải lên tới 3000m3/tấn giờ hoặc hơn nữa [63]. Giai đoạn 3 kéo dài 8 á 12 giờ cuối, cường độ hô hấp và toả nhiệt giảm, lượng không khí chỉ cần 4 á 5 lần thể tích phòng nuôi [60]. Sự tích tụ enzim phụ thuộc vào chủng giống vi sinh vật và loại enzim. Ví dụ: A. oryzae tích tụ nhiều enzim khác nhau amylaza được tích tụ nhiều nhất sau 21 á 30 giờ, còn proteaza tích tụ chậm hơn, thời gian nuôi kéo dài tới 40 á 48 giờ. Sự tích tụ hemixenlulaza và xenlulaza kéo dài tới 7 á10 ngày. Khi nuôi cấy nấm mốc Aspergillus trong môi trường lỏng thời gian kéo dài tới 62á72 giờ [40]. Yêu cầu về số lượng không khí và cung cấp oxy trong môi trường lỏng cũng có những điểm khác.Vấn đề là phải làm cho oxy của không khí hoà tan vào môi trường lỏng càng nhiều càng tốt. Khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy của không khí có thể tan vào canh trường. Lượng oxy hoà tan phải đủ dư và chứa 1 á 3 mg/ l. Như vậy mới đủ cho sự phát triển và sinh khối của vi sinh vật; đồng thời phải thừa ra một lượng kể trên. Hiện nay một số nước như Nhật Bản, Hà Lan và Đan Mạch đã có nhiều thành công trong việc sục khí. Nhưng hướng phát triển hiện nay là không giảm lượng không khí cho 1m3 môi trường mà người ta tăng nồng độ chất dinh dưỡng tương ứng với lượng oxy hoà tan để đạt sinh khối cao và do đó tăng năng suất của thiết bị. Trên thế giới phương pháp nuôi cấy chìm trong môi trường dịch thể được xem là phương pháp tiên tiến và ngày càng được hoàn thiện. Quá trình này bao gồm các giai đoạn sau: 1. Nuôi cấy nấm mốc trong điều kiện phòng thí nghiệm. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy. Nuôi cấy nấm mốc ở giai đoạn trung gian. Nuôi cấy nấm mốc để thu nhận chế phẩm amylaza. 1.5. enzim trong công nghệ sản xuất rượu vang gạo Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của công nghệ enzim trên thế giới, Việt Nam cũng đã sử dụng một số loại enzim trong công nghiệp thực phẩm nói chung và công nghệ sản xuất rượu nói riêng. Việc ứng dụng enzim đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế cao, công nghệ sản xuất được đơn giản hoá đi nhiều và giá thành sản phẩm giảm, sản phẩm được thị trường tiêu thụ chấp nhận. Có rất nhiều dạng chế phẩm enzim được dùng trong công nghiệp đồ uống lên men. Các enzim thuộc nhóm Amylaza như Termamyl, Fungamyl, AMG cũng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất đường bột, Malto-Dextrin, glucoza… ở một số doanh nghiệp với sản lượng 1500 tấn/ năm 1999 [16]. Hiện nay, trong công nghệ sản xuất Sake ở Nhật Bản đã cải tiến theo hướng sử dụng enzim, người ta dùng những chế phẩm enzim tạo thành dextrin, phân giải tinh bột và các enzim koji. Các enzim tạo thành dextrin có nhiệt độ thích hợp 60 - 800C có thể được dùng như: amylaza 800 [102], các chế phẩm này có thể chịu được nhiệt độ trên 800C. các chế phẩm thuỷ phân tinh bột như sanuper, sumizym L [16]. Trong công nghệ sản xuất rượu vang gạo cẩm ở Việt Nam, người ta đã bước đầu sử dụng một số chế phẩm sau: 1.5.1. Termamyl (a amylaza) Termamyl là enzim chịu nhiệt, chế phẩm enzim dưới dạng nước chứa a- amylaza, có hoạt lực cao. Được sản xuất bởi chủng Bacillus licheniformis. Enzim này là một endo - amylaza, nó có khả năng thuỷ phân liên kết a-1,4 glucozid trong tinh bột thành dextrin và oligosacarit tan trong nước. Mặt khác, do có tính chịu nhiệt cao nên Termamyl có thể hoạt động ở nhiệt độ xấp xỉ 1000C. Trong công nghiệp sản xuất rượu vang gạo và một số đồ uống làm từ nguyên liệu ngũ cốc, Termamyl được dùng trong quá trình dịch hoá làm cho quá trình dịch hoá được dễ dàng. Tỷ lệ Termamyl thường dùng nằm trong khoảng 0,05 á 0,1% so với lượng bột gạo. 1.5.2. Chế phẩm AMG (Amylo glucoaza) AMG là một exo-D-glucosidaza - 1,4a (Gluco-amylaza), được sản xuất từ một số chủng loại vi sinh vật chọn lọc khác nhau: A. niger, Rhizopus sp hoặc sumizin bằng sự lên men chìm. Tên theo hệ thống là 1,4-a-D-Glucan glucohydrolaza. AMG chuyển các phân tử của glucose từ vị trí 1,4-a qua 1,6-a (có thể tạo thành panoza và isomaltoza). Liều lượng sử dụng là 0,1 - 0,6% so với khối lượng bột, enzim này hoạt động tối thích ở nhiệt độ 650C và pH = 5,4 - 6. Glucoamylaza ảnh hưởng đến sự hình thành hương vị của vang thành phẩm [76]. Tuy nhiên có những loại glucoamylaza làm mất màu của rượu vang gạo đỏ thơm vì thế cần xác định nguồn gốc chế phẩm enzim trước khi xử dụng cho phù hợp và an toàn. 1.5.3. Chế phẩm Neutrase (Proteaza) Nhờ có Neutrase mà protein được thuỷ phân để tạo thành các axit amin hoà tan. Thực tế cho thấy các hợp chất nitơ có vai trò rất quan trọng trong việc tạo hương, vị, mầu sắc, độ trong đặc biệt là tăng cường nguồn dinh dưỡng cho nấm men phát triển. Vai trò của peptit và polipeptit trong quá trình nấu là rất quan trọng, chúng sẽ được chuyển hoá tiếp thành các axit amin là nguồn dinh dưỡng cần thiết đảm bảo cho nấm men phát triển, hàm lượng nitơ tổng cùng với các hợp phần của chúng có sự ảnh hưởng tới hương rượu và thay đổi chu trình sinh hoá được thể hiện bằng sự trao đổi chất của nấm men. Đồng thời các tác giả trên cũng chỉ ra mối liên quan giữa hàm lượng axit amin và sự tạo thành các loại rượu bậc cao, este, diaxetyl và các hợp chất cacbonyl. Chế phẩm Neutrase (Proteaza) thu được từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus amyloliquepaciens được sử dụng trong quá trình thuỷ phân protein để tăng lượng axit amin trong dịch đường. Chế phẩm Neutrase 0,5L là chất lỏng có mầu nâu nhạt, tỷ trọng xấp xỉ 1,25 g/ml. Điều kiện hoạt động tối ưu của Neutrase là 45 - 550C và pH=5,5-7,5. Nên bảo quản Neutrase ở nơi khô ráo, ở 50C hoạt lực của Neutrase có thể duy trì trong một năm, còn khi ở nhiệt độ 250C có thể duy trì trong 3 tháng [31] và [107]. 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng rượu vang gạo 1.6.1. ảnh hưởng của nguyên liệu gạo đến hương vị của rượu vang Rượu gạo nếp cẩm làm từ gạo nếp cẩm lật (Oryza sativa var. Indica, Tapol) có hương vị đặc trưng là loại rượu có chất lượng cao, trong khi đó rượu làm từ loại gạo đỏ thơm xát thì chất lượng thấp hơn. Rượu gạo làm được từ cám gạo đỏ thơm và gạo đỏ, có hàm lượng rượu bậc cao cao hơn 2,5 lần và este bay hơi cao hơn 3,5 lần rượu làm từ cám của gạo nếp và gạo tẻ (bảng1.10) [73], [78] và [98]. Bảng 1..9. Các thành phần tạo hương vị của các loại rượu vang gạo khác nhau [73] TT Các chỉ tiêu Gạo lật đỏ thơm Gạo xát bổ sung cám khử lipit Gạo đỏ thơm xát Gạo xát bổ sung lipit chiết suất từ cám 1 rượu Etylic (%) 9,6 9,6 9,7 9,6 2 rượu isobutyl (ppm) 210 240 180 180 3 rượu Isoamyl (ppm) 260 230 190 190 4 Axetaldehyt (ppm) 1200 1520 1060 5 Ethyl axetat (ppm) 330 360 390 280 6 Axit axetic (ppm) 160 150 130 130 7 Hiệu suất lên men (%) 95 95 97 98 Cảm quan ++++ ++++ ++ + Ghi chú: ++++: rất tốt; +++: khá tốt; ++: trung bình; +: kém Gạo lật là gạo giã; gạo xát là gạo giã xong xay tiếp để bỏ lớp cám. Gạo đỏ thơm lật là nguyên liệu sản xuất vang gạo có hương vị tốt hơn gạo xát. Tuy nhiên hiệu suất lên men thấp hơn khi lên men bằng gạo xay và hàm lượng axit trong sản phẩm có cao hơn nhưng không đáng kể. Khi phân tích thành phần tạo hương vị của rượu gạo làm từ những nguyên liệu có mức độ xát khác nhau cho thấy: Lipit trong cám gạo không ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành hương vị của rượu vang. 1.6.2. Những ảnh hưởng của công nghệ 1.6.2.1. ảnh hưởng bởi quá trình xử lý nguyên liệu * Mức độ xát ảnh hưởng đến sự thay đổi thành phần hạt gạo theo mức độ xát sau khi giã (tỷ lệ %) được chỉ ra qua bảng1.10. Bảng 1.10. Sự thay đổi thành phần (%) của hạt gạo theo mức độ xát [97] và [101] Thành phần (% trọng lượng) Mức độ xát (%) 100 90 80 70 60 50 Độ ẩm A 13,5 13,5 13,3 13,0 11,0 10,5 B 13,2 13,2 12,9 11,8 11,0 11,0 Protein A 6,55 5,66 5,12 4,41 4,06 3,80 B 7,95 7,24 6,39 5,83 5,47 5,12 Chất béo A 3,28 0,67 0,15 0,10 0,07 0,05 B 1,90 0,55 0,11 0,08 0,05 0,04 Chất tro A 1,00 0,38 0,22 0,19 0,20 0,15 B 1,06 0,39 0,25 0,20 0,18 0,19 Tinh bột A 70,9 73,5 74,3 76,1 76,3 77,6 B 69,6 72,8 74,6 75,8 76,9 78,3 A: là gạo Yamadanisishki thu hoạch ở quận Hyogo. B: gạo thường thu hoạch ở quận Chiba Nhật Bản Hàm lượng chất béo và chất tro giảm nhanh nhất, trong khi đó hàm lượng protein giảm dần đến khi qúa trình xát đạt 50%, sau khi hàm lượng đó tương đối ổn định. Trong sự tương phản của sự thay đổi thành phần chất béo, thành phần lipit không đổi theo mức độ xát tăng. Nói chung, gạo làm sạch với mức độ xát là 70 á 75% thường được dùng trong sản xuất Sake [79]. Trong trường hợp dùng gạo đỏ thơm và gạo đỏ làm nguyên liệu sản xuất rượu, chất lượng của rượu gạo làm từ nguyên liệu gạo lật tốt hơn chất lượng của rượu làm từ gạo xay và cám. Rượu gạo làm từ gạo đỏ thơm lật có hương thơm trái cây và vị chua hấp dẫn, là rượu có chất lượng cao nhất củ Nhật Bản [100]. * Mức độ vo gạo và ngâm nước Trong quá trình vo gạo, mức độ ngậm nước của hạt gạo phụ thuộc vào mức độ đánh bóng của hạt gạo. Đây là quá trình loại bỏ phần trên bề mặt của hạt (1 - 3% tổng số trọng lượng hạt), thành phần này tạo ra dịch lơ lửng. Trong quá trình vo gạo, hạt hấp thu nước 9 á 17% trọng lượng hạt của chúng [97] và [101]. Trong suốt quá trình vo gạo và ngâm, hạt hấp thu nước 25 á 30% trọng lượng trung bình của chúng. Trong quá trình ngâm hạt, mầm của hạt chứa nhiều rễ con hơn, ở lúa nâu lượng amino axit cần thiết đã tăng lên 3 lần và lượng gamma-aminobutiric axit (GABA) tăng hơn 10 lần, và các amino axit khác cũng phát huy được chức năng của mình. Nhiều nghiên cứu [13],[15] và [109] đã xác minh rằng enzim trong sự nảy mầm đã được tăng lên nhiều lần. Chính nhờ quá trình ngâm, hạt nảy mầm đã làm tăng hoạt lực của enzim vốn đang ở dạng không hoạt động. Quá trình ngâm còn làm cho quá trình nấu chín dễ dàng hơn. Sản phẩm sẽ có hương vị ngọt hơn nhờ enzim có khả năng phân cắt một số đường và protein quan trọng. Đây là quá trình rất quan trọng chuẩn bị cho giai đoạn hồ hoá gạo. Sự hấp thu nước rất khác nhau ở từng loại gạo và mức độ đánh bóng. Hạt gạo được ngâm trong nước 1 á 20 giờ theo mức độ của tỷ lệ hấp thu nước. Gạo mềm hấp thu nước 1 á 3 giờ. Gạo xát kỹ hơn hấp thu nước nhanh hơn [79],[96] và [99]. * ảnh hưởng của sự hồ hoá Để gạo được hồ hoá triệt để, hạt thường được hồ hoá trong khoảng 30 á 60 phút. Trong quá trình hồ hoá, hạt hấp thu nước tới khoảng 7 á 12% trọng lượng của hạt gạo, như vậy kết quả lượng nước thu được khoảng 35 á 40%. Vì thế quá trình lên men rượu bằng nguyên liệu được hồ hoá xảy ra nhanh hơn ở nguyên liệu không qua hồ hoá [97]. Lên men rượu vang gạo không qua giai đoạn hồ hoá đã được nghiên cứu rộng rãi và cho thấy sự lên men không qua hồ hoá ảnh hưởng đến hiệu suất kinh tế vì đã giảm được sự tiêu hao năng lượng và lượng nhiệt cung cấp cho quá trình. Đã có một số nghiên cứu [99] và [108] ứng dụng hệ thống lên men rượu từ gạo đỏ thơm không qua giai đoạn hồ hoá để sản xuất loại rượu gạo giàu dinh dưỡng mùi thơm trái cây và vị phù hợp với thị hiếu và hiệu quả kinh tế. Tính ưu việt của công nghệ sản xuất rượu gạo không qua hồ hoá so với dịch lên men qua hồ hoá bằng phương pháp cổ truyền, được xác định bằng những phương pháp so sánh sản phẩm dịch lên men từ các nguồn nguyên liệu tinh bột khác nhau là gạo đỏ thơm (Oryza sativa var Indica, Tapol), gạo đỏ (Oryza sativa var Indica, Tapol), gạo nếp (Oryza sativa var Japonica), gạo tẻ (Oryza sativa var Japonica). Tất cả loại gạo này đều là gạo lật (bảng 1.11). ảnh hưởng của sự hồ hoá nguyên liệu tới sự tạo hương của rượu vang gạo. So sánh thành phần hương thơm của một số loại rượu khác nhau, hàm lượng izobutalat và izoamy alcol trong dịch lên men không qua hồ hoá là cao hơn 1,2 - 1,6 lần dịch lên men có qua hồ hoá. Hàm lượng etylaxetat trong dịch từ lên men không qua hồ hoá cũng cao hơn so với dịch lên men qua hồ hoá bằng phương pháp cổ truyền. Bằng phương pháp kiểm tra hàm lượng chất hữu cơ, rượu gạo sản xuất lên men không qua hồ hoá tốt hơn nhiều so với rượu gạo sản xuất lên men qua hồ hoá. Đặc biệt, rượu gạo đỏ thơm sản xuất bằng lên men không qua hồ hoá giàu hương thơm ngát, độ cồn cao, vị giống rượu hồng trái cây và sản phẩm có màu đỏ rubi độc đáo. Khi so sánh Sake dùng gạo lên men với loại sản phẩm trên, cho thấy rằng: màu đỏ rubi của dịch lên men bằng phương pháp không qua hồ hoá sáng đẹp hơn, các hợp chất thơm cũng nhiều hơn trong Sake. So sánh với một vài loại rượu gạo khác nhau, càng cho thấy rằng quá trình lên men không hồ hoá là yếu tố cần thiết cho bảo vệ vị ngọt đặc trưng trong gạo đỏ thơm [77]. Nguyên liệu gạo thơm là nguyên liệu phù hợp cho việc sản xuất đồ uống có cồn với hương vị độc đáo và màu sắc đặc trưng [53] và [109]. Dùng phương pháp lên men gạo đỏ thơm không qua hồ hoá là yếu tố cần thiết cho việc bảo quản hương vị có trong gạo đỏ thơm. So sánh với Sake phương pháp lên men không qua hồ hoá sản phẩm có màu đỏ tươi hấp dẫn hơn: giảm được nhiệt cho quá trình hồ hoá. Rượu gạo sản xuất bằng lên men không qua hồ hoá tốt hơn rượu gạo sản xuất bằng phương pháp lên men qua hồ hoá. Đặc biệt là hương thơm trái cây và vị của nó. Ngược lại rượu gạo đỏ thơm qua hồ hoá có nhiều este bay hơi và rượu bậc cao [53] và [100]. 1.6.2.2. ảnh hưởng của nguồn enzim Có rất nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzim thuỷ phân tinh bột và mỗi enzim có đặc tính riêng thể hiện ở bảng 1.11. Bảng 1.11. Đặc tính của một số enzim amyloglucosidaza [44] Cơ thể vi sinh vật PH thích hợp Nhiệt độ thích hợp (0C) Hiệu suất thuỷ phân tinh bột (%) Mức độ thuỷ phân tinh bột nguyên liệu Aspergillus awamori 4,5 60 90 ++ A. niger I 4,5 - 5,0 95 ++ A. oryzae I 4,5 60 100 +++ Mucor rouxianus I 4,6 55 100 +++ Rhizopus delemar 4,5 40 95 ++ Ghi chú: +++ thuỷ phân mạnh, ++ thuỷ phân trung bình, + thuỷ phân yếu, Có khoảng 50 loại enzim đã tìm thấy trong dịch đường hoá Koji, quan trọng nhất là amylaza và proteaza trong đó a-amylaza và amyloglucosidaza đóng vai trò quan trọng trong quá trình thuỷ phân tinh bột ở dịch Koji. Sự hình thành các axit amin và peptit từ protein được thực hiện ở pH 3 - 4 [31] và [106]. Trong thời gian đường hoá bằng enzim trong Koji, hàm ẩm của gạo đóng vai trò quan trọng. Hiện tượng đông tụ protein xuất hiện ở Sake sau quá trình thanh trùng và đóng chai không thể loại bỏ bằng sự lọc đơn giản, nguyên nhân của hiện tượng này là do tính chất đông tụ của protein của enzim khi thanh trùng Pasteur [69]. 1.6.2.3. ảnh hưởng của chế phẩm glucoamylaza đến chất lượng rượu vang gạo cẩm Khi dùng glucoamylaza để tăng hiệu quả đường hoá đã cho thấy sản phẩm thu được có hương vị giống rượu vang trái cây[53]. Kết quả phân tích quang phổ đã chỉ ra vang gạo không sử dụng chế phẩm glucoamylaza có độ hấp thụ đặc trưng tại bước sóng 530nm, ở bước sóng này độ hấp thụ đặc trưng của rượu vang gạo đỏ có sử dụng chế phẩm glucoamylaza (mẫu thí nghiệm) đã bị giảm một phần (bảng 1.12) Bảng 1.12. ảnh hưởng của glucoamylaza tới sự hình thành các cấu tử thơm của vang gạo [53] TT Chỉ tiêu Mẫu thí nghiệm Mẫu đối chứng 1 Rượu etylic (%) 9,5 9,4 2 Rượu Isobutylic (ppm) 250 160 3 Rượu Isoamylic (ppm) 270 240 4 Axetaldehyt (ppm) 1100 950 5 Isovaleraldehyt (ppm) 3,1 2,6 6 Etylaxetat (ppm) 380 200 7 Axit axetic (ppm) 180 40 8 Phép thử cảm quan* ++++ + *Trong đó: ++++ xuất sắc, +++ tốt, ++: đạt, +: không đạt Khi nghiên cứu ảnh hưởng của glucoamylaza đến sự mất màu của rượu vang gạo đỏ thơm kết quả nghiên cứu cho thấy trong glucoamylaza 2N có hoạt độ của b glucoamylaza cao, lượng glucoza tạo ra tăng lên, làm độ hấp thụ tại 530nm của hỗn hợp phản ứng chứa glucoamylaza giảm xuống. Nguyên nhân có thể được giải thích do một phần các chất màu bị kết tủa làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng này. Theo kết quả phân tích quang phổ, màu đỏ của vang gạo sử dụng chế phẩm glucoamylaza 2N kém hơn các chế phẩm glucoamylaza khác (từ Rhizopus spp). Đặc biệt sản xuất từ sumizin có màu đỏ sáng đặc trưng. Kết quả phân tích quang phổ đã chỉ ra rằng vang gạo được sản xuất từ sumizin và các chế phẩm glucoamylaza khác từ Rhizopus có độ hấp thụ đặc trưng tại 530nm. Như vậy, để nâng cao chất lượng vang rượu đỏ thơm cần sử dụng chế phẩm glucoamylaza chứa nhiều loại enzim khác nhau. Chúng có vai trò quan trọng trong sự hình thành hương vị của vang thành phẩm. Để tránh sự mất màu đỏ đặc trưng của vang gạo đỏ thơm nên chọn loại chế phẩm có hàm lượng b glucosidaza thấp vì nó được coi là enzim anthoxyanaza từ A. niger có thể đồng hoá anthoxyanin và làm mất màu vang gạo đỏ thơm bằng cơ chế anthoxyanin được chuyển thành anthoxyanidin với sự có mặt của glucoza nhờ hoạt động của anthoxyanaza, sau đó nó chuyển thành hợp chất không màu. 1.6.2.4. ảnh hưởng của nhiệt độ đến màu sắc của dịch chiết từ gạo cẩm Màu sắc của rượu không chỉ phụ thuộc vào sắc tố của nguyên liệu mà còn bị chi phối bởi một số yếu tố trong quá trình sản xuất và tàng trữ [14]. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong cả hai trường hợp pH=3,6, vàpH =6,8 cường độ hấp thụ màu sắc lớn nhất khi nhiệt độ ở 970C. Độ hấp thụ màu tăng dần theo sự tăng của nhiệt độ. Tuy nhiên mức độ thay đổi màu sắc còn phụ thuộc cả pH của môi trường. Tại pH = 6,8, cường độ hấp thụ màu thay đổi rõ rệt nhất khi nhiệt độ từ 70 đến 97 0C. Tuy nhiên sự thay đổi cường độ màu của gạo cẩm dưới tác dụng ảnh hưởng của nhiệt độ hoàn toàn phù hợp với tính chất của màu tự nhiên anthoxyanin. Trong tự nhiên các hợp chất màu thường gặp dưới dạng glucozit và cường độ màu tăng khi nhiệt độ tăng[14] và [109]. Ngoài ra, các sắc tố màu của gạo cẩm có khả năng hoà tan ở điều kiện nhiệt độ thường (30oC), khác với một số loại gạo màu không có khả năng này[108] và [109]. 1.6.2.5. ảnh hưởng của pH đến màu của dịch chiết từ gạo cẩm Trong các môi trường có pH khác nhau cho thấy màu sắc của dịch chiết từ gạo cẩm bị thay đổi. Sự thay đổi màu nhiều nhất xảy ra khi pH ở trong môi trường pH11 có màu xanh. Như vậy màu sắc của dịch chiết gạo cẩm rất nhậy với sự thay đổi của pH. Sự khác nhau này biểu thị trên phổ hấp thụ ánh sáng D = 2,2 khi pH 3,0; D=1.1.khi pH=3,6. Cường độ màu ở pH 3,5 lớn gấp 3 lần so với pH5,0 . Trong khi đó, ở pH 6,8 dịch chiết có màu nâu và bước sóng hấp thụ cực đại ở vùng l< 460 nm; ở pH 8,2, sắc tố tím có bước sóng cực đại là 540nm. Như vậy màu sắc của gạo cẩm thay đổi theo điều kiện pH và cho các sắc tó màu đỏ, màu nâu, tím, xanh. Hiện tượng này có thể giải thích theo bản chất của chất màu anthoxyanin dễ bị oxy hoá [14] và [109]. Trong quá trình lên men bề mặt do sử dụng bánh men thuốc bắc và điều kiện thuận lợi cho nấm men và nhiều vi sinh vật tạp nhiễm khác cũng phát triển, đặc biệt là các vi khuẩn sinh axit đã làm giảm pH của môi trường lên men, do đó làm ức chế hoạt động của nấm men [17] và[53]. 1.6.2.6. ảnh hưởng của chất sát trùng Công nghệ sản xuất vang nếp cẩm tuy đã được cải tiến song chủ yếu vẫn chỉ là lên men ẩm kết hợp với pha chế. Trong quá trình lên men ẩm do sử dụng bánh men thuốc bắc và điều kiện lên men không vô trùng nên thường bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật có hại. Chúng làm giảm hiệu suất lên men gây cho sản phẩm có độ chua cao, mùi vị lạ, chất lượng không ổn định. Nguyên nhân chủ yếu là chưa có biện pháp kỹ thuật để hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men. Có nhiều biện pháp để khắc phục trong đó việc sử dụng anhydrit sunphurơ (SO2) là một hợp chất sát trùng tốt nhất được nhiều nước sử dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang. SO2 có tính khử và chống oxi hoá mạnh, ức chế hoạt động của enzim oxydaza, dẫn đến việc ức chế tiêu diệt vi khuẩn và nấm men dại. ở hàm lượng vừa phải 10 - 100mg SO2/lit có thể hoạt hoá nấm men bởi - SH tạo thành sẽ hoạt hoá alcoldehydrogenaza và các enzim khác, giảm pH môi trường, làm tăng hoạt lực enzim, ức chế vi khuẩn giúp quá trình lên men tốt hơn. SO2 còn là dung môi hoà tan tốt các polyphenol làm cho rượu vang sáng màu và còn có tác dụng làm tăng độ kết dính của các hạt huyền phù trong dịch làm dịch nhanh trong hơn, khả năng lắng cặn tốt hơn. Cơ chế tác dụng của SO2 Trong dung dịch SO2 hoà tan dễ dàng tạo axit sunfurơ SO2 + H2O đ H2SO3 Axit này không bền và có khuynh hướng kết hợp với oxy của không khí và oxy trong dịch lên men: H2SO3 + O đ H2SO4 Vì vậy mà nó có thể bảo vệ dịch lên men không bị oxy hoá. Tuy nhiên khả năng chống oxy hoá của SO2 thực sự hiệu quả là do nó phá huỷ các enzim có khả năng chống oxy hoá của SO2 thực sự hiệu quả là do nó phá huỷ các enzim oxy hoá oxydaza (tyrozinaza, lacaza...) xúc tác quá trình oxy hoá các hợp chất phenol gây sẫm màu dịch quả. SO2 trong dịch luôn là chất nhận oxy trong quá trình oxy hoá xảy ra trong môi trường nước làm ức chế sự hô hấp của vi sinh vật, môi trường trở nên thiếu oxy, thể hiện oxy hoá khử của môi trường thay đổi và ngoài phạm vi tối thiểu cho vi sinh vật sẽ ức chế sự phát triển. SO2 có khả năng phân huỷ tế bào thực vật, làm mất khả năng co nguyên sinh của tế bào, giải phóng ra các chất chiết (tanin, chất màu, chất khoáng, axit...). Tuy nhiên nếu dùng SO2 với nồng độ quá cao sẽ kìm hãm sự phát triển của nấm men [111]. 1.6.2.7. ảnh hưởng của việc dùng cồn hãm Trong công nghệ sản xuất rượu vang, để tăng nồng độ cồn của rượu thành phẩm, người ta thường dùng cồn bổ sung sau khi lên men, đó là biện pháp dân gian thường làm , vừa hạn chế được khả năng xâm nhập và phát triển của vi khuẩn và ức chế nấm men hoạt động sớm kết thúc quá trình lên men bằng nồng độ cồn cao. Song với phương pháp này không tạo được hương thơm đặc trưng của vang thành phẩm do chất lượng của vang phụ thuộc phần lớn vào chất lượng cồn dùng pha chế, nồng độ cồn cao điịt ngột tăng trong dịch gây ức chế hoạt động của vi sinh vật trong giai đoạn tàng trữ tạo hương của rượu, mặt khác khi dùng rượu pha chế này thường gây chận cảm giác một sự “ xốc” không gây được hương vị cay nồng hài hoà của rượu, dẫn đến hậu vị kém, độ dinh dưỡng và độ bền vững của rượu chưa đạt, thậm chí nhiều khi gây đau đầu do hàm lượng aldehyt trong cồn pha chế lên men ở nhiệt độ cao thường nhiều hơn so với những sản phẩm rượu lên men ở nhiệt độ thấp [23]. Sau quá trình khảo sát chất lượng rượu vang gạo của một số công nghệ điển hình chúng tôi thấy: công nghệ lên men bằng giống thuần chủng trong điều kiện lên men thích hợp cho nấm men hoạt động mới có thể tạo ra sản phẩm đồ uống lên men chất lượng cao và đảm bảo an toàn thực phẩm (bảng3.13). Bảng 3.13. Thành phần cấu tử chất tạo hương của một số rượu vang khác nhau [23] Thành phần của rượu Sake Nhật Bản Rượu cẩm lên men ở 200C Rượu cẩm lên men ở 300C Rượu cẩm dân gian Aldehit (g/l) 0,027 0,026 0,046 0,106 Etylaxetat(g/l) 0,018 0,003 0,003 0,597 Metanol % (v/v) 0,0005 0,001 0,001 0,010 Propanol(g/l) 0,570 0,030 0,040 0,031 Isobutanol(g/l) 0,380 0,078 0,085 0,022 Isoamilic (g/l) 0,046 0,139 0,127 0,016 Qua một số công nghệ sản xuất rượu vang gạo ở các nuốc trong khu vực, thấy rằng công nghệ sản xuất rượu vang gạo là một cônng nghệ được phát triển ở hầu hết các nước vùng châu á Thái Bình Dương. Mỗi nước đều có công nghệ sản xuất bánh men và công nghệ lên men đều dùng nguồn ngũ cốc theo những cách rất riêng của từng nước. Việt Nam là nước có nghề sản xuất rượu từ lâu, xong mới chỉ dừng ở phương pháp thủ công, theo kinh nghiệm dân gian, chất lượng chưa ổn định và chưa đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng, hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc bắc còn chưa thuần chủng, chưa đảm bảo về tiêu chuẩn an toàn sản phẩm. Chất lượng rượu còn phụ thuộc vào cồn pha chế sau lên men. Sản lượng còn thấp, hiệu suất kinh tế chưa cao, chưa có sự đầu tư thoả đáng để có thể có nền công nghệ lên men như các nước trong khu vực. Việc cải tiến kỹ thuật công nghệ sản xuất sản phẩm mang tính truyền thống với qui mô công nghiệp đối với Việt Nam là một đầu tư có đầy triển vọng vì Việt Nam là một nước vừa là thị trường vừa là nơi có đầy đủ khả năng phát triển ngành rượu, trong đó có sản phẩm rượu vang cẩm đặc sản.