Đề tài Tổng quan về Peptide có hoạt tính sinh học

oaûng 1,35x107 caëp bazô ñaõ ñöôïc giaûi trình töï vaøo naêm 1996 vaø coù kích thöôùc daøi hôn E.coli khoaûng 3,5 laàn. Caùc vi naám khaùc cuõng ñöôïc söû duïng laøm teá baøo chuû trong caùc thí nghieäm taïo doøng gen nhö naám moác Aspergillus nidulans, Neurospora crassa hoaëc Pechia pastoris. Vector bieåu hieän gen ôû teá baøo S.cerevisiae cuõng nhö ôû sinh vaät nhaân chuaån khaùc chuùng bao goàm khôûi ñieåm (P- promotor), ñieåm keát thuùc (T- terminator), khôûi ñaàu sao cheùp cuûa E.coli (ori E); khôûi ñaàu sao cheùp ôû teá baøo Eukaryota (orieuk); caùc gen ñaùnh daáu choïn loïc (ESM); caùc vò trí nhaän bieát cuûa enzym giôùi haïn (MCS- multicloning site: ñieåm ña taùch doøng). Caùc teá baøo chuû thöïc vaät Moät soá loaïi teá baøo chuû thöïc vaät ñöôïc söû duïng laøm teá baøo chuû trong caùc thí nghieäm thao taùc gen. Taûo ñôn baøo, ví duï nhö loaøi Chramydomonas rainhardii coù taát caû nhöõng ñaëc tính öu vieät cuûa vi sinh vaät coäng vôùi caáu truùc vaø chöùc naêng cuûa teá baøo thöïc vaät. Do vaäy taûo ñôn baøo ñöôïc söû duïng ngaøy caøng nhieàu. Tuy nhieân, ngöôøi ta cuõng coøn duøng caùc teá baøo thöïc vaät nuoâi caáy trong nhöõng moâi tröôøng thích hôïp coù theå duøng laøm teá baøo chuû. Caùc teá baøo chuû ñoäng vaät Caùc teá baøo chuû ñoäng vaät nuoâi raát phöùc taïp, nhöng trong nhöõng ñieàu kieän caàn thieát cho söï bieåu hieän ra caùc protein coù hoaït tính sinh hoïc, ngöôøi ta vaãn söû duïng teá baøo chuû ñoäng vaät. Caùc teá baøo chuû ñoäng vaät bao goàm: Teá baøo thaän cuûa khæ xanh Chaâu Phi (African green monkey kidney). Teá baøo thaän chuoät ñoàng nhoû (Baby hamster kidney). Teá baøo thaän phoâi ngöôøi (Human embryonic kidney). Teá baøo töû cung chuoät baïch (Chinese hamster ovary). Teá baøo coân truøng ñeå nuoâi Baculovirus bieåu hieän protein ngöôøi. Teá baøo tuyeán truøng Caenorhabditis elegans. Phöông phaùp leân men Nguyeân taéc: Peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù theå ñöôïc giaûi phoùng khoûi protein ban ñaàu nhôø quaù trình leân men cuûa vi sinh vaät. Vi sinh vaät coù theå söû duïng caùc enzyme ngoaïi baøo ñeå thuûy phaân protein hoaëc khi caùc vi sinh vaät naøy bò phaân huûy thì caùc enzyme noäi baøo cuûa noù thoaùt ra ngoaøi, caùc enzyme naøy coù theå tieáp tuïc thuûy phaân protein. Leân men söõa: Ñeå laøm taêng löôïng peptide coù hoaït tính sinh hoïc trong caùc saûn phaåm söõa leân men thì ngöôøi ta cho leân men hoaëc ñoàng leân men vôùi chuûng vi khuaån lactic thuûy phaân protein maïnh. Vieäc löïa choïn chuûng vi khuaån coù aûnh höôûng tôùi vieäc giaûi phoùng peptide coù hoaït tính sinh hoïc. Chuûng vi khuaån khoâng neân thuûy phaân protein quaù maïnh (noù coù theå phaù huûy saûn phaåm) vaø caàn coù tính ñaëc hieäu phuø hôïp ñeå coù theå giaûi phoùng peptide coù hoaït tính sinh hoïc mong muoán. Caùc protease ôû thaønh teá baøo vi khuaån lactic coù tính ñaëc hieäu roäng, noù thuûy phaân protein söõa, laøm giaûi phoùng nhieàu loaïi oligopeptide. Vi khuaån lactic coù theå vaän chuyeån caùc peptide coù töø 18 amino acid trôû xuoáng ñi vaøo teá baøo ñeå söû duïng laøm nguoàn nitô. Caùc peptide coù maïch daøi hôn thì khoâng ñöôïc vaän chuyeån vaøo teá baøo. Sau khi teá baøo vi khuaån bò phaân huûy thì nhöõng peptide naøy seõ ñöôïc thuûy phaân tieáp bôûi caùc peptidase noäi baøo cuûa vi khuaån lactic. Nhieàu vi sinh vaät coù heä enzyme thuûy phaân protein maïnh, ví duï 1 soá loaøi ñaõ ñöôïc nghieân cöùu nhö: Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, Lb plantarum, Lb rhamnosus, Lb acidophilus, Streptococcus thermophilus vaø Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus…. Heä enzyme naøy bao goàm caùc enzyme ôû thaønh teá baøo vaø caùc enzyme beân trong teá baøo ví duï: endopeptidase, aminopeptidase, tripeptidase vaø dipeptidase (Christensen, Dudley, Pederson, & Steele, 1999). Hieän ñaõ coù nhieàu nghieân cöùu baùo caùo veà söï giaûi phoùng cuûa caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc töø protein cuûa söõa nhôø vi sinh vaät thuûy phaân (Gobbetti et al., 2004; Gobbetti, Stepaniak, De Angelis, Corsetti, & Di Cagno, 2002; Korhonen & Pihlanto-Leppa la, 2001, 2004; Matar et al., 2003), tuy nhieân haàu heát nhöõng baùo caùo naøy ñeàu taäp trung vaøo vieäc thu nhaän caùc peptide coù taùc duïng laøm giaûm chöùng cao huyeát aùp, ñieàu hoøa heä mieãn dòch, choáng oxi hoùa. Hai trong soá nhöõng peptide öùc cheá ACE ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát laø VPP vaø IPP, 2 peptide naøy ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong söõa leân men bôûi Lb.helveticus (Nakamura, Yamamoto, Sakai, Okubo et al., 1995; Sipola, Finckenberg, Korpela, Vapaatalo, & Nurminen, 2002). So vôùi caùc vi khuaån lacitc khaùc thì khi leân men söõa vôùi Lb.helveticus thì saûn phaåm cho thaáy hoaït tính öùc cheá ACE cao vaø taùc ñoäng laøm giaûm huyeát aùp roõ reät. Gobbetti, Ferranti, Smacchi, Goffredi, and Addeo (2000) ñaõ chöùng minh coù söï taïo thaønh peptide öùc cheá ACE khi söû duïng 2 loaøi Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus vaø Lc. lactis ssp.cremoris sau khi leân men söõa trong 72 giôø. Hai peptide öùc cheá ACE ñöôïc tìm thaáy Ser-Lys-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly Pro-Ile vaø Ser-Lys-Val-Tyr-Pro cho thaáy khaû naêng beàn vöõng trong moâi tröôøng taùc ñoäng bôûi acid, kieàm, enzyme thuûy phaân cuûa heä tieâu hoùa hoaëc trong ñieàu kieän baûo quaûn ôû 5-10oC trong 4 ngaøy. Nhieàu nghieân cöùu ñaõ chöùng minh söï thuûy phaân nhôø vi sinh vaät coù theå laøm sinh ra caùc peptide coù khaû naêng ñieàu hoøa heä mieãn dòch (Gill, Doull, Rutherfurd, & Cross, 2000). Khi söû duïng enzyme ñöôïc taùch ra töø Lactobacillus GG var. casei ñeå thuûy phaân casein, sau ñoù tieáp tuïc cho thuûy phaân baèng pepsin vaø trypsin, saûn phaåm thu ñöôïc coù tính chaát ñieàu hoøa heä mieãn dòch, khaû naêng naøy theå hieän maïnh nhaát khi söû duïng -casein. Matar (2001) ñaõ cho Lb.helveticus vaøo söõa, sau ñoù laáy söõa naøy cho chuoät aên trong 3 ngaøy thì phaùt hieän löôïng IgA taêng raát cao trong chaát nhaày ôû ruoät. Baûng 3.5: Moät vaøi ví duï veà caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù nguoàn goác töø protein cuûa söõa ñöôïc giaûi phoùng ra nhôø vi sinh vaät Leân men ñaäu naønh: Gaàn ñaây ngöôøi ta cuõng quan taâm ñeán caùc saûn phaåm töø ñaäu naønh leân men nhö: natto, tempeh, nöôùc töông, soy paste. Ngöôøi ta nhaän thaáy quaù trình leân men (nhôø Bacillus vaø Rhizopus) ñaäu naønh chæ coù theå thuûy phaân protein ñaäu naønh thaønh nhöõng peptide lôùn. Ngoaøi ra, Gibbs vaø coäng söï (2004) ñaõ phaùt hieän moät ñieàu thuù vò laø trong quaù trình leân men coù xuaát hieän peptide ELLVYLL, peptide naøy khoâng coù trong protein ñaäu naønh, do ñoù hoï cho raèng trong quaù trình leân men cuõng coù theå xaûy ra hieän töôïng toång hôïp caùc peptide. Peptide öùc cheá ACE (His-His-Leu) ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong soy paste (Shin vaø coäng söï, 2001), nöôùc töông (Okamoto 1995), natto vaø tempeh (Gibbs 2004). Phöông phaùp duøng enzyme thuûy phaân Nguyeân taéc: Duøng protease coù tính ñaëc hieäu phuø hôïp ñeå thuûy phaân protein, töø ñoù thu ñöôïc hoãn hôïp caùc peptide. Hoãn hôïp peptide sau ñoù seõ ñöôïc taùch vaø tinh saïch ñeå thu ñöôïc peptide mong muoán. Theo Haileselassie vaø coäng söï (1999) thì trong phaân töû peptide neáu coù chöùa caøng nhieàu goác proline thì peptide naøy seõ caøng coù nhieàu khaû naêng khaùng laïi söï taán coâng cuûa caùc enzyme thuûy phaân. Ngöôøi ta coù theå keát hôïp quaù trình thuûy phaân vaø taùch trong cuøng moät thieát bò: tieán haønh thuûy phaân trong thieát bò phaûn öùng membrane. Trong thieát bò naøy, söï thuûy phaân protein ñi keøm vôùi vieäc tinh saïch caùc peptide töø hoãn hôïp caùc saûn phaåm nhôø quaù trình loïc (hoaëc keát tuûa). Ngoaøi ra, do enzyme ñöôïc giöõ laïi trong heä thoáng neân laøm cho heä thoáng coù theå deã daøng vaän haønh lieân tuïc. Vieäc söû duïng maøng sieâu loïc (1-100nm hoaëc MWCO 500-100000 Da) phuø hôïp cho vieäc giöõ laïi haàu heát enzyme (Prazeres vaø Cabral, 1994). Vieäc taùch 1 peptide cuï theå naøo ñoù töø hoãn hôïp sau phaûn öùng thì buoäc ta phaûi söû duïng enzyme coù tính ñaëc hieäu cao, giaûi phoùng caùc peptide mong muoán 1 caùch nhanh choùng, ñoàng thôøi caùc peptide coù phaân töû löôïng khaùc nhau seõ ñöôïc taùch rôøi choïn loïc nhôø maøng sieâu loïc. Öu ñieåm chính cuûa thieát bò phaûn öùng membrane: Naêng suaát cao do hoaït ñoäng lieân tuïc Khoáng cheá söï chuyeån hoùa cuûa saûn phaåm Ñieàu chænh phaân töû löôïng cuûa saûn phaåm thuûy phaân Nhöôïc ñieåm chính cuûa phöông phaùp naøy: söï giaûm naêng suaát theo thôøi gian do söï taêng noàng ñoä cuûa caùc chaát tích ñieän, söï voâ hoaït cuûa enzyme (Perea vaø Ugalde, 1996). Söï thuûy phaân casein glycomacropeptide bôûi trypsin ñaõ ñöôïc thí nghieäm trong thieát bò naøy. Moät maøng sieâu loïc vôùi MWCO 3000Da taùch nhöõng peptide nhoû töø thieát bò, ñoàng thôøi, cô chaát môùi ñöôïc cho vaøo thieát bò vôùi toác ñoä phuø hôïp. So saùnh vôùi thieát bò phaûn öùng theo meû thì thieát bò naøy cho naêng suaát cao hôn 3 laàn sau 3.5 giôø tieán haønh thuûy phaân. Tuy nhieân löôïng CMP ñöôïc thuûy phaân thì chæ khoaûng 50%, do ñoù caàn phaûi toái öu hoùa noàng ñoä cô chaát vaø löu löôïng cho vaøo thieát bò (Bouhallab et al., 1992). Moät nghieân cöùu töông töï, immunomodulatory peptide -casein (193-209) ñöôïc phaân taùch töø vieäc thuûy phaân -casein bôûi chymosin. Khi thieát bò söû duïng maøng loïc membrane laøm töø cellulose thì vieäc vaän chuyeån cuûa peptide qua maøng seõ deã daøng hôn (Bouhallab et al., 1993). Khi tieán haønh thí nghieäm giaùn ñoaïn (theo meû), ngöôøi ta thu ñöôïc 1 soá oligopeptide coù phaân töû löôïng töø 1000Da trôû xuoáng khi cho phaàn loøng ñoû tröùng gaø thuûy phaân bôûi enzyme Newlase F thoâ vaø sau ñoù cho loïc baèng maøng loïc baùn thaám (semi-permeable membrane filter). Trong nhöõng nghieân cöùu sau ñoù, ngöôøi ta nhaän thaáy caùc oligopeptide naøy coù khaû naêng laøm ngaên chaën hieän töôïng taêng huyeát aùp ôû SHR (Yoshii et al, 2001). Söû duïng thieát bò phaûn öùng sieâu loïc 3 caáp, ngöôøi ta ñaõ thu ñöôïc caùc peptide öùc cheá ACE baèng caùch thuûy phaân gelatin laáy töø da boø vaø Alaska Pollack bôûi alkalase, pronase E vaø collagenase. Hình 3.8: Sô ñoà thieát bò phaûn öùng membrane ba 3 böôùc (three-step) tuaàn hoaøn ñeå saûn xuaát saûn phaåm thuûy phaân cuûa gelatine. TI: temperature indicator (nhieät keá); PI: pressure indicator (aùp keá); FI: flow indicator (löu löôïng keá); P1: recycling pump (bôm tuaàn hoaøn); P2: feed pump; P3: NaOH pump (bôm NaOH); PCV: pressure control valve (van ñieàu chænh aùp suaát); pHIC: pH indicator controller; FH: first hydrolysate (saûn phaåm thuûy phaân böôùc thöù nhaát); SH: second hydrolysate (saûn phaàm thuûy phaân böôùc thöù 2); TH: third hydrolysate (saûn phaåm thuûy phaân böôùc thöù 3) (Byun vaø Kim,2001). Thieát bò phaûn öùng sieâu loïc tính töø thieát bò phaûn öùng thöù nhaát ñeán thöù 3 thì giaûm daàn MWCO töø 10kDa ñeán 5kDa roài 1kDa. Söï keát hôïp caùc enzyme khaùc nhau cho ta möùc ñoä thuûy phaân saâu saéc hôn. Löôïng peptide öùc cheá ACE caøng taêng trong saûn phaåm thuûy phaân neáu ta giaûm MWCO cuûa membrane. Ñoái vôùi gelatin laáy töø da cuûa Alaska Pollack thì giaù trò IC50 cuûa saûn phaåm thuûy phaân ôû thieát bò phaûn öùng thöù 3 (0.63mg/ml) lôùn gaáp ñoâi so vôùi saûn phaåm thuûy phaân cuûa thieát bò phaûn öùng thöù nhaát (1.4mg/ml). Saûn phaåm thuûy phaân ôû thieát bò phaûn öùng thöù 3 coù chöùa caùc peptide öùc cheá ACE laø Gly-Pro-Met vaø Gly-Pro-Leu (Byun vaø Kim, 2001). Ñoái vôùi gelatin laáy töø da boø, giaù trò IC50 töông töï cuõng ñöôïc phaùt hieän, ngoaøi ra thu ñöôïc 2 peptide öùc cheá ACE (khi ngöôøi ta tinh saïch caùc saûn phaåm thuûy phaân ôû thieát bò phaûn öùng thöù 3) laø Gly-Pro-Val vaø Gly-Pro-Leu (Kim, 2001). Trong taøi lieäu [25], ngöôøi ta ñaõ söû duïng quaù trình sieâu loïc 2 caáp ñeå taùch saûn phaåm thuûy phaân: Nguoàn protein: whey protein. Whey protein concentrate (WPC, 35% protein) hoaëc whey protein isolate (WPI, 94% protein) coù ñöôïc nhôø quaù trình saéc kyù trao ñoåi ion (BiPRO, Davisco Foods International, LeSueur, MN) ñöôïc söû duïng laøm nguoàn protein cho nghieân cöùu naøy. Ñieàu kieän thuûy phaân: Trypsin (Type III-S vaø Type XIII cuûa Sigma, hoaëc PTN 6.0S cuûa Novo Nordisk) vaø chymotrypsin (800S oral grade cuûa Novo Nordisk) ñöôïc söû duïng laø enzyme thuûy phaân (söû duïng rieâng). Hai enzyme naøy coù tính ñaëc hieäu ñoái vôùi cô chaát khaùc nhau. Trypsin thuûy phaân taïi ñuoâi C cuoái cuûa goác Arg vaø Lys (2 amino acid coù tính base), trong khi ñoù chymotrypsin thuûy phaân taïi amino acid coù goác thôm hoaëc chuoãi khoâng phaân cöïc (kò nöôùc) (Phe, Tyr, Trp, Leu, Met). Ñoái vôùi caû 2 enzyme, phaûn öùng thuûy phaân ñöôïc thöïc hieän ôû pH 8.0 vaø nhieät ñoä töø 42-45oC, vaø kyõ thuaät pH-stat (duy trì pH) ñöôïc söû duïng ñeå duy trì pH toái thích cho enzyme. Quaù trình sieâu loïc (UF) 2 caáp: Hình 3.9: Quaù trình sieâu loïc 2 caáp ñöôïc ñeà nghò bôûi Turgeon vaø Gauthier (1990) Phöông phaùp naøy tieáp tuïc ñöôïc nghieân cöùu theâm. Ñaàu tieân, dung dòch sau thuûy phaân ñöôïc cho qua membrane 30kDa ñeå loaïi enzyme vaø nhöõng protein khoâng bò thuûy phaân, phaàn naøy ñöôïc goïi laø retentate hoaëc reaction mixture, trong khi ñoù phaàn ñi qua maøng loïc (permeate) ñöôïc goïi laø total hydrolysate (TH). Phaàn TH naøy seõ ñöôïc tieáp tuïc cho ñi qua membrane 1kDa, khi ñoù phaàn retentate seõ chöùa hoãn hôïp caùc peptide, coøn phaàn permeate seõ chöùa caùc amino acid. Nhöõng peptide naøy seõ tieáp tuïc ñöôïc ñöa ñi phaân tích ñeå ñaùnh giaù tính chaát cuûa chuùng. Quaù trình taùch caùc peptide: Noùi chung, ñaàu tieân phaàn peptide seõ ñöôïc phaân taùch bôûi quaù trình saéc kyù trao ñoåi ion (cation hoaëc anion) hoaëc bôûi ampholyte-free isoelectric focusing (Rotofor cell, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ñeå coù ñöôïc caùc phaàn peptide coù tính chaát khaùc nhau, thuaän lôïi cho quaù trình xaùc ñònh tính chaát sau naøy. Sau ñoù nhöõng phaàn peptide naøy seõ ñöôïc phaân tích baèng RP-HPLC söû duïng coät C18 (Nova-Pak, 3.9 i.d. x150 mm, Waters, Milford, MA). Quaù trình röûa giaûi ñöôïc tieán haønh theo gradient tuyeán tính (0 ñeán 60%) cuûa dung moâi acetonitrile : nöôùc : TFA (60 : 40 : 0.1%) vaø löu löôïng 1 ml/phuùt. Söû duïng böôùc soùng haáp thuï ôû 214nm. Peak peptide chính ñöôïc thu laïi, saáy trong Speed-Vac concentrator, sau ñoù ñöôïc ñem ñi thuûy phaân (trong ñieàu kieän chaân khoâng) baèng HCl 6N trong 24h ôû 110oC trong Pico-Tag station (Waters). Amino acid ñöôïc taïo daãn xuaát vôùi phenyllisothiocyanate theo phöông phaùp cuûa Bidlingmeyer (1984). Keát quaû phaân tích thaønh phaàn amino acid seõ cho ta bieát veà caáu taïo cuûa peptide thu ñöôïc. Baûng 3.6: Moät soá peptide xaùc ñònh ñöôïc khi thuûy phaân whey protein 1Turgeon et al., 1992a; Nadeau, 1995; Barbeau et al., 1996; Wijers et al., 1998; Pouliot et al., 1999, 2000; Persaud et al., 2000; Lajoie, 2001. 2Phaân töû löôïng vaø ñieåm ñaúng ñieän ñöôïc tính töø ExPaSy. 3Ñoä kò nöôùc (hydrophobicity) trung bình ñöôïc tính theo phöông phaùp Bigelow (1967) 4Caùc peptide coù ñöôïc do bò thuûy phaân bôûi chymotrypsin. 5Caùc peptide coù taïo caàu disulfide. Trong thí nghieäm naøy ngöôøi ta thaáy haàu heát caùc peptide coù ñöôïc thì coù nguoàn goác töø , chæ coù ñoaïn 105-108 coù töø (maëc duø chæ chieám 15% WPI). Ngoaøi ra, trong baûng coù 1 soá peptide coù maët do söï thuûy phaân bôûi chymotrypsin, ñieàu naøy cho thaáy trong saûn phaåm trypsin thöông maïi cuõng coù maët chymotrypsin. Baûng 3.7: Saûn phaåm thuûy phaân cuûa whey protein bôûi chymotrypsin 1Saûn phaåm thuûy phaân coù bôûi chymotrysin 800S oral grade cuûa Novo Nordisk. 2Phaân töû löôïng vaø ñieåm ñaúng ñieän ñöôïc tính töø ExPaSy. 3Ñoä kò nöôùc (hydrophobicity) trung bình ñöôïc tính theo phöông phaùp Bigelow (1967) 4Caùc peptide coù ñöôïc do bò thuûy phaân bôûi trypsin. Neáu theo lyù thuyeát thì seõ coù hôn 35 loaïi peptide ñöôïc giaûi phoùng, tuy nhieân thí nghieäm naøy ñaõ khoâng phaùt hieän ñöôïc taát caû caùc peptide. Lyù do coù theå laø chuùng coù noàng ñoä quaù thaáp hoaëc ôû böôùc soùng 214nm thì chuùng quaù beù ñeå coù theå phaùt hieän ñöôïc. Chöông 4: TINH SAÏCH CAÙC PEPTIDE Ñ eå thöïc hieän baát cöù quaù trình taùch thu nhaän cheá phaåm naøo thì vieäc nghieân cöùu vieäc tinh saïch ôû möùc ñoä phaân tích luoân laø böôùc ñaàu tieân, noù duøng ñeå toái öu hoùa quaù trình taùch thu nhaän cheá phaåm. Duø peptide ñöôïc taïo baèng phöông phaùp naøo thì noù cuõng coù laãn taïp chaát, muoán coù ñöôïc saûn phaåm coù haøm löôïng peptide cao thì ta phaûi traûi qua quaù trình tinh saïch Ta coù theå chia laøm 2 möùc ñoä tinh saïch: Möùc ñoä phaân tích (analytical level): duøng ñeå phaân tích ñònh tính, ñònh löôïng caùc caáu töû trong maãu Möùc ñoä taùch cheá phaåm (preparative level): duøng ñeå taùch, laøm saïch vaø thu nhaän caùc caáu töû. Quaù trình tinh saïch naøy toán raát nhieàu thôøi gian vaø coâng söùc. Quaù trình tinh saïch khoâng hieäu quaû coù theå daãn ñeán nhöõng keát luaän sai laàm. Nhöõng goác nhö Trp, Met, Gln ôû ñaàu N, vaø Cys ñöôïc bieát nhö laø nhöõng nguyeân nhaân gaây ra nhöõng phaûn öùng khoâng mong muoán trong quaù trình thöïc hieän caùc phaûn öùng, thao taùc hay baûo quaûn. Cys, Met vaø Trp deã bò oxi hoùa. Söï oxi hoùa Cys vaø Met thöôøng laø thuaän nghòch, coøn Trp thì khoâng thuaän nghòch. Gln ôû vò trí ñuoâi-N cuûa chuoãi peptide coù khaû naêng hình thaønh caáu truùc lactam, thöôøng ñöôïc goïi laø pyroglutamte. Thoâng thöôøng ngöôøi ta phaân bieät thaønh petide “thoâ” vaø peptide “tinh saïch”. Peptide tinh saïch ñöôïc chia ra laøm 3 möùc ñoä: ñoàng nhaát (homogeneous), raát tinh saïch (very pure), tinh saïch möùc ñoä saéc kyù (chromatographically pure). Ñoái vôùi caùc öùng duïng khaùc nhau thì ngöôøi ta söû duïng peptide vôùi caùc möùc ñoä tinh saïch khaùc nhau. Ví duï, polyclonal antisera söû duïng nhö laø khaùng nguyeân thì caàn möùc ñoä tinh sạch thaáp; coøn peptide ñöôïc söû duïng ñeå nghieân cöùu veà tính chaát, caáu taïo vaø hoaït tính sinh hoïc cuûa noù thì caàn phaûi coù möùc ñoä tinh saïch raát cao. Haàu heát vieäc tinh saïch protein hay peptide lieân quan tôùi raát nhieàu giai ñoaïn. Ñaàu tieân, thoâng thöôøng ngöôøi ta seõ taùch choïn loïc baèng phöông phaùp keát tuûa, sieâu loïc, saéc kyù hoaëc trích ly pha raén ñeå coù ñöôïc moät hoãn hôïp (giaøu peptide mong muoán hôn ban ñaàu). Hoãn hôïp naøy sau ñoù seõ tieáp tuïc ñöôïc tinh saïch (thöôøng söû duïng phöông phaùp RP-HPLC) ñeå coù ñöôïc peptide mong muoán. 4.1 xöû lyù sô boä ñeå laøm taêng noàng ñoä peptide mong muoán Töø hoãn hôïp peptide ban ñaàu khoâng theå naøo taùch laáy ngay moät peptide cuï theå naøo ñoù maø caàn phaûi qua vaøi böôùc xöû lyù ban ñaàu ñeå laøm taêng daàn noàng ñoä peptide mong muoán, hay laøm giaûm löôïng taïp chaát. Keát tuûa: vieäc keát tuûa caùc peptide lôùn vaø protein ñöôïc thöïc hieän vôùi dung moâi höõu cô (methanol, ethanol hoaëc acetone) hoaëc acid (trichloroacetic acid), hoaëc bôûi muoái (ví duï ammonium sulphate, muoái naøy coù theå keát tuûa ñöôïc nhieàu protein maø khoâng laø aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa chuùng) noàng ñoä cao, hoaëc bôûi ñieàu chænh pH ñeán ñieåm ñaúng ñieän. Phöông phaùp naøy ñôn giaûn vaø hieäu quaû, tuy nhieân noù seõ gaëp nhieàu khoù khaên ñoái vôùi nhöõng peptide khoù keát tinh (nhöõng peptide nhoû töø pentapeptide trôû xuoáng) Phöông phaùp sieâu loïc (ultrafiltration-UF): duøng nhöõng maøng loïc coù loã loïc raát nhoû, coù theå duøng laøm taêng noàng ñoä dung dòch peptide vaø protein, khoù coù khaû naêng taùch 1 peptide hay 1 protein cuï theå naøo ñoù. Phöông phaùp saéc kyù baûn moûng (thin-layer chromatography): laø kyõ thuaät taùch peptide ñôn giaûn nhaát, noù thöôøng ñöôïc noái tieáp baèng phöông phaùp ñieän di. Trong tröôøng hôïp coù nhieàu taïp chaát trong hoãn hôïp thì noù caàn phaûi ñöôïc xöû lyù theâm. Trong tröôøng hôïp muoán coùù moät dung dòch cuûa moät protein/peptide noäi baøo thì tröôùc tieân teá baøo phaûi ñöôïc phaù vôõ ñeå laøm thoaùt dòch beân trong. Nhöõng phaàn khoâng tan, bao goàm caû membrane, coù theå ñöôïc loaïi boû baèng quaù trình ly taâm hoaëc baèng caùc phöông phaùp khaùc. Protein hoaëc peptide hoøa tan coù theå ñöôïc taùch ra vaø tinh saïch töø dung dòch thoâ naøy. Quaù trình giaûi laáy nhöõng protein lieân keát vôùi membrane ñoâi khi coù theå thöïc hieän baèng caùc chaát taåy röûa. 4.2 Tinh saïch peptide Sau khi xöû lyù sô boä hoãn hôïp ban ñaàu thì hoãn hôïp sau ñoù seõ ñöôïc xöû lyù theâm ñeå coù theå coù ñöôïc peptide mong muoán, moät soá phöông phaùp thöôøng söû duïng: Saéc kyù loûng cao aùp pha ñaûo (reversed-phase HPLC : RP-HPLC): laø phöông phaùp thoâng duïng nhaát ñeå taùch vaø tinh saïch peptide. Thuoäc loaïi saéc kyù coät coù pha ñoäng laø chaát loûng. Hieäu quaû phaân tích cao cuûa HPLC ñaït ñöôïc laø do vaät lieäu nhoài coät coù kích thöôùc haït raát beù (5-10m) vaø ñoä ñoàng nhaát cao laøm taêng ñaùng keå soá ñóa lyù thuyeát, vieäc söû duïng bôm cao aùp duy trì aùp suaát cao ôû ñaàu coät nhaèm ñieàu chænh vaø oån ñònh vaän toác doøng vaø taêng toác quaù trình phaân tích. RP-HPLC duøng pha tónh keùm phaân cöïc hôn pha ñoäng. Khi ñoù caùc dung moâi söû duïng laø dung moâi phaân cöïc, thöôøng ít ñoäc haïi hôn, reû hôn vaø khoâng gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Saéc kyù loûng cao aùp pha thuaän (normal-phase HPLC): töông töï treân, nhöng pha tónh phaân cöïc hôn pha ñoäng. Thöôøng duøng ñeå taùch caùc peptide öa nöôùc. Saéc kyù trao ñoåi ion (ion-exchange chromatography: IEC): thöôøng duøng ñeå tinh saïch protein. Coù theå coi ñaây laø 1 daïng ñaëc bieät cuûa saéc kyù haáp phuï maø trong ñoù caùc caáu töû maãu mang ñieän coù khaû naêng töông taùc tónh ñieän 1 caùch thuaän nghòch vôùi pha tónh laø caùc haït nhöïa mang ñieän traùi daáu, coøn pha ñoäng laø caùc dung dòch ñieän ly. Löïc lieân keát phuï thuoäc vaøo baùn kính ion vaø maät ñoä ion cuûa pha tónh (soá ñieän tích treân 1 ñôn vò theå tích phaân töû). Phöông phaùp naøy coù tieàm naêng trong vieäc öùng duïng trong quy moâ lôùn. Saéc kyù aùi löïc (affinity chromatography: AC): phöông phaùp naøy döïa treân khaû naêng giöõ peptide baèng nhöõng chaât neàn khoâng hoøa tan, ñöôïc nhoài vaøo trong caùc coät saéc kyù. Phöông phaùp naøy raát höõu duïng do coù tính ñaëc hieäu cao, ví duï vieäc taùch 1 peptide naøo ñoù coù maët vôùi noàng ñoä thaáp trong 1 dung dòch sinh hoïc hoaëc dòch chieát cuûa teá baøo. Khaùng theå thöôøng ñöôïc duøng ñeå taùch vaø tinh saïch khaùng nguyeân töông öùng. Traùi laïi cuõng coù theå taùch khaùng theå naøo ñoù baèng caùch duøng khaùng nguyeân coá ñònh treân coät. Phöông phaùp ñieän di mao quaûn (capillary electrophoresis – CE): hieän nay ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå taùch caùc peptide vaø protein, bao goàm caû caùc protein taùi toå hôïp. Xeùt veà maët lyù thuyeát, taát caû caùc phöông phaùp ñieän di (CE, ITP-isotachophoresis: ñieän di ñaúng toác, IEF-isoelectric focusing: ñieän di ñaúng ñieän), ñeàu coù theå ñöôïc tieán haønh vôùi coät mao quaûn, treân cuøng 1 loaïi thieát bò ñieän di. Hieän nay phöông phaùp ñieän di mao quaûn ñöôïc söû duïng phoå bieán nhaát laø phöông phaùp ñieän di mao quaûn vuøng (capillary zone electrophoresis- CZE). Khi aùp ñaët ñieän aùp, hai hoaït ñoäng ñieän ñoäng seõ xaûy ra döôùi taùc ñoäng cuûa ñieän tröôøng, ñoù laø söï ñieän di vaø söï ñieän thaåm (electroosmotic flow-EOF, ñoù laø söï di chuyeån cuûa 1 lôùp chaát loûng coù ñieän tích döôùi taùc duïng cuûa ñieän tröôøng). Chòu taùc ñoäng ñoàng thôøi cuûa quaù trình ñieän di vaø ñieän thaåm, caùc phaàn töû trong maãu mang ñieän tích döông, ñieän tích aâm hoaëc trung hoøa veà ñieän seõ di chuyeån veà phía catode vôùi vaän toác khaùc nhau. Caùc phaàn töû mang ñieän tích döông seõ ñeán catode nhanh nhaát, hay noùi caùch khaùc, peak cuûa caùc cation treân ñieän di ñoà seõ xuaát hieän tröôùc EOF. Caùc anion coù linh ñoä ñieän di nhoû hôn EOF seõ ra sau EOF vaø caùc anion coù linh ñoä ñieän di lôùn hôn EOF seõ khoâng phaùt hieän ñöôïc vì di chuyeån veà phía anode. Caùc phaàn töû trung hoøa veà ñieän seõ ñi cuøng vôùi EOF vaø xuaát hieän treân ñieän di ñoà ôû cuøng vò trí cuûa EOF. Löôïng maãu ñöôïc söû duïng khi taùch thöôøng raát nhoû (döôùi 20nl), do ñoù seõ raát khoù khaên neáu muoán phaùt hieän nhöõng thaønh phaàn coù tæ leä nhoû trong 1 hoãn hôïp phöùc taïp, chính vì vaäy, tröôùc khi phaân tích ta caàn phaûi laøm giaøu thaønh phaàn caàn phaân tích trong maãu (baèng caùc phöông phaùp xöû lyù sô boä ôû phaàn 4.1). Saéc kyù raây phaân töû (size-exclusion chromatography: SEC): laø phöông phaùp taùch döïa treân söï khaùc nhau veà kích thöôùc phaân töû cuûa caùc chaát. Ngöôøi ta cho dung dòch phaân tích ñi qua caùc vaät lieäu coù khaû naêng taïo thaønh boä khung gel hoaëc caùc raây phaân töû. Pha tónh trong saéc kyù gel laø dung moâi ôû trong caùc loã cuûa gel, coøn pha ñoäng cuõng chính laø dung moâi chaïy qua. Noùi caùch khaùc, pha tónh vaø pha ñoäng cuõng chính trong saéc kyù gel ñöôïc caáu taïo töø 1 chaát hay töø 1 hoãn hôïp caùc chaát Caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn hôn loã gel khoâng haáp phuï leân gel maø chæ khueách taùn vaøo caùc khe hôû giöõa caùc haït raén xoáp, coøn caùc phaân töû coù kích thöôùc beù hôn coù theå ñi xuyeân vaøo caùc loã cuûa gel vaøo saâu beân trong. Khi pha ñoäng ñi ngang qua, caùc phaân töû seõ ñöôïc röûa giaûi ra khoûi gel theo thöù töï khaùc nhau. Caùc phaân töû coù kích thöôùc lôùn hôn loã gel seõ theo pha ñoäng ñi ra ñaàu tieân, caùc phaân töû coù kích thöôùc beù nhaát seõ ñi ra sau cuøng. Ñoái vôùi caùc phaân töû coù caáu truùc khoâng gian gaàn gioáng nhau, thöù töï röûa giaûi seõ giaûm theo chieàu giaûm troïng löôïng phaân töû. 4.3 Ñaùnh giaù keát quaû tinh saïch Sau khi tinh saïch thì caàn phaûi kieåm chöùng veà möùc ñoä ñoàng nhaát (homogeneity) vaø nhöõng tính chaát veà caáu truùc (structural characterization) ñeå coù ñöôïc saûn phaåm theo yeâu caàu. Coù nhieàu phöông phaùp phaân tích ñöôïc söû duïng. Hình 4.1: Moái quan heä giöõa caùc phöông phaùp phaân tích Hình treân cho ta thaáy moái quan heä cuûa caùc phöông phaùp phaân tích. Caùc phöông phaùp phaân tích amino acid (amino acid analysis) thì thích hôïp ñeå phaân tích caáu truùc hoùa trò cuûa phaân töû; trong khi ñoù phöông phaùp phaân tích thöù töï (sequence analysis) cho pheùp ñaùnh giaù caû möùc ñoä ñoàng nhaát laãn caáu truùc phaân töû. Phöông phaùp ghi phoå khoái löôïng (mass spectrometry) cuõng laø moät phöông phaùp quan troïng ñeå phaân tích protein. Phöông phaùp coäng höôûng töø haït nhaân ( nuclear magnetic resonance- NMR) laø moät trong nhöõng phöông phaùp chính ñeå phaân tích caáu truùc cuûa peptide hay protein trong dung dòch. Phöông phaùp quang phoå töû ngoaïi (ultraviolet spectroscopy) thöôøng duøng ñeå phaân tích amino acid coù chöùa voøng thôm (ñaëc bieät laø Trp), noù cuõng laø coâng cuï ñeå ñaùnh giaù, kieåm soaùt vieäc tinh saïch peptide. Tuy nhieân nhöõng thoâng tin veà caùc lieân keát hoùa trò cuûa peptide thì vaãn coøn nhieàu haïn cheá. Keát quaû ñaùnh giaù ñònh löôïng quaù trình tinh saïch peptide hay protein ñöôïc goïi laø “hoaït tính”. Thuaät ngöõ naøy thöôøng ñöôïc söû duïng cho enzyme. Söï phaân tích enzyme döïa treân nhöõng phaûn öùng xuùc taùc ñaëc hieäu cuûa enzyme, trong khi ñoù, protein thì döïa treân nhöõng tính chaát vaät lyù cuûa noù, ví duï döïa treân coäng toá coù khaû naêng sinh maøu cao (highly chromogenic cofactor) ta coù theå bieát ñöôïc thoâng qua phöông phaùp quang phoå. Hoaït tính rieâng laø thöôùc ño cho möùc ñoä tinh saïch, noù ñöôïc ñònh nghóa laø tæ soá giöõa löôïng protein theå hieän hoaït tính trong dung dòch so vôùi toång soá protein trong dung dòch. Hoaït tính rieâng gia taêng trong quaù trình tinh saïch do ta ñaõ loaïi boû nhöõng protein khaùc khoâng coù hoaït tính naøy. Moät protein hoaøn toaøn tinh saïch neáu noù theå hieän hoaït tính rieâng cuûa protein aáy cao nhaát. Chöông 5: XÖÛ LYÙ VAØ TOÀN TRÖÕ PEPTIDE  Tính oån ñònh cuûa peptide Noùi chung, peptide vaø protein thu ñöôïc töø quaù trình tinh saïch thöôøng coù giöõ laïi 1 löôïng nöôùc vaø acid. Trong quaù trình toàn tröõ moät soá bieán ñoåi coù theå dieãn ra nhö söï oxi hoùa, söï haáp phuï, söï haáp thuï hay giaûi phoùng aåm, bieán ñoåi do tieáp xuùc vôùi aùnh saùng, nhieät…. Nhìn chung thì traïng thaùi raén beàn hôn so vôùi traïng thaùi dung dòch töông öùng. Ôû traïng thaùi dung dòch thì baûn chaát cuûa dung moâi, noàng ñoä, pH, vaø nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán tính oån ñònh. Söï haáp phuï leân beà maët vaät chöùa, söï voâ hoaït, söï racemic hoùa, oxi hoùa, deamin hoùa, phaù maïch, hình thaønh diketoptperazine (hôïp chaát ñöôïc taïo thaønh töø vieäc hydrate hoùa 2 phaân töû Gly) vaø söï saép xeáp laïi maïch laø nhöõng hieän töôïng xaûy ra cho peptide neáu noù khoâng oån ñònh trong dung dòch. Coù moät vaøi tröôøng hôïp maø khi ôû daïng raén ngöôøi ta laïi nhaän thaáy noù keùm beàn hôn so vôùi khi ôû daïng dung dòch. Ñoái vôùi daïng raén, söï khoâng oån ñònh neáu xaûy ra thì cuõng töông töï nhö daïng dung dòch (phaù maïch, hình thaønh caùc lieân keát, söï saép xeáp laïi, thay theá…). Nhöõng phaûn öùng ñieån hình nhö: Söï deamin hoùa cuûa Asn vaø Gln Söï oxi hoùa nguyeân töû löu huyønh cuûa Cys vaø Met Söï thay ñoåi caàu disulfur ôû Cys Söï phaân huûy lieân keát peptide Söï dime hoùa hoaëc söï keát hôïp caùc phaân töû. Peptide trong thöïc phaåm cuõng nhö trong döôïc phaåm coù theå phaûn öùng vôùi nhöõng hôïp chaát khoâng phaûi protein. Söï thieáu huït Lys trong protein thöïc phaåm chuû yeáu do phaûn öùng Maillard, moät vaøi goác amino acid khaùc nhö Asn, Arg, Gln cuõng coù khaû naêng phaûn öùng vôùi ñöôøng khöû. Hình 5.1: Böôùc ñaàu cuûa phaûn öùng Maillard Vieäc nhöõng phaûn öùng phaân huûy vaãn coù theå xaûy ra ôû trong caû daïng raén (ít aåm) vaãn chöa ñöôïc hieåu roõ raøng. Söï huùt aåm, nhieät ñoä vaø söï hình thaønh caùc “excipient” (ví duï nhö polymer) ñöôïc xem laø nhöõng nhaân toá chính aûnh höôûng ñeán söï khoâng oån ñònh cuûa peptide hay protein ôû daïng raén. Söû duïng vaø toàn tröõ peptide Caùc peptide khaùc nhau coù nhöõng tính chaát hoøa tan khaùc nhau. Söï khoù khaên trong vieäc hoøa tan peptide coù lieân quan ñeán söï hình thaønh caáu truùc baäc 2. Söï taïo thaønh caáu truùc baäc 2 naøy xuaát hieän vôùi haàu heát caùc peptide (tröø nhöõng peptide coù ñoä daøi maïch quaù ngaén) vaø ñaëc bieät laø nhöõng peptidec coù chöùa nhieàu amino acid öa beùo. Söï hình thaønh caáu truùc baäc 2 naøy coù theå ñöôïc thuùc ñaåy bôûi muoái. Khi söû duïng, tröôùc tieân ta caàn hoøa tan peptide trong nöôùc caát, soùng sieâu aâm coù theå giuùp taêng khaû naêng hoøa tan cuûa peptide. Khi caàn toàn tröõ peptide trong thôøi gian daøi thì ta caàn phaûi tieán haønh saáy laïnh peptide. Peptide ñöôïc saáy laïnh coù theå baûo quaûn vaøi naêm ôû nhieät ñoä -20 hoaëc thaáp hôn maø haàu nhö khoâng coù söï phaân huûy. So vôùi daïng toàn tröõ naøy thì peptide ôû trong daïng dung dòch ít beàn hôn. Peptide deã bò taùc ñoäng bôûi vi sinh vaät, do ñoù chuùng caàn ñöôïc hoøa tan trong nöôùc caát. Peptide coù chöùa Met, Cys hoaëc Trp thì coù thôøi gian baûo quaûn ôû daïng dung dòch ngaén hôn do chuùng bò oxi hoùa. Nhöõng peptide naøy caàn phaûi ñöôïc hoøa tan trong dung moâi ñaõ ñöôïc loaïi oxi. Peptide thöôøng ñöôïc baùn döôùi daïng boät mòn ñöôïc saáy laïnh, ñöïng trong caùc loï nhoû. Caàn phaûi tröõ laïnh chuùng sau khi mua veà. Ñeå hoaøn nguyeân (reconstitute) peptide thì neân duøng nöôùc caát hoaëc dung dòch ñeäm, coù theå duøng dung dòch acetic acid hoaëc ammonium bicarbonate ñoái vôùi peptide khoù hoøa tan. Moät soá dung moâi khaùc coù theå ñöôïc söû duïng ñeå hoøa tan peptide nhö acetonitrile, DMSO, DMF, hoaëc isopropanol. Nhöõng dung moâi naøy neân duøng vôùi moät löôïng toái thieåu, sau ñoù theâm nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm ñeán theå tích yeâu caàu. Sau khi peptide ñöôïc hoaøn nguyeân, chuùng caàn phaûi ñöôïc söû duïng ngay ñeå traùnh bò phaân huûy trong dung dòch. Phaàn peptide coøn dö thì neân tieán haønh saáy laïnh trôû laïi, giöõ ôû -20. Caàn traùnh vieäc laïnh ñoâng, raõ ñoâng nhieàu laàn. Phöông phaùp hoøa tan peptide: Caùch toát nhaát ñeå hoøa tan peptide laø duøng nöôùc. Ñoái vôùi caùc peptide khoâng tan trong nöôùc thì ta coù theå duøng nhöõng caùch sau: Ñoái vôùi peptide coù tính acid (tích ñieän aâm), ta duøng moät löôïng nhoû base ví duï ammonium bicarbonate 10% ñeå hoøa tan peptide, theâm nöôùc vaøo ñeán noàng ñoä theo yeâu caàu. Khoâng söû duïng base cho peptide coù chöùa Cys Ñoái vôùi peptide coù tính base (tích ñieän döông), söû duïng moät löôïng khoaûng acid acetic 30%, theâm nöôùc ñeán noàng ñoä yeâu caàu. Ñoái vôùi peptide raát kò nöôùc, coá gaéng hoøa tan peptide trong moät löôïng nhoû DMSO, theâm nöôùc ñeán noàng ñoä yeâu caàu. Ñoái vôùi peptide coù khuynh höôùng keát tuûa (thöôøng laø nhöõng peptide coù chöùa Cys), theâm urea 6M vôùi acid acetid 20%, hoaëc guanidine. HCl 6M vaøo peptide, theâm nöôùc tôùi noàng ñoä yeâu caàu. Chöông 6: ÖÙNG DUÏNG CUÛA PEPTIDE COÙ HOAÏT TÍNH SINH HOÏC D o coù nhöõng tính chaát ñaëc bieät, aûnh höôûng ñeán chöùc naêng sinh lyù cuûa cô theå neân caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù theå ñöôïc öùng duïng trong döôïc phaåm vaø trong thöïc phaåm (thöïc phaåm chöùc naêng). Döôïc phaåm Neáu tính caû aspartame vaø peptide khaùng sinh vaøo, thì peptide cuõng chæ chieám khoaûng 0.0025% (khoái löôïng) döôïc phaåm ñöôïc saûn xuaát haøng naêm, tuy nhieân noù vaãn ñoùng vai troø raát quan troïng trong vieäc ñieàu trò beänh. Lieäu phaùp chöõa beänh duøng peptide coù moät tieàm naêng raát lôùn, noù coù theå öùng duïng trong caùc vaán ñeà: huyeát aùp, thaàn kinh, taêng tröôûng, tieâu hoùa, sinh saûn, ñieàu hoøa söï trao ñoåi chaát trong cô theå…. Nhieàu peptide ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp hoùa hoïc coù ít hôn 40 amino acid. Phöông phaùp hoùa hoïc coå ñieån (tieán haønh phaûn öùng trong dung dòch) thích hôïp cho saûn xuaát nhöõng peptide coù ñoä daøi maïch ngaén cho tôùi trung bình, naêng suaát coù theå ñaït tôùi vaøi traêm kg cho tôùi vaøi taán/naêm. Nhieàu hormone vaø ñaëc bieät laø caùc polypeptide döôïc phaåm coù nhieàu hôn 40 amino acid trong maïch coù theå ñöôïc saûn xuaát nhôø kyõ thuaät taùi toå hôïp. Insulin cuûa ngöôøi, hormone taêng tröôûng cho ngöôøi, corticotropin (ACTH), relaxin, somatostatin, renin, corticoliberin, atrial natriuretic peptide, -endorphin, cholecystokinin, chorionic gonadotropin, vaø follicle-stimulating hormone laø nhöõng ví duï veà peptide coù theå ñöôïc toång hôïp baèng kyõ thuaät taùi toå hôïp. Tuy nhieân, hieän nay chuùng vaãn chöa ñöôïc saûn xuaát thöông maïi. Insulin laø moät trong nhöõng döôïc phaåm sinh hoïc ñaàu tieân, hieän nay noù ñöôïc baùn khoaûng 2000 kg/naêm. Insulin taùi toå hôïp ñaàu tieân ñöôïc toång hôïp bôûi Eli Lilly (thuoäc Huminsulin®) naêm 1982. Khaùi nieäm chung veà hoocmon Hoocmon laø caùc chaát ñöôïc toång hôïp vôùi lieàu löôïng raát nhoû nhöng coù hoaït tính sinh hoïc cao vaø mang tính ñaëc hieäu. Trong cô theå, caùc hoocmon ñöôïc toång hôïp vaø ñoå tröïc tieáp vaøo maùu nhöng moãi loaïi hoocmon chæ coù taùc duïng ñaëc hieäu vôùi moät cô quan, moät chöùc naêng hay moät quaê trình sinh hoïc nhaát ñònh cuûa cô theå. Ví duï: hoocmon kích thích noaõn hoaøng coù taùc duïng kích thích quaù trình phaùt trieån vaø chín noaõn baøo; hoocmon LH kích thích ruïng tröùng; hoocmon parahooocmon cuûa tuyeán caän giaùp taùc duïng leân quaù trình trao ñoåi phospho vaø canxi; hoocmon hGH coù taùc duïng ñieàu hoøa quaù trình sinh tröôûng. Trong cô theå, moät soá hoocmon ñöôïc taïo ra ôû daïng ñaõ hoaøn chænh. Tuy nhieân, moät soá hoocmon laïi ñöôïc hình thaønh qua nhieàu giai ñoaïn. Ví duï preproinsulin ® proinsulin ® insulin. Caùc hoocmon coù tính chaát ña daïng veà caáu truùc hoùa truùc hoùa hoïc, nôi phaùt sinh vaø baûn chaát. Döïa vaøo baûn chaát cuûa hoocmon, ngöôøi ta chia hoocmon ra laøm 2 nhoùm: Caùc hoocmon coù baûn chaât laø lipit coøn ñöôïc goïi laø steroid nhö cortison ñöôïc tieát töø tuyeán treân thaän, testosteron ñöôïc tieát ra töø tinh hoaøn vaø oestrogen ñöôïc tieát töø buoàng tröùng. Caùc hoocmon coù baûn chaát laø protein. Trong nhoùm naøy ña daïng veà caáu truùc vaø nôi phaùt sinh nhö: Caùc hoocmon laø caùc chuoãi peptit ngaén nhö oxytocin ñöôïc tieát ra töø teá baøo thaàn kinh cuûa tuyeán hypothalamus, sau ñoù ñöôïc tích tuï ôû thuøy sau tuyeán yeân, hoocmon naøy chæ laø nhöõng peptit ngaén khoaûng 9 amino axit. Caùc hoocmon coù caáu truùc goàm nhieàu chuoãi polypeptit daøi nhö insulin tieát ra töø tuyeán tuïy goàm 2 loaïi chuoãi: 1 chuoãi coù 21 amino axit vaø 1 chuoãi goàm 30 amino axit. Hoocmon sinh tröôûng coù khoái löôïng phaân töû lôùn vaø thay ñoåi tuøy loaøi ñoäng vaät. Haàu heát caùc hoocmon khoâng mang tính ñaëc tröng cho loaøi, nghóa laø hoocmon cuûa loaøi ñoäng vaät naøy cuõng coù theå gaây taùc duïng vôùi loaøi ñoäng vaät khaùc, keå caû ñoái vôùi ngöôøi Toång hôïp peptit – hoocmon baèng coâng ngheä di truyeàn Caùc peptit – hoocmon ñöôïc toång hôïp trong cô theå ñoäng vaät. Vôùi söï phaùt trieån cuûa coâng ngheä gen, ngöôøi ta coù theå töï toång hôïp ñöôïc nhieàu loaïi hoocmon coù hoaït tính sinh hoïc töông töï hoocmon töï nhieân. Saûn xuaát insulin: Insulin laø hoocmon ñieàu chænh quaù trình ñoàng hoùa ñöôøng trong cô theå ngöôøi. Söï thieáu huït hoocmon naøy seõ phaùt sinh beänh tieåu ñöôøng. Insulin duøng ñeå chöõa beänh cho ngöôøi maéc beänh tieåu ñöôøng. Naêm 1955, ngöôøi ta ñaõ xaùc ñònh ñöôïc trình töï caùc amino axit cuûa insulin. Phaân töû insulin goàm 2 chuoãi polypeptit: chuoãi A goàm 21 amino axit vaø chuoãi B goàm 30 amino axit. Phaân töû pre-proinsulin noái vôùi nhau baèng 3 caàu lieân keát disulfid. Sau khi caét boû ñoaïn peptit tín hieäu goàm 24 amino axit cuûa phaân töû preproinsulin seõ taïo thaønh phaân töû proinsulin. Phaân töû proinsulin laïi caét boû 35 amino axit ôû ñoaïn giöõa (ñoaïn C) vaø hình thaønh lieân keát disulfur giöõa 2 chuoãi A vaø B ñeå taïo thaønh phaân töû insulin hoaøn chænh Naêm 1987, laàn ñaàu tieân insulin ñöôïc toång hôïp baèng coâng ngheä di truyeàn nhôø vi khuaån E. coli. Saûn phaåm insulin saûn xuaát baèng coâng ngheä di truyeàn coù giaù trò trong vieäc chöõa beänh tieåu ñöôøng cho ngöôøi vaø ñöôïc baùn phoå bieán treân thò tröôøng. Quaù trình saûn xuaát insulin nhaân taïo coù theå toùm taét nhö sau: Ñaàu tieân ngöôøi ta toång hôïp nhaân taïo 2 ñoaïn DNA maõ hoùa cho 2 chuoãi polypeptit A vaø B Gaén moãi ñoaïn DNA treân vaøo plasmid pBR322 ôû ñoaïn cuoái cuûa gen lacZ. Moãi vector taùi toå hôïp ñöôïc bieán naïp vaøo moät doøng vi khuaån E.coli toång hôïp neân chuoãi polypeptit b-gal – chuoãi A, moät doøng E.coli khaùc toång hôïp chuoãi polypeptit b-gal – chuoãi B. Taùch rieâng 2 chuoãi polypeptit A vaø B baèng kyõ thuaät ñaëc tröng. Keát hôïp 2 chuoãi naøy vôùi phaûn öùng thích hôïp ñeå taïo caùc lieân keát disulfur, taïo neân phaân töû insulin coù khaû naêng chöõa beänh tieåu ñöôøng. Saûn xuaát hoocmon sinh tröôûng ngöôøi: Hoocmon sinh tröôûng ngöôøi (hGH) trong coû theå ñöôïc toång hôïp ôû tuyeán yeân. Hoocmon sinh tröôûng ngöôøi goàm coù 191 amino axit coù taùc duïng laøm cho tre em phaùt trieån bình thöôøng. Söï thieáu huït hoocmon naøy laøm treû em phaùt trieån coøi coïc . Quaù trình saûn xuaát hoocmon sinh tröôûng ngöôøi baèng coâng ngheä di truyeàn coù theå toùm taét nhö sau: Taùch chieát mARN cuûa gen hGH töø caùc teá baøo tuyeán yeân ñang hoaït ñoäng. Toång hôïp phaân töû DNA boå sung (cDNA) nhôø coù enzym phieân maõ ngöôïc vaø caùc enzym DNA-polymerase. Söû duïng 2 loaïi enzym giôùi haïn E.coRI vaø HinIII caét cDNA vaø loaïi boû ñoaïn DNA ñieàu khieån peptit tín hieäu. Taïo ñoaïn DNA môùi maõ hoùa 24 amino axit vaø gaén ñoaïn DNA naøy vaøo cDNA ñeå taïo ra gen maõ hoùa hGH. Taïo ra plasmid taùi toå hôïp baèng caùch gaén gen maõ hoùa hGH vôùi plasmid pBR322. Bieán naïp plasmid taùi toå hôïp treân vaøo vi khuaån E.coli. nuoâi caáy E.coli sau khi ñöôïc bieán naïp ñeå taïo thaønh sinh khoái roài taùch chieát, tinh saïch hGH ñeå taïo saûn phaåm hoocmon sinh tröôûng ngöôøi. Saûn xuaát hoocmon somatostatin baèng coâng ngheä di truyeàn: Somatostatin laø peptit hoocmon ngaén goàm coù 14 amino axit, ñöôïc toång hôïp töø vuøng döôùi ñoài cuûa naõo, coù taùc duïng öùc cheá söï giaûi phoùng hGH, öùc cheá toång hoïp insulin, öùc cheá tieát axit ôû daï daøy, coù taùc duïng haï thaân nhieät… Coù theå saûn xuaát somatostatin baèng coâng ngheä di truyeàn theo caùc böôùc chuû yeáu sau: Toång hôïp hoùa hoïc ñoaïn maïch ñôn DNA goàm coù 51 nucleotit coù trình töï laø TAC – 42 nucleotit (maõ hoùa somatostatin) – ACTATC. Phieân maõ ñeå taïo mADN töông öùng coù trình töï boå sung töông öùng laø AUG – 42 ribonucleotit – UGAUAG. Toång hôïp DNA boå sung (cDNA) töông öùng baèng phaûn öùng phieân maõ ngöôïc nhôø enzym phieân maõ ngöôïc vaø DNA polymerase. Bieán ñoåi plasmid pBR322 ñeå coù promotor Lac vaø moät phaàn cuûa gen lacZ. Trong ñoù gen lacZ coù phaàn maõ hoùa enzym b-galactosidase. Gaén keát cDNA vôùi vector plasmid pBR322 ñaõ bò bieán ñoåi ñeå taïo vector taùi toå hôïp. Bieán naïp vector taùi toå hôïp vaøo teá baøo chuû E.coli. Gen toång hôïp somatostatin ñöôïc bieåu hieän trong sinh khoái teá baøo chuû. Taùch chieát, tinh cheá vaø xöû lyù ñeå thu somatostatin. Somatostatin ngoaøi taùc duïng nhö teân, noù coøn coù hoaït ñoäng ñeán heä thaàn kinh, gaây voâ caûm. Neáu vôùi soá löôïng lôùn quaù möùc caàn thieát, somatostatin coøn gaây ñoäng kinh, chaäm lôùn. Do vaäy, ngöôøi ta ñaõ coá gaéng gaây mieãn dòch choáng laïi somatostatin nhaèm laøm taêng möùc ñoä sinh tröôûng cuûa vaät nuoâi vaø ngay caû vôùi con ngöôøi. Thöïc phaåm Nhö caùc chöông tröôùc ñaõ noùi, caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù nguoàn goác töø thöïc phaåm (ñaëc bieät laø söõa vaø ñaäu naønh) cho thaáy nhieàu chöùc naêng ñaùng chuù yù nhö: laøm giaûm huyeát aùp, aûnh höôûng ñeán heä thaàn kinh (laøm giaûm caêng thaúng, deã nguû…), vaän chuyeån khoaùng trong cô theå, taêng cöôøng heä mieãn dòch (choáng vi sinh vaät, choáng ung thö…), choáng ñoâng maùu…. Do nhöõng tính chaát naøy maø ngöôøi ta ñaõ tieán haønh saûn xuaát nhöõng thöïc phaåm giaøu peptide coù hoaït tính sinh hoïc ôû qui moâ coâng nghieäp, ta coù theå xem ñaây laø nhöõng thöïc phaåm chöùc naêng. Moät soá phöông phaùp ñeå saûn xuaát caùc saûn phaåm naøy: Thuûy phaân caùc thaønh phaàn trong nguyeân lieäu. Leân men, lôïi duïng enzyme cuûa vi sinh vaät ñeå thuûy phaân caùc thaønh phaàn trong nguyeân lieäu. Ñoái vôùi moät soá nguyeân lieäu ñaõ coù saün caùc peptide (nhöng haøm löôïng nhoû), ngöôøi ta seõ tieán haønh moät soá böôùc ñeå laøm giaøu caùc peptide naøy (nhö saûn phaåm cuûa CAPOLAC®): ví duï nhö sieâu loïc, keát tuûa caùc thaønh phaàn khaùc, loïc taùch, coâ ñaëc, saáy phun. Baûng 6.1: Moät soá saûn phaåm töø söõa treân thò tröôøng coù caùc tính chaát coù lôïi cho söùc khoûe döïa vaøo tính chaát cuûa peptide coù hoaït tính sinh hoïc Teân saûn phaåm Loaïi saûn phaåm, caùch thu nhaän saûn phaåm Peptide coù hoaït tính sinh hoïc Chöùc naêng coù lôïi Nhaø saûn xuaát Calpis Söõa chua Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, Coù töø -casein vaø -casein Giaûm huyeát aùp Calpis Co., Japan Evolus Söõa leân men uoáng giaøu Ca. Leân men nhôø vi khuaån L. helveticus Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro, Coù töø -casein vaø -casein Giaûm huyeát aùp Valio Oy, Finland Biozate Saûn phaåm thuûy phaân whey protein isolate Söû duïng enzyme thuûy phaâm Caùc ñoaïn cuûa -lactoglobulin Giaûm huyeát aùp Davisco, USA BioPURE-GMP Whey protein isolate Coù ñöôïc töø whey trong quaù trình saûn xuaát phoâ mai. Saûn phaåm chöùa toái thieåu 90% -casein (ñoaïn 106-109) (glycomacropeptide) Ngöøa saâu raêng, aûnh höôûng tôùi söï ñoâng maùu, baûo veä cô theå khoûi virus vaø vi khuaån Davisco, USA PRODIET F200/Lactium Söõa uoáng, vi bao -casein f (91–100) (Tyr- Leu-Gly Tyr-Leu-Glu-Gln- Leu-Leu-Arg) Giaûm stress Ingredia, France Festivo Phoâmai cöùng ít beùo -casein ñoaïn (1–9), -casein ñoaïn (1–7), -casein ñoaïn (1–6) Chöa coâng boá MTT Agrifood Research Finland Cysteine Peptide Saûn phaåm thuûy phaân vaø caùc thaønh phaàn cuûa söõa. Peptide töø protein söõa Giuùp deã nguû Taêng cöôøng söï tieát glutathione DMV International, the Netherlands C12 Saûn phaåm thuûy phaân vaø caùc thaønh phaàn Peptide töø casein Giaûm huyeát aùp DMV International, the Netherlands Capolac Thaønh phaàn cuûa söõa. Söõa gaày à sieâu loïc à keát tuûa à loïc à coâ ñaëc à saáy phun à ñoùng goùi. Caseinophosphopeptide Taêng haáp thu khoaùng Arla Foods Ingredients, Sweden PeptoPro Saûn phaåm thuûy phaân vaø caùc thaønh phaàn Peptide töø casein Cô baép nhanh choùng phuïc hoài khoûi meät moûi DMV International, the Netherlands Vivinal Alpha Saûn phaåm thuûy phaân vaø caùc thaønh phaàn Peptide töø huyeát thanh söõa Deã nguû, thö giaõn. Borculo Domo Ingredients (BDI), the Netherlands Hình 6.1: Saûn phaåm söõa leân men chöùa peptide coù hoaït tính sinh hoïc cuûa Evolus®. Taøi lieäu tham khaûo Hoà Huyønh Thuøy Döông, Sinh hoïc phaân töû, NXB Giaùo Duïc, 2003. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä enzyme, NXB Ñaïi Hoïc Quoác Gia TPHCM, 2004. Phaïm Thaønh Hoå, Di truyeàn hoïc, NXB Giaùo Duïc, 2006. Anne-marie Fiat, Biologically Active Peptides from Milk Proteins with Emphasis on Two Examples Concerning Antithrombotic and lmmunomodulating Activities, J. Dairy Sci. Vol 76, 1993, 301-303. A. Quiroùs, B. Hernaùndez-Ledesma, Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitory Activity of Peptides Derived from Caprine Kefir, J. Dairy Sci. Vol 88, 2005, 3480-3487. Bernard F. Gibbs, Production and characterization of bioactive peptides from soy hydrolysate and soy-fermented food, Food Research International ,Vol 37, 2004, 123-131. Bianca Sparatore, Extracellular processing of amphoterin generates a peptide active on erythroleukaemia cell differentiation, Biochem. J. 357, 2001, 569-574. C. G. Rizzell, Antibacterial Activities of Peptides from the Water-Soluble Extracts of Italian Cheese Varieties, J. Dairy Sci. Vol 88, 2005, 2348-2360. Charles W.Hilton, Food Contains the Bioactive Peptide, Cyclo(His-Pro), Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1992, 375-378. D. A. Clare, Bioactive Milk Peptides: A Prospectus, J Dairy Sci 83, 2004, 1187-1195. P.F.Fox vaø P.L.H.Mc Sweeney, Dairy chemistry and biochemistry, Blackie Academic & Professional, 1998, 461p. Emily Haque vaø Rattan Chand, Milk Protein Derived Bioactive Peptides, Haryana, India, 2005, 203-211. G. Debry, Dietary proteins and atherosclerosis, CRC Press, Boca Raton, 2004, 343p. G. S. Lvi, G. C. Huo, vaø X. Y. Fu, Expression of Milk-Derived Antihypertensive Peptide in Escherichia coli, J. Dairy Sci. 86, 2003, 1927-1931. Hannu Korhonen, Bioactive peptides: Production and functionality, International Dairy Journal 16 ,2006, 945-960. Hans Meisel, Overview on milk protein-derived peptides, International Dairy Journal Vol 8, 1998, 363-373. H. Korhonen, Functionality of Bovine Whey Proteins and Their Enzymatic Hydrolysates with Special Reference to Colostral Whey Proteins, Food Research Institute, Jokioinen, Finland, 1999. Ir. Vanessa Vermeirssen, Release and activity of ace inhibitory peptides from pea and whey protein:fermentation, in vitro digestion and transport, Academiejaar, 2003, 245p. KeShun Liu, Soybeans as Functional foods and Ingredients”, AOCS press, 2004, 333p. Kwok-YU Ng, Enhancement of macrophage cytokine productionby cell-free fractions of fermented milk, GueIph, 2000, 107p. M.A.F. Belem, Proposing Sequences for Peptides Derived from Whey Fermentation with Potential Bioactive Sites, J. Dairy Sci 82, 1999, 486-493. M. Gobbetti, Production of Angiotensin-I-Converting-Enzyme-Inhibitory Peptides in Fermented Milks Started by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 and Lactococcus lactis subsp. cremoris FT4, Applied And Environmental Microbiology, Vol 66, No.9, 2000, 3898-3904. Noble P.Wong, Fundamentals of dairy chemistry, Aspen Publishers, Inc. 1998, 763p. Norbert Sewald, Hans-Dieter Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, 2002, 543p. O.Park, Calcium Binding of Phosphopeptides Derived from Hydrolysis of -Casein or -Casein Using Immobilized Trypsin, J Dairy Sci 81, 1998, 2850-2857. P.F.Fox, Dairy chemistry and biochemistry, Blackie Academic & Professional, London, 1998, 461p. Reneù Floris, Bioactive peptides from milk, NIZO food research B.V, 2004, 106p. Ruth S.Macdonald, A Cell Culture Model to Identify Biologically Active Peptides Generated by Bacterial Hydrolysis of Casein, J Dairy Sci 77, 1994, 1167-1175. R. Y. Yada, Proteins in food processing, CRC Press LLC, 2004, 643p. S. F. Gauthier vaø Y. Pouliot, Functional and Biological Properties of Peptides Obtained by Enzymatic Hydrolysis of Whey Proteins, J Dairy Sci 86, 2003, 78-87. Sari Repka, Effects of Phosphate and Light on Growth of and Bioactive Peptide Production by the Cyanobacterium Anabaena Strain 90 and Its Anabaenopeptilide Mutant, Applied And Environmental Microbiology, Vol 70, No.8, 2004, 4551-4560. S. Mizuno, S. Nishimura, Release of Short and Proline-Rich Antihypertensive Peptides from Casein Hydrolysate with an Aspergillus oryzae Protease, J. Dairy Sci. 87, 2004, 3183-3188. S. S. Haileselassie, Purification and Identification of Potentially Bioactive Peptides from Enzyme-Modified Cheese, J Dairy Sci . 82, 1999, 1612–1617. T.Saito, T.Nakamura, H.Kitazawa, Isolation and Structural Analysis of Antihypertensive Peptides That Exist Naturally in Gouda Cheese, 2000 J Dairy Sci 83:1434–1440. Tung- Ching Lee vaø Chi-Tang Ho, Bioactive Compounds in Foods – Effects of Processing and Storage, American Chemical Society, Washington, DC, 2002, 260p. Wenyi Wang, Elvira Gonzalez de Mejia, A New Frontier in Soy Bioactive Peptides that May Prevent Age-related Chronic Diseases , Vol. 4—Comprehensive Reviews In Food Science And Food Safety, Institute of Food Technologists, 2005, 63-78. Xiao-Yu Hu, Peptides-Biology and Chemistry, Kluwer Academic Publishers, 1998, 285p. Yasutsugu Shimonishi, Peptide science – present and future, Kluwer Academic Publishers, 2002, 832p. www.bioZate.com 41. Trònh Ñình Ñaït, Coâng ngheä Sinh hoïc – Taäp 4 “Coâng ngheä Di truyeàn”, NXB Giaùo duïc.