Đề tài Ứng dụng Chitosan trong chế biến và bảo quản rau quả

MUÏC LUÏC I. Giới thiệu chung về Chitosan: 1. Giới thiệu sơ lược về Chitin: Chitin là một polysacharide xuất hiện nhiều thứ hai trong thiên nhiên chỉ sau cellulose, sản phẩm thương mại thường ở dạng rắn. Chitin có mặt trong vỏ các loại giáp xác (tôm, cua…), nhuyễn thể (sò, ốc…), bộ cánh cứng của côn trùng, màng tế bào nấm thuộc họ Zygemycetes, có trong sinh khối nấm mốc và một vài loại tảo. Chitin có tên khoa học là: poly[-b (1-4) -2 –acetamido -2-deoxy-D-glycopyranose]. Công thức cấu tạo của Chitin: Hình 1: Cấu trúc của Chitin Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, khi thay C(2) – nhóm hydroxyl của cellulose bằng C(2)–acetamido ta sẽ Chitin. Æ Cấu trúc mạng tinh thể của Chitin: Chitin tồn tại ở 3 dạng polymorphic. Hướng sắp xếp của các mạch thay đổi hình thành 3 dạng cấu trúc a, b, g a - Chitin: b- Chitin: g- Chitin: Dạng a - Chitin là bền nhầt và phổ biến nhất. Từ b, g- Chitin có thể chuyển hóa về dạng a - Chitin a. fomic b- Chitin a - Chitin Dd HCl 6M nguội Dd LiSCN bão hòa g- Chitin a - Chitin Dạng b, g đều bền trong NaOH 1.25M, HCl 1.25M. a - Chitin có nhiều ở phần cứng vỏ động vật. b, g- Chitin có nhiều ở vùng mềm và dai của động vật. Trong tự nhiên, dạng liên kết của Chitin thường là phức với protein và polysaccharic. Liên kết Protein-Chitin được gọi là “ Coralent”. Chitin thường không tồn tại trong thiên nhiên như một chất riêng biệt mà xuất hiện dưới dạng phức chất với nhiều chất khác như protein, polysaccharic (kể cả cellulose). Chitin tinh khiết chỉ có trong vỏ gai (extracellular spine) của những loài khúc tảo, còn lại là trong phòng thí nghiệm sau quá trình xử lý để lọai các thành phần khác. Thực tế ta chỉ khảo sát được Chitin dưới dạng hợp chất có chứa Chitin. Ngay cả khi dùng Chitin đã được làm sạch người ta vẫn không xem nó là một đơn chất vì các mạch polime sẽ chứa một phần 2-amino-2-deoxy-D-glycopyranose và một lượng đáng kể 2-acetamido-2-deoxy-D-glycopyranose. Chitin không hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thường nên khả năng ứng dụng bị hạn chế. Do đó người ta thực hiện quá trình deacetyl hóa Chitin để tạo ra sản phẩm Chitosan nhằm cải thiện độ hòa tan, tăng khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. 2. Chitosan: Ø Chitosan có tên khoa học: poly[b- (1-4) -2 - amido -2-deoxy-D-glycopyranose]. Ø Công thức phân tử: (C6H11NO4)n Ø Trọng lượng phân tử trung bình: 10000 – 50000 dalton Hình 2: Cấu trúc của Chitosan à Chitosan là sản phẩm biến tính của Chitin, được tạo thành bằng cách loại các nhóm acetyl từ phân tử Chitin (quá trình deacetyl). Tách nhóm acetyl Chitosan thương phẩm đã khử 80-85% nhóm acetyl (DD=80-85%) Ø Những tính chất chung của Chitosan thương phẩm: Chitosan Hình 3: Chitosan thương phẩm + Kích thước hạt: 1-3 mm + Trọng lượng riêng biểu kiến: 0.15-0.05 + Độ ẩm: 10% + Phần hòa tan trong kiềm và tro: 5% + Màu dung dịch: trắng hơi vàng + Trọng lượng phân tử: 1,6.105 – 3.105 g/mol + Hàm lượng amin: 7-10% a. Tính chất vật lý: Chitosan thương phẩm có dạng vảy rắn, màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị. Nhiệt độ nóng chảy: 309-311oC Ø Cấu trúc vật lý: Cấu trúc của Chitosan thay đổi tùy thuộc cấu trúc của Chitin nguyên liệu và phương pháp điều chế. Sự khác nhau trong cách sắp xếp các mạch polime trong Chitin sẽ dẫn đến sự khác nhau tương ứng trong Chitosan. Song người ta cho rằng trạng thái bền vững nhất của Chitosan tinh chế là một trong những cấu trúc tinh thể đúng của Chitosan. Kết quả phân tích những sản phẩm thu được bằng cách nấu chảy Chitin trong KOH ở 180oC và bằng cách xử lý với dd NaOH đậm đặc cho thấy là như nhau. Ø Tính tan: Chitosan là một base tạo được các muối với acid do đó hình thành các polyelectrolyte mà tính tan phụ thuộc vào bản chất của những amino liên quan. Thường thì acid được cho vào Chitosan đang ngâm nước để tạo thành muối và sự hòa tan tự xảy ra đồng thời. Ví dụ để có dd 1% thì dùng 1,0g Chitosan trong 50ml nước và cho tiếp thêm 50ml dd acid 2%. Tính tan của Chitosan trong các dung môi khác nhau như sau: + Trong acid vô cơ: Chitosan tan được trong HCl, HBr, HI, HNO3 và HclO4 lõang nhưng cũng có thể tạo tủa tách riêng được trong dd HCl hoặc HBr khi tăng nồng độ acid. Chitosan cũng hòa tan được trong H2SO4 ở nhiệt độ phòng. Trong acid H2SO4 đậm đặc, sự hòa tan xảy ra song song với sự sulphat hóa và thủy phân Chitin. + Trong các acid hữu cơ: Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ. Những muối monocarboxylic acid lên đến hecxanoic dễ dàng hòa tan trong nước khi hình thành với maloic acid đến nonane dioic acid dều hòa tan được trong nước. Những nghiên cứu về muối của Chitosan và các acid aromatic carboxylic cũng cho thấy khả năng tan được trong nước như Chitosan benzoate, Chitosan o-amino benzoate (Chitosan anthranilate), Chitosan p-amino benzoate và cũng có một số muối không tan hoặc ít tan trong nước như Chitosan phenylacetate… Còn muối của Chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong nước. + Trong những dung môi hữu cơ: Chitosan hòa tan một cách dễ dàng trong hỗn hợp DMF-N2O4 với tỷ lệ N2O4 : Chitosan =3:1 cho những dd có độ nhớt thấp và không xảy ra một biến đổi hóa học nào của Chitosan. Đây là dung môi hữu cơ được nghiên cứu đến. Ø Tính tương hợp với các dung môi: Dung dịch Chitosan trong dung dịch acid acetic có thể tạo một thể thống nhất với các dung môi phân cực mà không gây ra sự tạo tủa Chitosan. Dung dịch acid acetic-Chitosan có tính tương hợp tốt với rượu như metanol, propanol, butanol, ethylen glycol, diethylene glycol, aceton, glycol formamide. Những dung dịch acid của Chitosan đều hòa lẫn được với các lọai nhựa tan trong nước không ion, hồ, dextrin, glucose, saccharose, các glycol, sorbitol và các lọai dầu mỡ, các parafin, hydrocloric, nitric, formic, citric, và acid lactic nhưng không hòa tan trong acid sulfuric và các sulphate. Ø Bản chất điện ly cao phân tử của Chitosan trong dung dịch acid: Trong dung dịch acid, những nhóm amin của Chitosan bị proton hóa và thể hiện bản chất của chất điện ly cao phân tử. Trong dung dịch lõang không có mặt chất điện ly, chỉ số độ nhớt tăng theo sự tăng nồng độ dung dịch Chitosan. Đây là đặc trưng của những dung dịch chất điện ly cao phân tử và là kết quả của sự tăng kích thước sợi khi pha lõang dung dịch do lực đẩy tĩnh điện giữa các đọan mạch. Lực đẩy này có thể bị khử mất bằng cách thêm một chất điện ly trọng lượng phân tử thấp có tác dụng che những phần mang điện trên mặt polymer. Và đồng thời, chỉ số độ nhớt cũng giảm theo nồng độ Chitosan cho trước. Ø Cấu tạo và kích thước phân tử của những mạch Chitosan trong dung dịch acid: Mạch sẽ mềm dẻo khi tăng sức căng ionic của dung dịch vì lực đẩy tĩnh điện giữa các mạch giảm. Độ dài bền vững phụ thuộc vào sức căng ionic của chất trung gian và mức độ ion hóa. Tính mềm dẻo của mạch tăng theo mức độ deacetyl hóa vì khi đó giảm sự tạo liên kết hydrogen trong phân tử giữa nhóm C(6)-OH và C(2)-NHCOCH3. Tính ổn định của mạch sẽ giảm khi tăng sự deacetyl hóa và tăng theo sự tăng nhiệt độ. Trong dung dịch Chitosan tồn tại những glycan b-(1- 4) và có cấu tạo xoắn ngẫu nhiên. Bảng 1: Kích thước phân tử Chitosan trong dung dịch acid Dung dịch acid Độ dài (Ao) CH3COOH 0,33M – NaCl 0,3M 30-230 CH3COOH 0,167M – NaCl 0,46M 73 CH3COOH 0,2M – NaCl 0,1M – Ure 4M 122 b. Tính chất hóa học của Chitosan: Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích D-glucozamin, do đó nó có thể tham gia các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chức, tạo ra các dẫn xuất thế. Mặt khác chitosan là một polime mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glucoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: axit, bazơ, tác nhân oxy-hóa và các enzim thuỷ phân. Hình 4: Cấu trúc của Chitosan Ø Tính acid bazơ: Chitosan là một bazơ. Hằng số Kb của nhóm amin thu được từ phương trình: -NH2 + H2O -NH3+ + OH- Kb = Và pKb = -logKb Trong khi đó hằng số acid liên hợp thu được từ cân bằng : -NH3+ + H2O -NH2 + H3O+ Ka = Và pKa = -logKa pKa của Chitosan phụ thuộc vào mật độ điện tích của polime và mức độ deacetyl hóa. Giá trị pKa có thể thay đổi từ 6,0 đến 6,8. Ø Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp: Trong phân tử Chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxi và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+,Ni2+,Co2+... Tuỳ nhóm chức trên mạch polime mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau. Trong đó là mạng polime. Hình 5: Phức Ni(II) chitosan Sự tạo phức giữa Chitosan và ion kim loại xảy ra chủ yếu nhờ những nhóm amin đóng vai trò ligant. Do đó mức độ deacetyl hóa Chitosan và nồng độ của những nhóm amin linh động có ảnh hưởng lớn đến mức độ tạo phức. Kết quả thực nghiệm cho thấy mức độ hấp phụ những ion chuyển tiếp ở pH7 bởi các dung dịch Chitosan có mức độ deacetyl hóa khác nhau sẽ khác nhau như sau: Bảng 2: Mức độ hấp thu kim loại của Chitosan Chất nền Mức độ hấp phụ của ion kim loại x 103 mol.g -1 Ni (II) Cu (II) Zn (II) Cd (II) Chitosan [0.55] 3,5 5,3 5,5 6,5 Chitosan [0.03] 2,3 4,8 3,2 4,9 Kết quả cho thấy dung dịch Chitosan có mức độ deacetyl hóa cao ([0.55]) thì mức độ hấp phụ các ion kim loại sẽ cao và mức độ này tùy thuộc vào từng loại kim loại. Ø Phản ứng thủy phân trong môi trường acid: Trong môi trường acid Chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân phụ thuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng. Những kết quả cho thấy : Trong môi trường H2SO4, sự thủy phân Chitosan kèm theo quá trình N-Sulphate hóa, cho sự phân hóa ngẫu nhiên các mạch phân tử Trong môi trường HF, Chitosan cũng bị thủy phân nhưng kém hơn Chitin, tạo thành hỗn hợp các Oligome sau 19h ở 20oC. Trong các môi trường acid khác như HCl, H3PO4…, Sự thủy phân cũng xảy ra ở những mức khác nhau Sự thủy phân Chitosan trong môi trường acid được ứng dụng để điều chế Chitosan vi tinh thể. Ø Phản ứng deamin hóa: Dưới tác dụng của acid nitric, nhóm amin của Chitosan sẽ bị khử. Vận tốc của quá trình có thể tính như sau: W = Kcf.[H2NO2+].[-NH2] Trong đó Kcf là hằng số tốc độ cơ bản. Ø Phản ứng nitro hóa: Cho Chitosan tác dụng với HNO3 trong hỗn hợp của các loại: glacial acetic acid : acetic anhydric : acid nitric nguyên chất với tỷ lệ:1:1:1,3 trong 5,5h ở nhiệt độ [ 5oC,sau đó trung hòa bằng dung dịch kiềm loãng. Sản phẩm thu được là muối acid của Chitosan nitrat. Ø Phản ứng sulphate hóa: Cho Chitosan tác dụng với hỗn hợp H2SO4 95% và ClSO3H 98% ở nồng độ từ 0-4oC, tỉ lệ 1:2 trong 1h, cho sản phẩm ở dạng Zwitter ionic (là liên kết tĩnh điện giữa C(6)OSO3- và NH3+C(2) trong phân tử) làm tăng tính cứng của chuỗi. Sản phẩm có dạng: Ø Phản ứng N-acyl hóa: Ta có thể acyl hóa Chitosan bằng các Carboxylic acid, chẳng hạn như formyl hóa Chitosan bằng cách đun Chitosan trong HCHO 100% ở 90oC. Trong những trường hợp khác người ta thường cho Chitosan phản ứng với các carboxylic anhydric trong môi trường là hệ dung môi đồng tướng: CH3COOH 10% vol – Methanol; hoặc hệ: acid acetic : H2O : Methanol tỉ lệ 1 : 9 : 40 Chitosan phản ứng với RCOOH tạo: Ngoài ra Chitosan còn có thể tạo các bazo shiff, do tác dụng với các andehyde mạch thẳng hay vòng tạo các dẫn xuất N-alkylidene Chitosan và N- arylidene Chitosan gel. c. Phương pháp khảo sát phản ứng định tính chitosan: Để kiểm tra một chất có phải là chitosan hay không, người ta có thể sử dụng phản ứng với Kali Bicromat như sau: + Cho 1ml dung dịch Kali Bicromat 5% vào 10ml dung dịch chitosan 0.5% trong dung dịch acid acetic 1% + Nếu có xuất hiện kết tủa màu vàng là có chitosan 3. Lĩnh vực ứng dụng: Hiện nay trên thế giới, Chitin và Chitosan đang ngày càng được sử dụng rộng rãi, nhất là ở các nước phát triển như châu Âu (48% sản lượng), Mỹ (31%), Nhật Bản (16%) và Hàn Quốc (5%). Việc sử dụng Chitin và Chitosan đã mang lại giá trị kinh tế to lớn. Hình 6: Tình hình sử dụng Chitin và Chitosan trên thế giới Chitin và Chitosan có thể dễ dàng bị vi khuẩn phân hủy, tức là chúng cũng thân thiện với môi trường hơn các loại polymer tổng hợp. Hiện nay Chitosan được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: y học, thực phẩm, nông nghiệp, môi trường… Ø Trong Y tế: nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bỏng, viêm loét dạ dày, hạ cholesterol, trị béo phì, giảm đau, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp và chống đựợc cả bệnh ung thư + Tác nhân hạ cholesterol: chitosan có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật. Người ta đã tiến hành thí nghiệm với thỏ và thấy khi được cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lượng cholesterol huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/ trên 1kg thể trọng. Trong trường hợp với khẩu phần ăn như trên nhưng có bổ sung 2% chitosan, lượng cholesterol huyết thanh giảm còn 300 mg/1kg thể trọng, trong khi đó lượng cholesterol có ích (HDL – cholesterol) giảm không đáng kể. Tuy nhiên khi tiêm chitosan-oligosaccharide vào thỏ thì không thấy hiện tượng giảm cholesterol, điều này cho thấy sự giảm cholesterol chỉ xảy ra trong ruột động vật. Và từ lâu, một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện, Chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ + Điều trị béo phì: khi vào đường tiêu hóa, chitosan có khả năng bao các hạt cầu béo và kéo chúng thải ra ngoài theo (động vật không tiêu hóa chitosan) nhờ đó được ứng dụng làm thuốc giảm béo. Nước ta hiện nay có thuốc Chitozan để giảm béo Hình 7: Khả năng kết hợp của Chitosan với chất béo + Các vật liệu y sinh học và dược phẩm: Chitin và chitosan có thể kết hợp sinh học với mô, cơ quan, tế bào,…và có thể được sử dụng trong việc cấy vào mô. Chitin và các dẫn xuất của nó có thể tiêu đi trong mô động thực vật, nhưng vẫn có thể dẫn đến gia tăng sự cảm ứng các protein bảo vệ sinh học gồm lysozyme và chitinase. Tốc độ thủy phân enzyme với chitin cũng được điều khiển bởi cấu trúc của một nhóm N-acetyl và dẫn xuất của nó. Do những tính chất đặc trưng này, chitin và các dẫn xuất được sử dụng như những vật liệu y sinh học hay vật liệu để bao gói các loại thuốc tan chậm. Hoạt độ lipoprotein lipase trong máu tăng lên khi tiêm N, O-sulfate chitosan và hoạt động miễn dịch được tăng cường khi cấy chitin N-deacetyl một phần vào mô động vật. Film chitosan bao thuốc (thấm qua được) cũng công dụng nhu các dang con nhộng thương phẩm và chitosan được sử dụng như vật liệu dùng để cấy giải phóng chậm các loại thuốc chống ung thư. Chitosan cũng được đưa vào công thức các loại thuốc uống, làm gia tăng sự hấp thu của thuốc vào máu + Vật liệu vá vết thương: Các vết thương ở mô động, thực vật có thể được bao bằng một tấm màng hay một miếng xốp chitin và chitosan, hoặc dạng bông, dạng bột mịn. Các vết thương cũng có thể được trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan. Kết quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thương được kích thích, chitinase và lysozyme được tăng cường, dẫn đến mau lành vết thương và hạn chế nhiễm trùng. Tại cuộc chiến Iraq vừa qua, Mỹ cũng đã sử dụng loại băng cứu thương kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo bởi chất Chitosan. So với các loại băng thường, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần. + Chất chống nghẽn mạch và chống đông máu: dẫn xuất N-octanoyl và N-hexanoyl của chitosan có chức năng chống nghẽn mạch, chitosan có chức năng cầm máu. Dẫn xuất sulfate hóa của chitin và chitosan có hoạt tính chống tụ máu. N, O-sulfate chitosan có hoạt tính chống đông tụ thấp hơn heparin nhưng O-oligosulfate chitin thì cao hơn mặc dù nó không có nhóm N-sulfate trong phân tử. Nhóm N-sulfate có vai trò quan trọng trong hoạt tính của heptarin. + Theo nghiên cứu của bệnh viện K Hà Nội trên 60 bệnh nhân ung thư đã cho thấy chitosan là một chất hỗ trợ điều trị tốt thông qua việc ngăn cản sự gia tăng của tế bào ung thư.  + Chữa bệnh khớp: Điển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang được thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng phụ, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh (điều này có ý nghĩa rất quan trọng). Nước Mỹ đã tiêu thụ được hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin. Những năm gần đây, loại thuốc chữa khớp này còn đựợc phổ cập rộng ở nhiều nước, trong đó có Việt Nam. Nước ta cũng có Glusivac đặc trị thoái hóa khớp Ø Trong Công nghiệp: xử lý nước thải và làm trong nước sinh hoạt + Chitosan cationit tạo các phức hợp đa điện ly với những polymer polyanionic và tạo phức hợp chelate với các ion kim loại để tạo kết tủa. Các phản ứng này được ứng dụng để làm trong nước thải ô nhiễm. Vào năm 1975, muối chitosan acetate lần đầu tiên được một công ty Nhật giới thiệu như một tác nhân cationit tự nhiên để đông tụ và loại các chất thải trong nước cống. Hiện nay hệ thống này vẫn còn được sử dụng để xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước thải (ví dụ nước hồ bơi), thu hồi các protein và khoáng từ nước thải công nghiệp, bao bọc các hạt béo, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nước tiểu và tách các chất độc nội bào từ dung dịch loãng. Chitosan cũng được sử dụng như một chất hấp phụ để tách các đồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước ô nhiễm và thu hồi uranium từ nước biển và nước ngọt Hình 8: Chitosan tạo phức chelate với kim loại trong xử lý nước thải Ø Trong nông nghiệp: + Làm phân bón rau sạch: Chitin và chitosan chủ yếu được bón ở dạng bột, dạng miếng hay dạng dung dịch vào đất nông nghiệp hay môi trường nuôi cấy lỏng. Ngoài ra dung dịch chitosan có thể được phun lên lá cây. + Xử lý hạt giống: hạt giống có thể được nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng hay bột mịn. Khi được bao phủ như vậy, hoạt động của chitinase của hạt được tăng cường trong giai đoạn nảy mầm. Sự tăng cường chitinase trong hạt sẽ làm gia tăng khả năng tự vệ sinh học của hạt qua việc nhiễm VSV, kết quả là làm cho cây trồng phát triển tốt. Ø Trong mỹ phẩm: nguyên liệu sản xuất kem dưỡng da, kem chống tia tử ngoại… + Kem dưỡng da: CM-chitin và HP-chitosan cationic hòa tan trong nước và bền trong một khoảng pH rộng, chúng được sử dụng như một thành phần của mỹ phẩm chăm sóc da. Chitosan, CM-chitosan, HP-chitosan có chức năng tạo độ ẩm cho da, ngăn cản sự hủy hoại cơ học tóc. Đặc tính giữ độ ẩm tương ứng với dung dịch propylenglycol 20% và dung dịch hyaluronic loãng. Những dẫn xuất trên của chitosan có thể ngăn chặn sự nhiễm khuẩn trên da và hoạt hóa tế bào da dẫn đến sự ngăn chặn sự lão hóa của da. Một số dẫn xuất Chitosan phức polyelectrolyte –based có tác dụng làm mềm da, kích thích phát triển da non, do đó được sử dụng như một chất phụ gia trong kem dưỡng da. + Dầu gội: Dẫn xuất Chitosan do phản ứng với hợp chất epoxy mạch dài có tính chất hoạt động bề mặt. Các dầu gội hiện nay đều sử dụng do có đặc tính tương hợp tốt với da đầu, ưu điểm hơn so với Lauryl-ether-sulfate dùng trong sản xuất dầu gội trước đây. Người ta điều chế bằng cách cho Chitosan phản ứng với 1,2 expoxytetradecane trong acid acetic 0.1M-methanol tạo sản phẩm có khả năng hoạt động bề mặt, làm giảm sức căng bề mặt, tạo tính ổn định bọt tốt, hoàn toàn không gây hại cho da. + Các muối hữu cơ của chitosan phân tử thấp hòa tan trong ethanol loãng và được sử dụng như một thành phần của keo xịt tóc. Ø Trong thực phẩm: hiện nay chitosan được sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm. Có thể sử dụng để thu hút nước và béo (quá trình nhũ hóa), quá trình đồng hóa, kết hợp với thuốc nhuộm, quá trình đông đặc. Chitosan cũng được chứng minh là có khả năng tạo dạng màng mỏng để sử dụng như là những lớp màng mỏng hoặc những lớp bao không độc hại (có thể ăn được). Màng bao Chitosan có thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lượng không khí bên trong bao gói cũng như giảm quá trình thoát hơi nước. Hình 9: Ứng dụng chitosan trong thực phẩm + Có thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khô, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trước khi làm kim chi… + Hoặc cũng có thể tạo thành màng trước rồi mới cho sản phẩm vào: bánh mì, xúc xích… + Hoặc cho chitosan trực tiếp vào sản phẩm dạng lỏng: xử lý nước quả, làm trong giấm, bảo quản tàu hũ, đồng hóa sữa, kem và mayonaise, bảo quản mì… Ø Trong một số lĩnh vực khác + Làm môi trường sắc ký và cố định: các loại gel N-methylen-chitosan và N-acyl-chitosan có thể được dùng như một môi trường hấp phụ trong môi trường hấp phụ trong việc cố định enzyme hay tế bào, hay cố định thuốc. Các hạt chitin và chitosan với các kích thước khác nhau đã được bán trên thị trường với công dụng hấp phụ các ion kim loại, ion uranium, kallikrein nước tiểu, urokinase và erythropoetin. Chitinase và lysozyme tạo thành phức hợp ES với một loạt các dẫn xuất “N-acyl béo thấp” của chitosan. Các dẫn xuất N-butyryl và N-hexanol kháng lại sự thủy phân các enzyme này và hình thành các phức hợp ES, điều này cho thấy các dẫn xuất này rất thích hợp với việc sử dụng như một chất hấp phụ tron sắc ký ái lực để phân lập và tinh sạch enzyme trên. + Hóa chất dùng trong phân tích: chitosan, HE-chitosan và methyl-chitosan phản ứng theo kiểu stoichiomdtrically (hóa học lượng pháp) với các chất keo polymer anionic trong dung dịch loãng để tạo thành kết tủa trung tính. Phản ứng này được ứng dụng trong phương pháp chuẩn độ chất keo và đã được sử dụng trong hóa phân tích. Chitin dạng keo, chitin tái tạo (N-acy chitosan) và dạng gel của nó, CM-chitin và HE-chitin được sử dụng như cơ chất của enzyme + Một số công ty đã giới thiệu sản phẩm sợi tổng hợp có bao chitin hay chitosan, vải đan tổng hợp tráng một lớp chitosan. Những sản phẩm này có khả năng giữ độ ẩm, kháng khuẩn kháng nấm. Chitin xanthate, alkaline chitin, N-acetylchitosan gels và chitosan được dùng như nguyên liệu sản xuất sợi, bông, film, xốp. II. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT CHITOSAN: Chitosan là sản phẩm Deacetyl hóa của Chitin. Chitin có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như từ tôm, cua, côn trùng có bộ cánh cứng, các loài giáp xác, nhuyễn thể (sò, ốc…), từ nấm…Đặc biệt trong vỏ tôm cua, hàm lượng Chitin cao, từ 10-15% nguyên liệu khô. Trong đó Chitin liên kết với Protein, các chất vô cơ mà chủ yếu là CaCO3 và các chất béo. Do đó cần phải loại các hợp chất này ra khỏi Chitin. Có 2 phương pháp để sản xuất Chitosan là sử dụng hóa chất và Enzym. Phương pháp dùng hóa chất rất đơn giản, ít chi phí đầu tư nhưng ảnh hưởng không tốt đến môi trường xung quanh. Ngược lại, phương pháp sử dụng enzym không làm ô nhiễm môi trường, song phức tạp và đòi hỏi chi phí đầu tư cao. Hiện nay trên thế giới, Chitosan phần lớn được sản xuất bằng hóa chất, phương pháp dùng enzym mới bước đầu đi vào ứng dụng ở một số nước.Theo thực tế nghiên cứu điều chế cho thấy ở nước ta chưa thể điều chế Chitin- Chitosan theo phương pháp sinh học, do các lý do sau: + Hiệu suất thu sản phẩm Chitosan rất thấp, mặc dù hoạt tính Enzym cao nhưng chỉ có một phần nhỏ Chitin tham gia phản ứng do độ tinh thể của vỏ cao, chỉ có những nhóm acetyl của Chitin nằm bên ngoài mới tiếp xúc được với Enzym. + Việc sản xuất Chitosan bằng Enzym sẽ thành công khi và chỉ khi Enzym được phá tinh thể trước khi cho phản ứng deacetyl hóa. Mà thực tế, vấn đề các phòng thí nghiệm trong nước chưa thực hiện được điều này do thiếu thiết bị máy móc. + Điều chế Chitosan theo phương pháp sinh học bằng cách sử dụng Enzym đòi hỏi phải có một nguồn cung cấp Enzym thường xuyên và ổn định hay một môi trường nuôi cấy Enzym thích hợp. Điều này trong nước vẫn chưa thực hiện được. Bên cạnh những bất lợi của phương pháp sinh học thì phương pháp hóa học lại tỏ ra có nhiều lợi điểm hơn: + Quy trình sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền. + Hoá chất sử dụng rẻ tiền. + Chất lượng sản phẩm cao hơn do có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao hơn. + Hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao. Tuy nhiên phương pháp hoá học cũng có những bất lợi cần quan tâm: + Vấn đề xử lý nước thải: phải xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường. + Vấn đề thu hồi hoá chất. + Điều kiệnlàm việc với hóa chất ( NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức –NH2. + Chưa có biện pháp tận thu Protein sau khi loại ra khỏi vỏ giáp xác. Bảng 3: Thành phần hóa học của vỏ các loại giáp xác Hình 10: Hiệu suất thu hồi Chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau Hình 11: Hàm lượng chitin trong 7 loài giáp xác Vỏ tôm,cua Loại Protein Tạp chất Dd NaOH 3.5% Dd HCl Loại muối khoáng (CaCO3) Tạp chất Dd NaOH 50% t=60-120oC Chitin Nước Rửa Deacetyl hóa Làm nguội Rửa Nghiền Bột Chitosan Hòa tan trong HCl Kết tủa chậm Kết tủa nhanh Vẩy Chitosan 50-60% Chitosan kết tủa mịn Chitosan dd keo Sấy Hình 12: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Chitosan Hình 13: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Chitosan C Cụ thể người ta tiến hành lần lượt các công đoạn sau: 1. Chuẩn bị: Làm sạch vỏ giáp xác: Phế liệu vỏ giáp xác được thu thập và đun sôi trong 1h để loại hết các mô. Vỏ tiếp tục được cho vào lò ở 163OC trong 1h, sau đó lấy ra, tách phần mô đã sấy khô còn sót lại trên vỏ, cọ rứa sạch lớp vỏ. Khử màu: Lớp vỏ cứng bên ngoài của loài giáp xác có chứa chất màu chủ yếu là Cardenoid. Thành phần chính là astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin và b - carotene. Chúng không xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô cơ cũng như protein, vì vậy khử protein và khử khoáng cũng không loại được Cardenoid. Tuy vậy có thể khử màu bằng chất trích màu như KmnO4, NaOCl, SO2, NaHSO3… Có thể bổ sung công đoạn ngâm vỏ trong dung dịch chất tẩy trắng loãng trước khi thực hiện quá trình đun sôi. Hình 14: Nghiền vỏ bằng cối và chày Làm nguội vỏ giáp xác: Vỏ sau khi đã làm sạch được đặt trong lò ở 80oC trong 48h để phá vỡ cấu trúc tinh thể của Chitin, nhằm chuyển hầu hết Chitin trong vỏ thành dạng vô định hình. Sau 48h, vỏ được lấy ra khỏi lò và đổ nhanh vào bể chứa Nitơ lỏng (-196oC) để làm nguội. Việc làm nguội nhanh sẽ hạn chế được sự tái hình thành tinh thể Chitin, làm chúng trở nên vô định hình hơn. Ngoài ra trong quá trình làm nguội, nhiệt độ của Nitơ lỏng còn làm cho vỏ trở nên rất giòn, dễ vỡ, giúp quá trình nghiền sau đó sẻ dễ dàng hơn. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy vỏ ra khỏi dd Nitơ lỏng, nghiền bằng cối và chày. Có thể thay dung dịch Nitơ lỏng bằng hỗn hợp methanol- nước đá khô. 2. Loại Protein: Protein được loại bằng cách nấu với NaOH, nhiệt độ 60-100oC. Gần đây các nghiên cứu mới được thực hiện với một khoảng rộng với các tác nhân như NaOH, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO4, NaHSO3, Ca(SO4)2, NaPO4, Na2S. Song NaOH vẫn được dùng thông dụng hơn. Tùy từng loại vỏ mà điều kiện xử lý có thể thay đổi về nồng độ NaOH, nhiệt độ hoặc thời gian. Với những loại vật liệu dễ khử protein, có thể dùng Na2CO3 0.1M ở khoảng 100oC trong 4h. Đối với vật liệu khó xử lý, có thể dùng NaOH 5M ở khoảng 100oC trong 4h. Tuy nhiên, hầu hết các quá trình khử thường dùng NaOH 1N với một khoảng nhiệt độ và thời gian xử lý (từ 65-100oC) trong vòng 0.5-7h. Tiến hành: Cho hỗn hợp vỏ đã làm nguội vào dd NaOH 3,5% (tỉ lệ 1:10 w/v) ở 65oC. Sau 2h lấy phần nổi lên trên, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 90oC. Người ta có thể định lượng xác định lượng protein tách ra từ vỏ tôm. 3. Loại muối khoáng: Để khử khoáng có thể dùng các tác nhân acid như HCl, HNO3, H2SO4, CH3COOH, HCOOH…, song người ta thường dùng HCl ở nhiệt độ phòng. Tùy tính chất nguyên liệu mà thay đổi nồng độ acid và thời gian xử lý cần thiết. Ngoài ra người ta cũng nghiên cứu quá trình khử EDTA ở pH kiềm. Nguyên liệu được xử lý bằng EDTA ở pH9 hoặc pH10, sau đó xử lý ở pH3 sẽ cho sản phẩm có khoảng 15% chất vô cơ chủ yếu là silicat. Hình 16: Loại muối khoáng bằng dd HCl Tiến hành: Vỏ tôm đã loại protein được cho vào dd HCl 1N (tỉ lệ 1:15 w/v) ở 25oC trong 2h ở nhiệt độ phòng. Sau 2h lấy phần vỏ nổi lên trên, rửa bằng nước cất, sấy ở 90oC. Vỏ tôm sau khi đã sấy khô chứa chủ yếu là Chitin. 4. Phản ứng deacetyl hóa: Phản ứng chính trong điều chế Chitosan là deacetyl hóa bằng dung dịch kiềm. Dungdịch phản ứng cần được gia nhiệt và khuấy trộn đều trong suốt thời gian phản ứng. Hình 17: Thực hiện phản ứng deacetyl hóa Chitin Tiến hành: Chitin thu được đem phản ứng với dung dịch NaOH 50% (tỉ lệ 1:25 w/v) để trong lò ở 80oC trong 96h.Chuẩn độ đến pH 7.0 với dd HCl 1N. Chitosan sẽ kết tủa, ta tiến hành lọc hoặc ly tâm, sau đó sấy thu được Chitosan. 5. Tinh sạch Chitosan: Kết tủa sau khi đã sấy khô được nghiền thành bột và hòa tan trong dd acid acetic 2% với tỉ lệ 1:100 (w/v). Cho dung dịch vào các ống thẩm tích, đặt các ống vào dung dịch acid acetic có nồng độ tương đương trong 24h. Mục đích của quá trình nhằm loại bỏ các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ( muối CH3COONa, muối Calci, các Protein có phân tử lượng thấp…). Sau đó lấy dung dịch trong ống ra và sấy chân không, ta thu được Chitosan gần như tinh khiết (Được kiểm nghiệm bằng phương pháp phân tích HPLC). Tiến hành thí nghiệm lần lượt với 1g và 10g vỏ tôm ban đầu, sự giảm khối lượng vỏ tôm khi qua từng công đoạn được thể hiện trong bảng sau: Bảng 4: Sự giàm khối lượng vỏ tôm qua từng công đoạn Khối lượng vỏ tôm ban đầu % so với ban đầu Sau khi lọai protein Sau khi lọai muối khóang Sau khi lọai nhóm acetyl Sau khi thẩm tích 1 g 67,53 40,46 33,38 19,85 10 g 69,58 33,55 29,78 15,08 Hình 18: Chitosan thu được từ một số loại vỏ giáp xác Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ deacetyl hóa: Nhiệt độ Nồng độ dd NaOH Thời gian phản ứng Hình 19: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến mức độ deacetyl hoá dd Chitin Tiến hành thí nghiệm khảo sát mức độ deacetyl hóa dd Chitin ở hai chế độ nhiệt độ 100oC và 120oC, hai nồng độ dd NaOH 40% và 50%. Kết quả thu được biểu diễn bằng đồ thị như sau Hình 20: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến khối lượng phân tử trung bình của dd Chitosan Từ đồ thị ta thấy: ở nhiệt độ 120oC – dd NaOH 50%, mức độ deacetyl hóa là cao nhất. Ngược lại, ở nhiệt độ 100oC – dd NaOH 40%, mức độ deacetyl hóa là thấp nhất. Một thí nghiệm khác được tiến hành để khảo sát khối lượng phân tử trung bình của dung dịch Chitosan khi deacetyl hóa Chitin bằng dd NaOH 40% và 50%, nhiệt độ 100oC và 120oC, kết quả thu được: Từ đồ thị ta thấy ở nhiệt độ 120oC – dd NaOH 50%, khối lượng phân tử trung bình của dd Chitosan giảm nhanh nhất. Ngược lại, ở nhiệt độ 100oC – dd NaOH 40%, khối lượng phân tử trung bình của dd Chitosan giảm chậm nhất. Điều này được giải thích là do nhiệt độ cao, nồng độ NaOH lớn, mức độ deacetyl hóa càng lớn làm khối lượng phân tử trung bình của dung dịch giảm và ngược lại. Ngoài ra, sự giảm nhanh khối lượng phân tử trung bình được giải thích là do có sự cắt mạch phân tử Chitosan khi phản ứng với dd NaOH ở nồng độ cao và nhiệt độ cao. 6. Xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan: Thử độ deacetyl hóa bằng phương pháp hòa tan mẫu sản phẩm trong dung dịch acid acetic 2%. Xác định độ deacetyl hóa bằng quang phổ hồng ngoại IR. Và đo phân tử lượng trung bình bằng phương pháp đo độ nhớt kế Ostwald Hoặc tiến hành xác định mức độ deacetyl hóa chitosan bằng phương pháp đo độ đạm tổng số: ü Nguyên tắc: Khi chitin chuyển hóa thành chitosan, gốc acetyl chuyển thành gốc amino làm ảnh hưởng tới độ đạm tổng số, dựa vào sự thay đổi độ đạm tổng số để tính mức độ deacetyl hóa (DD). Nếu sản phẩm có độ deacetyl hóa > 50% thì sản phẩm đó là chitosan. Còn ngược lại là chitin. ü Phương pháp thực hiện: + Cân 0.5 g mẫu chitosan cho vào ống Kjedahl, tiếp tục cho vào mỗi ống 10 ml dd H2SO4 đậm đặc và 5g CuSO4 (tỉ lệ 1:10) à cho vào máy vô cơ hóa à máy chưng cất đạm, lượng đạm thu được ở dạng NH4+ và đem chuẩn độ bằng H2SO4 0.1N với chất chỉ thị màu là tashiro à chuẩn đến khi xuất hiện màu xám bền à xác định thể tích H2SO4 đã chuẩn độ à xác định lượng đạm tổng số bằng công thức + Công thức tính lượng Nitơ toàn phần trong mẫu chitosan: Trong đó: c: Nitơ toàn phần (g/100g) V: thể tích H2SO4 0.1N dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) P: trọng lượng mẫu ĐK: độ khô của mẫu thử (%) + Công thức tính độ khô của mẫu chitosan: Trong đó: m1: khối lượng mẫu đem sấy ban đầu m2: khối lượng mẫu không đổi sau thời gian sấy (g) + Công thức tính độ deacetyl hóa: Trong đó: c: hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan đem kiểm nghiệm a: hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitin theo lý thuyết b: hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan theo lý thuyết Với a, b tính được là: a=14/203=6.89 (%); b=14/161=8.69(%) 7. Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm Chitosan: a. Thử độ tinh khiết: Ø Giới hạn polypeptide và acidamin: Cân chính xác 1g Chitosan nghiền mịn với 50ml nước cất. Đun sôi 10ph, lấy dịch lọc trong (A). Lấy 5ml dịch lọc A thêm 3 giọt NaOH 10% và 1 giọt CuSO4 1% lắc đều. Không có màu xanh tím của phản ứng Urê. Lặp lại thí nghiệm để có dịch lọc A, cho vào A vài giọt dung dịch Ninhydrin 0.1%, lắc đều. Dung dịch không có màu xanh tím. Ø Độ tro: Cân chính xác 1g Chitosan trong chén sứ (đã được nung đến khối lượng không đổi). Nung trong lò ở 650oC đến khi được tro trắng và khối lượng không đổi. Cân và xác định độ tro. b. Xác định pH: Cân 10g Chitosan nghiền mịn trong 100ml nước cất đun sôi, để nguội. Lọc lấy nước trong, đem đi xác định pH bằng máy đo pH. c. Xác định độ deacetyl hóa của Chitosan: Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của Chitin nên việc xác dịnh mức độ deacetyl hóa là cần thiết. Người ta thường sử dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại, mẫu đo được ép viên với KBr. Độ deacetyl hóa được xác định theo công thức: Độ N-acetyl hóa được ác định theo công thức: Với A1655: diện tích của đỉnh quang phổ ứng với bước sóng 1655 cm-1 A3450: diện tích của đỉnh quang phổ ứng với bước sóng 3450 cm-1 d. Xác định độ ẩm: Sử dụng máy đo độ ẩm SCALTEC SM001. e. Xác định hàm lượng kim loại nặng. f. Xác định độ nhớt: Đo để phản ánh cùng lúc tính tan và tính bị cắt mạch của Chitosan. Dùng Chitosan thô để đo độ nhớt. g. Xác định hiệu suất thu sản phẩm ứng với 100g Chitin: Lấy 10g Chitin ẩm từ 9-55% đem thực hiện phản ứng deacetyl hóa thu được b1 g Chitosan thô (ẩm A1%). Từ b1 g lấy b2 g Chitosan thô (ẩm A1%) đem hòa tan trong 500ml acid acetic 2%, khuấy tan hoàn toàn, lọc lấy phần dung dịch bên dưới màng lọc, đem kết tủa dung dịch thu được bằng NaOH 5%, thu kết tủa, đem lọc rửa đến khi hết kiềm, sấy thong gió thu được b3 g Chitosan tinh (độ ẩm A3%). Hiệu suất H của quá trình xác định theo công thức: Với: III. Ứng dụng Chitosan trong chế biến và bảo quản rau trái 1. Bảo quản rau trái bằng màng bao Chitosan: a. Đặc điểm của màng bao chitosan: P Là một lớp màng mờ bao bọc bên ngoài rau quả P Được tạo thành bằng cách nhúng rau quả vào dung dịch chitosan pha sẵn với nồng độ xác định P Màng bao chitosan có thể dùng để bảo quản các loại rau trái đông lạnh, các sản phẩm fresh-cut… b. Tác dụng bảo quản của màng bao chitosan P Kiểm soát thành phần không khí bên trong màng bao: + Thông thường người ta hay dùng màng PE để bao gói các loại thực phẩm khô. Nếu dùng PE để bao gói các thực phẩm tươi sống thì có nhiều bất lợi do không khống chế được độ ẩm và độ thoáng không khí (oxy) cho thực phẩm. + Trong khi bảo quản, các thực phẩm tươi sống vẫn "thở", nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển. + Chitosan có khả năng thấm chọn lọc O2 và CO2, trong đó O2 bị hạn chế hơn so với CO2 nhờ đó sẽ giải quyết được các vấn đề trên P Hạn chế quá trình hô hấp và quá trình chín: + Nhờ khả năng thấm chọn lọc O2 hơn so với CO2 nên tỉ lệ O2 bên trong màng bao thấp hơn tỉ lệ CO2 , nhờ đó quá trình hô hấp của rau trái bị hạn chế + Tỉ lệ CO2 làm cho sự sản sinh khí etylen bị hạn chế, nhờ đó làm chậm quá trình chín của rau trái P Hạn chế sự thoát hơi nước và đảm bảo cấu trúc sảm phẩm: + Do có cấu trúc mạng, màng chitosan có khả năng hạn chế hơi nước thấm qua, nhờ đó hạn chế sự thất thoát hơi nước à hạn chế giảm trọng lượng, đảm bảo cấu trúc của rau quả P Làm rau trái lâu bị thâm, đảm bảo màu sắc cho rau trái: + Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị + Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polyme hóa của oquinon. Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho màu sắc của rau quả tươi lâu hơn. P Hạn chế giảm lượng đường và acid: + Rau quả bị giảm lượng đường và acid trong quá trình bảo quản là do các phản ứng hô hấp, sử dụng đường và acid, giải phóng năng lượng. + Màng bao chitosan ức chế hô hấp nên cũng hạn chế giảm lượng đường và acid của rau trái trong quá trình bảo quản. P Màng bao chitosan có khả năng kháng nấm và vi khuẩn: + Cơ chế kháng nấm và vi khuẩn của chitosan: hiện nay đã có nhiều giả thiết về cơ chế kháng VSV của chitosan nhưng chưa có giả thiết nào giải thích đầy đủ. Cơ chế hợp lý nhất: chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào VSV đa số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào VSV bị hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài à tiêu diệt VSV. Cơ chế thứ hai liên quan đến đối tượng được bao gói: khi sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm fresh-cut, chitosan tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các emzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, b-1,3-glucanse, từ đó tiêu diệt VSV. Cơ chế này không còn đúng trong trường hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đó chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với các mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt VSV. Một số cơ chế khác được đề nghị như: các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào VSV sẽ tạo ra các tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dưỡng … + Các thí nghiệm thực tế cho thấy chitosan có khả năng ức chế hoạt động của một số loại vi khuẩn (như E.Coli). Một số dẫn xuất của Chitosan diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu…(như Botrytis cinerea và Rhizopus stolonifer ở dâu tây) và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài + Chitosan có khả năng kháng khuẩn tốt hơn kháng nấm Hình 21: Sự phát triển của Listeria monocytogenes sau khi thêm Chitosan hoặc acid acetic Hình 22: Sự phát triển của Listeria monocytogenes sau khi thêm Chitosan hoặc acid acetic P Ngoài ra màng chitosan còn có một số ưu điểm như: không độc hại, khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói, dễ phân hủy sinh học và thân thiện với môi trường, được sản xuất từ vỏ tôm, cua – là phế phẩm của ngành chế biến thủy hải sản nên hạn chế được ô nhiễm và có hiệu quả kinh tế. c. Cách sử dụng: + Rau quả được rửa sạch + Nhúng vào dung dịch chitosan + Để khô tự nhiên + Bảo quản lạnh rau trái Rau quả Rửa Dd chitosan Nhúng vào dd chitosan Để khô Bảo quản lạnh Hình 23: Quy trình xử lý rau trái bằng chitosan Cách pha dung dịch chitosan: dung dịch chitosan được sử dụng có nồng độ 2% pha trong dung dịch acid acetic 1.5%. Hiện nay ở nước ta dung dịch này được pha sẵn với tên thương mại là PDP và bán với giá chỉ 15000đồng /lít, trung bình một lít có thể xử lý được 1 tạ rau quả. Vì vậy màng chitosan được xem là một phương pháp kéo dài thời gian bảo quản của rau trái và có tính thực tế rất cao d. Một số ứng dụng thực tế hiện nay ở nước ta: Trong thực tế người ta đã dùng màng chitosan để đựng và bảo quản các loại rau quả như: P Bưởi, cam, quýt: + Bưởi là một loại trái cây được trồng khá phổ biến ở nước ta ở cả 2 miền với nhiều giống bưởi nổi tiếng như Năm Roi, Da Xanh, Da Láng, Đường Hồng, bưởi Ổi…Đây cũng là một mặt hàng xuất khẩu được ưa chuộng nhưng hiện nay sản lượng còn thấp, thời gian bảo quản ngắn, bị giảm hương vị, trọng lượng và màu sắc trong quá trình bảo quản. Bảo quản bằng màng chitosan sau 3 tháng, màu sắc của bưởi chỉ thay đổi chút ít so với lúc mới hái nhưng màu vẫn đều và đảm bảo chất lượng. Bao nhựa PE cũng có thể bảo quản bưởi trong 3 thánh nhưng màu sắc vỏ bưởi không đều và có hiện tượng úng vỏ. Hình 24: Bưởi sau thu hoạch và sau 2 tháng bảo quản bằng màng bao chitosan + Cam, quýt có thể bảo quản bằng màng bao chitosan trong vòng 60 đến 90 ngày P Nhãn, vải, xoài, dứa… + Nhãn, vải có thể bảo quản trong 8 đến 10 ngày Hình 25:Táo đã được bao bằng màng Chitosan + Một số giống xoài có vỏ mỏng (xoài Cát Hòa Lộc) khó bảo quản lâu và vận chuyển đi xa, gây khó khăn trong việc xuất khẩu. Xoài được xử lý chần nước nóng để ngăn bệnh thán thư và ruồi đục trái, sau đó được nhúng vào dung dịch chitosan. Bảo quản xoài tốt nhất ở 10-12oC, có thể giữ được 4-6 tuần. + Dứa có thể bảo quản trong 20 ngày P Dâu, táo, mận, đào, nho, hồng, … + Có thể bảo quản hồng trong thời gian từ 80-90 ngày P Cà chua, củ cải, su hào, cà rốt, dưa chuột,… + Cà chua có thể bảo quản trong 30 ngày Hình 26: Kiwi đã được bao bằng màng Chitosan Ø Nghiên cứu cải tiến: + Nhiều nghiên cứu đã cố gắng để kết hợp Calcium, Vitamin E, Kali, acid oleic… vào màng bao Chitosan để kéo dài thời gian bảo quản và nâng cao giá trị dinh dưỡng của trái cây. Người ta đã ghi nhận được như sau: tính giữ ẩm của màng Chitosan có chứa calcium hoặc vitamin E có cải tiến đáng kể. Đó là do khi cho muối calcium với nồng độ cao vào hệ thống mạng thì Ca2+ sẽ tương tác tĩnh điện với những ion trái dấu, kết quả là làm giảm khả sự khuếch tán của hơi nước qua màng, đồng thời cũng làm giảm tính thấm nước của màng Chitosan. Ảnh hưởng của những chất bổ sung kỵ nước như Vitamin E đối với tính thấm hơi nước của màng nhìn chung là do làm do màng có tính kỵ nước và tăng khả năng chống lại sự vận chuyển nước. Khi bổ sung acid oleic 82.7% thì màng có cải thiện tính giữ ẩm. Việc bổ sung acid oleic không những cải thiện tính chống thấm nước mà còn tăng khả năng kháng khuẩn. Tuy nhiên cần lưu ý rằng để tránh những biến đổi không mong muốn về mặt cảm quan thì nên cho acid oleic và chitosan có tỉ lệ nhỏ hơn 4:1. Thêm vào đó, người ta cũng quan sát thấy rằng việc kết hợp calcium hoặc vitamin E vào màng chitosan đã làm tăng lên đáng kể lượng dinh dưỡng trong quả dâu và mâm xôi đỏ, phụ thuộc vào sự khuếch tán của calcium và vitamin E khi nhúng quả. Khi thêm vào 1% calcium gluconate vào chitosan (1.5% trong acid acetic 0.5%) không kéo dài thời gian bảo quản hơn, tuy nhiên tổng số calcium được quả giữ lại là 3.079 g/kg chất khô lớn hơn so với chỉ dùng calcium (2.34g/kg) à tăng giá trị dinh dưỡng của quả. 2. Xử lý nước quả bằng chitosan: a. Làm trong nước quả: Quá trình làm trong nước quả trước đây thường sử dụng các phụ gia trợ lọc như gelatin, bentonite, silicasol, tannins, polyvinylpyrrolidone, hay hỗn hợp các hợp chất này. Chitosan được sử dụng như một chất kết bông với các chất lơ lửng trong nước quả, tạo thành khối lắng xuống, nhờ đó ta có thể loại ra khỏi hỗn hợp nước quả. Tính chất này của chitosan cũng được ứng dụng để hỗ trợ lắng trong rượu vang, xử lý nước thải, tinh sạch thuốc… Hình 27: Làm trong nước cam bằng Chitosan ü Cơ chế kết dính: + Liên kết: chitosan làm cầu nối trung gian liên kết các phân tử nhỏ bằng liên kết tĩnh điện và liên kết hydro, tạo thành mạng lưới và lắng xuống + Trung hòa điện: các hạt mixen trong chất lỏng thường mang điện tích âm, các đại phân tử sinh học thường mang điện tích dương. Chúng sẽ tương tác với nhau, trung hòa và lắng xuống + Hấp phụ: các đại phân tử có những nhóm linh động, khi gặp các nhóm tương thích trong dung dịch sẽ hấp phụ, kết khối và lắng xuống ü Ứng dụng: + Làm trong nước ép táo, nho, chanh, cam: sử dụng dung dịch chitosan nồng độ 2% trong acid acetic 7% à giảm độ đục hiệu quả hơn so với sử dụng betonit và gelatin + Đối với nước táo có thể sử dụng dung dịch chitosan hòa tan trong acid malic 2%. Người ta nhận thấy rằng độ đục giảm đáng kể khi tăng lượng chitosan sử dụng từ 0.1 đến 0.7 g/lít nước quả. Tuy nhiên khi tăng lên đến 1g/l thì độ đục tăng lên, điều đó được giải thích là do sự bão hòa về tính chất hấp phụ của chitosan. Người ta cũng so sánh hiệu quả của chitosan từ nấm và chitosan từ vỏ tôm và thấy rằng khi sử dụng chitosan từ nấm từ 0.5-1.0 g/lit thì cho hiệu quả cao trong việc làm giảm độ đục của nước táo b. Bảo vệ màu nước quả Chitosan có khả năng tạo phức với các chất màu, vì vậy khi cho chitosan vào dung dịch nước quả, chitosan sẽ tạo phức với các chất màu có trong nước quả, bao bọc và bảo vệ các phức màu này trước tác dụng của các quá trình chế biến và làm giảm mất màu trong quá trình bảo quản. Nhờ sử dụng chitosan trong việc loại bỏ các chất lơ lửng bằng quá trình lọc và ly tâm, ta cũng có thể ngăn cản được sự hóa nâu do enzyme trong nước ép táo và lê. Người ta đã bổ sung chitosan với nồng độ 1% trong acid malic 1% và nhận thấy rằng: sự hóa nâu có thể được ngăn chặn trong nước ép táo bằng cách thêm vào ít nhất 200 ppm chitosan (từ bất kỳ nguồn nào, mức độ deacetyl hóa, độ nhớt). Chitosan sử dụng với nồng độ 1000 ppm để ngăn chặn sự hóa nâu trong nước ép từ lê Cơ chế: Chitosan có khả năng kiểm soát sự hóa nâu bởi enzyme là do chitosan là một polymer tích điện dương tạo tủa với các chất rắn lơ lửng có khả năng kết hợp với enzyme polyphenol oxydase (PPO) CAM ↓ Gọt vỏ ↓ Ép ↓ Đồng hóa ↓ Lọc ↓ Khuấy trộn ↓ Lọc ↓ Đóng gói ↓ Thanh trùng ↓ NƯỚC CAM ÉP Chitosan Hình 28: Quy trình sản xuất nước cam ép có sử dụng chitosan A: mẫu đối chứng B: 0.5g C: 1.0g D: 2.0g E: 3.0g F: 4.0g (Chitosan 1% trong dd acid ascorbic 2%, cho vào 100 g mẫu) Hình 29: Ảnh hưởng của Chitosan đến màu sắc nước cam c. Hiệu chỉnh độ chua của nước quả ü Người ta thấy rằng việc xử lý chitosan với nồng độ 1.2% trong acid ascorbic đối với nước ép carrot và táo không có tác dụng làm trong nước quả nhưng lại làm giảm đáng kể lượng acid của dịch ép. ü Cơ chế: chitosan với một phần mang điện tích dương có khả năng kết hợp với các phần mang điện tích âm của các acid trong nước quả ü Do cơ chế trên mà chitosan không những được sử dụng để hiệu chỉnh độ chua/độ acid của nước quả mà còn có tiềm năng ứng dụng trong các loại thực phẩm khác nhau d. Tính chất kháng VSV của chitosan: Người ta cũng đã nghiên cứu về khả năng kháng VSV của chitosan và kết luận rằng chitosan glutamate là một chất bảo quản hiệu quả trước các loại nấm men gây hư hỏng nước ép táo. Sự có mặt của chitosan glutamate (mức độ deacetyl hóa 75% đến 85%) trong nước ép táo (pH 3.4) ở nồng độ từ 0.1-5 g/l sẽ ức chế sự phát triển của tất cả các loại nấm men gây hư hỏng nước quả như Zygosaccharomyces bailii, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces exiguous, Saccharomycodes ludwigii ở 25oC. Chủng nhạy cảm nhất là Z. bailii, chúng hoàn toàn bị mất hoạt tính ở nồng độ 0.1-0.4 g/l trong 32 ngày bảo quản ở 25oC. Chủng có khả năng chịu đựng cao nhất là S. ludwigii, cần phải 5 g/l để vô hoạt hoàn toàn và để duy trì tình trạng không có nấm men trong nước táo trong 14 ngày ở 25oC. Người ta cũng so sánh khả năng chống VSV của chitosan tự nhiên và chitosan qua thủy phân sơ bộ bằng nhựa đu đủ chống lại các quần thể vi khuẩn tự nhiên trong sản phẩm nước táo (apple-elderflower) đã qua thanh trùng và bảo quản ở pH 7oC (pH 3.3) và thấy rằng khi bổ sung 0.3 g chitosan/l loại bất kỳ thì đều loại trừ được hoàn toàn nấm men trong 13 ngày bảo quản, tổng số vi khuẩn và vi khuẩn lactic đếm được sẽ tăng chậm hơn so với mẫu đối chứng PHUÏ LUÏC CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHITIN VÀ CHITOSAN Bảng 5: Khả năng kháng khuẩn và nấm của Chitosan TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Tập thể tác giả, “Hoá dược”, Đại Học Y Dược Hà Nội, 1988. George A.F. Roberts, “Chitin Chemistry”, Senior Lecturer in Dyeing No Hingham Polytecnic, Mac. London, 1992. Gudmund Skjak- Brack, Thorleif Anthonsen, Paul Standford, “Chitin & Chitosan”, 1989 P. Gross, E. Konrad & H. Mager, “In Chitin & Chitosan, The Japan Society of Chitin & Chitosan”, Tohori, 1982. Y. Ili, Y. MaChiDa, T. ShanNan, “Preparation of Chitosan Microphere containing floruaracil using the Dry in oil method and its releasecharacteristics”, HoShin University, Tokyo, 1991. Các bài báo: Đỗ Đình Ràng, Phạm Đình Cường, “Xác định hàm lượng Chitin của vỏ một số loài thủy sản ở Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học & CNHC 7 (200) Nguyễn Văn Bằng và cộng sự, “Nghiên cứu sử dụng Chitosan làm chất điều hòa sinh trưởng cho cây”. Phan Lê Dũng và cộng sự, “Vật liệu sinh học từ Chitin & dẫn xuất. So sánh về da sinh học từ Chitin & Chitosan”. Lưu Văn Chính và cộng sự, “Sử dụng polymer thiên nhiên cho bảo quản thực phẩm”. AArul J. “Use of Chitosan films to retard post-harvest spoilage of fruits and vegetables,” Chitin Workshop. ICNHP, North Carolina State University, Raleigh, NC E. Piron, A. Domard, “Interaction between Chitosan and Uranyl ions”, Int. Jour. Bio. Macromolecules 21 (1997). Peniston QP and Johnson EL, “Method for Treating an Aqueous Medium with Chitosan and Derivatives of Chitin to Remove an Impurity”, US Patent 3,533,940. Oct. 30:1970. Cùng một số địa chỉ Website.