1. MỞ ĐẦU
Urease là một loại enzym thuỷ phân ure hình thành NH3 và CO2, được ứng dụng rất nhiều
trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong các mẫu bệnh phẩm và nước
chấm. Trên thế giới, có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về enzym urease và và các đặc tính
của chúng, tuy nhiên các bài nghiên cứu về urease từ các nguồn nguyên liệu đậu khác nhau cho
các kết quả khác nhau về đặc tính urease. Điều này chứng tỏ urease từ các nguyên liệu đậu khác
nhau có thể có một số khác biệt về tính chất. Còn ở Việt Nam chỉ mới có các nghiên cứu để tinh
sạch urease, hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu nào về các đặc tính urease từ nguyên liệu
đậu nành Việt Nam.
Để có thể ứng dụng urease trong Y học và Thực Phẩm hiệu quả rất cần thiết phải nắm được
các đặc tính urease.ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài
với giá thành rất cao. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một số đặc tính urease đậu
nành hạt vàng Việt Nam: phân tử lượng của urease và chuỗi tiểu đơn vị, các thông số động học
của urease.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
Urease đậu nành hạt vàng Việt Nam: được tinh sạch qua các công đoạn: trích ly với dệm
phosphate pH 7, 1/15M chứa 0,05M EDTA và 0,05M L-cystein; tủa phân đoạn sunfat amon 65%
và 55% bão hòa; trao đổi ion trên DEAE – cellulose; đông khô bảo quản dưới dạng bột trắng,
mịn.
Hoá chất: dãy protein chuẩn 10 000 – 250 000 Da và 35 000 – 400 000 Da, Nessler (Merck),
Glycine, Tris(base), EDTA, L-Cystein.HCl, Acrylamide và bisacrylamide, SDS, TEMED,
Amonium persulfate, DEAE – Cellulose (Merck).
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease [4]
Phương pháp điện di: điện di trên gel 7,5% và 10% polyacrylamid với tốc độ dòng 20mA, gel
được nhuộm với Coomassie Blue R-250. [1]
Xác định phân tử lượng của urease: lập đồ thị đường chuẩn biểu hiện sự tương quan giữa
phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển của chúng khi điện di trên gel polyacrylamyd.
Từ khoảng di chuyển của urease, bằng phương trình đường chuẩn trên chúng tôi sẽ xác định được
phân tử lượng của urease. [19]
Xác định vận tốc phản ứng thuỷ phân ure của enzym urease: dựa vào lượng NH3 hình thành
xác định bằng phương pháp Nessler, từ đó tính được lượng ure phân huỷ theo thời gian.
3. KẾT QUẢ
3.1 Xác định phân tử lượng của urease đậu nành:
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel poliarylamid 7,5% để
xác định phân tử lượng các mẫu urease đậu nành hạt vàng Việt Nam đã tinh sạch. Trong đệm mẫu
chúng tôi không sử dụng SDS và b -mercaptoethanol nhằm giữ nguyên phân tử lượng urease
chạy trong điện trường điện di. Để so sánh chúng tôi dùng các chất chuẩn có phân tử lượng từ 35
000 – 400 000 Da. Mẫu enzym urease hoà tan trong đệm mẫu, xử lý nhiệt, sau đó qua điện di trên
gel polyacrylamid 7,5% với đệm điện di cũng không bổ sung SDS. Theo [19] muốn xác định
phân tử lượng của một chất thông qua các chất chuẩn trên gel polyacrylamide trước hết phải lập
phương trình đường chuẩn với các thông số tương quan tuyến tính là phân tử lượng của dãy chất
chuẩn cà khoảng cách di chuyển của chúng trên điện di đồ. Trong thí nghiệm chúng tôi xác lập
phương trình đường chuẩn với dãy protein chuẩn có phân tử lượng từ 35 000 – 400 000 Da. Kết
quả ở hình 1 và bảng 1.
9 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2061 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Xác định phân tử lượng và các thông số động học của urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG VÀ CÁC THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC CỦA UREASE
TỪ ĐẬU NÀNH HẠT VÀNG VIỆT NAM
Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi
Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng
1. MỞ ĐẦU
Urease là một loại enzym thuỷ phân ure hình thành NH3 và CO2, được ứng dụng rất nhiều
trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong các mẫu bệnh phẩm và nước
chấm. Trên thế giới, có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về enzym urease và và các đặc tính
của chúng, tuy nhiên các bài nghiên cứu về urease từ các nguồn nguyên liệu đậu khác nhau cho
các kết quả khác nhau về đặc tính urease. Điều này chứng tỏ urease từ các nguyên liệu đậu khác
nhau có thể có một số khác biệt về tính chất. Còn ở Việt Nam chỉ mới có các nghiên cứu để tinh
sạch urease, hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu nào về các đặc tính urease từ nguyên liệu
đậu nành Việt Nam.
Để có thể ứng dụng urease trong Y học và Thực Phẩm hiệu quả rất cần thiết phải nắm được
các đặc tính urease.ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài
với giá thành rất cao. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một số đặc tính urease đậu
nành hạt vàng Việt Nam: phân tử lượng của urease và chuỗi tiểu đơn vị, các thông số động học
của urease.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu
Urease đậu nành hạt vàng Việt Nam: được tinh sạch qua các công đoạn: trích ly với dệm
phosphate pH 7, 1/15M chứa 0,05M EDTA và 0,05M L-cystein; tủa phân đoạn sunfat amon 65%
và 55% bão hòa; trao đổi ion trên DEAE – cellulose; đông khô bảo quản dưới dạng bột trắng,
mịn.
Hoá chất: dãy protein chuẩn 10 000 – 250 000 Da và 35 000 – 400 000 Da, Nessler (Merck),
Glycine, Tris(base), EDTA, L-Cystein.HCl, Acrylamide và bisacrylamide, SDS, TEMED,
Amonium persulfate, DEAE – Cellulose (Merck).
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease [4]
Phương pháp điện di: điện di trên gel 7,5% và 10% polyacrylamid với tốc độ dòng 20mA, gel
được nhuộm với Coomassie Blue R-250. [1]
Xác định phân tử lượng của urease: lập đồ thị đường chuẩn biểu hiện sự tương quan giữa
phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển của chúng khi điện di trên gel polyacrylamyd.
Từ khoảng di chuyển của urease, bằng phương trình đường chuẩn trên chúng tôi sẽ xác định được
phân tử lượng của urease. [19]
Xác định vận tốc phản ứng thuỷ phân ure của enzym urease: dựa vào lượng NH3 hình thành
xác định bằng phương pháp Nessler, từ đó tính được lượng ure phân huỷ theo thời gian.
3. KẾT QUẢ
3.1 Xác định phân tử lượng của urease đậu nành:
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel poliarylamid 7,5% để
xác định phân tử lượng các mẫu urease đậu nành hạt vàng Việt Nam đã tinh sạch. Trong đệm mẫu
chúng tôi không sử dụng SDS và b -mercaptoethanol nhằm giữ nguyên phân tử lượng urease
chạy trong điện trường điện di. Để so sánh chúng tôi dùng các chất chuẩn có phân tử lượng từ 35
000 – 400 000 Da. Mẫu enzym urease hoà tan trong đệm mẫu, xử lý nhiệt, sau đó qua điện di trên
gel polyacrylamid 7,5% với đệm điện di cũng không bổ sung SDS. Theo [19] muốn xác định
phân tử lượng của một chất thông qua các chất chuẩn trên gel polyacrylamide trước hết phải lập
phương trình đường chuẩn với các thông số tương quan tuyến tính là phân tử lượng của dãy chất
chuẩn cà khoảng cách di chuyển của chúng trên điện di đồ. Trong thí nghiệm chúng tôi xác lập
phương trình đường chuẩn với dãy protein chuẩn có phân tử lượng từ 35 000 – 400 000 Da. Kết
quả ở hình 1 và bảng 1.
Hình 3.1 Điện di phân tích phân tử lượng urease đậu nành
Bảng 3.1: Kết quả phân tích tương quan giữa phân tử lượng dãy protein chuẩn và khoảng cách di
chuyển của chúng trên điện di đồ gel 7.5%
Phân tử lượng Khoảng cách di chuyển ln(M)
M (kDa) d (cm)
400 0,3 5,99146
250 1,3 5,52146
160 2,1 5,07517
105 2,9 4,65396
75 3,5 4,31749
50 4,6 3,91202
5 5,1 3,55535
y = -0.5024x + 6.1392
R2 = 0.997
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
0 1 2 3 4 5 6
Khoaûng di chuyeån (cm)
ln
(M
)
Hình 3.2: Đồ thị tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng cách di chuyển của chúng
khi điện di trên gel polyacrylamide 7,5%
Dựa vào kết quả phân tích bảng 1, chúng tôi đã xây dựng được đường chuẩn xác định phân tử
lượng với trục hoành là khoảng di chuyển protein chuẩn và trục tung là Ln(phân tử lượng protein
chuẩn). Đướng chuẩn do chúng tôi xây dựng có độ chính xác cao với phương trình y = - 0,5024x
+ 6,1392. Điều này chứng tỏ chúng tôi hoàn toàn có thể dựa vào đường chuẩn trên để xác định
phân tử lượng của urease đậu nành Việt Nam.
Trên điện di đồ thấy rõ khoảng di chuyển của urease đậu nành là d = 0,1 cm. Từ phương trình
đường chuẩn vừa tìm xác định được phân tử lượng của urease đậu nành vào khoảng 440 000 Da.
3.2 Xác định trọng lượng của các chuỗi tiểu đơn vị
Trong thí nghiệm này, với mục đích xác định trọng lượng các tiểu đơn vị trong phân tử
urease, chúng tôi đồng thời sử dụng các tác nhân SDS, b - mercaptoethanol để cắt cấu trúc bậc 4
urease đậu nành thành các tiểu đơn vị mang điện tích âm, và quá trình điện di được tiến hành trên
gel polyacrylamide nồng độ 10% với cường độ dòng 20 mA. Các chất chuẩn là những protein có
phân tử lượng 10 000 – 250 000 Da. Kết quả thu được như sau
Vạch xuất
phát
Hình 3.3: Điện di đồ xác định trọng lượng chuỗi tiểu đơn vị của urease đậu nành
(Mẫu xử lý bằng SDS, b - mercaptoethanol; gel 10% , dòng điện 20mA)
Bảng 3.2: Kết quả phân tích tương quan giữa phân tử lượng protein chuẩn và khoảng di chuyển
của chúng khi điện di trên gel acrylamide 10%
Phân tử lượng Khoảng di chuyển ln(M)
M (kDa) d(cm)
250 0,35 5,52146
160 0,65 5,07517
105 1,1 4,65396
75 1,5 4,31749
50 2,3 3,91202
35 3,1 3,55535
30 3,6 3,40120
25 4 3,21888
15 5,4 2,70805
10 6 2,30259
y = -0.5158x + 5.3109
R2 = 0.9651
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Khoaûng di chuyeån (cm)
ln
(M
)
Hình 3.4: Đồ thị tương quan giữa phân tử lượng protein và khoảng cách di chuyển của chúng khi điện di
trên gel acrylamide 10%
Trên điện di đồ hình 4 cho thấy urease đậu nành sau khi xử lý bằng SDS, b-mercaptoethanol;
gel polyacrylamide 10% xuất hiện một vạch của các tiểu đơn vị của phân tử urease, khoảng cách
từ điểm xuất phát tới vạch d = 4,8 cm. Điều này chứng tỏ các tiểu đơn vị của urease đậu nành hạt
vàng Việt Nam có cùng trọng lượng, Dựa vào phương trình đường chuẩn y = - 0,5158x + 5,3109
(đồ thị hình 3.12) tìm khối lượng tương ứng với khoảng cách 4.8cm, đó sẽ là phân tử lượng của
tiểu đơn vị urease đậu nành. Trên đường chuẩn trong thí nghiệm của chúng tôi, ứng với khoảng
cách 4,8 cm chúng tôi xác định được trọng lượng của tiểu đơn vị urease là 17000Da.
3.3 Xác định các thông số động học của urease đậu rựa và đậu nành:
Thông số động học của enzym là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis Km.
Tốc độ của phản ứng enzym trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có
trong môi trường. Chừng nào enzym chưa bị bão hoà bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ lệ
thuận với nồng độ cơ chất. Do đó chúng tôi khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thuỷ phân ure
của urease đậu nành và đậu rựa bằng cách thay đổi nồng độ ure từ 1 – 100 mM để tìm khoảng
nồng độ ure mà trong đó enzym chưa bị bão hoà bởi cơ chất.
Quá trình xác định động học enzym urease được tiến hành như sau: hoà tan bột enzym urease
đậu rựa (Merck) và urease đậu nành đã tinh sạch bằng đệm phosphate 1/15M, pH7 để có dung
dịch enzym hoạt lực 20UI Summer/1ml (đơn vị hoạt lực UI Summer được định nghĩa là lượng
enzym có khả năng thuỷ phân ure tạo thành 1mg NH3 trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn).Bổ
sung 0.5ml dịch urease 20 UI Summer/1ml vào các ống nghiệm đã có sẵn ure với nồng độ tăng
dần từ 1 – 100 mM, ủ ở 300C trong 5 phút. Lượng NH3 tạo thành được xác định theo phương
pháp Nessler, qua tính toán tìm được lượng cơ chất ure bị thuỷ phân rồi tính được vận tốc phản
ứng enzym urease. Kết quả thu được như sau:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Noàng ñoä urea (mM)
V
(
m
M
/p
hu
ùt)
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi vận tốc thuỷ phân của enzym urease đậu rựa khi thay đổi nồng độ cơ
chất ure
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Noàng ñoä urea (mM)
V
(
m
M
/p
hu
ùt)
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi vận tốc thuỷ phân của urease đậu nành khi thay đổi nồng độ cơ chất
ure.
Từ đường biến thiên tốc độ phản ứng enzym ở cả 2 đồ thị cho thấy cả urease đậu nành và đậu
rựa hoạt tính 10 UI Summer đều bị bão hoà cơ chất khi nồng độ ure ³ 30 mM (tức tốc độ phản
ứng không tăng khi nồng độ cơ chất tăng). Ở nồng độ ure £ 30 mM, vận tốc thuỷ phân ure của
enzym urease đậu nành và đậu rựa tăng dần khi tăng nồng độ cơ chất ure. Như vậy, các thông số
động học của urease có thể được xác định khi thay đổi khoảng nồng độ cơ chất £ 30 mM ứng với
10 UI Summer urease.
Các thông số động học của urease đậu rựa và urease đậu nành thu được từ quá trình tinh sạch
trên được xác định dựa trên tương quan vận tốc thuỷ phân của enzym urease và nồng độ cơ chất.
Để lập đưởng thẳngn thể hiện mối tương quan giữa vận tốc phản ứng thuỷ phân và nồng độ cơ
chất chúng tôi xác định vận tốc thuỷ phân của enzym urease ở nồng độ cơ chất từ 1 – 10 mM với
hoạt tính enzym 10 UI Summer. Chúng tôi xây dựng đường thẳng tương quan giữa vận tốc thuỷ
phân của enzym và nồng độ cơ chất theo phương trình Lineweaver – Burk:
1
v =
Km
Vmax [s]
* + Vmax
1
Kết quả phân tích như sau:
Bảng 3.3: Kết quả xác định vận tốc thuỷ phân của urease đậu rựa
[S]
(mM)
[V]
(mM/phút)
1/[S]
(mM)-1
1/[V}
(mM/phut)-1
1 0,971 1 1030,30
2 1,606 0,5 622,71
3 2,065 0,333 484,33
4 2,524 0,25 396,27
5 2,700 0,2 370,37
6 2,771 0,167 360,93
7 3,194 0,143 313,08
8 3,265 0,125 306,31
9 3,406 0,111 293,61
10 3,441 0,1 290,60
Bảng 3.4: Kết quả xác định vận tốc thuỷ phân của urease đậu nành
[S]
(mM)
[V]
(mM/phút)
1/[S]
(mM)-1
1/[V}
(mM/phut)-1
1 1,076 1 928,962
2 1,818 0,5 550,162
3 2,382 0,333 419,753
4 3,053 0,25 327,553
5 3,265 0,2 306,306
6 3,512 0,167 284,757
7 4,006 0,143 249,633
8 4,112 0,125 243,205
9 4,218 0,111 237,099
10 4,324 0,1 231,293
y = 827.14x + 204.58
R2 = 0.9985
0
200
400
600
800
1000
1200
0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1
1/[S] (mM)-1
1/
V
(m
M
/p
hú
t)
-1
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/[S] của urease đậu rựa
y = 785.29x + 147.86
R2 = 0.9984
0
200
400
600
800
1000
0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1
1/[S] (mM)-1
1/
V
(m
M
/p
hú
t)
-1
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/[S] của urease đậu nành
Bảng 3.5: Các thông số động học của urease đậu rựa và đậu nành
Đậu Vmax (mM/phút) Km (mM)
Đậu rựa 4,89.10-3 3,84
Đậu nành 6,77.10-3 5,3
Từ kết quả phân tích cho thấy giá trị Km của urease đậu rựa thấp hơn đậu nành, điều này có
thể giúp chúng ta kết luận urease đậu rựa có ái lực với cơ chất ure lớn hơn urease đậu nành nhưng
sự khác biệt này không lớn lắm. Kết quả tính giá trị Vmax cho thấy urease đậu nành có giá trị
Vmax cao hơn urease đậu rựa.
4. KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã xác định được một số đặc tính urease đậu nành và đậu
rựa như sau:
Đặc tính Đậu nành Đậu rựa
Trọng lượng phân tử (Da) 440 000 -
Trọng lượng chuỗi tiểu đơn vị (Da) 17 000 -
Km (mM) 5,3 3,84
Vmax (mM/phút/10UI summer) 6,77 4,89
Đây là một số đặc tính quan trọng hỗ trợ cho những nghiên cứu tiếp theo để đưa urease đậu
nành vào ứng dụng trong Y học và Thực Phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Phạm Thị Anh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, NXB ĐHQG Tp.HCM, (2003)
[2]. Nguyễn Đức Lượng và các tác giả, Công nghệ enzyme, NXB ĐHQG Tp.HCM, (2004)
[3]. Nguyễn Văn Mùi, Thực hành sinh hóa, NXB KH&KT Hà Nội, (2002).
[4]. Đào Hữu Vinh và các tác giả, Các phương pháp sắc ký, NXB KH&KT Hà Nội, (985).
[5]. Cristian Follmer và các tác giả, Jackbean, soybean and bacillus pasteurii urease -
biological effects unrelated to ureolytic activity, Eur. J. Biochem. 271, 1357-1363,
Cambridge, (004).
[6]. E. G. Schmidt, The inactivation of urease, The department of biological chemistry of the
university of Maryland schoolof medicine, Baltimore, (1928)
[7]. Frederick J. Dechow, Separation and purification technique in biotechnology, Noyes
publications, New Jersey, (1989)
[8]. Henry Tauber and Israel S. Kleiner, The toxicity of crystalline urease, medical college
and flower hospital, J. Biol. Chem. 92, 177, New York, (1931)
[9]. Irwin W. Sier, The activation energy of urea hydrolysis catalyzed by soybean urease,
Eur. J. Biochem. 132, 209, Cambridge, (1939)
[10]. J. G. Mateer, E. K. Marshall, The urease content of certain beans, with special
referenace to the jack bean, John Hopkins University, Baltimore, (1916)
[11]. Jack Peterson, Kent M. Harmon, and Carl Niemann, The dependence of the specific
activity of urease upon the chemistry, California Institute of Technology, Pasadena,
(1948).
[12]. James B. Summer, The isolation and crystallization of the enzym urease, J. Biol. Chem.
69, 435 - 441, New York, (1926)
[13]. K. Takisnima and T. Suga, The structure of jack bean urease, the complete amino acid
sequence, limited proteolysis and reactive cystein residues, Eur. J. Biochem. 175, 151 –
165, Cambridge, (1988).
[14]. Stacey F. Howell and James B. Sumner, The specific effects of buffer upon urease
activity, J. Biol. Chem. 104, 619, New York, (1934)
[15]. Isobel J. Rosenstein, Jeremy M. Hamilton and Miller and William Brufitt, Role of
urease in the formation of infection stones: comparision of urease from different
sources, www.pubmedcentral.com, (1981)
[16]. Joseph C. Polacco and Evelyn A. Havir, Comparisions of soybean urease isolated from
seed and tissue culture, www.biomedcetral.com, (1979)
[17]. Prem P. Sehgal and Aurbrey W.Naylor, Purication and properties of urease derived
from hydrated seeds of jack bean, Canavalia ensiformis (L), Plant Physiology. 4, 567 –
572, Horsham, (1966)
[18]. William N. Fishbein, Stoichiometry, Kinetics, and Inhibitory Properties of a third
subtrate: Dihydroxyurea, The Journal of Biological Chemistry, New York, (1969).
[19]. Quantitation & Electrophoresis of Proteins, www.cas.vanderbilt.edu
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- TH035.pdf