Đề tài Xác định và phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng và giống xoài đang được trồng tại tỉnh Đồng Tháp

markers này thƣờng hiện diện với mức độ cao của hiện tƣợng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự đƣợc lặp lại thƣờng đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tƣơng ứng với việc lặp lại di-, tri-, và tetranucleotide), và có thể đƣợc lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thƣờng xuyên trong bộ gene ngƣời và các loài khác, và đƣợc hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Nhƣ vậy có sự xuất hiện thƣờng xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thƣờng cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể đƣợc nhận biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là lý tƣởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn. Microsatellite có đƣợc tính hay thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể đƣợc giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trƣợt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu đƣợc sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhƣng một vài đột biến có thể không đƣợc sửa chữa. Kích thƣớc của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng nhƣ là tính thƣờng xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tƣơng tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể đƣợc khuếch đại. 2.6.2.2 Khuếch đại của microsatellites Microsatellites có thể đƣợc khuếch đại để nhận biết bằng việc sử dụng PCR, sử dụng mẫu của những vùng lân cận (primer). DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao, tách ra làm hai dãy, cho phép sự bắt cặp của primer và sự kéo dài của trình tự nucleotide dọc theo chuỗi đối diện ở nhiệt độ thấp. Kết quả của quá trình này là có đủ hàm lƣợng DNA để có thể nhìn thấy đƣợc trên gel agarose hay arcrylamide; một số lƣợng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại kết hợp với chu trình nhiệt cách hợp lí để tạo ra sự tăng lên theo số mủ trong đoạn đƣợc sao chép. Với sự phong phú của kỹ thuật microsatellite, primer liên kết với vị trí microsatelltes thì đơn giản và đƣợc sử dụng nhanh chóng, tuy nhiên sự phát triển của những primers nhƣ vậy thƣờng là một quá trình tốn kém và đơn điệu. 2.6.2.3 Sự phát triển của primer microsatellite Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dòng dƣơng tính có thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đoán trƣớc và primers đƣợc thu nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa.Vị trí microsatellite đƣợc trải xuyên suốt genome và có thể đƣợc thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR. Primer microsatellite đặc trƣng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 2.6.2.4 Những giới hạn của microsatellite Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt là trong nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng không phải là không có hạn chế. Microsatellite đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng có thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền đƣợc khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẩn đến sự cố „alleles không giá trị‟ (null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Null alleles có thể đóng góp vào một vài hiện tƣợng. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp nghèo nàn của primer, đặc biệt ở vùng 3‟ nơi mà sự kéo dài bắt đầu; sự khuếch đại ƣu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử đƣợc ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị). Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù đƣợc khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hƣởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần đƣợc xem xét để không đƣa ra giá trị sai của alleles không giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thƣớc allele cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự i.e đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lƣợng hoặc sự cố trong vùng exon của genes dƣới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhƣng số vị trí khuếch đại thành công trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hƣởng xấu trong trƣờng hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể đƣợc dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thƣớc, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thƣớc, khi mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thƣớc; sự ép buộc này đã đƣợc xác định nhƣng giá trị khẳng định là chƣa chuyên biệt. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thƣờng xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó. 2.6.3 Các loại microsatellite 2.6.3.1 Các loại microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). 2.6.3.2 Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) . Hình 2.2: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân Quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp. Sự trƣợt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.3: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 2.6.3.3 Vai trò của microsatellite Rất nhiều microsatellite đã đƣợc tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng, mặc dù ngƣời ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite đƣợc dùng nhƣ một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite đƣợc tìm thấy khắp nơi ở phần trƣớc vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã đƣợc tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lƣợng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trƣờng hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này đƣợc giải phóng thì gen đƣợc khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động nhƣ một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hƣởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hƣởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hƣởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Nhƣ một trình tự mang mã, microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hƣởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv.,1990,1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv., 1997, 1998). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 2.6.3.4 Các phƣơng pháp phát hiện microsatellite Có 2 phƣơng pháp để phát hiện microsatellite: phƣơng pháp lai và phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp lai Phƣơng pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế. Trong phƣơng pháp lai có hai cách: phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phƣơng pháp nhuộm bạc. Phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ Phƣơng pháp hiệu quả và đƣợc dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Ngƣời ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhƣng ngày nay phƣơng pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít đƣợc sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời và đòi hỏi việc xử lý chất thải tốn kém. Phƣơng pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ) Phƣơng pháp này rẻ, không hại nhƣng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Đây cũng chính là phƣơng pháp đƣợc chúng tôi áp dụng. Phƣơng pháp này đƣợc phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện đƣợc bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thƣớc chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này đƣợc gắn vào một đầu 5‟ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10000 phản ứng PCR. Phƣơng pháp này có hiệu quả rất cao và đang đƣợc sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Ngƣời ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thƣớc các đoạn bằng nhau nhƣng chúng ta vẫn có thể xác định đƣợc nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả đƣợc thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định đƣợc chính xác kích thƣớc của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A,… 2.7 Tình hình nghiên cứu cây xoài ở Việt Nam Cho đến nay Việt Nam chƣa có công trình nào nghiên cứu thật đầy đủ về giống xoài ở các vùng trong nƣớc. Kết quả điều tra bƣớc đầu của Trần Thế Tục (1977, 1978, 1991), Dƣơng Minh, Lê Thanh Phong, Võ Thanh Hoàng (1993) cho thấy ngoài các loại hoang dại và bán hoang dại (quéo, muỗm, xoài mủ, xoài hôi) hiện có khoảng 50 giống xoài trong đó một số giống đƣợc nhập từ Campuchia, Thái Lan, Ấn Độ, Srilanka vào nƣớc ta rất lâu đời có khả năng cho năng suất cao và phẩm chất thơm ngon. Khi nhu cầu về xuất khẩu của xoài tăng thì các nghiên cứu về cây xoài mới bắt đầu và chỉ tập trung vào phƣơng pháp canh tác, các biện pháp phòng trừ sâu hại gây bệnh….Chƣa có nghiên cứu nào đi sâu vào mặt di truyền cũng nhƣ tạo cơ sở di truyền để phân biệt các giống xoài với nhau. Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 Các giống xoài thí nghiệm Mẫu lá thu thập đƣợc ở một số nhà vƣờn tại tỉnh Đồng Tháp bao gồm các giống: - Xoài cát Hòa Lộc: Giống có giá trị thƣơng phẩm cao với các đặc điểm: trái to, cơm dày, thịt dẻ, không có xơ và hƣơng vị rất ngon nhƣng khó chăm sóc, năng suất không cao và khó bảo quản. - Xoài cát chu: Có cơm dày, hột nhỏ, không xơ, ngọt và ngon chỉ sau xoài cát Hòa Lộc. - Xoài cát nƣớc: Trái to, phẩm chất chỉ kém xoài cát Hoà Lộc và cát Chu, vỏ dày, hạt to, ít xơ. - Xoài ù: Trái to, vỏ dày, phẩm chất không ngon, ít ngọt. - Xoài Thanh Ca: Trái nhỏ, vỏ dày, vị ngọt thanh, dễ chăm sóc và tỉ lệ đậu trái cao, ra hoa đồng loạt. - Xoài thơm: Dễ đậu trái, hoa nhiều, thịt mềm, trái khi chín có mùi thơm. - Xoài hòn: Trái nhiều, mọc thành chùm, vỏ mỏng khi chín có mùi thơm nhẹ. - Xoài xiêm: Dễ đậu trái nhƣng cành yếu, phẩm chất ngon, trái dài, dẹt, hạt mỏng. - Xoài bƣởi: Cho trái sớm, ít đƣợc ƣa chuộng vì chất lƣợng không cao. Cách lấy mẫu: Mẫu lá đƣợc lấy tại vƣờn, cho vào túi nylon, đánh dấu mẫu và đƣa về trữ trong tủ lạnh để tiến hành ly trích DNA. Mẫu lá đƣợc lấy trên những cây có một số đặc điểm khác biệt so với các cây trong vƣờn và đƣợc chủ vƣờn xác nhận tên giống. 3.1.2 Các hóa chất thí nghiệm 3.1.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA Dịch trích EB: đƣợc pha lần lƣợt theo thứ tự sau + Cân 1g CTAB cho vào 28ml nƣớc cất 2 lần, để ở 650C chờ CTAB tan hoàn toàn. CTAB có tác dụng phá vỡ vách tế bào và màng nhân. + 14ml NaCl 5M: là môi trƣờng đệm, tạo thuận lợi cho việc kết tủa DNA. + 5ml Tris-HCl 1M: là một dung dịch đệm đảm bảo môi trƣờng ly trích mẫu ở pH là 8.0, pH này giúp DNA ổn định. + 2ml EDTA 0.5M: EDTA gắn nối các ion có hoá trị II (nhƣ Mg2+, Ca2+) có trong dịch trích mẫu, ngăn chặn sự hoạt động của các enzym phân huỷ DNA, vì các enzym này hoạt động rất mạnh nếu có mặt của các ion hoá trị II (nhất là Mg2+). + 0.5ml Mercaptro ethanol: có tác dụng bảo vệ DNA. Dịch trích chỉ nên pha mỗi lần 50ml, đựng trong chai đƣợc bọc kín do trong dịch trích có mercaptro ethanol dễ bị ánh sáng phân hủy và dễ mất hoạt tính khi để lâu. Chloroform/Isoamyl Alcohol + 24V Chloroform: làm biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu, ngoài ra chloroform còn có tác dụng tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc giải phóng nằm trong pha nƣớc ở phía trên. + Isoamyl Alcohol: giúp mẫu không bị sủi bọt trong khi votex hay ly tâm tộc độ cao. Ethanol 70%: dùng rửa DNA thu đƣợc . Ethanol 100%: kết hợp với sodium acetate trong quá trình tủa DNA. Isoproanol: giúp ngƣng kết DNA. Sodium acetate 3M (CH3COONa, M = 82 g/mol): là dung dịch đệm làm tăng lực ion trong dịch trích tạo điều kiện tốt cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -200C. TE 10X: dùng 10ml Tris-HCl 1M, 2ml EDTA và 88ml nƣớc cất 2 lần, hấp ở 1210C trong 30 phút. TE 1X dùng để hoà tan và trữ DNA. 3.1.2.2 Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR PCR buffer MgCl2 . dNTP‟s. Taq DNA polymerase. Primer. DNA mẫu (ly trích từ lá xoài). H2O cất chạy PCR. Thể tích cần cho một phản ứng PCR của một SSR chỉ khoảng 15- 50μl. DNA có thể đƣợc ly trích từ nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣng nhất thiết phải kiểm tra số lƣợng và chất lƣợng trƣớc khi sử dụng (bằng các phƣơng pháp định tính và định lƣợng đã biết). Nồng độ DNA dùng cho một phản ứng SSR khoảng 25ηg/ μl. 3.1.2.3 Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự Sản phẩm PCR. Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide Chất chuẩn để xác định kích thƣớc của các peak (size standard). Polymer pop 6-ABI. Buffer. 3.1.3 Trang thiết bị thí nghiệm Chén sứ và chày giã. Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml. Cân phân tích 4 số. Máy hút và tủ cấy vô trùng. Pipet các loại. Đầu típ các loại. Máy ly tâm lạnh. Máy luân nhiệt. Máy điện di. Máy chụp ảnh DNA. Lò Viba. Máy định ôn. Tủ lạnh các loại. Máy giải trình tự. 3.2 Phƣơng Pháp Nghiên Cứu 3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006. Địa điểm lấy mẫu tại tỉnh Đồng Tháp và phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm – Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2 Kỹ thuật ly trích DNA DNA của lá xoài đƣợc ly trích trên cơ sở qui trình trong luận văn tốt nghiệp của Nguyễn Thị Phƣơng Dung, ngành Công Nghệ Sinh Học, Khóa 27. 1- Cân 0,15g lá đã rửa sạch. Cho 1.2ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 45 phút. 2- Thêm 500µl Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm10 phút 14000 vòng ở 4oC. 3- Chuyển lấy dịch trong, lặp lại bƣớc 2. 4- Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 250µl Isopropanol lạnh. Để tủa ở -200C khoảng 30 phút. 5- Li tâm 10 phút 14000 vòng ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong. 6- Cho vào 300µl TE 1X, ủ 370C trong 1 giờ. 7- Thêm 20µl muối Sodium acetate 3M và 640µl Ethanol 96%, trộn đều và để ở -200C trong 30 phút. 8- Ly tâm 10 phút 14000 vòng ở 4oC, đổ bỏ dịch trong. 9- Rửa cặn với 400µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 4 oC, đổ bò dịch trong. 10- Lặp lại bƣớc 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100µl TE 1X, ủ ở 370C trong 45 phút. 11- Bảo quản mẫu ở 4oC. 3.2.3 Kiểm tra định lƣợng và định tính DNA 3.2.3.1 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Để kiểm tra kết quả li trích có thu đƣợc DNA hay không, chúng tôi tiến hành điện di các mẫu DNA đã li trích trên gel agarose 0.8%. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 20 phút. Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại (UV). Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. 3.2.3.2 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bƣớc sóng 260nm và 280nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100 DNA đƣợc xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.7 đến 2.2. 3.2.4 Qui trình phản ứng Phản ứng PCR với cặp primer đã lựa chọn Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 2,0 μl 10X 1X MgCl2 1 μl 50mM 2,5mM dNTPs 0,6 μl 10mM 0,3mM Primer forward 0,2 μl 10pmol/ μl 0,2pmol/ μl Primer reverse 0,2 μl 10pmol/ μl 0,2pmol/ μl DNA mẫu 2,0 μl Taq polymerase 0,4 μl 5u/ μl 0,1u/ μl H2O cất 13,6 μl Tổng thể tích: 20µl Primer đƣợc sử dụng trong phản ứng này là primer có khả năng khuếch đại các vùng có tính bảo tồn cao trên nhóm cây xoài cũng nhƣ các cây cùng họ có quan hệ gần gũi. Trình tự của primer theo chiều 5‟ – 3‟ nhƣ sau: GGCAAACCCATTAGTGAGTTTA AAGGGTGAGAATCTGAAATTTA. Các thao tác tiến hành pha mix phải thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thành phần phải luôn đƣợc giữ trong điều kiện lạnh. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR (tham khảo trong luận văn tốt nghiệp của Nguyễn Thị Phƣơng Dung, khoa Công Nghệ Sinh Học, khóa 27). Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian 1 94 2 phút 2 đến 35 94 30 giây 52 30 giây 72 2 phút 15 giây 36 72 5 phút 37 10 1 phút 38 4 15 phút Trữ mẫu: Sau khi phản ứng hoàn chỉnh, chờ cho nhiệt độ trong máy về 40C trong 5 phút rồi đem mẫu trữ ở 40C hay -200C. 3.2.5 Điện di sản phẩm PCR Đổ gel agarose với nồng độ 2.0%, nấu agarose trong lò viba trong 2 phút, 500W . Trộn 2 µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad). Vận hành máy điện di ở 100V, 250A trong 15 phút. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút. Các mẫu khác nhau nhƣng đƣợc khuếch đại bởi cùng loại primer có băng điện di rất giống nhau nên không thể phân biệt đƣợc trên gel điện di agarose, cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự DNA ABI 3100. 3.2.6 Phân tích kết quả từ sản phẩm PCR của các mẫu xoài bằng máy ABI3100 Sản phẩm PCR đƣợc đƣa vào phân tích trình tự qua 3 bƣớc chính: Bƣớc 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard và hidi formamide. Tổng thể tích cho 1 phản ứng trên máy giải trình tự DNA là 10µl với thành phần phản ứng nhƣ sau: Thành phần Thể tích dùng cho 1 phản ứng Sản phẩm PCR Size standard Hidi formamide 0.5µl 0.5µl 9µl Bƣớc 2: Biến tính mẫu ở 95oC trong 5 phút bằng máy PCR để DNA mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. Sau đó phải giữ lạnh mẫu trong đá ngay để 2 mạch đơn không bắt cặp lại với nhau. Bƣớc 3: Bơm 10µl mẫu vào từng ô trên đĩa, sau đó đƣa vào máy giải trình tự DNA đã đƣợc lắp đặt sẵn mao quản thích hợp và cài đặt chƣơng trình phù hợp trong phần mềm Gene Mapper, là phần mềm sẽ phân tích kích thƣớc al chứa trình tự microsatellite. Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên trong mao quản. Kết quả đƣợc phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công ty Master Food cung cấp. Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về kích thƣớc và độ tin cậy của các al tƣơng ứng với mỗi loại primer. Do đó, có những trƣờng hợp kết quả phân tích có nhiều hơn 2 al microsatellite nhƣng bin set chỉ cho ra dữ liệu của 2 al đặc trƣng nhất (có độ tin cậy cao nhất). 3.2.7 Phân tích kết quả dựa trên phần mềm phân tích về đa dạng di truyền NTSYSpc2.1. Phần mềm NTSYSpc 2.1 là phần mềm thống kê dùng để thống kê đặc điểm di truyền trong kỹ thuật DNA dựa trên kỹ thuật PCR mẫu DNA và điện di. Trong tự nhiên có những loài động vật hay thực vật giống nhau về mặt hình thái nhƣng về mặt di truyền lại hoàn toàn khác nhau. Do đó, việc thống kê mức độ giống và khác nhau của quần thể hay cá thể là rất cần thiết trong việc chọn tạo giống cho sản xuất cũng nhƣ tìm các đặc tính nổi trội cho mục đích sản xuất. Phần mềm NTSYSpc2.1 đƣợc sử dụng dựa trên sự có mặt hay không của band DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1. Sau khi các thông số về DNA đã đƣợc mã hóa dƣới dạng ma trận hoàn chỉnh sẽ đƣợc đƣa vào phân tích trong phần mềm và từ đó thu đƣợc cây phát sinh loài, ta có thể quan sát đƣợc mức độ cũng nhƣ khoảng cách di truyền của các giống trong phân tích. Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quá trình ly trích và sản phẩm DNA thu đƣợc Li trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Qui trình li trích DNA đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Dịch trích DNA chứa chất mercaptro có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Thêm vào đó, sự có mặt của muối sodium acetate có khả năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA. Mặt khác, bƣớc sử dụng Chloroform đƣợc lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu đƣợc tƣơng đối tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra. Kết quả định lƣợng DNA của các mẫu thí nghiệm bằng quang phổ kế cho thấy DNA của các mẫu đem li trích có độ tinh sạch cao với tỉ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.7 đến 2.2 và lƣợng DNA có trong mỗi mẫu trung bình khoảng 50ng/µl. Năm mẫu có chỉ số OD tƣơng đối thấp, nhƣng vẫn có thể tiến hành chạy PCR đƣợc bằng cách xử lý nhƣ sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, rồi li tâm ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4oC để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trƣờng hợp này thể tích DNA trong phản ứng PCR đƣợc tăng lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) và giảm thể tích nƣớc đi 2µl. Bƣớc pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm tiếp theo sẽ giúp thu đƣợc DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. 32 mẫu đƣợc lọc ra và tiến hành chạy PCR để phân tích tính đa dạng di truyền là những mẫu có tỉ lệ OD nằm trong khoảng 1.8 – 2.2 và đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0.8%. Hình điện di sản phẩm ly trích DNA Bảng OD của một số mẫu dùng để chạy PCR # Name Dilut. Factor Ratio Abs Abs 1 I1 1.00000 1.81260 0.31665 0.17470 2 I2 1.00000 1.83870 0.16376 8.9066E-2 3 I3 1.00000 1.74950 0.94226 0.53859 4 I4 1.00000 1.87450 6.8121E-2 3.6340E-2 5 I5 1.00000 1.99500 0.43032 0.21570 6 I6 1.00000 2.02890 0.67489 0.33264 7 I7 1.00000 1.93730 0.24591 0.12693 8 J2 1.00000 2.02800 0.79770 0.39335 9 J3 1.00000 1.96900 1.31580 0.66826 10 J4 1.00000 1.81140 0.43096 0.23792 14 K1 1.00000 1.88940 0.77546 0.41044 15 K2 1.00000 1.98650 0.59841 0.30123 16 K3 1.00000 1.97500 1.03510 0.52408 17 K4 1.00000 1.88680 0.85344 0.45231 18 K5 1.00000 1.95050 0.53627 0.27494 Mẫu sau khi ly trích đƣợc trữ ở 40C và tiến hành chạy PCR. 4.2 Phản ứng PCR Phản ứng PCR qua nhiều thí nghiệm với nhiều quy trình nhiệt độ và thành phần thay đổi để tìm điều kiện thích hợp nhất. Quy trình PCR ở trên là phù hợp và cho kết quả tin cậy. Sau khi kiểm tra các phân đoạn DNA thu đƣợc trong các sản phẩm khuếch đại bằng PCR, sự không xuất hiện các band trong một số mẫu thí nghiệm có thể do các yếu tố sau: + Không có sự xuất hiện của các vị trí microsatellite tƣơng ứng trong genome hay sự bắt cặp không thành công của primer lên genome. + Mẫu ly trích đã để quá lâu trƣớc khi tiến hành phản ứng PCR, quá trình rã đông nhiều lần trong khi thao tác cũng làm ảnh hƣởng rất lớn đến chất lƣợng mẫu. + Sự tạp nhiễm trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Tuy nhiên nguyên nhân này rất khó xảy ra vì có sự xuất hiện của đoạn DNA trên các mẫu thí nghiệm khác ở cùng điều kiện. + Có thể có sự tạp nhiễm của các enzym cắt vào trong quá trình trữ sản phẩm PCR làm gãy DNA trong kết quả phân tích. Do các đoạn DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR có kích thƣớc không quá khác biệt nhau nên sự đa hình rất khó nhận thấy trong sản phẩm khi điện di trên gel thông thƣờng. Vì vậy cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự ABI 3100 để thu đƣợc những kết quả chính xác hơn. 4.4 Kết quả kiểm tra các phân đoạn của sản phẩm PCR thu đƣợc trên máy ABI 3100 Kết quả phân đoạn các sản phẩm khuếch đại bằng PCR trên máy ABI 3100 đƣợc mã hoá dƣới dạng sau: Các band/ giống Cát Chu Xoài Bƣởi Cát Hòa Lộc Thanh Ca Cát Ù Hòn Xanh Hòn Dâu Xoài Xiêm Xoài Thơm D1 I4 J3 K2 L2 I6 K5 L3 M1 J1 J2 L1 C1 M3 I7 K4 A3 H6 I2 L5 I3 105 + + 110 + + + + + + + + + 125 + 135 + + 139 + 143 + + 148 + + + 155 + 200 + + 208 + + 213 + + 236 + 241 + 247 + 258 + 260 + 277 + 314 + + 320 + 323 + 329 + 347 + 350 + Các band/ giống (tt) Cát Chu Xoài Bƣởi Cát Hòa Lộc Thanh Ca Cát Ù Hòn Xanh Hòn Dâu Xoài Xiêm Xoài thơm D1 I4 J3 K2 L2 I6 K5 L3 M1 J1 J2 L1 C1 M3 I7 K4 A3 H6 I2 L5 I3 409 + 436 + + 449 + 473 + 477 + 485 + 493 + + 501 + 534 + 585 + 602 + 606 + 620 + 635 + 658 + + Dựa vào kết quả phân tích trên máy ABI 3100 rút ra các nhận xét sau: Tổng số band DNA xuất hiện trong 21 mẫu phân tích là 58 band sản phẩm với trung bình 2,76 sản phẩm/ mẫu phân tích. Trong 58 band sản phẩm thu này có 23 band là đa hình, 35 band còn lại đồng hình với tần số xuất hiện khác nhau, cao nhất là band 110 bp với 9 lần lặp lại trên các giống. Band có tần số lặp lại cao thứ hai là 148 bp với 3 lần lặp lại và cuối cùng là các band 105, 135, 143, 200, 208, 213, 314, 436, 493, 658 bp chỉ với 2 lần lặp lại trên 21 giống. - Sự xuất hiện của những band đồng hình trên cùng một giống hay trên các giống khác nhau đã chứng minh sự nhầm lẫn về giống của các chủ vƣờn. Sự xuất hiện này cũng chỉ ra mối quan hệ giữa các giống. Sự xuất hiện của các band đa hình trong sản phẩm tạo hy vọng về việc thu nhận band đặc trƣng cho giống. - Tính tƣơng đồng của các giống xoài phân tích là rất cao. Điều này thể hiện qua sự xuất hiện của các dãy band trong sản phẩm PCR thu đƣợc. Để có những nhận định rõ ràng hơn về tính đa dạng di truyền của các giống xoài, từ dữ liệu ban đầu trên máy giải trình tự ABI 3100 ta tiếp tục phân tích bằng phần mềm thống kê NTSYSpc2.1 để có thể nhận xét về mối quan hệ họ hàng giữa các giống khảo sát. 4.4 Kết quả phân tích bằng NTSYSpc2.1 Từ kết quả phân tích trên máy sequencing, ta thu đƣợc kích thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại từ đó mã hoá chúng dƣới dạng ma trận 0, 1 sau đó đƣa vào xử lý với NTSYSpc 2.1 ta thu đƣợc cây phân loại nhƣ trình bày dƣới đây: Hình 4.4 Cây phân loại thể hiện mối quan hệ giữa các giống xoài sau khi phân tích với phần mềm NTSYSpc2.1. Do có sự không chính xác về tên giống ban đầu nên rất khó xác định tính khác biệt nổi trội của mỗi giống và vì vậy rất khó so sánh khoảng cách di truyền cũng nhƣ đặc tính chính xác của từng giống với nhau. Theo kết quả thu đƣợc sau khi xử lý trên phần mềm NTSYSpc2.1 ta thấy: - Nhóm có cùng mối quan hệ di truyền gồm các cá thể sau (nhóm 1): Bao gồm các cá thể I3 (xoài thơm), I7 (xoài Ù), J1 (cát Hoà Lộc), M3 (Thanh Ca), K4 (xoài Ù), K5 (xoài bƣởi). Trong nhóm này có cá thể giống nhau về hình thái bên ngoài nhƣng cũng có giống khác hoàn toàn so với các cá thể còn lại. + Nhóm 1A: Các cá thể giống nhau: I7, J1 và K4. Cả 3 cá thể này có lá to, đầu lá hơi bầu, thuôn dài, kích cở trái khá to và ít. + Nhóm 1B: Ba cá thể còn lại có những đặc trƣng rất riêng. K5 có lá vừa phải, xanh nhẹ, phiến lá mỏng, trái trung bình. M3 lá nhỏ, xanh đậm, phiến rất dày, trái nhỏ. I3 lá rất to, trái nhỏ, nhiều và rất thơm. Điều này có thể do điều kiện chăm sóc, chế độ phân bón tại các vƣờn khác nhau hay cũng có thể do ảnh hƣởng của vùng đất canh tác khác nhau dẫn đến hiện tƣợng thƣờng biến. - Nhóm 1 có quan hệ gần với I6 (xoài bƣởi), về hình thái I6 khá giống với nhóm 1A với lá to, khác về tán lá và chiều cao so theo tuổi cây và năng suất trái: I6 cao hơn, tán hẹp hơn và cho trái nhỏ và nhiều hơn. - Cá thể K2 (cát Chu) giống nhóm 1 về hình thái lá và trái: lá to, ít; giống I6 về hình dạng thân, nhƣng K2 có tán rộng hơn so với các nhóm trên. - Nhóm cá thể khác nhau hoàn toàn về mặt di truyền cũng nhƣ về hình thái nhƣng lại có mối quan hệ tƣơng đối gần nhau so với các nhóm khác gồm các cá thể: H6 (hòn xanh), I2 (hòn dâu), L5 (xoài xiêm), J2 (cát Hòa Lộc). So sánh về hình thái thì các giống này có sự khác biệt rất lớn H6: có thân cao, lá rất to, trái to, ít. I2: thân thấp, cành khoẻ, lá nhỏ, trái nhỏ mọc thành chùm có màu phớt tím ở cuống. L5: thân thấp, lá thon dài đều, trái dài dẹt. J2: thân trung bình, lá rất to, trái trung bình, tròn đều. Có thể giải thích đƣợc mối quan hệ gần giữa H6 và I2 vì cùng thuộc nhóm xoài Hòn, còn về L5 và J2 thì cần phải có những phân tích, khảo sát cụ thể hơn về vùng đất canh tác, nguồn gốc giống. - Giải thích mối quan hệ lân cận giữa I4 (cát Chu) và L1 (cát Hòa Lộc) cùng thuộc dòng xoài cát, khả năng chống chịu kém và khác nhau về thời gian trổ hoa (I4 trổ hoa sớm), năng suất trái (L1 cho năng suất) cao hơn. - Đối với cá thể C1 khi so sánh với 2 nhánh còn lại có một phần giống với đặc điểm của giống này nhƣ về năng suất, hình thái lá. Một phần giống với giống khác nhƣ hình dạng thân, tính chống chịu….nhƣng khác biệt nhất là C1 ra hoa rất nhiều và khả năng đậu trái rất thấp. - Giống có mối quan hệ di truyền xa nhất trong nhóm cá thể phân tích là L3. Các cá thể có mối quan hệ di truyền tiến gần lần lƣợt là L2, D1, M1, J3 và A3. Từ các kết quả phân tích trên cho thấy các sản phẩm khuếch đại bằng PCR thu nhận có thể chỉ là do sự bắt cặp đƣợc của primer lên vùng bảo tồn của bộ gene, chƣa có sự chắc chắn nào về sự có mặt của microsatellite trong vùng bảo tồn dựa trên kết quả thu đƣợc từ máy giải trình tự ABI 3100. Tuy kết quả đạt đƣợc không nhƣ mục đích ban đầu nhƣng cặp primer trên cũng có thể dùng để phân tích tính đa dạng di truyền của các giống xoài khá hiệu quả. PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận Từ những kết quả thu đƣợc ta rút ra những kết luận sau: - Các kết quả phân tích cho thấy chín giống xoài thuộc năm dòng khác nhau khi phân tích có mức độ đa dạng di truyền rất thấp. - Có sự không thống nhất giữa tên giống và kiểu di truyền khi phân tích. Điều này đặt ra giả thuyết có biểu hiện phổ biến của sự lẩn tạp giữa các giống đƣợc trồng trong vƣờn. - Nguồn quỹ gene của các giống xoài phân tích tƣơng đối nghèo nàn. Điều này thể hiện qua sự xuất hiện của rất nhiều band đồng hình trong sản phẩm PCR. Sự nghèo nàn của nguồn quỹ di truyền trong nghiên cứu này là sự biểu hiện của việc mất dần tính đa dạng trong quần thể lai tạo. - Các đặc điểm nổi trội của các giống xoài do nhà vƣờn cung cấp phụ thuộc rất lớn vào cảm nhận chủ quan của họ nên việc tìm thấy một đoạn gene mã hoá đặc trƣng cho một đặc tính sản xuất nào đó là rất khó khăn. - Đối với những cá thể cho sản phẩm khuếch đại bằng PCR giống nhau hoàn toàn nhƣ: I3, I7, J1, M3, K4, K5 chỉ với một band 110 bp duy nhất, nên có những nghiên cứu sâu hơn nhƣ tiến hành đọc trình tự các đoạn này để so sánh trình tự nucleotide của các cá thể với nhau nhằm giải thích cho sự khác biệt tƣơng ứng với kiểu hình bên ngoài. - Phân tích tính đa dạng trên xoài với cặp primer trên tuy cho hiệu quả phân tích tƣơng đối tốt nhƣng sự lặp lại của vùng microsatellite là không chắc chắn. Các kết quả thu đƣợc có thể là do sự bắt cặp đƣợc của primer lên vùng bảo tồn trong bộ gene. - Để hỗ trợ cho công tác lai, chọn tạo giống có thể ứng dụng kỹ thuật PCR sử dụng primer trên để phân biệt một số giống xoài nhƣ marker 534 bp đặc trƣng cho giống xoài cát Hòa Lộc; các marker 320, 501 bp đặc trƣng cho giống xoài cát Chu… 5.2 Đề Nghị Trong các công trình nghiên cứu tiếp theo về microsatellite để mang lại các kết quả khả quan hơn trong việc thu nhận các đoạn DNA mã hoá cho các tính trạng có lợi nhƣ khả năng cho trái, phẩm chất trái, khả năng chống chịu…cần lƣu ý một số vấn đề sau: - Tìm nguồn tin cậy trong quá trình lấy mẫu kết hợp với việc chọn lọc các mẫu đƣợc trồng đại trà để có cơ sở chính xác về nguồn giống từ đó có thể dễ dàng so sánh các giống với nhau. Yếu tố tuổi cây cũng cần đƣợc quan tâm khi thu thập mẫu vì yếu tố này có thể ảnh hƣởng đến nhận định về hình thái hay một đặc trƣng nào đó của giống. - Tiếp tục áp dụng kỹ thuật microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho các giống xoài phục vụ cho việc trao đổi dữ liệu, thông tin về đa dạng di truyền giữa các loại giống, đồng thời phục vụ cho công tác lai tạo giống. - Từ kết quả nghiên cứu lần này tiếp tục phát triển thêm về độ chính xác của giống, chọn lựa primer phù hợp hơn…để xây dựng cơ sở di truyền hoàn chỉnh và tin cậy cho các giống có phẩm chất cao tại Việt Nam nhằm xây dựng thƣơng hiệu và tạo thuận lợi cho những nhận định, kiểm tra, phân tích sau này. - Đề tài này chỉ sử dụng phần mềm NTSYSpc2.1 nên việc phân tích có thể không sâu. Để phân tích sâu hơn các nhóm tƣơng tự nhau về mặt di truyền nhƣng khác xa về hình thái ta có thể tiến hành đọc trình tự các đoạn tƣơng đồng để khảo sát sự khác biệt. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang-1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng- Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, 278 trang. 2. Lê Trọng Cúc – 2002. Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên – Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 247 trang. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng- 1997. Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục, 301 trang. 4. Nguyễn Thị Lang – 2002. Các phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học – Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 219 trang. 5. Phạm Kim Duệ - 2005. Giáo trình kỹ thuật trồng cây ăn quả - Nhà xuất bản Hà Nội, trang 105 – 113. 6. Phạm Thị Hƣơng - Trần Thế Tục - Nguyễn Quang Thạch – 2003. Cây xoài - Những điều cần biết – Nhà xuất bản Nông nghiệp, 76 trang. 7. Phạm Bình Quyền - Nguyễn Nghĩa Thìn – 2002. Đa dạng sinh học - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 155 trang. 8. Nguyễn Nghĩa Thìn – 2005. Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 214 trang. 9. Trần Thế Tục –1998. Giáo trình cây ăn quả - Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, trang 151 – 168. 10. Các kết quả nghiên cứu KHCN năm 2001 - Viện cây ăn quả miền nam, 678 trang Tiếng Anh 1. SCHNELL .R. J, OLANO .C.T, UINTANILLA .W.E và MEEROW .A. W – 2005. Isolation and characterization of 15 microsatellite loci from mango(Mangifera indicaL.) and cross-species amplification in closely related taxa - Molecular Ecology Notes. 2. WILLIAMS .D.A, STERNBERG .L.DA S.L & HUGHES .C.R – 2002. Characterization of polmorphic microsatelliteloci in invasive Brazilian pepper, Schinus terebinthifolius – Molercular Ecology Notes. Website: 1. 8286.2005.01076.x;jsessionid=eDkq1htlXI59_- pp3S?cookieSet=1&journalCode=men 2. 8286.2005.01076.x 3. 4. /00007982;jsessionid=2s379bbtd9doh.alice 5. www.blackwell-synergy.com/ doi/pdf/10.1111/j.1471-8286.2005.01018.x 6. www.cabi-publishing.org/Pdf/SampleJournals/PGR9.pdf 7. ution.asp?referrer=parent&backto=issue, 8.www.ncl-india.org/reportsandpress/annualReport/PDFReport/17- Biotechnology.pdf 9. 10. 11. 5=175357 12. Phụ Lục 1 Danh sách các mẫu xoài thu thập đƣợc tại một số nhà vƣờn tỉnh Đồng Tháp Ngày 26/1/2006 Mẫu A : nhà vƣờn Bùi Thanh Sơn xã Tân Long – Thanh Bình cây tơ 6-7năm A1: Cát Hòa Lộc (HL): Trái to, vỏ mỏng, ngon, thơm A2: Thanh Ca (TC): trái to, nhiều, ngọt thanh,vỏ dày A3: Hòn Xanh (XH): trái nhiều, to, thịt nhiều nƣớc, mềm. Mẫu B: Vƣờn Bùi Thanh Sang xã Tân Long – Thanh Bình B1: TC: Thân bị sùng, hoa trái nhiều, trái nhỏ cây 15 năm tuổi B2: TC: Trái to, ngọt, cành dễ gãy, cây tơ. Mẫu C: Vƣờn Phan Văn Gấu: Tân Long – Thanh Bình cây tơ 6-7 tuổi C1:TC: Trái sai, đều, ngọt C2: TC: Trái to Ngày 2/2/2006 Mẫu D: Võ Minh Ba, Mỹ Thới, Mỹ Thọ, Cao Lãnh D1: Cát Chu (CC): Trái to, hoa trái nhiều Mẫu E: Võ Văn Thăng Mỹ Thới - Mỹ Thọ - Cao Lãnh E1: CC: Hoa trái nhiều, dễ đậu E2: HL: Phát triển tốt, hoa trổ sớm, đậu trái tốt. Mẫu F: Vƣờn Trƣơng Khắc Phục Mỹ Thới - Mỹ Thọ - Cao Lãnh F1 :HL ghép gốc xoài Bƣởi: Hoa trái nhiều, trổ sớm và kéo dài F2: HL ghép gốc xoài Bƣởi: Hoa trổ sớm, nhiều Mẫu G: Phan Văn Bé Đông Mỹ- Mỹ Hội – Cao Lãnh: cây tơ G1: HL: Trái lớn, năng suất cao G2:Xoài cát Ù(XU): Trái lớn, năng suất cao, không ngon. Mẫu H: Nguyễn Hữu Thiền, Mỹ Thới, Mỹ Xƣơng, Cao Lãnh H1: Xoài Thơm(XT): Thân mục, cành nhỏ, dễ gãy H2: Hòa Lộc : Hoa nở trể, nhiều, trái non rụng nhiều H3: Cát Chu: Vỏ cây sần sùi, trái ít, trái to H4: Ghép Bƣởi(XB): Hoa nở kéo dài, trái nhiều, nhỏ H5: Xoài Ù: Đậu trái ít, trái to, xốp, ngọt nhẹ H6: Hòn xanh: Trái to, ngọt thơm. Ngày 15/3/2006 Mẫu I: Nguyễn Thị Ngọc Quyên, Mỹ Thới, Mỹ Xƣơng, Cao Lãnh I1: HL: Thân cành bị sùng, gãy ít, hoa trễ, lá cháy và đốm đen tròn I2:Hòn Dâu(HD) – thanh ca chùm??: Cành yếu, thân mục vỏ, trái nhỏ, nhiều, dể đậu trái, vỏ mỏng, lá nhỏ cháy mép (10t) I3: Xoài Thơm(XT): Thân mục, cành gãy ít, nhỏ I4: CC: Hoa trái sớm, đều, lá cháy mép, khô quăn, đốm vàng I5: Cát Chu: Thân mục , bị sùng, trái nhiều đều I6: Ghép Bƣởi(XB): Trái nhiều, hoa nở kéo dài I7: XU: Trái to, không ngon Ngày 16/3/2006 Mẫu J: Võ Bá Ngôn, Đông Mỹ, Mỹ Hội, Cao Lãnh J1: HL: Hoa nở sớm, kéo dài, rụng nhiều J2:HL: Hoa nở trể, nhiều, rụng nhiều J3: CC: Trái sớm, rụng nhiều, lá cháy, quăn mép+ đốm đen J4:HL: Cành yếu, hoa nở kéo dài, đậu trái tƣơng đối, trái to Mẫu K: Trần Tấn Phúc, Đông Mỹ,Mỹ Hội,Cao Lãnh K1:HL: Vỏ cây, cành nứt, xì mủ, hoa nở ko đều, rụng nhiều, trái ít K2: CC: Vỏ cây sần sùi, trái ít, cây trái xì mủ K3:XB: Đậu trái tốt, cây trái bị xì mủ, lá vàng K4: XU: Đậu trái ít, trái xì mủ, da cám, trái to K5: XB: Ngã đổ trái nhiều, sức sống tốt, hoa nhiều, NS cao, ổn định Mẫu L: Hoàng Văn Hải, Đông Mỹ, Mỹ Hội, Cao Lãnh L1:HL: NS cao, ổn định, lá vàng quăn mép L2:CC: NScao, trổ đều, trái nhỏ L3: XB: Trổ sớm, đậu tốt, trái nhỏ,cành mục gãy ít L4: XU: Hoa trổ sớm, ko đồng loạt, ít rụng trái non, dễ nứt L5: Xoài Xiêm: (XX) cây giòn, đậu trái tốt, lá đốm đen Mẫu M: ngẫu nhiên: Nguyễn Văn Tấn, An Phú, An Bình, Cao Lãnh 8t M1: XB: Cây phát triển tốt, trái to, đều M2: XB: Cây tốt, mối ăn, rụng trái non nhiều M3: TC: Trái nhiều, đều, vỏ cây nứt. Phụ lục 2 Kết quả phân tích trên máy ABI3100 Dye/Sample Peak Sample File Name Size Ngày 120606 Tên mẫu Ta B,8 ABI3100_M5_011_2006-06-12.fsa I2 ngày 17/4 52 208 Ngày 150606 B,13 ABI3100_M1_003_2006-06-15.fsa I4 ngày 17/4 52 347 B,14 ABI3100_M1_003_2006-06-15.fsa 396 B,14 ABI3100_M3_007_2006-06-15.fsa L52 ngày 17/4 52 148 B,22 ABI3100_M4_009_2006-06-15.fsa M12 ngày 17/4 52 105 B,23 ABI3100_M4_009_2006-06-15.fsa 260 B,24 ABI3100_M4_009_2006-06-15.fsa 409 B,25 ABI3100_M4_009_2006-06-15.fsa 606 B,26 ABI3100_M4_009_2006-06-15.fsa 620 B,53 ABI3100_M6_013_2006-06-15.fsa H6 ngày 13/6 55 602 Ngày 1606 lần 1 B,10 ABI3100_1.J1_006_2006-06-16.fsa J1 ngày 18/4 52 110 B,11 ABI3100_22.K4_011_2006-06-16.fsa K4 ngày 6/5 52 110 B,10 ABI3100_24.M3_015_2006-06-16.fsa M3 ngày 6/5 52 110 Ngày 1606 L2 30 B,10 ABI3100_10.C1_004_2006-06-16.fsa C1 ngày 3/5 110 B,11 ABI3100_10.C1_004_2006-06-16.fsa 314 B,12 ABI3100_10.C1_004_2006-06-16.fsa 436 B,13 ABI3100_10.C1_004_2006-06-16.fsa 473 B,10 ABI3100_11.I62_006_2006-06-16.fsa I62 ngày 3/5 52 110 B,11 ABI3100_11.I62_006_2006-06-16.fsa 658 B,12 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa L2 ngày 3/5 52 139 B,13 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 148 B,14 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 155 B,15 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 277 B,16 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 372 B,17 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 449 B,18 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 493 B,19 ABI3100_12.L2_008_2006-06-16.fsa 635 B,27 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa L3 ngày 3/5 52 105 B,28 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 110 B,29 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 125 B,30 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 241 B,31 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 258 B,32 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 323 B,33 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 329 B,34 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 350 B,35 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 477 B,36 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 485 B,37 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 493 B,38 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 585 B,39 ABI3100_13.L3_010_2006-06-16.fsa 658 B,9 ABI3100_15.A3_014_2006-06-16.fsa A3 ngày 3/5 52 135 B,10 ABI3100_15.A3_014_2006-06-16.fsa 247 B,11 ABI3100_15.A3_014_2006-06-16.fsa 356 B,7 ABI3100_2.J22_003_2006-06-16.fsa J22 ngày 18/4 52 314 B,11 ABI3100_3.J32_005_2006-06-16.fsa J32 ngày 18/4 52 135 B,12 ABI3100_3.J32_005_2006-06-16.fsa 143 B,13 ABI3100_3.J32_005_2006-06-16.fsa 148 B,14 ABI3100_3.J32_005_2006-06-16.fsa 320 B,15 ABI3100_3.J32_005_2006-06-16.fsa 501 B,10 ABI3100_5.D1_009_2006-06-16.fsa D1 ngày 19/4 52 143 B,11 ABI3100_5.D1_009_2006-06-16.fsa 200 B,12 ABI3100_5.D1_009_2006-06-16.fsa 208 B,13 ABI3100_5.D1_009_2006-06-16.fsa 236 B,14 ABI3100_5.D1_009_2006-06-16.fsa 241 B,15 ABI3100_5.D1_009_2006-06-16.fsa 354 B,10 ABI3100_6.I3_011_2006-06-16.fsa I3 ngày 19/4 52 110 B,8 ABI3100_7.I7_013_2006-06-16.fsa I7 ngày 19/4 52 110 B,11 ABI3100_8.K2_015_2006-06-16.fsa K2 ngày 13/6 55 110 B,12 ABI3100_8.K2_015_2006-06-16.fsa 200 B,8 ABI3100_9.L1_002_2006-06-16.fsa L1 ngày 19/4 52 213 B,9 ABI3100_9.L1_002_2006-06-16.fsa 534 B,11 ABI3100_23.K5_013_2006-06-16.fsa K5 ngày 6/5 52 110 Phụ lục 3 Bảng OD của các mẫu thí nghiệm # Name Dilut. Factor Ratio Abs Abs 1 I1 1.00000 1.81260 0.31665 0.17470 2 I2 1.00000 1.83870 0.16376 8.9066E-2 3 I3 1.00000 1.74950 0.94226 0.53859 4 I4 1.00000 1.87450 6.8121E-2 3.6340E-2 5 I5 1.00000 1.99500 0.43032 0.21570 6 I6 1.00000 2.02890 0.67489 0.33264 7 I7 1.00000 1.93730 0.24591 0.12693 8 J2 1.00000 2.02800 0.79770 0.39335 9 J3 1.00000 1.96900 1.31580 0.66826 10 J4 1.00000 1.81140 0.43096 0.23792 14 K1 1.00000 1.88940 0.77546 0.41044 15 K2 1.00000 1.98650 0.59841 0.30123 16 K3 1.00000 1.97500 1.03510 0.52408 17 K4 1.00000 1.88680 0.85344 0.45231 18 K5 1.00000 1.95050 0.53627 0.27494 19 L1 1.00000 1.91260 1.26160 0.65964 20 L2 1.00000 1.86340 0.32478 0.17430 21 L3 1.00000 1.86110 0.36803 0.19775 22 L4 1.00000 1.94870 1.06040 0.54413 23 L5 1.00000 1.85190 0.80807 0.43634 24 M1 1.00000 1.96280 0.80008 0.40762 25 M2 1.00000 1.87500 0.72339 0.38581 26 M3 1.00000 1.80140 0.43336 0.24057 29 F1 1.00000 2.00810 0.18178 9.0522E-2 30 F2 1.00000 1.71660 0.20828 0.12133 31 G1 1.00000 1.83530 1.82780 0.99592 32 G2 1.00000 2.17750 0.35520 0.16312 33 H1 1.00000 1.80660 2.03180 1.12460 34 H2 1.00000 2.06630 0.12330 5.9673E-2 35 H3 1.00000 2.06870 1.16020 0.56084 36 F2S 1.00000 1.86330 0.16867 9.0518E-2 37 H4 1.00000 1.82320 1.23870 0.67944 38 H5 1.00000 1.72720 2.94780 1.70670 39 H6 1.00000 1.72400 0.66116 0.38350 Phụ lục 4 Bảng mã hoá các band DNA thu đƣợc từ ABI 3100 để phân tích trong NTSYSpc2.1 Band A3 C1 D1 H6 I2 I3 I4 I6 I7 J1 J2 J3 K2 K4 K5 L1 L2 L3 L5 M1 M3 105 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 110 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 135 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 139 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 143 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 148 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 155 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 200 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 208 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 213 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 236 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 241 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 247 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 258 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 260 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 277 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 314 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 320 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 323 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 329 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 347 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 350 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 354 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 356 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 372 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 396 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 409 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 436 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 449 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 473 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 477 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 485 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 493 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 501 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 534 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 585 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 602 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 606 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 620 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 635 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 658 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0