Định danh ba loài, Paris Fargesii, Paris Polyphylla, Paris Vietnamensis thu tại Việt Nam và suy luận sự phát sinh loài ở chi Paris

TNU Journal of Science and Technology 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 395 ĐỊNH DANH BA LOÀI, Paris fargesii, Paris polyphylla, Paris vietnamensis THU TẠI VIỆT NAM VÀ SUY LUẬN SỰ PHÁT SINH LOÀI Ở CHI Paris Nguyễn Thị Ngọc Lan*, Nguyễn Hữu Quân, Vũ Thị Thu Thủy, Chu Hoàng Mậu Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Các loài thuộc chi Paris (Bảy lá một hoa) là loại dược liệu quý, chứa nhiều loại dược chất có tác dụng cân bằng nội môi, kháng khuẩn, kháng virus, chống viêm và ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, do khai thác quá mức để sản xuất dược phẩm đã phá hủy quần thể tự nhiên, làm cho số cá thể trong mỗi loài trong chi này còn rất ít, do đó, các loài Bảy lá một hoa cần được thực hiện các biện pháp bảo tồn khẩn cấp. Chính vì vậy, việc thu thập, định danh loài và phân tích phát sinh loài làm cơ sở xây dựng các biện pháp bảo tồn, phát triển các loài thuộc chi Paris ở Việt nam. Trong nghiên cứu này, ba loài thuộc chi Paris (Paris fargesii, Paris polyphylla var chinensis, Paris vietnamensis) thu tại Lai Châu, Lạng Sơn và Thanh Hóa (Việt Nam) được định danh dựa trên phương pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA với trình tự vùng ITS và đoạn gen matK. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen matK phân lập từ ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis ở Việt Nam và 21 loài thuộc chi Paris có trình tự ITS và matK trên GenBank theo phương pháp Maximum Likelihood đã cho thấy kết quả bước đầu về sự tiến hóa các loài thuộc chi Paris. Từ khóa: Chi Paris; đặc điểm hình thái; ITS; mã vạch DNA; matK; phân tích phát sinh loài. Ngày nhận bài: 07/7/2020; Ngày hoàn thiện: 17/7/2020; Ngày đăng: 31/7/2020 IDENTIFICATION OF THREE SPECIES, Paris fargesii, Paris polyphylla, Paris vietnamensis COLLECTED IN VIET NAM AND PHYLOGENETIC INFERENCE IN THE GENUS Paris Nguyen Thi Ngoc Lan*, Nguyen Huu Quan, Vu Thi Thu Thuy, Chu Hoang Mau TNU - University of Education ABSTRACT Species of the genus Paris are precious medicinal herbs, which consist of many kinds of pharmaceutical substances with homeostasis effect, antibacterial, antiviral, anti-inflammatory and detoxification activities as well as inhibition of cancer cells. However, due to overexploitation of these species to produce pharmaceuticals, the number of individuals in each species of the Paris genus declined dramatically, which is why it is necessary to carry out emergency conservation measures for the Paris species. Therefore, the collection, identification and phylogenetic analysis of Paris species are a basis for conduction of conservation and development measures for species of the genus Paris in Vietnam. In this study, three species of the genus Paris (Paris fargesii, Paris polyphylla var chinensis, Paris vietnamensis) collected in Lai Chau, Lang Son and Thanh Hoa (Vietnam) were identified based on comparative morphology and DNA barcode including ITS and matK. Phylogenetic tree was established based on nucleotide sequences of ITS region and matK gene isolated from three Paris species of P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis in Vietnam and ITS and matK sequences of 21 Paris species on GenBank using Maximum Likelihood method has shown initial results of evolution of Paris species. Keywords: Paris genus; morphological characteristics; ITS; DNA barcode; matK; phylogenetic analysis. Received: 07/7/2020; Revised: 17/7/2020; Published: 31/7/2020 * Corresponding author. Email: ntnlan.dhsptn@tnu.edu.vn Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 396 1. Mở đầu Trong những năm gần đây, các loài thuộc chi Paris đã thu hút nhiều sự chú ý trong hệ thống y học cổ truyền. Bảy lá một hoa là dược liệu quan trọng, là nguồn của các hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau [1]. Rễ, củ của cây Bảy lá một hoa chứa saponin, flavonol, sphingolipid và nhiều glycoside khác [2]. Saponin trong rễ, củ của cây Bảy lá một hoa có tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, chống viêm và giải độc. Saponin cũng là một thành phần của một số dược phẩm được sử dụng để ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [3]. Nghiên cứu của Wang và đồng tác giả (đtg) (2013) đã báo cáo rằng 70 loại saponin steroid đã được phân lập từ một số loài thuộc chi Paris và thành phần, hàm lượng của các dược chất là khác nhau giữa các loài trong chi [4]. Hiện nay, có 24 loài thuộc chi Paris đã được xác định phân bố khắp châu Âu, châu Á và vùng Himalaya; ở một số quốc gia như Bhutan, Nepal và Ấn Độ, Tây nam Trung Quốc [5]. Ở Việt Nam tìm thấy 8 loài phân bố ở các địa phương miền núi phía Bắc, miền Trung và Tây Nguyên. Các loài Paris nằm rải rác trên các khu rừng nhiệt đới thường xanh, trong đất ẩm và mùn ở vùng núi, ở độ cao từ 100 m đến 1500 m [6]. Việc khai thác quá mức các loài thuộc chi Paris đã dẫn đến sự hủy diệt của quần thể tự nhiên và các loài Bảy lá một hoa được đưa vào danh mục nguy cấp [7] . Do đó, cần phải thực hiện các biện pháp bảo tồn và phát triển nguồn gen bằng việc thu thập, định danh, lưu giữ, nhân giống loài cây dược liệu quý này. Mã vạch DNA được báo cáo là công cụ đáng tin cậy trong định danh loài và có thể sử dụng một hay một số trình tự DNA ngắn trong hệ gen để xác định loài. Việc sử dụng kết hợp hai mã vạch DNA sẽ cho kết quả chính xác hơn khi sử dụng mã vạch riêng lẻ [8], [9]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả định danh, phân tích tính đa dạng và phát sinh loài dựa trên đặc điểm hình thái và sự kết hợp trình tự gen matK và vùng ITS của ba loài thuộc chi Paris (P. fargesii, P. var chinensis, P.vietnamensis) thu thập tại Lai Châu, Lạng Sơn và Thanh Hóa. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Các mẫu cây thuộc chi Paris được thu tại Lai Châu (mẫu Lai Châu), Bắc Sơn - Lạng Sơn (mẫu Lạng Sơn), Pù Luông (mẫu Thanh Hóa) và được lưu giữ tại Vườn tiêu bản ở huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn. Lá non của các mẫu Bảy lá một hoa được sử dụng cho tách chiết DNA. Các trình tự vùng ITS và đoạn gen matK khai thác từ cở sở dữ liệu NCBI [10]. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Định danh mẫu Bảy lá một hoa Định danh loài thuộc chi Paris theo Nguyễn Quỳnh Nga và đtg (2016) [6] và tra cứu trên trang web của Tropicos [11], kết hợp với hai mã vạch DNA dựa trên trình tự gen matK và vùng ITS. 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại, giải trình tự đoạn gen matK và vùng ITS DNA tổng số từ mô lá được tách chiết theo phương pháp của Saghai-Maroof và cộng sự (cs) (1984) [12]. DNA tổng số sau tách chiết được sử dụng làm khuôn cho PCR với các cặp mồi được tổng hợp dựa trên trình tự mồi nhân bản đoạn gen matK và vùng ITS đã công bố. Cặp mồi matK-F/matK-R sử dụng trong PCR khuếch đại đoạn gen matK có trình tự nucleotide là: matK-F: 5’- CGATCTATTCATTCAATATTTC -3’ matK-R: 5’- TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT-3’ [13] và đoạn gen matK được nhân bản có kích thước dự kiến khoảng 0,8 kb. PCR nhân bản vùng ITS với cặp mồi ITS-F/ITS-R có trình tự nucleotide là: ITS-F: 5’- ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG-3’ ITS-R: 5’- TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC-3’ dự kiến đoạn DNA được nhân bản có kích thước 0,8 kb [14]. Thành phần PCR được tiến hành với thể tích là 20 µL gồm: 1X DreamTaq Buffer; 1 mM dNTP; 2,5 μM mỗi mồi; 0,75 unit Dream Taq DNA polymerase; 50 ng DNA tổng số. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Eppendorf Mastercycler với Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 397 chu trình nhiệt của PCR để khuếch đại đoạn gen matK là 94oC trong 1 phút; 35 chu kỳ với 94oC/30 giây, 53oC/40 giây, 72oC/40 giây; 72oC/10 phút, sau đó giữ ở 10oC. Chu trình nhiệt của PCR khuếch đại vùng ITS là 94oC/4 phút; 35 chu kỳ với 94oC/30 giây, 58oC/60 giây, 72oC/60 giây; 72oC/10 phút, sau đó giữ ở 10oC. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen JET PCR Purification của hãng Thermo Scientific. Trình tự của các đoạn DNA được xác định trên máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer bằng cách sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Trình tự nucleotide được phân tích bằng BLAST trong NCBI để nhận diện đoạn gen matK, vùng ITS và định danh loài. Phân tích tiến hóa và sự phát sinh loài thực hiện bằng phần mềm MEGAX [15] theo phương pháp Maximum Likelihood và mô hình Tamura- Nei [15]. Cây liên kết ứng với giá trị bootstrap suy luận ra từ 1000 lần lặp lại được sử dụng để thể hiện lịch sử tiến hóa của các loài [17]. 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận Các mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Lai Châu, Lạng Sơn và Thanh Hóa được lưu giữ tại Vườn tiêu bản ở huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn và được định danh dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích đặc điểm phân tử của gen matK và vùng ITS. 3.1. Đánh giá mức độ đa dạng các đặc điểm hình thái của ba loài Bảy lá một hoa thu thập tại Lai Châu, Lạng Sơn, Thanh Hóa Sử dụng phương pháp hình thái so sánh [6] và tra cứu trên trang web của Tropicos [11] các mẫu Bảy lá một hoa bước đầu đã được xác định thuộc chi Paris và tên khoa học của mẫu Lai Châu thuộc loài P. fargesii, mẫu Lạng Sơn là loài P. polyphylla var chinensis và mẫu Thanh Hóa là loài P. vietnamensis. Kết quả so sánh hình thái giữa ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis cho thấy rất ít điểm sai khác và sự khác nhau là không lớn (Bảng 1, Hình 1). Những điểm sai khác chủ yếu là các tính trạng số lượng và hình dạng lá. Như vậy, có thể thấy hình thái ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis có mức độ đa dạng thấp, rất khó phân biệt, cho nên dễ nhầm lẫn giữa các loài. Do vậy, mã vạch DNA cần được sử dụng để khẳng định chính xác tên khoa học của ba loài Bảy lá một hoa này. 3.2. Sự đa dạng trong trình tự đoạn gen matK và vùng ITS ở ba loài Bảy lá một hoa DNA tổng số tách chiết từ lá non của ba mẫu Bảy lá một hoa và kiểm tra bằng điện di và quang phổ hấp thụ, kết quả cho thấy DNA đảm bảo độ tính sạch sử dụng cho PCR. PCR nhân bản đoạn gen matK với cặp mồi matK- F/matK-R và nhân bản vùng ITS với cặp mồi ITS-F/ITS-R được thực hiện và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Sản phẩm PCR được tách từ gel điện di và tinh sạch sử dụng để giải trình tự nucleotide. Sau khi xử lý và loại bỏ những đoạn nhiễu, kết quả thu được đoạn gen matK phân lập từ 3 mẫu Bảy lá một hoa thu tại Lai Châu, Lạng Sơn và Thanh Hóa có 800 nucleotide; vùng ITS có kích thước 695 nucleotide. Phân tích trực tuyến bằng chương trình BLAST trong NCBI đã xác định được mẫu Bảy lá một hoa thu tại Lai Châu là loài P. fargesii, mẫu Lạng Sơn là loài P. polyphylla var chinensis và mẫu Thanh Hóa là loài P. vietnamensis. Bảng 1. Một số đặc điểm sai khác về hình thái giữa ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis Đặc điểm P. fargesii P. polyphylla var chinensis P. vietnamensis Số lượng lá 5 lá 5 lá 5 – 9 Chiều cao thân cây 50 cm 40 cm 25 - 70 cm Chiều dài lá 17 cm 26 cm 11 - 12 cm Chiều rộng lá 10 - 12 cm 15,6 cm 5 - 9 cm Hình dạng phiến lá Hình trứng, mép lá trơn, hơi lượn sóng Hình xoan ngược, không có lông, chóp lá có mũi 1,5 cm Lá hình mác thuôn, đầu nhọn Màu sắc lá Xanh đậm Xanh hơi vàng Xanh hơi vàng Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 398 Hình 1. Một số đặc điểm hình thái của ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis và P. vietnamensis thu tại Lai Châu, Lạng Sơn và Thanh Hóa (Việt Nam). A: Loài P. fargesii (a- cây; b- lá; c-hoa; d-củ); B: Loài P. polyphylla var chinensis (e- cây; g- lá; h-hoa; i- củ); C: Loài P. vietnamensis (k-cây; l-hoa; m-quả chín; n-hạt) So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen matK và vùng ITS bằng phần mềm BioEdit đã xác định được 78 vị trí nucleotide sai khác trong trình tự đoạn gen matK và 76 vị trí nucleotide sai khác trong trình tự vùng ITS giữa ba loài với nhau (Bảng 2). Sư sai khác biểu hiện ở sự thay đổi cùng nhóm base (đồng hoán): A T; G  C; hoặc khác nhóm (dị hoán): A  C; A  G; C  T; G  T. Đặc điểm này đã cho thấy tính đa dạng trong trình tự đoạn gen matK và vùng ITS của ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis. 3.3. Phân tích sự phát sinh loài thuộc chi Paris dựa trên dữ liệu trình tự vùng ITS và đoạn gen matK Chi Paris có 24 loài, trong đó 21 loài tìm được dữ liệu trình tự đoạn gen matK và vùng ITS trên GenBank, đó là các loài Paris axialis, Paris bashanensis, Paris caobangensis, Paris cronquistii, Paris daliensis, Paris delavayi, Paris dulongensis, Paris dunniana, Paris fargesii, Paris forrestii, Paris luquanensis, Paris mairei, Paris marmorata, Paris polyphylla, Paris quadrifolia, Paris rugosa, Paris thibetica, Paris vaniotii, Paris verticillata, Paris vietnamensis, Paris xichouensis. Trình tự nucleotide của vùng ITS của ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis, P. vietnamensis (thu tại Việt Nam) và các loài có trình tự ITS trên GenBank được lựa chọn để phân tích sự phát sinh loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại của các loài thuộc chi Paris. Phân tích sự tiến hóa phân tử được thực hiện bằng phần mềm MEGAX [15]. Lịch sử tiến hóa đã được suy luận bằng cách sử dụng phương pháp Maximum Likelihood và mô hình Tamura-Nei. Phân tích sự phát sinh loài bằng phương pháp Bootstrap với số lần lặp là 1000 theo mô hình Tamura-Nei [16]. Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 399 Bảng 2. Sự sai khác trong trình tự nucleotide của đoạn gen matK và vùng ITS giữa ba loài Bảy lá một hoa Vị trí P. far. P. polyp. P. vie. Vị trí P. far. P. polyp. P. vie. Vị trí P. far. P. polyp. P. vie. Các vị trí sai khác trong gen matK giữa ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis và P. vietnamensis 22 A T A 454 T A T 649 A T A 24 C T C 456 A G A 651 A G A 25 A T A 467 C T C 652 T G T 26 A T A 504 T A T 653 T G T 31 A G A 514 G A G 654 T C T 34 T A T 518 C T C 671 A A T 46 G G C 526 G T G 702 A A G 54 A A C 535 A G A 712 A A T 55 G G T 565 A T A 719 A A G 60 T - C 568 A G A 720 G G A 71 A A G 570 A A G 724 G G A 73 G A G 595 - A G 725 A A G 99 G G T 605 G - C 734 G G A 117 A A G 618 C A C 751 T T A 121 G A G 619 - T C 752 T T A 122 - G G 629 C T C 753 T T A 139 A A T 630 T G T 754 T T G 198 C A C 632 T G T 760 A A G 251 A T A 634 - T T 762 A A G 289 G G C 635 G T G 765 T T A 311 T G T 636 A G A 774 A A T 323 C A A 637 A G A 775 T T A 350 T A T 638 A A C 776 A A G 386 C A C 642 C T C 777 G G A 400 C T C 643 G A G 778 G G T 444 C T C 644 G A G 786 A A T Các vị trí sai khác trong vùng ITS giữa ba loài P. fargesii, P. polyphylla var chinensis và P. vietnamensis 2 T C C 255 C T C 592 A A C 10 A G G 260 T C C 596 G G C 23 C G G 278 C C T 600 G G C 34 A A T 316 T A C 603 G G A 52 G G C 317 A T T 608 C C G 58 G A A 322 T T A 611 G G A 64 G G A 353 T T A 612 A T T 77 C T C 358 G G T 616 C C T 88 A A T 389 C C T 621 G G C 111 G G A 431 G C C 622 G G C 115 C C T 443 C C T 639 G G C 124 G A A 477 C T C 644 C C A 134 A A C 478 T C T 645 C T C 135 C C A 505 T T C 646 A A C 138 T T C 536 C T C 648 T T C 142 G G C 562 T T C 653 T T C 144 C C G 566 G G C 658 T C C 145 G T T 573 A A C 662 A A T 155 C C G 575 G G C 671 C C G 170 A A G 576 G G T 672 T T C 187 G T T 578 G G C 675 G C C 192 T A A 580 G G C 680 C C T 193 T A A 581 T T C 691 T T C 236 G G A 582 G G A 692 A A T 237 T C C 589 A A C 695 C C T 254 C C T Ghi chú: P. far.- loài P. fargesii; P. polyp.- loài P. polyphylla var chinensis; P. vie.-loài P. vietnamensis; (- ): Khuyết nucleotide Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 400 Tỷ lệ bootstrap với 1000 lần lặp lại được hiển thị bên cạnh các nhánh trong cây phát sinh chủng loại. Phân tích liên quan đến 24 trình tự nucleotide. Tất cả các vị trí chứa khoảng trống và dữ liệu bị thiếu đã được loại bỏ, sơ đồ cây thiết lập trên cơ sở sử dụng bộ dữ liệu cuối cùng (Hình 2). A B C Hình 2. Cây phát sinh loài thuộc chi Paris thiết lập dựa trên trình tự nucleotide đoạn gen matK và vùng ITS theo phương pháp Maximum Likelihood trong MEGAX. P.vietnamensis-TH: loài P.vietnamensis thu tại Thanh Hóa; P. fargesii-LC: loài P. fargesii thu tại Lai Châu; P. polyphylla-LC: loài P. polyphylla thu tại Lạng Sơn; Các loài còn lại thuộc chi Paris có trình tự vùng ITS và đoạn gen matK công bố trên GenBanK với mã số đính kèm. Sơ đồ cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide vùng ITS (A), đoạn gen matK (B) và sự kết hợp ITS và matK (C). Kết quả phân tích ở hình 2A dựa trên trình tự ITS với 613 nucleotide trong bộ dữ liệu cuối cùng cho thấy, các loài thuộc chi Paris phân bố trong 2 nhánh, ở nhánh thứ nhất các loài phân bố trong hai nhóm, một nhóm gồm 18 loài, trong đó có loài P.vietnamensis thu tại Thanh Hóa và nhóm còn lại có 5 loài, trong đó có loài P. fargesii thu tại Lai Châu và loài P. polyphylla var chinensis thu tại Lạng Sơn. Nhánh thứ hai chỉ có một loài P. dunniana Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 401 (JF977287). Kết quả phân tích tiến hóa dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK với 709 nucleotide trong bộ dữ liệu cuối cùng (Hình 2B) cho thấy các loài phân bố ở 14 nhánh, thứ nhất gồm 10 loài, trong đó ba P.vietnamensis, P. fargesii, P. polyphylla var chinensis thu tại Thanh Hóa, Lai Châu và Lạng Sơn. Nhánh thứ hai có hai loài và các nhánh còn lại mỗi nhánh chỉ có một loài. Kết hợp trình tự nucleotide của vùng gen ITS và đoạn gen matK với 1322 nucleotide trong bộ dữ liệu cuối (Hình 2C) cho thấy các loài phân bố ở 5 nhánh, trong đó một nhánh có 19 loài, một nhánh có 2 loài, còn lại 3 nhánh, mỗi nhánh có một loài. Loài P. polyphylla var chinensis thu tại Lạng Sơn phân bố ở nhóm 19 loài. Trong các nghiên cứu trước, sự kết hợp phân tích đặc điểm hình thái và vùng gen ITS đã sử dụng để định danh các mẫu P. vietnamensis thu tại Lào Cai (Việt Nam) [18], [19]. Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2018) đã cho thấy sử dụng vùng gen ITS có thể phân biệt loài P. vietnamensis với các loài thuộc chi Paris với độ tin cậy cao (giá trị bootstrap là 100) [18]. Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, trong cả 3 cây phát sinh loài, tỷ lệ bootstrap ở nhiều nhánh thấp cho thấy độ tin cậy về kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại còn hạn chế. Do vậy, để có bức tranh toàn diện về lịch sử tiến hóa của các loài thuộc chi Paris phân bố ở Việt Nam cần phân tích số lượng mẫu lớn và sử dụng trình tự của cả hệ gen lục lạp kết hợp với một số gen phân loại trong hệ gen nhân. 4. Kết luận Những dữ liệu phân tích kết hợp phương pháp hình thái so sánh với mã vạch DNA dựa trên trình tự vùng gen ITS và đoạn gen matK đã xác định được mẫu Bảy lá một hoa thu tại Lai Châu thuộc loài P. fargesii, mẫu Lạng Sơn là loài P. polyphylla var chinensis và mẫu Thanh Hóa là loài P. vietnamensis. Các cây phát sinh loài thuộc chi Paris đã được thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS, đoạn gen matK và dựa trên sự kết hợp ITS và matK đã cho thấy sơ bộ về sự tiến hóa các loài thuộc chi Paris trong phạm vi chỉ dựa trên trình tự vùng gen ITS và đoạn gen matK. Cần tiếp tục nghiên cứu và giải trình tự toàn bộ hệ gen lục lạp của các loài Bảy lá một hoa để có dữ liệu chính xác hơn về lịch sử tiến hóa của chi Paris. Lời cảm ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi Bộ Giáo dục và Đào tạo Việt Nam trong Nhiệm vụ Quỹ gen B2018-TNA-04-GEN. TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1]. M. Tariq, S. Paul, I. D. Bhatt, K. Chandrasekar, V. Pande, and S. K. Nandi, “Paris polyphylla Amith: An important high value Hymalayan medicinal herb.,” Int. J. Adv. Res., vol. 4, pp. 850-857, 2016. [2]. T. L. Do, Medicinal plants and medicines in Viet Nam. Medical Publishing House, Vienam, 2004. [3]. J. C. Wei, W. Y. Gao, X. D. Yan, Y. Wang, S. S. Jing, and P. G. Xiao, “Chemical constituents of plants from the genus Paris,” Chemistry & Biodiversity, vol. 11, pp. 1277- 1297, 2014. [4]. Y. Wang, W. Gao, X. Li, J. Wei, S. S. Jing, and P. Xiao, “Chemotaxonomic study of the genus Paris based on steroidal saponins,” Biochemical Systematics and Ecology, vol. 48, pp. 163-173, 2013. [5]. H. Li, “The phylogeny of the genus Paris L,” Acta Botanica Yunnanica, vol. 6, pp. 351-362, 1984. [6]. Q. N. Nguyen, T. H. Pham, V. T. Phan, and V. T. Hoang, “Taxonomy of the genus Paris L. (Melanthiaceae) in Vietnam,” Journal of Biology, vol. 38, pp. 333-339, 2016. [7]. N. T. Dang, and T. B. Nguyen, Vietnam Red List. Publishing House for Science and Technology, 2007. [8]. CBOL Plant Working Group, “A DNA barcode for land plants,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 106, pp. 12794-12797, 2009. [9]. J. W. Kress, K. J. Wurdack, E. A. Zimmer, L. A. Wei, D. H. Janzen, “Use of DNA barcodes to identify flowering plants,” Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.102, pp. 8369-8374, 2005. [10]. National Center for Biotechnology Information (USA). [Online]. Available: Nguyễn Thị Ngọc Lan và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 225(08): 395 - 402 Email: jst@tnu.edu.vn 402 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ [Accessed June 25, 2020]. [11]. Missouri Botanical Garden. [Online]. Available: [Accessed June 25, 2020]. [12]. M. A. Saghai-Maroof, K. M. Soliman, R. A. Jorgensen, and R. W. Allard, “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics,” Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, vol. 81, pp. 8014-8018, 1984. [13]. J. Yu, J. H. Xue, and S. L. Zhou, “Research ArticleNew universal matK primers for DNA barcoding angiosperms,” Journal of Systematics and Evolution, vol. 49, pp. 176- 181, 2011. [14]. Y. Sun, D. Z. Skinner, G. H. Liang, and S. H. Hulbert, “Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internaltranscribed spacers of nuclear ribosomal DNA,” Theoretical and Applied Genetics, vol. 89, pp. 26-32, 1994. [15]. S. Kumar, G. Stecher, M. Li, C. Knyaz, and K. Tamura, “MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms,” Molecular Biology and Evolution, vol. 35, pp.1547-1549, 2018. [16]. K. Tamura, and M. Nei, “Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees,” Molecular Biology and Evolution, vol. 10, pp. 512-526, 1993. [17]. J. Felsenstein, “Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap,” Evolution, vol. 39, pp. 783-791, 1985. [18]. T. D. Nguyen, Q. N. Nguyen, N. L. Tran, T. T. Nguyen, T. P. Ninh, T. T. N. Doan, T. T. H. Le, and N. L. Nguyen, “Morphological Characteristics and DNA Barcodes of Paris vietnamensis (Takht.) H.Li in Vietnam,” Vietnam Journal of Agricultural Sciences, vol. 16, pp. 282-289, 2018. [19]. T. T. T. Vu, L. T. K. Vu, Q. H. Nguyen, K. V. Pham, D. T. Nguyen, L. T. N. Nguyen, and M .H. Chu, “Cytotoxic effects of steroidal glycosides isolated from the Paris vietnamensis plant on cancer cell lines and against bacterial strains,” Biotechnology & Biotechnological Equipment (B&BE), vol. 33, pp. 1516-1524, 2019.