Định danh loài Alternaria sesami gây bệnh đốm nâu chanh leo tại Nghệ An

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 39 ĐỊNH DANH LOÀI Alternaria sesami GÂY BỆNH ĐỐM NÂU CHANH LEO TẠI NGHỆ AN The Identification of Alternaria sesami Causing Brown Spot Disease of Passion Fruit in Nghe An Võ Thị Dung 1 , Hà Viết Cƣờng 2 , Hà Minh Thanh 3 và Đỗ Duy Hƣng 3 Ngày nhận bài: 15.3.2019 Ngày chấp nhận:16.7.2019 Abstract Brown spot is a dangerous and common disease of passion fruit in Nghe An. The disease has been known to be caused by several Alternaria species worldwide. The major aim of this study is to identify the identity of Alternaria species causing the brown spot diseaseof passion fruit in Nghe An. The Alternaria isolates were isolated from brown spot lesions and cultured on nutrient media. The morphological characteristics and sporulation manner of the Alternaria isolates were evaluated. The Internal Transcribed Spacer (ITS) gene of 11 Alternaria isolates collected from Nghe An (7 isolates), Quang Binh (1 isolate), Thanh Hoa (1 isolate), Ha Tinh (1 isolate) and Hoa Binh (1 isolate) were sequenced directly from the PCR amplicons. Sequence analysesshowed that the ITS sequences of the 11 Alternaria isolates were identical with each other and with those of 3 Alternaria species, A. sesami, A. ricini and A. acalyphicola, of the Section Porri. Phylogenetic analysis showed the 11 Alternaria isolates, A. sesami, A. ricini and A. acalyphicola formed a separate cluster on the ITS tree. In the ITS2 region, 11 Alternaria isolates, A. sesami, A. ricini and A. acalyphicola contain 1 nucleotide (G) distinct from 60 remaining Alternaria species of this Section. The conidia of the Alternaria species causing the brown spot disease were smooth wall and produced singly on conidiophores, meaning that the sporulation manner and conidial morphology of the Alternaria causing brown spot are similar with those of A. sesami but distinct with those of A. ricini and A. acalyphicola. In combination with the result of inoculation on sesame plant conducted previously, the Alternaria species causing brown spot disease of passion fruit in Nghe An is identified as A. sesami. Keywords: Alternaria sesami, Internal Transcribed Spacer (ITS), Nghe An, Passion fruit, sporulation 1. ĐẶT VẤN ĐỀ * Chanh leo là cây trồng có giá trị kinh tế cao, đang được trồng nhiều tại Việt Nam và ở Nghệ An, chanh leo là loại cây đã được đưa vào danh sách cơ cấu cây trồng. Tuy nhiên hiện nay, người trồng chanh leo đang gặp nhiều khó khăn trong sản xuất do bệnh hại tấn công, trong đó có bệnh đốm nâu, một trong những bệnh nghiêm trọng nhất tại Nghệ An. Bệnh gây hại trên lá làm giảm khă năng quang hợp của cây, trên quả làm hư hại vỏ quả, giảm chất lượng thương phẩm của quả, ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế. Trên thế giới bệnh đốm nâu chanh leo đã được xác định do ít nhất 9 loài Alternaria gây ra gồm A. passiflorae, A. alternata, A. macrospora, A. aliena, A. aragakii, A. hawaiiensis, 1. Trường Đại học Kinh tế Nghệ An 2. Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3. Viện Bảo vệ thực vật A. tenuissima, A. tropica, A. guangxinesis, A. bannaensis và A. tomato (Holliday, 1995; Chen& Zhang, 1997; Ploetz, 2003; Simmons, 1993; Ram et al., 1977; Fischer& Rezende, 2008). Trong số các loài trên, A. passiflorae và A. alternata được xem là 2 loài phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới (Fischer & Rezende, 2008; Joy & Sherin, 2012). Hiện nay, dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự gen, khoảng 280 loài Alternaria đã được phân loại và được phân chia vào 27 nhóm loài gọi là Section (Lawrence et al., 2013, 2016), trong đó Section Porri (từ tên loài đại diện A. porri) là Section lớn nhất với tổng số 63 loài được ghi nhận (Woudenberg et al., 2014). Các loài đã công bố gây hại trên chanh leo như A. passiflorae, A. macrospora, A. aragakii, A. hawaiiensis, A. tropicavà A. tomato thuộc Section này. Tại Việt Nam, có rất ít nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo. Gần đây, một Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 40 nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái của 71 mẫu nấm Alternaria phân lập trên chanh leo thu tại Lâm Đồng và Đắk Nông đã xác định nguyên nhân gây bệnh là nấm A.passiflorae (Phan Thị Thu Hiền và CS, 2015). Có thể thấy, tất cả các công bố về nguyên nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo trên thế giới và Việt Nam ở trên đều dựa trên đặc điểm hình thái của nấm. Giống như đối với nhiều chi nấm khác, phân loại nấm Alternaria dựa trên đặc điểm hình thái đã chứng tỏ không chính xác (Lawrence et al., 2016). Chẳng hạn, loài A. hawaiiensis công bố gây bệnh đốm nâu chanh leo, sau khi phân tích trình tự gen, đã được phân loại lại là loài A. Passiflorae (Woudenberg et al., 2014). Tại Nghệ An, các nghiên cứu bước đầu về bệnh đốm nâu chanh leo đã xác định nguyên nhân gây bệnh là do nấm Alternaria. Nghiên cứu trình bày trong bài báo này cung cấp thông tin khoa học nhằm xác định chính xác tới mức loài của nấm gây bệnh dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái và trình tự DNA mã hóa vùng Internal Transcribed Spacer (ITS). Vùng ITS hiện được coi là mã vạch phân tử (barcode) phổ biến và quan trọng nhất của nấm (Schoch et al., 2012) và cũng đã được sử dụng để xác định nấm Alternaria (Sanka et al., 2012; Singh et al., 2018). 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập nấm và đánh giá đặc điểm hình thái Mẫu lá, quả chanh leo bị bệnh đốm nâu điển hình được thu thập và rửa sạch bằng nước vòi. Mẫu được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 30 giây và được thấm khô trên giấy thấm vô trùng. Các mảnh mô (5 x 5 mm) chứa cả mô bệnh và mô khỏe được cắt và được đặt trên môi trường WA (Water Agar) và được ủ ở nhiệt độ 28 o C. Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh 1- 2cm, nấm được làm thuần bằng cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm sang môi trường PDA (Potato Dextrose Agar). Các đặc điểm hình thái của nấm gồm tản nấm, sợi nấm, cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh, cách sinh bào tử phân sinh được quan sát từ các mẫu nấm thuần được nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng gồm PDA, PDA+1%YE (PDA bổ sung 1% Yeast Extract), PCA (Potato Carrot Agar). 2.2 PCR và giải trình tự DNA tổng số được chiết từ sợi nấm thuần theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle and Doyle (1987).DNA được hòa trong 50µL đệm TE và bảo quản ở -20°C. Phản ứng PCR được thực hiện với hai mồi ITS1và ITS4 (White et al., 1990) để nhân vùng ITS của các mẫu nấm. Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 52°C. Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết Gel Extraction Kit D2500 (Omega, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự 1 chiều tại Hãng First Base (Singapore) và Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene) 2.3 Phân tích trình tự Các trình tự mẫu được xác định danh tính sơ bộ khi so sánh với các trình tự tại cơ sở dữ liệu MYCOBANK ( Căn trình tự đa chuỗi được thực hiện với phần mềm ClustalX2.1 (Larkin et al., 2007). Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm MEGA7.0 (Kumar et al., 2016). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu trên chanh leo Nghệ An Nấm Alternaria trên cây chanh leo chủ yếu gây hại ở bộ phận lá và quả. Trên vết bệnh, nấm hình thành cành bào tử phân sinh riêng rẽ và trên cành hình thành một bào tử phân sinh đơn lẻ có mỏ dài. Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo như PDA+1%YE, PCA và PDA, tản nấm tạo các vòng tròn đồng tâm, đều, hơi dày, có màu nâu đậm. Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, nấm dễ dàng sinh sản trên bề mặt môi trường (Hình 1A). Cành bào tử phân sinh mọc trực tiếp từ sợi nấm và vuông góc với sợi nấm, dạng đơn lẻ, có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh. Cành bào tử phân đa bào, kích thước 80 X 3-5 μm, có màu nâu đến nâu đậm.Bào tử phân sinh non và trưởng thành thường có hình elip, kích thước (49 - 102) X (12 - 24) µm. Bào tử trưởng thành nhẵn, màu đậm, có 6 - 10 vách ngăn ngang, 0 - 3 vách Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 41 ngăn dọc, vách ngăn dọc đầu tiên xuất hiện ở vị trí ngăn thứ 2 - 3 của bào tử và các vách ngăn dọc khác ở vị trí có đường kính bào tử lớn hơn so với các vị trí khác. Bào tử phân sinh có mỏ kéo dài theo thời gian sinh trưởng của bào tử, kích thước 186 - 390 X 2,5 μm). Bào tử phân sinh mọc đơn lẻ từ đỉnh cành bào tử phân sinh (Hình 1). Hình 1. Đặc điểm hình thái nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo tại Nghệ An (A, B), trong đó: A: Cách sinh bào tử của nấm trên bề mặt môi trƣờng PDA; B: cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh hình thành từ sợi nấm nuôi cấy trên môi trƣờng PDA. Bào tử phân và cành bào tử phân sinh loài A. sesami (C) theo Simmons, 2004. 3.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS và tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng trên Genbank Vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria phân lập từ vết bệnh đốm nâu trên cây chanh leo tím thu thập từ Nghệ An (7 mẫu), Hà Tĩnh (1 mẫu), Quảng Bình (1 mẫu), Thanh Hóa (1 mẫu) và Hòa Bình (1 mẫu) đã được nhân bằng PCR và giải trình tự trực tiếp 1 chiều bằng mồi PCR. Sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu, bốn mẫu Alternaria thu tại Nghệ An, ký hiệu từ NA1 đến NA4, đều có kích thước 518 bp; bảy mẫu còn lại đều có kích thước 532 bp (Bảng 1). Bảng 1. Nguồn gốc và kết quả giải trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria phân lập từ vết bệnh đốm nâu chanh leo ở Việt Nam STT Ký hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Kích thước (bp) 1 NA1 Nghệ An 518 2 NA2 Nghệ An 518 3 NA3 Nghệ An 518 4 NA4 Nghệ An 518 5 NA5 Nghệ An 532 6 NA6 Nghệ An 532 7 NA7 Nghệ An 532 8 HT1 Hà Tĩnh 532 9 QB1 Quảng Bình 532 10 TH1 Thanh Hóa 532 11 HB1 Hòa Bình 532 Tiếp theo, trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria được căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm Clustal và so sánh trình tự cho thấy chúng đồng nhất 100 % với nhau, chứng tỏ chúng thuộc cùng 1 loài. Tuy nhiên, do khác nhau về kích thước nên trình tự của chúng được trình bày cụ thể như sau với phần trùng nhau được đánh dấu: >Trình tự 4 mẫu NA1, NA2, NA3 và NA4 (518 bp): TAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGG CACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTC CTTGGTGGGCTCGCCCACCACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAG TAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC GCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCAGCC GGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTAGCATC CAACAAG >Trình tự 7 mẫu NA5, NA6, NA7, HT1, QB1, TH1 và HB1 (523 bp): GCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGT ACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGCTCGCCCACCACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGC AATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 42 GAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCA AGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCAT TGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCT AGCATCCAACAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAGC Trình tự của vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria ở trên, tiếp theo, được sử dụng để xác định loài gần gũi từ Cơ sở dữ liệu MYCOBANK. Kết quả tìm kiếm (Bảng 2) cho thấy các loài gần gũi nhất xác định được gồm A. sesami, A. ricini và và A. acalyphicola với phần trăm đoạn so sánh từ 89.9 – 96.9 % và mức đồng nhất trình tự 100%. Đáng chú ý, tất cả 3 loài xác định được đều thuộc Section Porri của chi Alternaria. Bảng 2. Tìm kiếm Cơ sở dữ liệu MYCOBANK xác định loài gần gũi dựa trên trình tự vùng ITS của các mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo TT Loài 1 Mã GenBank/CBS 2 Mức đồng nhất trình tự (%) Phần trăm đoạn so sánh (%) 1 A. sesami JF780939 100 96,9 2 A. sesami JF780940 100 94,4 3 A. ricini CBS 353.86 100 94,2 4 A. ricini CBS 215.31 100 89,9 5 A. ricini KJ718228 100 89,9 6 A. sesami KJ718231 100 89,9 7 A. acalyphicola KJ718097 100 89,9 8 A. sesami CBS 240.73 100 89,9 9 A. ricini KJ718227 100 89,9 10 A. ricini KJ718226 100 89,9 Ghi chú: 1 Chỉ trình bày 10 mẫu gần gũi nhất; 2 là mã mẫu nấm lưu trữ tại CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan). 3.3 So sánh trình tự và phân tích phả hệ Dựa trên kết quả tìm kiếm loài gần gũi, trình tự ITS của 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo đã được phân tích với trình tự tương ứng của tất cả 63 loài Alternaria thuộc Section Porri được công nhận mới đây nhất (Woudenberget al., 2014) (Bảng 3). Tổng số 74 trình tự đã được căn trình tự đa chuỗi, so sánh trình tự và phân tích phả hệ (Bảng 3, Hình 2, Hình 3). Kết quả so sánh trình tự cho thấy tất cả 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo đều đồng nhất trình tự 100% với nhau. So sánh cũng cho thấy các mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo có mức đồng nhất trình tự 100 % với 3 loài A. sesami, A. ricini và A. acalyphicola. Đáng chú ý, so sánh trình tự cho thấy các mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo trong nghiên cứu này chỉ có mức đồng nhất trình tự 98,0 % với loài A. passiflorae (Bảng 3). Bảng 3. So sánh trình tự vùng ITS của 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo với các loài Alternaria thuộc Section Porri 1 TT Loài Ký chủ Quốc Gia Mã GenBank Mức đồng nhất trình tự (%) 1 A. acalyphicola Acalypha indica Seychelles KJ718097 100 2 A. ricini Ricinus communis Nhật Bản KJ718226 100 3 A. sesami Sesamum indicum Ấn Độ JF780939 100 4 A. agerati Ageratum houstonianum Mỹ KJ718098 99,7 5 A. citrullicola Citrullus vulgaris Síp KJ718144 99,7 Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 43 TT Loài Ký chủ Quốc Gia Mã GenBank Mức đồng nhất trình tự (%) 6 A. cyamopsidis Cyamopsis tetragonoloba Mỹ KJ718156 99,5 7 A. aragakii Passiflora edulis Mỹ KJ718111 99,3 8 A. blumeae Blumea aurita Thái Lan KJ718126 99,3 9 A. cassiae Sauropus androgynus Malaysia KJ718136 99,3 10 A. deserticola Đất sa mạc Namibia KJ718249 99,3 11 A. sennae Senna corymbosa Ấn Độ KJ718230 99,3 12 A. azadirachtae Azadirachta indica Úc KJ718115 99,1 13 A. cucumerina Luffa acutangula Mỹ KJ718153 99,1 14 A. venezuelensis Phaseolus vulgaris Venezuela KJ718263 99,1 15 A. zinniae Zinnia elegans New Zealand KJ718270 99,1 16 A. macrospora Gossypium barbadense Mỹ KC584204 98,9 17 A. novae-guineensis Citrus sp. Papua New Guinea KJ718202 98,9 18 A. obtecta Euphorbia pulcherrima Mỹ KJ718204 98,9 19 A. sidae Sida fallax Kiribati KJ718232 98,9 20 A. crassa Datura stramonium Síp KJ718147 98,7 21 A. nitrimali Solanum viarum Puerto Rico KJ718201 98,7 22 A. rostellata Euphorbia pulcherrima Mỹ KJ718229 98,7 23 A. steviae Stevia rebaudiana Nhật Bản KJ718252 98,7 24 A. thunbergiae Thunbergia alata Úc KJ718257 98,7 25 A. tillandsiae Tillandsia usneoides New Zealand KJ718260 98,7 26 A. anodae Anoda cristata Nam Phi KJ718110 98,5 27 A. tagetica Tagetes erecta Anh KC584221 98,5 28 A. catananches Catananche caerulea Hà Lan KJ718139 98,0 29 A. cichorii Cichorium intybus Síp KJ718141 98,0 30 A. dichondrae Dichondra repens Italy KJ718166 98,0 31 A. grandis Solanum tuberosum Mỹ KJ718239 98,0 32 A. jesenskae Fumana procumbens Slovakia KJ718177 98,0 33 A. linariae Linaria maroccana Đan Mạch KJ718180 98,0 34 A. montanica Cirsium arvense Mỹ KJ718194 98,0 35 A. multirostrata Richardia scabra Mỹ KJ718195 98,0 36 A. paralinicola Linum usitatissimum Canada KJ718206 98,0 37 A. passiflorae Passiflora edulis Mỹ KJ718210 98,0 38 A. protenta Hordeum vulgare New Zealand KJ718220 98,0 39 A. ranunculi Ranunculus asiaticus Israel KJ718225 98,0 40 A. scorzonerae Scorzonera hispanica Hà Lan KJ718191 98,0 41 A. silybi Silybum marianum Nga KJ718233 98,0 42 A. solani Ageratum houstonianum Ý Y17070 98,0 43 A. allii Allium cepa Puerto Rico KJ718100 97,8 44 A. alternariacida Solanum lycopersicum Anh KJ718105 97,8 45 A. carthami Helianthus annuus Canada KJ718132 97,8 46 A. carthamicola Carthamus tinctorius Iraq KJ718134 97.8 47 A. centaureae Centaurea solstitialis Mỹ KJ718140 97.8 48 Alternaria cirsinoxia Cirsium arvense Canada KJ718143 97.8 49 Alternaria porri Allium cepa Mỹ KJ718218 97.8 50 Alternaria solani-nigri Cyphomandra betacea New Zealand KJ718242 97.8 Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 44 TT Loài Ký chủ Quốc Gia Mã GenBank Mức đồng nhất trình tự (%) 51 Alternaria argyroxiphii Argyroxiphium sp. Mỹ KJ718112 97.6 52 Alternaria calendulae Calendula officinalis Đức KJ718127 97.6 53 Alternaria pipionipisi Cajanus cajan Ấn Độ KJ718214 97.6 54 Alternaria tropica Passiflora edulis Mỹ KJ718261 97.4 55 Alternaria bataticola Ipomoea batatas Nhật Bản KJ718117 97.2 56 Alternaria dauci Daucus carota Italy KJ718158 97.2 57 Alternaria echinaceae Echinacea sp. New Zealand KJ718170 97.2 58 Alternaria ipomoeae Ipomoea batatas Ethiopia KJ718175 97.2 59 Alternaria neoipomoeae Ipomoea batatas Nam Phi KJ718198 97.2 60 Alternaria pseudorostrata Euphorbia pulcherrima Mỹ JN383483 97.2 61 Alternaria conidiophora Datura stramonium Síp KJ718145 96.9 62 Alternaria agripestis Euphorbia esula Canada KJ718099 87.3 63 Alternaria anagallidis Anagallis arvensis New Zealand KJ718108 86.4 1 Tất cả 63 loài được phân loại mới nhất theo Woudenberg et al.(2014) Trên vùng ITS của nấm có 2 vùng phụ được ký hiệu là ITS1 và ITS2, có mức độ biến động cao (tiến hóa trung tính) nên được xem là 2 vùng chủ chốt để phân loại nấm (Blaalidet al., 2013; Yang et al., 2018). So sánh trình tự ITS cho thấy 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và 3 loài A. sesami, A. ricini và A. acalyphicola có một nucleotide khác biệt so với tất cả 60 loài Alternaria còn lại của Section Porri. Nucleotide khác biệt này là G, nằm ở vùng ITS2 (Hình 2). Hình 2. Đoạn trình tự thuộc vùng ITS2 chứa 1 nucleotide (G, đƣợc đánh dấu bằng hình tam giác) của A. sesami, A. ricini và A. acalyphicola và 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo tại Nghệ An khác biệt duy nhất so với 60 loài Alternaria còn lại của Section Porri Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 45 Tương tự như kết quả so sánh trình tự, phân tích phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự ITS cho thấy tất cả 11 mâu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và 3 loài A.sesami, A. ricini và A. acalyphicola cũng phân nhóm thành một cụm với nhau, độc lập với các loài Alternaria khác của Section Porri (Hình 3). Hình 3. Phân tích phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leovà tất cả 63 loài Alternaria thuộc Section Porri theo Woudenberg et al. (2014) Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 46 Nguồn gốc các loài này được trình bày ở Bảng 3. Cây được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Neighbor-Joining với khoảng cách di truyền được xác định dùng mô hình thay thế chuỗi Jukes - Cantor. Giá trị ởcác nốt là giá trị thống kê bootstrap dưới dạng % (1.000 lần lặp) và chỉ trình bày các giá trị > 50%. Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền. 3.4 So sánh loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo với A. sesami, A. ricini và A. acalyphicola Dựa trên đặc điểm hình thái, so sánh trình tự cũng như tìm kiếm loài gần gũi từ cơ sở dữ liệu MYCOBANK, nơi lưu giữ thông tin các mẫu nấm đã được thẩm định, tất cả 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo tại Việt Nam thuộc cùng một loài thuộc Section Porri của chi Alternaria. Dựa trên so sánh trình tự cũng như phân tích phả hệ gen ITS,các mẫu nấm Alternaria gây bệnh trên chanh leo có thể phân biệt được với 60 loài Alternaria thuộc Section Porri nhưng không thể phân biệt được với 3 loài còn lại của Section nàylà A.sesami, A. ricini và A. acalyphicola. Các nghiên cứu phân loại phân tử gần đây về chi Alternaria cũng cho thấy gen ITS không đủ để phân loại tới mức loài đối với các loài có quan hệ gần gũi (Lawrenceet al., 2013, 2016). Chính vì vậy, một phân tích bổ sung dựa trên đặc điểm hình thái và sinh học của các mẫu nấm Alternaria trong nghiên cứu này với 3 loài kể trên đã được thực hiện (Bảng 4). Kết quả so sánh cho thấy loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và 3 loài A.sesami, A. ricini và A. acalyphicola chia sẻ nhiều đặc điểm hình tháigiống nhau liên quan đến cành bào tử phân sinh và đặc biệt là bào tử phân sinh cũng như khả năng sinh bào tử trên môi trường nhân tạo (Bảng 4). Về khả năng sinh bào tử trên môi trường nhân tạo, cả 4 loài đều sinh sản vô tính dễ dàng, tạo nhiều cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh trên môi trường nuôi cấy nhân tạo. Đặc điểm này khá quan trọng vì nhiều loài, chủng nấmkể cả Alternaria yêu cầu các điều kiện dinh dưỡng hoặc vật lý đặc biệt để sinh sản trên môi trường nhân tạo (Su et al., 2012; Rodrigueset al., 2010; Chaurasiaet al., 1998). Nhìn chung, phân loại các loài Alternaria dựa chỉ trên đặc điểm hình thái tương đối khó vì hình thái của chúng có thể thay đổi theo điều kiện nuôi cấy (Woudenberg, 2015).Tuy nhiên, so sánh các đặc điểm hình thái cho thấy loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo có 2 đặc điểm giống với loài A. sesami (Hình 1) và khác với loài A. ricini và A. acalyphicola là cách sinh bào tử phân sinh và bề mặt bào tử phân sinh. Bào tử phân sinh của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và A. sesami chỉ hình thành riêng lẻ từ đỉnh cành bào tử phân sinh, trong khi bào tử phân sinh của A. ricini và A. acalyphicola có thể mọc thành chuỗi 2 bào tử, mặc dù hiếm (Bảng 4, Simmons, 2007). Bề mặt bào tử phân sinh non và trưởng thành của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và A. sesami nhẵn trong khi của A. ricini và A. acalyphicola không nhẵn (Bảng 3, Simmons, 2004, 2007). Cũng cần chú ý rằng, bề mặt nhẵn hay không nhẵn của Alternaria là đặc điểm khá ổn định, không bị ảnh hưởng bởi điều kiện muôi cấy (Simmons, 2007). Một đặc điểm sinh học rất hữu ích giúp định danh loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo là tính gây bệnh trên cây ký chủ. Cho tới nay, mỗi loài A. ricini, A. acalyphicola và A. sesami được công bố chỉ gây bệnh trên một cây ký chủ, lần lượt là cây thầu dầu (Ricinus communis), cây tai tượng xanh (Acalypha indica) và cây vừng (Sesamum indicum) (Woudenberget al., 2014). Chính vì vậy, tính gây bệnh của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An cũng đã được đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo trên một số cây ký chủ và kết quả lây nhiễm (không trình bày trong bài báo này) cho thấy loài Alternaria này có thể gây bệnh trên cây vừng. Dựa trên phân tích đặc điểm hình thái, trình tự vùng gen ITS và tính gây bệnh trên cây vừng, chúng tôi kết luận loài Alternaria gây bệnh đốm nâu trên chanh leo là loài A.sesami và 11 trình tự ITS đã được gửi Genbank với danh tính của loài này. Như vậy, nghiên cứu này đã (i) lần đầu tiên phát hiện thấy loài A. sesami tại Việt Nam, (ii) phát hiện thêm một ký chủ thứ 2 của A. sesami là cây chanh leo và (iii) phát hiện thêm một loài Alternaria gây bệnh trên chanh leo. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 47 Bảng 4. Đặc điểm hình thái và sinh học của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và 3 loài Alternaria thuộc Section Porricó mức đồng nhất trình tự 100 % trên gen ITS Đặc điểm Chỉ tiêu/ đơn vị A.sesami (Simmons, 2004) A. acalyphicola (Simmons, 2007) A. ricini (Simmons, 2007) Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An Hình thành cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh trên môi trường nhân tạo Nhiều Nhiều Nhiều Nhiều Cành bào tử phân sinh Cách mọc Mọc trực tiếp từ sợi, ít khi phân nhánh, phình to ở đỉnh Hình thành như nhánh hoặc đỉnh sợi nấm Hình thành như nhánh hoặc đỉnh sợi nấm Cành bào tử mọc trực tiếp và vuông góc với sợi nấm, Kích thước (µm) (60-225) x (5.0-6.5) (50-100) x (5.0- 6.0) (50-150) x (5- 6.0) 80 x (3-5.0) Cách sinh bào tử phân sinh trên cành bào tử phân sinh Mọc đơn lẻ Chủ yếu mọc đơn lẻ, đôi khi mọc thành chuỗi 2 bào tử Chủ yếu mọc đơn lẻ, đôi khi mọc thành chuỗi 2 bào tử Mọc đơn lẻ Thân bào tử phân sinh Hình dạng Bào tử non hình elip hẹp, thót nhọn về đỉnh. Bào tử trưởng thành hình trứng hẹp Bào tử non hình elip, trứng hẹp. Bào tử trưởng thành hình elip, trứng rộng Bào tử non hình trứng hẹp, thót nhọn về đỉnh. Bào tử trưởng thành hình trứng, elip, trứng ngược dài Bào tử non hình elip hẹp, thót nhọn về đỉnh. Bào tử trưởng thành hình trứng hẹp Màu sắc Nâu đậm Nâu nhạt Nâu nhạt Nâu đậm Bề mặt Nhẵn Không nhẵn Không nhẵn Nhẵn Chiều dài (µm) 100 - 130 70 - 95 70 - 100 49 - 102 Chiều rộng (µm) 19 - 32 20 - 23 17 - 26 12 - 24 Số vách ngăn dọc 1 - 3 1 - 3 1 - 5 0-3 Số vách ngăn ngang 10 - 12 8 - 10 8 - 11 6 - 10 Mỏ bào tử phân sinh Chiều dài (µm) 200- 325 110-175 Phần lớn có mỏ nhắn; nếu có, mỏ có thể dài 75-125 186 – 390 Chiều rộng (µm) 2,5 1.5-2.0 1.5 - 2.0 2.5 Ký chủ Vừng Tai tượng xanh Thầu dầu Chanh leo, vừng* * Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo không trình bày trong nghiên cứu này Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 48 4. KẾT LUẬN Phân tích đặc điểm hình thái, trình tự vùng gen ITS, kết hợp với đánh giá tính gây bệnh trên cây ký chủ được thực hiện từ trước cho thấy loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo thu thập tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Hòa Bình là loài A.sesami. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Blaalid R., Kumar S., R. H. Nilsson, Abarenkov, K., Kirk, P. M., & Kauserud, H., 2013. ITS 1 versus ITS 2 as DNA metabarcodes for fungi, Molecular ecology resources, 13(2): 218-224. 2. Chaurasia S., Chand R. & Joshi A. K., 1998. A simple technique for the induction of sporulation in Alternaria triticina incitant of leaf blight of wheat, Journal of Plant Diseases and Protection, 17-21. 3. Chen W. Q., & Zhang T. Y., 1997. Two new species of Alternaria from China, Mycological Research, 101(10): 1257-1258. 4. Doyle J. J. & Doyle J. L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue, Phytochem. Bull., 19, 11-15. 5. Fischer I. H., & Rezende J. A., 2008. Diseases of passion flower (Passiflora spp.), Pest technology, 2(1): 1-19. 6. Joy P. P. & Sherin C. G., 2012. Diseases of Passion fruit (Passiflora edulis): Pathogen, Symptoms, Infection, Spread & Management, Technical Report, Kerala Agricultural University. 7. Kumar S., Stecher G., & Tamura K., 2016. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets, Molecular Biology and Evolution, 33(7): 1870-1874. 8. Larkin M. A., Blackshields G., Brown N., Chenna R., McGettigan P. A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I. M., Wilm A., and Lopez R., 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics, 23: 2947-2948. 9. Lawrence D. P., Gannibal P. B., Peever T. L., & Pryor B. M., 2013. The sections of Alternaria: formalizing species-group concepts, Mycologia, 105(3): 530-546. 10. Lawrence D. P., Rotondo F., & Gannibal P. B., 2016. Biodiversity and taxonomy of the pleomorphic genus Alternaria, Mycological Progress, 15(1): 3. 11. Phan Thị Thu Hiền, Đặng Thị Hạnh, Huỳnh Tiến Đông, Lê Đình Đôn, 2015. Nghiên cứu nấm Alternaria passiflorae gây bệnh đốm nâu trên cây chanh dây (Passiflora edulis), Tạp chí Bảo vệ Thực vật, Số 6: 17-23. 12. Ploetz R. C. (Ed.), 2003. Diseases of tropical fruit crops, CABI. 13. Ram B., Naidu R., & Singh H. P., 1977. Alternaria macrospora Zimm. a new record on passion fruit (Passiflora edulis Sims.) from India, Current Science, 46(5):165. 14. Rodrigues T. T., Maffia L. A., Dhingra O. D., & Mizubuti E. S., 2010. In vitro production of conidia of Alternaria solani, Tropical Plant Pathology, 35(4): 203-212. 15. Sankar N. R., Devamma M. N., & Giridhar D., 2012. First report of Alternaria alternata causing leaf spot on Rumex vesicarius in India, Australasian Plant Disease Notes, 7(1), 17-18. 16. Schoch C. L., Seifert K. A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J. L., Levesque C. A. &Chen W., 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(16): 6241-6246. 17. Simmons E. G., 2004. Novel dematiaceous hyphomycetes, Studies in Mycology, 50(1): l9-218. 18. Simmons E. G., 2007. Alternaria: An Indentification Manual (No. PA 632.488 S56.). 19. Simmons E. G., & Roberts R. G., 1993. Alternaria themes and variations (73), Mycotaxon, 48, 109-140. 20. Singh N. K., Patel D. B., Chaudhari S. R., Morad B. G., Rabari S. M., Chattopadhyay A., & Tetarwal M. L., 2018. Morphometric and internally transcribed spacer gene sequence-based characterization of Alternaria burnsii, Current Science, 114(9): 1927. 21. Su Y. Y., Qi Y. L., & Cai L., 2012. Induction of sporulation in plant pathogenic fungi, Mycology, 3(3), 195-200. 22. Woudenberg J. H., 2015. Restyling Alternaria, PhD thesis, Wageningen University. 23. Woudenberg J. H. C., Truter M., Groenewald J. Z., & Crous P. W., 2014. Large-spored Alternaria pathogens in section Porri disentangled, Studies in Mycology, 79: 1-47 24. White T. J., Bruns T., Lee S. J. W. T., & Taylor J. L., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR Protocols: A guide to Methods and Applications. 18(1): 315-322.