Định danh loài xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng khoai lang

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 13 6. Cohen, Y., and Coffey, M.D. 1986. Systemic Fungicides and the Control of Oomycetes. Annual Review of Phytopathology. 24:311-338. 7. Gary J Samuels and Prakash K Hebbar, 2015. Trichoderma: Identification and Agricultural Applications. APS publisher 8. Hu, J., Hong, C., Stromberg, E. L., and Moorman, G. W., 2007. Effects of propamocarb hydrochloride on mycelial growth, sporulation, and infection by Phytophthora nicotianae isolates from Virginia nurseries. Plant Dis. 91:414-420. 9. Nadiya Kollakkodan, K.N. Anith and Radhakrishnan, N.V., 2017. Diversity of endophytic bacteria from Piper spp. with antagonistic property against Phytophthora capsici causing foot rot disease in black pepper (Piper nigrum L.). Journal of Tropical Agriculture 55: 63-70 10. Nguyen, V.L., 2015. Spread of Phytophthora capsici in Black Pepper (Piper nigrum) in Vietnam. Engineering, 7, 506-513. 11. Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Quang Cơ, Lê Văn Chánh và Trần Thị Thu Hà, 2016. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm sinh học Pseudomonas putida đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây hồ tiêu giâm hom tại Pleiku, Gia Lai. Tạp chí Bảo vệ Thực vật 5:12-16 12. Toh, S. C., Samuel, L. and Awang, A. S. A. H. 2016. Screening for antifungal-producing bacteria from Piper nigrum plant against Phytophthora capsici. International Food Research Journal 23: 2616-2622. 13. Wilde, T. H. 1990. Propamocarb-HCl, a fungicide suitable for integrated pest management. Pages 303-306 in: Tomato and Pepper Production in the Tropics. Proc. Intl. Sympos. Integrated Management Practices, Taiwan. Phản biện: TS. Ngô Vĩnh Viễn ĐỊNH DANH LOÀI XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH HÉO VÀNG KHOAI LANG Identification of Actinomycete as Potential Antagonistic Ability Against Fusarium Wilt Disease on Sweet Potato Nguyễn Văn Tập 1 , Nguyễn Đức Cương 2 và Lê Minh Tường 3 Ngày nhận bài: 12.2.2019 Ngày chấp nhận: 12.3.2019 Abstract Three actinomyces TTr4, TL8 and TTh15 isolates that were collected and isolated from soil of sweet potato fields in Binh Tan district, Vinh Long province. These isolates were able to control Fusarium wilt disease caused by Fusarium oxysporum on Sweet potato but were not identified. In this research, these actinomycete isolates were identified based on morphological characteristics of cultured colony on the ISP mediums and their biochemical characteristics. In addition, the these isolates were also identified based on the 16S-rRNA gene sequence. The results showed that TL8 and TTh15 isolates are hook forms of spore-bearing mycelium; TTr4 isolate’s spore-bearing mycelium belongs to strainght form. Spore chain of TL8 is wavy form; TTr4 and TTh15 isolates’s spore chain are belong to straight forms; surface spores was smooth with three isolates. The colors of substrate of the TTr4 and TL8 isolates belongs to white group and TTh15 isolate belongs to brown group. Two TTr4 and TTh15 isolates can product melanin pigment and TL8 isolate can not produce melanin pigment. Beside, three isolates have ability to product extracellular enzymes such as protease, lipase, amylase. Comparison of the 16S-rDNA gene sequence with existing on Gene bank indicated that TTr4 isolate showed 99% similarity with Streptomyces bacillaris isolate, TL8 isolate showed 99% similarity with Streptomyces lavendulae isolate and TTh15 isolate showed 100% similarity with Streptomyces violaceoruber isolate. The results of this study will be a basis for further researchs, contributing in applications of actinomycetes as biocontrol to Fusarium wilt disease on Sweet potato. Keywords: Actinomycete, biochemical characteristics, identification, morphological characteristics. 1. Nghiên cứu sinh ngành Bảo vệ thực vật, trường Đại học Cần Thơ 2. Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long 3. Khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 14 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nhóm vi sinh vật có lợi thì xạ khuẩn là nhóm có triển vọng trong phòng trừ bệnh hại cây trồng với những đặc điểm nổi bậc do chúng có khả năng tiết ra nhiều chất kháng sinh (streptomycin, validamycin, kasugamycin, gentamycin) (Watve et al., 2001) và các enzyme ngoại bào (chitinase, glucanase, protease, lipase) để chống lại các tác nhân gây hại cây trồng (Lê Minh Tường và ctv, 2016). Theo Nguyễn Văn Tập và Lê Minh Tường, (2018), 3 mẫu xạ khuẩn TTr4, TL8 và TTh15 có khả năng đối kháng cao với nấm F. oxysporum trong điều kiện phòng thí nghiệm với bán kính vòng vô khuẩn từ 6,4mm đến 7,4mm và hiệu suất đối kháng từ 53,4% đến 64,2%. Bên cạnh đó, 3 mẫu xạ khuẩn trên cũng có khả năng quản lý bệnh héo rũ trên khoai lang trong điều kiện nhà lưới (Nguyễn Văn Tập và ctv, 2018). Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là định danh đến loài 3 chủng xạ khuẩn trên dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính hóa sinh và trình tự gene vùng 16S- rRNA. Từ đó, làm cơ sở cho những nghiên cứu sau nhằm tìm ra sản phẩm sinh học có nguồn gốc từ xạ khuẩn có khả năng quản lý bệnh héo vàng gây hại khoai lang nói riêng và quản lý bệnh có nguồn gốc từ đất nói chung vừa hiệu quả vừa thân thiện với môi trường. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Ba chủng xạ khuẩn thí nghiệm được nhận được từ Bộ môn Bảo vệ thực vật, trường Đại học Cần Thơ. Theo Nguyễn Văn Tập và Lê Minh Tường, (2018), 3 chủng TTr4, TL8 và TTh15 có khả năng đối kháng cao với nấm F. oxysporum trong điều kiện phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó, 3 chủng xạ khuẩn trên cũng có khả năng quản lý bệnh héo rủ trên khoai lang trong điều kiện nhà lưới (Nguyễn Văn Tập và ctv, 2018). 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất và sắc tố tan Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Shirling và Gottlieb (1966). Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP (International Streptomyces Project) ở điều kiện nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu ghi nhận là quan sát màu sắc hệ sợi cơ chất, hệ sợi khí sinh và sắc tố tan tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy ở thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau thí nghiệm. Ghi nhận các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây (Shirling và Gottlieb, 1966). Quan sát cuống sinh bào tử và hình dạng bề mặt bào tử Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Tresner et al. (1961). Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MS trong 5 ngày để nhân mật số. Chuỗi bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định dạng chuỗi bào tử của xạ khuẩn như sau: dạng thẳng, dạng hình móc câu và dạng xoắn ốc... Hình dạng bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử để xác định các dạng bào tử như sau: bào tử dạng trơn, bào tử dạng gai, bào tử dạng khối u, bào tử dạng có lông 2.2.2 Đặc tính sinh hóa Khả năng tiết enzym protease của các chủng xạ khuẩn Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Mitra and Chakrabartty (2005). Các chủng xạ khuẩn được nhân nuôi trên môi trường MS trong 5 ngày để nhân mật số. Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (có đường kính 5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Skim milk agar. Sau đó, tiến hành đo bán kính vòng phân giải protein ở thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau thí nghiệm. Khả năng tiết enzym lipase của các chủng xạ khuẩn Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Ertuğrul et al., (2007). Các chủng xạ khuẩn được nhân nuôi trên môi trường MS trong 5 ngày để nhân mật số. Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (có đường kính 5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Tween 80 agar. Sau đó, tiến hành đo bán kính vòng phân giải lipid ở thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau thí nghiệm. Khả năng tiết enzym amylase của các chủng xạ khuẩn Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Santos (2012). Xạ khuẩn được nhân nuôi trên môi trường MS trong 5 ngày để nhân mật số. Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (có đường kính 5mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường tinh bột. Sau đó, tiến hành Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 15 đo bán kính vòng phân giải tinh bột ở thời điểm 3, 5 và 7 ngày sau thí nghiệm. Sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Shirling and Gottlieb (1966). Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP6 ở nhiệt độ phòng. Sau đó, quan sát màu của môi trường ở thời điểm 4 ngày sau thí nghiệm. Nếu sinh sắc tố melanin, thì màu của môi trường nuôi cấy sẽ chuyển từ màu vàng sang màu nâu cho đến màu đen. 2.2.3 Định danh đến loài các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử Tách chiết DNA của 3 chủng xạ khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Weisburg et al., (1991). Cặp mồi được sử dụng để khuyếch đại đoạn gen 16S-rRNA của các chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu là: 1492R: 5’- TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ và 27: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ (Weisburg et al., 1991). Thành phần phản ứng PCR: hỗn hợp phản ứng PCR có thể tích 25 µl với thành phần hóa chất gồm: 13,35 µl nước; 2,5 µl buffer; MgCl2 2 µl; dNTPS 4 µl; DMNSO 0,5 µl; 0,25 µl Taq polymerase; 0,25 µl mồi 27F; 0,25 µl mồi 1492R và 2 µl DNA của xạ khuẩn. Phản ứng PCR với chu kì nhiệt bắt đầu bằng giai đoạn biến tính DNA ở 95 o C trong 5 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ lặp lại của giai đoạn biến tính ở 95 o C trong 1 phút, giai đoạn bắt cặp ở 53 o C trong 30 giây và giai đoạn kéo dài ở 72 o C trong 90 giây. Tiếp theo là giai đoạn kéo dài trong 5 phút ở 72 o C để chắc chắn rằng các sợi DNA đã được bổ sung hoàn toàn bởi dTNPS. Sau đó sản phẩm PCR sẽ được đưa vào bảo quản ở 10 o C. Sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 1,5%. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification Kit của QIAGEN. Mẫu phân tích được giải trình tự tại phòng thí nghiệm Bệnh cây, Khoa Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo, Nhật Bản (Giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL). Phân tích kết quả bằng phần mềm sequecing analysis 6.0 và so sánh với kết quả trên ngân hàng gen để xác định tên của xạ khuẩn. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Định danh xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa Kết quả về đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa của 3 chủng xạ khuẩn thí nghiệm được trình bày ở bảng 1, hình 1 và hình 2. Bảng 1. Đặc điểm về hình thái và đặc điểm sinh hóa của 3 chủng xạ khuẩn thí nghiệm Đặc điểm Chủng xạ khuẩn thí nghiệm TTr4 TL8 TTH15 Cuống sinh bào tử Thẳng (R) Mốc câu (RA) Mốc câu (RA) Chuổi bào tử Thẳng (R) Rợn sóng (RF) Thẳng (F) Bề mặt bào tử Trơn Trơn Trơn Màu sắc Trắng Trắng Nâu Sắc tố melanin Có Không có Có Tiết enzym Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase Gram dương dương dương Chủng TTr4 có chuỗi bào tử dạng thẳng (R), cuống sinh bào tử dạng thẳng (R), bề mặt bào tử dạng trơn, chủng này có màu trắng trên môi trường nuôi cấy. Chủng TTr4 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và có khả năng sinh melanin. Bên cạnh đó dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn TTr4 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase. Chủng TL8 có chuỗi bào tử dạng gợn sóng (RF), cuống sinh bào tử dạng mốc câu (RA), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu trắng. Chủng TL8 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy và không có khả năng sinh melanin. Bên cạnh đó dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn TL8 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 16 Chủng TTh15 có chuỗi bào tử dạng thẳng (R), cuống sinh bào tử dạng mốc câu (RA), bề mặt bào tử dạng trơn, trên môi trường nuôi cấy có màu nâu. Chủng TTh15 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy tuy nhiên có khả năng sinh sắc tố melanin. Bên cạnh đó dựa vào các đặc điểm chung của xạ khuẩn đã được nghiên cứu trước đây xác định các đặc điểm nhận dạng xạ khuẩn và xác định được chủng xạ khuẩn TTh15 thuộc Gram dương và có khả năng tiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase và lipase. Hình 1. Hình dạng chuổi bào tử dạng rợn sóng (A); cuống sinh bào tử dạng mốc câu (B) và bề mặt bào tử trơn (C) được quan sát dưới kính hiển vi quang học (A), (B) và kính hiển điện tử (C) Hình 2. Khả năng tạo sắc tố melanin (A) và không tạo sắc tố melanin (B) trên môi trường nuôi cấy ISP6 của xạ khuẩn ở 4 ngày sau khi cấy Bảng 2. Khả năng tiết enzyme amylase, lipase và protease của các chủng xạ khuẩn Nghiệm thức Bán kính vòng phân giải cơ chất (mm) của 3 chủng xạ khuẩn ở 7 ngày sau khi thí nghiệm amylase protease lipase TTr4 8,8 a 8,4 b 9,0 a TL8 7,4 b 10,8 a 9,0 a TTh15 8,8 a 8,2 b 9,0 a Mức ý nghĩa * * * CV (%) 11,38 8,24 7,86 Ghi chú: Các trung bình trong cùng một cột được theo sau bởi một hay những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan. (*) khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Chuỗi bào tử A B A B C Cuống sinh bào tử Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 17 Các đặc điểm hình thái và sinh hóa của ba mẫu xạ khuẩn TTr4, TL8 và TTh15 được so sánh với khóa phân loại xạ khuẩn của International Streptomyce Project (Shirling và Gottlieb, 1972; Pridham et al., 1958; Waksman, 1961) cho thấy ba mẫu xạ khuẩn này được xếp vào chi Streptomyces. Hơn nữa, kỹ thuật PCR và giải trình tự sản phẩm PCR được sử dụng tiếp theo để có thể xác định chính xác đến tên loài của các mẫu xạ khuẩn trên. 3.2 Định danh các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử DNA của ba mẫu xạ khuẩn được chiết tách bằng phương pháp của Saito và ctv, 2006 và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi (1492R: 5’- TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ và 27: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’) để nhân vùng 16S-rRNA (Weisburg et al., 1991). Kết quả cho thấy sản phẩm PCR của ba mẫu xạ khuẩn được khuếch đại với kích thước băng sản phẩm là 1500 bp (Hình 3). Hình 3. Sản phẩm PCR được khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S-rRNA của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu Dựa vào kết quả bảng 3 cho thấy các chủng xạ khuẩn thí nghiệm có mức độ tương đồng từ 99 – 100% khi so sánh với loài chuẩn dựa vào trình tự gen vùng 16S rRNA. Cụ thể là chủng TTr4 có mức tương đồng với loài Streptomyces bacillaris là 99%; chủng TL8 có mức tương đồng với loài Streptomyces lavendulae là 99% và chủng TTh15 có mức tương đồng với loài Streptomyces violaceoruber là 100%. Bảng 3. Kết quả xác định ba mẫu xạ khuẩn dựa trên trình tự vùng 16S-rDNA Mẫu xạ khuẩn Loài xác định kích thước trình tự (bp) Mức độ tương đồng (%) Mã số của chủng tương đồng trên GenBank TTr4 Streptomyces bacillaris 1515 99 DQ645958.1 TL8 Streptomyces lavendulae 1476 99 NR_112436.1 TTH15 Streptomyces violaceoruber 1477 100 NR_041114.1 Theo kết quả nghiên cứu của Lê Minh Tường và ctv, (2018) thì 2 chủng xạ khuẩn có tên khoa học là Streptomyces lavendulae và Streptomyces bacillaris có khả năng phòng chống bệnh vàng lá thối rễ do nấm Fusarium solani gây hại cây có múi ở đồng bằng sông Cửu Long. Bên cạnh đó, chủng xạ khuẩn có tên khoa học là loài Streptomyces violaceoruber cũng có khả năng quản lý bệnh đạo ôn hại lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra (Dương Thị Ngọc, 2014). 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - Ba chủng xạ khuẩn nghiên cứu thuộc loài Streptomyces bacillaris, loài Streptomyces lavendulae, và loài Streptomyces violaceoruber. - Đề nghị đánh giá khả năng phòng trị bệnh héo rủ trên khoai lang của 3 chủng xạ khuẩn trên ở điều kiện diện rộng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Minh Tường, Đinh Hồng Thái, Lý Văn Giang và Phạm Tuấn Vũ, 2016. Quản lý dịch hại cây trồng thân thiện môi trường. (Chủ biên: Nguyễn Thị Thu Cúc và Lê Văn Vàng). NXB Đại học Cần Thơ, trang 203-217. 2. Lê Minh Tường, Ngô Thành Trí và Nguyễn Hồng Quí, 2018. Định danh xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi. Tạp chí Bảo vệ thực vật. Số 4, trang 38-42. 3. Nguyễn Văn Tập và Lê Minh Tường, 2018. Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ trên khoai lang. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, 17, trang 52-57. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 18 4. Nguyễn Văn Tập, Nguyễn Đức Cương và Lê Minh Tường, 2018. Khả năng phòng trừ bệnh héo vàng trên khoai lang (Fusarium oxysporum) của xạ khuẩn Actinomyces sp. trong điều kiện nhà lưới. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, 22, trang 41-48. 5. Ertuğrul, S., G. Dönmez and S. Takaç, 2007. Isolation of lipase producing Bacillus sp. from olive mill wastewater and improving its enzyme activity. Journal of Hazardous Materials, 149(3): 720-724. 6. Mitra, P., and P. Chakrabartty, 2005. An extracellular protease with depilation activity from Streptomyces nogalator. Journal of Scientific and Industrial Research, 64(12): 978 7. Pridham, T. G., Hesseltin, C. W., and Benedict, R. G., 1970. A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections. App. Microbiol. 6: 52. 8. Saito, K., Togashi, K., Arie, T and Teraoka, T. , 2006. A simple method for a mini-preparation of fungal DNA. Journal of general plant pathology, 72: 348-350. 9. Santos, É.R.D., Z.N.S. Teles, N.M. Campos, D.A.J.D. Souza, A.S.D.R. Bispo and R.P.D. Nascimento, 2012. Production of α-amylase from Streptomyces sp. SLBA-08 strain using agro-industrial by-products. Brazilian Archives of Biology and Technology, 55(5): 793-800. 10. Shirling, E.T. and D. Gottlieb, 1966. Methods for characterization of Streptomyces species. International journal of systematic bacteriology, 16(3): 313-340. 11. Shirling, E.T. and Gottlieb, D., 1972. Cooperative description of type strains of Streptomyces V. Additional descriptions. International Journal of Systematic Bacteriology, 22(4): 265-394. 12. Tuzun, S. and J. Kloepper, 1995. Practical application and implementation of induced resistance. In Induced Resistance to Disease in Plants: 152-168. Springer Netherlands 13. Tresner, H., M. Davies and E. Backus, 1961. Electron microscopy of Streptomyces spore morphology and its role in species differentiation. Journal of Bacteriology, 81(1), 70-80. 14. Waksman, S.A, (1961). The Actinomycetes: Classification, identification and descriptions of genera and species. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, USA. 15. Waksman, S.A, 1961. The Actinomycetes: Classification, identification and descriptions of genera and species. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, USA. 16. Watve, M.G., R. Tickoo, M.M. Jog and B.D. Bhole (2001). How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces?. Archives of microbiology, 176(5): 386-390. 17. Weisburg, W.G., S.M. Barns, D.A. Pelletier, and D.J. Lane, 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of bacteriology,173(2), 697-703. Phản biện: TS. Nguyễn Đức Huy XÁC ĐỊNH PHỔ KÝ CHỦ CỦA Alternaria passiflorae GÂY BỆNH ĐỐM NÂU TRÊN CHANH DÂY (Passiflora edulis) TRONG ĐIỀU KIỆN LÂY NHIỄM NHÂN TẠO Host Determination of Alternaria passiflorae Causing the Brown Spot Disease on Passion Fruit (Passiflora edulis) in Artificial Inoculation Condition Phan Thị Thu Hiền 1 , Võ Thị Bảo Trang 1 , Đàng Nguyên Lưu Vi Vy 1 , Mai Quốc Cường 2 và Lê Đình Đôn 2 Ngày nhận bài: 15.2.2019 Ngày chấp nhận: 11.3.2019 Abstract A host spectrum of Alternaria passiflorae caused a brown spot disease on Passiflora edulis f. edulis was evaluated in this study. In laboratory condition, Alternaria passiflorae (isolate LĐ4T-3.10) caused a typical symptom on leaves of longan (Dimocarpus longan), durian (Durio zibethinus) and rubber (Hevea brasiliensis) after 3 to 10 days inoculated in both methods; injured by pin pricking and unpricked. In the net house, pathogenicity tests were conducted on ten different cultivars by spraying a spore suspention at 107 spores per milliliter. Results showed that Alternaria passiflorae (isolate LĐ4T-3.10) infected on mustard 1. Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II 2. Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh)