Định lượng lhasng thể kháng Phenolic Glycolipid I (PGL-I) có thể theo dõi và tiên lượng điều trị bệnh phong

Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 1/1.17( .13(12/, /2/,3,, 3/,2 7( 7(22, 7,(1/1,(875(1321 Nguyễn Phúc Như Hà*1, Trần Lê Minh Đức1, Trần Duy Thạch1, Nguyễn Thị Thời Loạn1, Nguyễn Thanh Tân1, Trần Xuân Việt1, Yuji Miyamoto2, Masanori Kai2, Vũ Tuấn Anh1 TÓM TẮT Định lượng nồng độ kháng thể kháng PGL-I trên 202 mẫu huyết thanh được lấy vào các thời điểm trước, trong và sau khi hoàn thành MDT của 56 bệnh nhân phong, bằng kỹ thuật ELISA; đồng thời theo dõi thời điểm xảy ra phản ứng phong của những bệnh nhân nói trên trong quá trình điều trị MDT liệu trình 12 tháng. Kết quả cho thấy: Nồng độ kháng thể kháng PGL-I là rất khác nhau trên từng cá thể, xu hướng chung là giảm dần theo thời gian trong quá trình điều trị, tại thời điểm 6 tháng điều trị MDT mức kháng thể trung bình giảm đi 50,2% và tại thời điểm kết thúc điều trị giảm còn 33,7% so với mức kháng thể ban đầu; Trong một số trường hợp nếu mức kháng thể kháng PGL-I tại thời điểm ban đầu ở mức cao và/hoặc có sự gia tăng mức kháng thể trong quá trình MDT thì có liên quan đến khả năng xảy ra PƯP. Nồng độ kháng thể kháng PGL-I giảm đi rất nhanh ở các bệnh nhân có phản ứng phong đã xảy ra trước điều trị hay những bệnh nhân được can thiệp đồng thời điều trị phản ứng phong và MDT ngay khi được chẩn đoán. Lượng giá kháng thể kháng PGL-I bằng ELISA có thể tiên lượng khả năng xảy ra phản ứng phong nhằm điều trị kịp thời phản ứng phong và điều trị bệnh phong hiệu quả. Từ khóa: PGL-I, Mycobacterium leprae, bệnh phong, phản ứng phong . 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng nguyên PGL-I, một kháng nguyên đặc hiệu của Mycobacterium leprae, đã được sử dụng rộng rãi trong huyết thanh học chẩn đoán và nghiên cứu bệnh phong. Nhiều ứng dụng nhằm sàng lọc người tiếp xúc có nguy cơ mắc bệnh phong tại cộng đồng, để phát hiện sớm và điều trị dự phòng [1,2]. Các nghiên cứu ứng dụng lâm sàng, theo dõi lượng kháng thể kháng PGL-I có thể đánh giá hiệu quả điều trị và tìm thấy mối liên quan giữa mức kháng thể và khả năng tồn lưu vi khuẩn phong trên người bệnh, các nghiên cứu cũng đặt ra câu hỏi sự tồn tại dai dẳng các kháng nguyên vi khuẩn phong hay sự gia tăng mức kháng thể là nguyên nhân xảy ra phản ứng phong (PƯP) [3,4], một biến chứng thường gặp trong quá trình điều trị bệnh phong và có thể để lại những tàn tật, dị hình nếu PƯP không được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và phù hợp. 1 Bệnh viện Phong Da liễu Trung Ương Quy Hòa, Việt Nam 2 Trung tâm nghiên cứu Phong, Viện Quốc Gia các bệnh nhiễm khuẩn Nhật Bản *Tác giả chính: Nguyễn Phúc Như Hà Địa chỉ: Bệnh viện Phong Da liễu Trung Ương Quy Hòa. Số 1 Chế Lan Viên, thành phố Quy Nhơn, Bình Định Điện thoại: 0914462762 Email: nguyenphucnhuha@gmail.com DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC Sử dụng kỹ thuật ELISA định lượng nồng độ kháng thể kháng PGL-I trong huyết thanh bệnh nhân phong, đánh giá sự thay đổi theo thời gian trước, trong và sau khi hoàn thành đa hóa trị liệu bệnh phong (MDT), đồng thời theo dõi thời điểm xảy ra PƯP trong quá điều trị, tìm mối liên quan giữa chúng để có thể tiên lượng khả năng xảy ra PƯP, nhằm điều trị PƯP kịp thời cũng như điều trị bệnh phong hiệu quả. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả và kỹ thuật phòng thí nghiệm 2.2 Bệnh nhân, mẫu nghiên cứu và nội dung nghiên cứu 56 bệnh nhân phong mới, nhóm MB, có chỉ số BI ≥2+; được điều trị MDT, liệu trình 12 tháng; Phát hiện từ 4/2015 đến 6/2016 tại 11 tỉnh thuộc khu vực Miền Trung - Tây Nguyên, Việt Nam (loại trừ bệnh phong có kèm bệnh nhiễm mycobacteria khác). 202 mẫu huyết thanh lấy từ 56 bệnh nhân nói trên, lấy tại 4 thời điểm: trước điều trị (T0) là 56 mẫu; tại MDT 1 tháng (T1) là 47 mẫu, tại MDT 6 tháng (T6) là 43 mẫu và lúc kết thúc MDT 12 tháng (T12) là 56 mẫu; Mẫu huyết thanh lưu giữ ở -20oC để thực hiện kỹ thuật ELISA. Thu thập thông tin lâm sàng về thời điểm xảy ra PƯP. Phân nhóm bệnh nhân theo thời điểm xảy ra PƯP: trước MDT, trong quá trình MDT và không có PƯP. Định lượng mức kháng thể kháng PGL-I trong huyết thanh bệnh nhân tại 4 thời điểm nói trên. Đánh giá sự thay đổi kháng thể theo tỉ lệ % của lần lấy mẫu sau so với lần lấy mẫu đầu tiên; Đánh giá trên từng bệnh nhân, đánh giá trên toàn bộ bệnh nhân nghiên cứu, đánh giá trên nhóm bệnh nhân theo thời điểm xảy ra PƯP; phân tích mối liên quan giữa sự thay đổi kháng thể kháng PGL-I và thời điểm xảy ra PƯP. Dữ liệu được phân tích bằng thuật toán thống kê SPSS, đối với biến định lượng, dữ liệu được mô tả bằng điểm trung bình ± độ lệch chuẩn đối với biến có phân phối chuẩn, hoặc trung vị (khoảng tứ phân vị) đối với biến có phân phối lệch. Mô hình hồi quy tuyến tính đơn biến đánh giá sự thay đổi các biến theo thời gian. Mối tương quan phân tích theo OR. 2.3 Kỹ thuật ELISA đo nồng độ kháng thể kháng PGL-I Thực hiện tại khoa Xét nghiệm, bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy Hòa. Sử dụng kỹ thuật ELISA lượng giá kháng thể IgM kháng PGL-I có trong mẫu huyết thanh được sản xuất bởi đáp ứng miễn dịch dịch thể của bệnh nhân đối với M. leprae. Bộ sinh phẩm Leprosy SD ELISA (Standard Diagnostic Inc Korea), gồm các đĩa vi lượng được gắn kháng nguyên ND-O-BSA (Natural Disaccharide - Octyl - BSA). Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ kháng thể kháng PGL-I là mật độ quang (OD: Optical Density - hay đơn vị ELISA) đo tại bước sóng 450 nm và bước sóng tham chiếu 630 nm. Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3. KẾT QUẢ 3.1 Thay đổi mức kháng thể kháng PGL-1 trên mỗi bệnh nhân Biểu đồ 1. Thay đổi mức kháng thể kháng PGL-1 trên mỗi bệnh nhân Mỗi đường biểu diễn cho sự thay đổi nồng độ kháng thể tại 4 thời điểm của từng bệnh nhân, mặc định mức kháng thể ban đầu là 1=100%, sự thay đổi kháng thể biểu hiện theo tỉ lệ % so với mức kháng thể ban đầu. So với thời điểm T0 có 15/146 mẫu biểu hiện tăng mức kháng thể, có 131/146 mẫu biểu hiện giảm mức kháng thể. 3.2 Xu hướng thay đổi và mức kháng thể kháng PGL-I trung bình của bệnh nhân phong tại 4 thời điểm T0, T1, T6 và T12 Bảng 1. Sự thay đổi kháng thể kháng PGL-I trung bình trong quá trình điều trị Thời điểm lấy mẫu Mức kháng thể TB (Đơn vị OD) Thay đổi so với T0 (%) T0 0,562 ± 0,393 100 T1 0,457 ± 0,393 83,09 ± 7,33 T6 0,272 ± 0,393 48,06 ± 11,76 T12 0,159 ± 0,352 33,73 ±9,68 p<0,001. R2= 0.38 y= -0.033x +0,524 Nồng độ kháng thể là rất khác nhau ở mỗi bệnh nhân, tại thời điểm chẩn đoán một số bệnh nhân có mức kháng thể PGL-I rất cao, cao nhất OD= 1.676 (đơn vị ELISA). Ngược lại có thể rất thấp, thấp nhất OD = 0.050, tương tự như vậy tại thời điểm kết thúc điều trị T12. Nồng độ kháng thể giữa các mẫu giao động với biên độ lớn, nhìn chung nồng độ trung bình giảm dần có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Mối liên quan giữa thời gian và sự thay đổi nồng độ kháng thể kháng PGL-I bằng mô hình hồi quy tuyến tính đơn biến cho thấy sự thay đổi nồng độ kháng thể trung bình là tương quan nghịch, tương đối chặt chẽ theo thời gian. DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3.3 Sự thay đổi mức kháng thể kháng PGL-I trên bệnh nhân với thời điểm xảy ra PƯP khác nhau Bảng 2. Nhóm bệnh nhân theo thời điểm xảy ra PƯP Thời điểm xảy ra PƯP Số BN n=56 OR χ2 = 3,621 p=0,047 Nhóm 1: PƯP xảy ra trước khi điều trị bệnh phong (PƯP(T0). 20 (35,7%) 1,33 Nhóm 2: PƯP xảy ra trong quá trình MDT (PƯP(#) Tháng thứ I: 4 bệnh nhân Tháng II đến VI: 8 bệnh nhân Tháng VI-XII: 7 bệnh nhân 19 (33,9%) 1,27 Nhóm 3: không có PƯP xảy ra (PƯP(-); 12 (21,4%) 1 Khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ, số lượng bệnh nhân có PƯP trước MDT, trong MDT so với bệnh nhân không xảy ra PƯP. Bảng 3. Sự thay đổi mức kháng thể kháng PGL-I trên 3 nhóm bệnh nhân có thời điểm xảy ra PƯP khác nhau Thời điểm Nhóm BN có PƯP (T0) n=20 Nhóm BN có PƯP(#) n=19 Nhóm BN PƯP (-) n=12 OD TB OD TB OD TB T0 0,632 ± 0,391 0,715 ± 0,393 0,311 ± 0,419 T1 0,442 ± 0,389 0,633 ± 0,392 0,289 ± 0,419 T6 0,217 ± 0,389 0,412 ± 0,392 0,163 ± 0,419 T12 0,127 ± 0,355 0,283± 0,353 0,092 ± 0,384 Tỉ lệ % so với T0 Tỉ lệ % so với T0 Tỉ lệ % so với T0 T0 100 100 100 T1 68,6 ± 7,80 82,7 ± 15,5 100,5 ± 8,3 T6 35,7 ± 12,3 53,5 ± 11,7 56,5 ± 13,2 T12 24,1 ± 10,1 41,6 ± 9,50 30,9 ± 10,1 y = - 0,040x + 0,559 R2: 0.29 p = 0.004069 y = - 0,035x + 0,659 R2: 0.11 p = 0.007283 y = - 0,018x + 0,298 R2: 0.15 p = 0.002589 Khác biệt có ý nghĩa thống kê về nồng độ TB tại mỗi thời điểm theo mỗi nhóm PƯP và mức độ thay đổi so với T0 giữa 3 nhóm PƯP. Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3.4 Sự thay đổi mức kháng thể PGL-I và khả năng xảy ra PƯP trong quá trình điều trị Bảng 4. Sự thay đổi mức kháng thể kháng PGL-1 và tần suất nguy cơ xảy ra PƯP Thời điểm xảy ra PƯP Mẫu của T1, T6 và T12 Tổng mẫu ORSố mẫu tăng nồng độ Số mẫu giảm nồng độ PƯP (T0) 2 56 58 OR=0,11 (0,02<OR<0,61) p=0,002 PƯP (-) 10 32 42 Cộng 12 88 100 PƯP (#) 3 43 46 OR=0,22 (0,04<OR<0,99) p=0,022 PƯP (-) 10 32 42 Cộng 13 75 88 PƯP (T0 và T#) 5 99 58 OR=0,16 (0,04<OR<0,57) p=0,0006 PƯP (-) 10 32 42 Tổng mẫu 15 131 146 So với thời điểm T0 có 15/146 mẫu biểu hiện tăng mức kháng thể, có 131/146 mẫu biểu hiện giảm mức kháng thể; Mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa sự tăng/giảm mức kháng thể kháng PGL1 và khả năng xảy ra PƯP trong quá trình điều trị, tuy nhiên tỉ suất chênh là thấp. 4. BÀN LUẬN Đã có các nghiên cứu theo dõi sự thay đổi kháng thể kháng PGL-I trong quá trình điều trị bệnh phong, theo Meeker HC (1990) thì những bệnh nhân có kháng thể tồn tại một thời gian dài sau điều trị có thể do tồn lưu số lượng lớn vi khuẩn chết vẫn còn trong cơ thể người bệnh [4]. Nghiên cứu của Cho SN (2001) cho thấy nồng độ kháng thể sẽ giảm dần từ khi bắt đầu điều trị, cao tại thời điểm chẩn đoán và giảm dần 25% đến 50% mỗi năm sau đó [5]. Gelber (1989) và Kai (2008) đã nhận định là thông thường mức kháng thể sẽ giảm trong tiến trình điều trị, mặc dù đây không phải là đặc tính liên tục mà nó phụ thuộc vào từng cá thể, sự suy giảm có thể tuyến tính và nhanh chóng trở về âm tính; hoặc không tuyến tính, giảm dần đến vài năm sau khi kết thúc điều trị và trở về âm tính [1, 3]; Như vậy so với các kết quả nghiên cứu nêu trên thì kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy nồng độ kháng thể kháng PGL-I là khác nhau trên mỗi bệnh nhân, có thể rất cao hoặc rất thấp. Xu hướng chung là giảm dần trong quá trình MDT, trong một số trường hợp mức kháng thể giao động trong một số thời điểm có thể tăng và/ hoặc không giảm so với thời điểm ban đầu. Mức kháng thể trung bình giảm đi 52% vào giữa liệu trình MDT và giảm còn 33% khi kết thúc liệu trình MDT, kết quả là tương tự với các dẫn liệu nghiên cứu khác về xu hướng và mức độ thay đổi kháng thể kháng PGL-I trong quá trình điều trị. Ngoài ra nghiên cứu này kỳ vọng tìm thấy mối liên quan giữa mức kháng thể kháng PGL-I và khả năng xảy ra PƯP trong quá trình MDT. Kết quả thể hiện tại Bảng 2 một điều đáng ghi nhận là ở bệnh nhân đã có PƯP xảy ra trước khi điều trị thì DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC mức kháng thể đã giảm rất nhanh trong quá trình MDT, đặc biệt trong tháng điều trị đầu tiên (giảm đến 31,4%), trong khi ở nhóm bệnh nhân PƯP(-): có nồng độ kháng thể TB thấp nhất, giảm chậm hơn và hầu như không giảm trong tháng điều trị đầu tiên. Việc giảm nhanh nồng độ kháng thể ở nhóm bệnh nhân PƯP(T0) so với mức độ giảm của 2 nhóm còn lại có thể được giải thích là do có can thiệp điều trị ENL (hay có tác động của corticoid) ngay từ khi bắt đầu MDT; điều này cũng được Anastasia P (2017) ghi nhận là corticoid có thể làm giảm nồng độ kháng thể kháng PGL-I [10]. Ở nhóm bệnh nhân PƯP(#), cho thấy mức kháng thể cao tại thời điểm chẩn đoán bệnh phong, cao nhất và cao hơn so với 2 nhóm khác. Như vậy nồng độ kháng thể cao tại thời điểm chẩn đoán bệnh phong có thể tiên lượng khả năng xảy ra PƯP trong quá trình MDT hay không? Roche P. W (1991) nhận định nồng độ kháng thể IgG kháng PGL-I cao khi bắt đầu điều trị thì có nguy cơ phát triển PƯP loại I, do đó cần theo dõi và điều trị sớm để làm giảm tổn thương thần kinh và tàn tật [6]. Brito MFM (2008) cho rằng những bệnh nhân có huyết thanh dương tính PGL-I có khả năng xảy ra PƯP trong thời gian sau điều trị lớn hơn gấp 10,4 lần so với bệnh nhân có có huyết thanh âm tính [7]. Mayra Hungria (2016) nghiên cứu trên bệnh nhân thử nghiệm lâm sàng với U-MDT/CT-BR ở Brazil, lại cho rằng không có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa PGL-I dương tính với bệnh nhân có và không có PƯP (p = 0,45) [8]. Cũng tác giả này, thực hiện tại Brazil 2017, nhằm tiên lượng khả năng xảy ra PƯP bằng việc xác định các tỉ lệ dương tính của 3 loại kháng thể kháng PGL-I, kháng LID-1 và kháng ND- O-LID, đây là các kháng nguyên tổng hợp đặc hiệu của M. leprae. Mayra kết luận: có mối liên quan giữa tỉ lệ dương tính, mức kháng thể và khả năng xảy ra PƯP, tuy nhiên không cao. Bên cạnh tác động của tải lượng vi khuẩn lên đáp ứng miễn dịch và gây nên nguy cơ phát triển PƯP, các yếu tố khác chưa được xác định có thể có liên quan đến khả năng xảy ra các PƯP trong quá trình điều trị [9]. Tại Bảng 4 nghiên cứu này cho thấy mối liên quan giữa sự tăng và/hoặc không giảm mức kháng thể PGL-I trong quá trình MDT và khả năng xảy ra PƯP là có ý nghĩa thống kê, tuy tỉ suất không cao. Như vậy huyết thanh học PGL-I ứng dụng lâm sàng dự đoán PƯP đã cho thấy nồng độ kháng thể PGL-I cao và/hoặc không giảm đi trong MDT có mối liên quan với khả năng xảy ra PƯP, nhưng không phải tất cả các nghiên cứu đều đồng thuận, mặc dù vậy các phát hiện này nên được áp dụng để theo dõi và tiên lượng khả năng xảy ra PƯP nhằm nhằm điều trị PƯP kịp thời cũng như điều trị bệnh phong hiệu quả. 5. KẾT LUẬN Nồng độ kháng thể kháng PGL-I khác nhau trên mỗi bệnh nhân phong, trong quá trình MDT xu hướng chung là giảm dần theo thời gian; Tại thời điểm 6 tháng trong liệu trình MDT, mức kháng thể trung bình giảm đi 52% và tại thời điểm kết thúc điều trị giảm còn 33,7% so với mức kháng thể ban đầu. Trên bệnh nhân phong nếu mức kháng thể kháng PGL-I cao tại thời điểm ban đầu và có sự gia tăng và/hoặc không giảm mức kháng thể là có liên quan với khả năng xảy ra PƯP. Những trường hợp bệnh nhân đã có PƯP xảy ra trước khi được chẩn đoán, trong quá trình MDT nồng độ kháng thể đã giảm đi rất nhanh, việc can thiệp đồng thời điều trị PƯP và MDT ngay thời Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC điểm ban đầu có thể đã làm giảm nhanh nồng độ kháng thể kháng PGL-I. Kỹ thuật ELISA lượng giá kháng thể kháng PGL-I nên được sử dụng để tiên lượng khả năng xảy ra PƯP để điều trị kịp thời phản ứng phong và điều trị bệnh phong hiệu quả. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kai Masanori, Nguyen Phuc Nhu Ha, et al. Serological diagnosis of leprosy in patients in Vietnam by enzyme linked immunosorbent assay with Mycobacterium leprae derived major membrane protein II. Clinical and Vaccine Immunology, 2008; 15(12): 1755-1759. 2. Moura Rodrigo Scaliante et al. Leprosy serology using PGL-I: a systematic review. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2008; 41:11-18. 3. Gelber, et al. Serum kháng bodies to dened carbohydrate antigens during the course of treated leprosy. International journal of leprosy and other mycobacterial diseases: ocial organ of the International Leprosy Association, 1989; 57(4): 744-751. 4. Meeker HC, et al. Sequential monitoring of leprosy patients with serum antibody levels to phenolic glycolipid I, a synthetic analog of phenolic glycolipid I, and mycobacterial lipoarabinomannan. International journal of leprosy and other mycobacterial diseases: ocial organ of the International Leprosy Association, 1990; 58(3): 503-511. 5. Sang Nae Cho, et al. Detection of Phenolic Glycolipid I of Mycobacterium leprae in Sera from Leprosy Patients before and after Start of Multidrug Therapy. Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2001; 8(1): 138-142. 6. Roche Paull W, Theuvenet Wim J, Britton Warwick J. Risk factors for type 1 reactions in borderline leprosy patients. The Lancet, 1991; 338(8768): 654-657. 7. Maria de Fátima de Medeiros Brito et al. Association between leprosy reactions after treatment and bacterial load evaluated using kháng PGL-I serology and bacilloscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2008; 41: 67-72. 8. Hungria Emerith Mayra, et al. Can baseline ML Flow test results predict leprosy reactions? An investigation in a cohort of patients enrolled in the uniform multidrug therapy clinical trial for leprosy patients in Brazil. Infectious diseases of poverty, 2016; 5(1): 110. 9. Hungria Emerith Mayra, et al. Leprosy reactions: The predictive value of Mycobacterium leprae specic serology evaluated in a Brazilian cohort of leprosy patients (U-MDT/CT-BR). PLoS neglected tropical diseases, 2017; 11(2): e0005396. 10. Anastasia Polycarpou, Stephen L. Walker, et al. A Systematic Review of Immunological Studies of Erythema Nodosum  Leprosum. Front Immunol, 2017; 8: 233. DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC ABSTRACT Levels of antibody anti PGL-I were measured by ELISA on 202 serum samples collected from 56 leprosy patients at points that before, under and after completion of MDT, also follow-up for the time of occurrence of leprosy reactions during MDT (12 months period). The results showed that the levels of antibody anti PGL-I was very dierent in individuals, during MDT the general trend was to decrease over time, at 6 months under MDT the mean of antibody level decreased about 52% and at the end of MDT that decreased to 33.7% compared to baseline; In some cases, if the levels of antibody to PGL-I showed high in initiation and increasing/or not change during MDT then have a associate with the risk of leprosy reaction occurrence. Anti PGL-I levels were rapidly decreased in patients who with a lepra reaction already occurrent before MDT, which may be due to simultaneous treatment of lepra reaction and MDT at diagnosed. Evaluation of PGL-I antibodies by ELISA can predict the leprosy reaction, in order to promptly leprosy reaction treatment and for eective of leprosy treatment Keywords: PGL-I, Mycobacterium leprae, leprosy, lepra reaction.