Đồ án Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4-D lên mẫu cây lá Kim Ngân ( Lonicera japonica Thunb )

laø loaïi döôïc lieäu quan troïng thuoäc hoï Kim Ngaân (Caprifoliaceae). Hoï naøy gồm khoảng 800 loài tập trung phoå bieán ôû khu vöïc oân ñôùi Baéc baùn caàu, vôùi trung taâm ña daïng naèm ôû mieàn ñoâng Baéc Myõ vaø mieàn ñoâng chaâu AÙ, trong khi khoâng coù maët taïi khu vöïc chaâu Phi nhieät ñôùi vaø mieàn nam cuûa chaâu luïc naøy. Trong phaân loaïi cuûa heä thoáng APG II naêm 2003 Caprifoliaceae Leycesteria: 6 loaøi Lonicera: 180 loaøi Symphoricarpos: 17 loaøi Triosteum: 6 loaøi Taïi Vieät Nam, chi Lonicera L. coù khoaûng 10 loaøi, taát caû ñeàu ñöôïc duøng laøm thuoác. Kim Ngaân Hoa laø caây buïi hay daây leo, ít thaáy caây thaân thaûo coù caùc ñaëc ñieåm hình thaùi sau: Thaân coù theå daøi ñeán 9-10m, roãng, coù nhieàu caønh, luùc non maøu xanh, khi giaø maøu ñoû naâu, treân thaân coù nhöõng vaïch chaïy doïc. Laù moïc ñoái nhau, hình tröùng daøi. Phieán laù roäng 1,5 - 5cm, daøi 38cm. Laù caây quanh naêm xanh töôi, muøa reùt khoâng ruïng. Hoa khi môùi nôû coù maøu traéng, nôû ra laâu chuyeån thaønh maøu vaøng. Hoa moïc ôû keõ laù, moãi keõ laù coù 2 hoa moïc treân 1 cuoáng chung. Laù baéc gioáng nhö laù caây nhöng nhoû hôn. Traøng hoa caùnh hôïp, daøi töø 2,5 – 3,5 cm, chia laøm 2 moâi khoâng ñeàu. Moâi roäng laïi chia thaønh 4 thuøy nhoû, 5 nhuïy ñính ôû hoïng traøng, moïc thoø daøi ra ngoaøi hoa. Quaû hình caàu, maøu ñen. Muøa quaû: thaùng 6 – 8. Nuï hoa hình gaäy, hôi cong queo, daøi 25cm, ñöôøng kính ñaït ñeán 5mm. Maët ngoaøi maøu vaøng ñeán vaøng naâu, phuû ñaày loâng ngaén. Muøi thôm nheï vò ñaéng. Muøa hoa: thaùng 3 – 5. Theo Taøi nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam, ngoaøi Kim Ngaân noùi treân ngöôøi ta coøn duøng moät soá loaïi Kim Ngaân sau: Kim Ngaân Daïi (Lonicera dasystyla Rehd): Laù hình tröùng nhoïn daøi 28 cm, roäng 14 cm; Meùp laù treân nguyeân, laù goác chia thuøy; Phieán laù moûng, maët treân nhaün, maët döôùi phuû loâng mòn; Hoa oáng traøng, thaúng hoaëc hôi cong, daøi 1,8 – 2,2 cm; Baàu nhaün. Kim Ngaân Loâng (Lonicera cambodiana Pierre): Laù hình thuoân hôi daøi, daøi khoaûng 5 – 12 cm, roäng 36 cm; Meùp laù nguyeân cuoän xuoáng döôùi maët laù; Phieán laù khaù daøy, maët treân nhaün, tröø cuoái gaân giöõa, maët döôùi loâng xuø xì, nhaát laø ôû gaân laù; Hoa oáng traøng, thaúng hoaëc hôi cong, daøi 56 cm; Baàu coù nhieàu loâng. Lonicera confusa D C: Laù hình thuoân daøi, daøi 46 cm, roäng 1,5 – 3 cm; Meùp laù nguyeân; Phieán laù hôi daøy, maët treân nhaün, maët döôùi coù nhieàu loâng ngaén mòn; Hoa oáng traøng thaúng hoaëc hôi cong, daøi 3 cm; Baàu coù loâng. Trong caây Kim Ngaân Hoa coù chöùa caùc thaønh phaàn hoùa hoïc nhö sau Luteolin, Inositol, Tannin, saponin (Trung Döôïc Hoïc). Hoa chöùa Scolymozid (Lonicerin), 1 soá Carotenoid (e. caroten, cryptoxanthin, auroxantin). Laù chöùa Loganin (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Chlorogenic acid, Isochlorogenic acid (Lyù Baù Ñình, 1986). Ginnol, b-Sitosterol, Stigmasterol, b-Sitosterol-D-Glucoside, Stimasteryl-D-Glucoside (Sim vaø coäng söï, 1981). Boä phaän duøng laøm thuoác thöôøng laø hoa môùi chôùm nôû, laù vaø thaân thì ít duøng hôn. Khi hoa saép chôùm nôû thì thu haùi; neân haùi vaøo khoaûng 9-10 giôø saùng (luùc naøy söông ñaõ raùo), nhaët boû taïp chaát, ñem taõi moûng phôi trong raâm maùt hoaëc saáy nheï ñeán khoâ. Daây laù coù theå thu haùi quanh naêm, thaùi nhoû, phôi khoâ, baûo quaûn nôi khoâ raùo, traùnh aåm. Coù taùc duïng döôïc lyù nhö sau: Taùc duïng khaùng khuaån: nöôùc saéc hoa Kim Ngaân coù taùc duïng öùc cheá maïnh ñoái vôùi tuï caàu khuaån, tröïc khuaån thöông haøn, tröïc khuaån lî Shiga. Nöôùc saéc coù taùc duïng maïnh hôn caùc daïng baøo cheá khaùc (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Khi nghieân cöùu taùc duïng khaùng khuaån in vitro baèng caùc phöông phaùp  khuyeách taùn vaø heä noàng ñoä, ngöôøi ta thaáy nöôùc saéc coâ ñaëc 100% cuûa hoa Kim Ngaân coù taùc duïng khaùng khuaån maïnh ñoái vôùi caùc tröïc khuaån lî, dòch haïch, thöông haøn, caän thöông haøn, lieân caàu khuaån tan maùu, phaåy khuaån taû. Taùc duïng yeáu hôn ñoái vôùi caùc tröïc khuaån baïch haàu, E.Coli, pheá caàu, tuï caàu khuaån vaøng. Nöôùc saéc laù Kim Ngaân vôùi noàng ñoä 201,2% öùc cheá tröïc khuaån Shiga, vôùi noàng ñoä 2050% öùc cheá tröïc khuaån caän thöông haøn, noàng ñoä 100% coù taùc duïng ñoái vôùi tieâu caàu khuaån (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Taùc duïng treân ñöôøng huyeát: Nöôùc saéc hoa Kim Ngaân cho uoáng coù taùc duïng ngaên chaën choaùng phaûn veä ôû chuoät lang. ÔÛ chuoät lang uoáng Kim Ngaân, soá löôïng vaø tính chaát caùc döôõng baøo ôû maïc treo ruoät ít thay ñoåi. Löôïng Histamin ôû phoåi chuoät lang bò choaùng phaûn veä cao gaáp röôõi so vôùi chuoät lang bình thöôøng vaø chuoät lang uoáng Kim Ngaân tröôùc khi gaây choaùng (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Taùc duïng khaùng vieâm: Laøm giaûm chaát xuaát tieát, giaûi nhieät vaø laøm taêng taùc duïng thöïc baøo cuûa baïch caàu (Trung Döôïc Hoïc). Taùc duïng höng phaán trung khu thaàn kinh: Cöôøng ñoä baèng 1/6 cuûa caø pheâ (Trung Döôïc Hoïc). Taùc duïng choáng lao: Nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa in vitro coù taùc duïng choáng Mycobacterium tuberculosis. Cho chuoät uoáng nöôùc saéc Kim Ngaân hoa roài cho chích vi khuaån lao cho thaáy ít thay ñoåi ôû phoåi hôn loâ ñoái chöùng (Trung Döôïc Hoïc). Khaùng Virus: Nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa  coù theå laøm giaûm söùc hoaït ñoäng cuûa PR8 ôû virus cuùm nhöng khoâng coù taùc duïng ôû phoâi gaø con ñaõ tieâm chuûng (Trung Döôïc Hoïc). Taùc duïng chuyeån hoùa Lipid: Cho chuoät beùo phì duøng löôïng lôùn Cholesterol voã beùo cho chuoät ñoàng thôøi cho uoáng nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa, möùc Cholesterol trong maùu cuûa chuùng thaáp hôn so vôùi nhoùm ñoái chöùng (Trung Döôïc Hoïc). Trong nhaõn khoa: Nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa coù hieäu quaû trong ñieàu trò cho nhöõng tröôøng hôïp bò keát maïc vieâm maïn, giaùc maïc loeùt (Trung Döôïc Hoïc). Laøm haï Cholesterol trong maùu (Trung Döôïc Hoïc). Taêng baøi tieát dòch vò vaø maät (Trung Döôïc Hoïc). Taêng taùc duïng thu lieãm do coù chaát Tanin (Soå Tay Laâm Saøng Trung Döôïc). Coù taùc duïng lôïi tieåu (Soå Tay Laâm Saøng Trung Döôïc). Ñieàu kieän troàng troït Kim Ngaân coù nguoàn goác ôû vuøng Ñoâng AÙ, phaân boá ôû Trung Quoác, Nhaät Baûn vaø Trieàu Tieân. ÔÛ Vieät Nam, Kim Ngaân phaân boá chuû yeáu ôû caùc tænh vuøng nuùi vaø trung du phía baéc, nhö Quaûng Ninh, Cao Baèng, Laïng Sôn, Baéc Giang, Haø Taây,… Kim Ngaân thích nghi vôùi nhieàu loaïi ñaát vaø khí haäu khaùc nhau. Caây öa saùng, thöôøng moïc ôû röøng thöù sinh, ñoài caây buïi vaø röøng thöa nuùi ñaù voâi. Gioáng Caây Kim Ngaân coù 2 caùch nhaân gioáng: Nhaân gioáng höõu tính vaø nhaân gioáng voâ tính Nhaân gioáng höõu tính: Duøng haït ñeå gieo, ñaàu thaùng 11 thu hoaïch quaû chín, trong moãi quaû coù 4-7 haït. Ñem haït phôi khoâ, caát giöõ ñeán cuoái thaùng 3 naêm sau ñem gieo. Boû haït vaøo nöôùc aám 300C ngaâm 21 giôø, vôùt ra troän vôùi caùt aåm ñeå thuùc ñaåy söï naûy maàm, khi haït ñaõ nöùt voû treân 30% thì ñem gieo. Nhaân gioáng voâ tính truyeàn thoáng Cho tôùi nay caùc nôi troàng Kim Ngaân phaàn lôùn duøng caùch nhaân gioáng voâ tính truyeàn thoáng goàm hai caùch: troàng baèng caém hom vaø troàng baèng ñaùnh tæa choài. + Caùch nhaân gioáng baèng ñaùnh tæa choài: Ñaùnh tæa choài thöôøng phaûi choïn luùc treân choài coù nuï hoa ñang nôû. Vì theá neáu ñaùnh choài ñi troàng thì sang naêm caây meï seõ khoâng ra hoa vaø aûnh höôûng tôùi saûn löôïng. Do ñoù caùch naøy thöôøng ít khi ñöôïc söû duïng + Caùch troàng baèng hom: Caùch troàng baèng hom laø caét laáy ñoaïn thaân caây chöa ra hoa ñeå mang ñi troàng. Caùch laøm naøy ñôn giaûn, caây ra hoa sôùm neân baø con noâng daân thích duøng caùch nhaân gioáng naøy. Luùc caém hom toát nhaát laø choïn ngaøy raâm maùt sau khi möa, vì ñaát aåm, ñoä aåm khoâng khí cao, caém xong tyû leä caây soáng cao.  Hom caàn phaûi choïn ôû caây khoeû maïnh, caây ñaõ moät, hai tuoåi, tyû leä soáng cao nhaát, sinh tröôûng cuõng nhanh. Tröôùc khi caém phaûi cuoác hoác roài ñaët hom vaøo hoác; ôû doác nuùi vaø ñaát bôø ruoäng khoaûng caùch giöõa caùc caây 1,3 – 1.7m choã ñaát ñai khaùc noùi chung haøng caây caùch nhau laø 1,7m, hoác saâu. Chaêm soùc Vun xôùi ñaát: Vun xôùi ñaát coù theå laøm cho ñaát tôi xoáp giöõ cho goác caây ñöôïc vöõng chaéc, laøm cho reã moïc nhieàu, caây moïc nhieàu caønh. Haøng naêm vaøo tieát tröôùc kinh traäp (khoaûng ngaøy 5 thaùng 3 haøng naêm), tieán haønh vun xôùi ñaát moät laàn vaø vaøo tröôùc luùc böôùc vaøo muøa ñoâng laïnh giaù cuoái thu vun goác caây laàn thöù hai. Laøm coû: Moãi naêm coù theå laøm coû 3 - 5 laàn. Khi laøm coû neân chuù yù tröôùc heát baét ñaàu töø ngoaøi vaøo goác, veà sau laøm daàn vaøo, laàn tröôùc xôùi ñaát saâu, caùc laàn sau xôùi noâng daàn ñeå traùnh reã bò toån thöông. Boùn phaân: Moãi naêm boùn phaân thuùc moät laàn, boùn vaøo luùc tröôùc khi böôùc vaøo muøa ñoâng hoaëc tröôùc khi caây ñaâm choài naûy loäc ñaàu xuaân. Nhöõng laàn sau coù theå boùn vaøo sau luùc ñaâm choài moät laàn vaø sau khi haùi heát hoa boùn moät laàn. Töôùi nöôùc: Thöïc teá cho thaáy töôùi nöôùc coù taùc duïng nhaát ñònh ñoái vôùi vieäc laøm taêng saûn löôïng. Vì theá vaøo muøa xuaân khoâ haïn neân tieán haønh töôùi nöôùc cho caây Tæa bôùt caønh: Tæa ôû nhöõng caây caønh moïc quaù daøy. Khi tæa phaûi naém vöõng nguyeân taéc tæa töø trong ra ngoaøi, chia ra töøng lôùp. Vieäc tæa caønh naøy seõ goùp phaàn laøm cho caây ra hoa nhieàu hôn Phoøng tröø saâu beänh Kim Ngaân raát ít saâu beänh. Saâu haïi Kim Ngaân coù reäp laø nghieâm troïng nhaát, loaøi naøy thöôøng xuaát hieän tröôùc khi caây ra hoa. Ñeå phoøng reäp thì cuoái ñoâng ñaàu xuaân phaùt vaø cuoác heát coû daïi ôû xung quanh goác caây, ñaøo xôùi cho ñaát tôi xoáp ôû xung quanh goác caây laø ñaõ tieâu dieät ñöôïc moâi tröôøng laây lan cuûa reäp. Haïn cheá duøng hoaù chaát tröø saâu beänh vì noù seõ laøm cho hoa bò nhieãm ñoäc khoâng an toaøn cho döôïc lieäu sau naøy. Thu hoaïch vaø cheá bieán:  Thu hoaïch: Thôøi vuï thu hoaïch Kim Ngaân laø töø cuoái thaùng 5 ñeán ñaàu thaùng 6, töø luùc caây coù nuï hoa ñeán luùc hoa nôû trong khoaûng 15 ngaøy. Thôøi gian haùi hoa neân choïn luùc nuï hoa maøu xanh trôû thaønh maøu traéng, luùc hoa baét ñaàu nôû laø toát nhaát.Sau khi haùi hoa veà neân phôi vaø saáy khoâ ngay. Hoa sau khi ñaõ phôi saáy khoâ neân chuù yù baûo quaûn ôû nôi thoaùng gioù, traùnh nôi aåm öôùt. Nhöõng nghieân cöùu chính veà Kim Ngaân Hoa Trong nöôùc Leâ Thò Dieãm Hoàng vaø coäng söï (2007) ñaõ nghieân cöùu taùc duïng choáng vieâm maõn tính cuûa saponin vaø flavonoid caây Kim Ngaân keát hôïp vôùi α-chymotrypsin vaø α-amylase cho thaáy saponin vaø flavonoid Kim Ngaân coù taùc duïng choáng vieâm treân moâ hình gaây vieâm maïn tính. Khi keát hôïp saponin vaø flavonoid Kim Ngaân vôùi α-chymotrypsin vaø α-amylase, taùc duïng taêng leân so vôùi khi duøng ñôn ñoäc töøng hoaït chaát. Saponin vaø flavonoid Kim Ngaân keát hôïp vôùi α-chymotrypsin vaø α-amylase coù taùc duïng laøm giaûm soá löôïng baïch caàu, khoâng laøm thay ñoåi noàng ñoä protein huyeát thanh, laøm taêng tyû soá A/G, laøm giaûm noàng ñoä seromucoid huyeát thanh töông ñöông vôùi cuûa indomethacin ôû loâ ñoái chöùng. Ngoaøi nöôùc Nghieân cöùu ñaàu tieân cuûa söï phaùt sinh moâ seïo töø caây treân 6 thaùng tuoåi do D. Georges vaø coäng söï (1993) ñaõ nghieân cöùu thaønh coâng söï taùi sinh caây Lonicera japonica "Hall's Prolific" töø nuoâi caáy moâ laù tröôûng thaønh, thaân vaø ñoát reã treân moâi tröôøng chöùa 10,7 µM NAA vaø 2.7 µM BA, trong khi ñoù moâi tröôøng chöùa 2,4-D laïi laøm cheát nhanh choùng caùc maãu caáy. Keát quaû cho thaáy söï taùi sinh choài ñaït ñöôïc tyû leä cao nhaát treân moâi tröôøng chæ chöùa BA (4.4 töø 44.4 µM ). Söï phaùt sinh choài deã daøng vaø ñaõ beùn reã treân moâi tröôøng duøng ñeå nhaân. Caây con ñem ra troàng ngoaøi töï nhieân coù tyû leä soáng khaù cao. Naêm 2003, Suk Weon Kim vaø coäng söï ñaõ tieán haønh nghieân cöùu taùi sinh Lonicera japonica Thunb thoâng qua phaùt sinh phoâi soma töø nuoâi caáy phoâi vaø nuoâi caáy huyeàn phuø teá baøo. Töø phoâi hôïp töû tröôûng thaønh ñaõ taïo ñöôïc moâ seïo vôùi taàn suaát cao 46.7% treân moâi tröôøng MS cô baûn coù boå sung 4.52 µM 2,4-D. Nuoâi caáy huyeàn phuø teá baøo treân moâi tröôøng MS loûng coù boå sung 4,52 µM 2,4-D ñaõ phaùt sinh raát nhieàu phoâi soma roài phaùt trieån thaønh caây con vôùi taàn suaát 68%. Caây con ñem troàng ngoaøi töï nhieân coù tyû leä soáng raát cao. Thôøi gian vaø ñòa ñieåm thí nghieäm Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh töø thaùng 4 ñeán thaùng 6 naêm 2009 taïi phoøng thí nghieäm thöïc vaät tröôøng Ñaïi hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä TP. HCM. Vaät lieäu Ñoái töôïng nghieân cöùu Ñoái töôïng ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu laø caây Kim Ngaân Hoa (Lonicera japonica Thunb) ñöôïc troàng taïi thaønh phoá Hoà Chí Minh. Nguoàn maãu ñöôïc söû duïng ñeå tieán haønh caùc thí nghieäm laø phaàn laù Kim Ngaân ñöôïc tuyeån choïn tröïc tieáp töø caùc vöôøn trong thaønh phoá Hoà Chí Minh. Caùc caây Kim Ngaân ñöôïc choïn phaûi khoûe, goác caây to, thaân leo toát, coù söùc soáng toát, phaàn laù non, xanh, phieán laù to, khoâng bò saâu boï phaù hoaïi. Maãu laù sau khi caét ra töø caây ñöôïc cho vaøo hoäp nhöïa vaø tieán haønh tuaàn töï theo caùc böôùc khöû truøng maãu nhö sau: Khöû truøng sô boä Maãu laù ñöôïc ñaët döôùi voøi nöôùc chaûy trong 30 phuùt ñeå loaïi boû bôùt söï nhieãm baån beà maët. Röûa kyõ töøng maãu laù trong nöôùc röûa cheùn ñöôïc pha loaõng. Röûa laïi baèng nöôùc maùy töø 4 – 5 laàn vaø ñöa vaøo tuû caáy. Khöû truøng maãu beân trong tuû caáy Chuyeån maãu sang moät erlen khaùc ñaõ ñöôïc haáp khöû truøng. Tieán haønh laéc khöû truøng maãu laù baèng dung dòch Javel (NaOCl) 7% coù boå sung theâm vaøi gioït Tween 20 trong caùc khoaûng thôøi gian khaùc nhau. Röûa laïi baèng nöôùc caát voâ truøng 3 – 4 laàn cho saïch heát chaát khöû truøng. Ngaâm maãu trong nöôùc caát voâ truøng ñeå chuaån bò tieán haønh caùc thí nghieäm. Trang thieát bò vaø duïng cuï Thieát bò: tuû voâ truøng, noài haáp, maùy ño pH, caân phaân tích, maùy laïnh, keä ñaët bình, ñeøn neon, … Duïng cuï: dao caáy, bình thuûy tinh 500 ml, ñóa, ñeøn coàn, … Caùc loaïi moâi tröôøng Moâi tröôøng söû duïng laø moâi tröôøng muoái khoaùng cô baûn cuûa Murashige vaø Skoog (1962) coù boå sung theâm ñöôøng sucrose (30 g/l), agar (9 g/l) vaø caùc chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng thöïc vaät. Tuøy theo muïc ñích cuûa töøng thí nghieäm maø moâi tröôøng coù theå boå sung caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng ôû nhöõng noàng ñoä khaùc nhau. Baûng 3.1. Moâi tröôøng MS boå sung 2,4-D vaø BA aûnh höôûng leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Kyù hieäu 2,4 – D (mg/l) BA (mg/l) A0 - - A1 0,1 0,5 A2 0,5 0,5 A3 1 0,5 A4 0,1 0,7 A5 0,5 0,7 A6 1 0,7 A7 0,1 1 A8 0,5 1 A9 1 1 A10 0,1 1,5 A11 0,5 1,5 A12 1 1,5 A13 0,1 2 A14 0,5 2 A15 1 2 Baûng 3.2. Moâi tröôøng MS boå sung NAA vaø BA aûnh höôûng leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Kyù hieäu NAA (mg/l) BA (mg/l) B0 - - B1 0,1 0,5 B2 0,5 0,5 B3 1 0,5 B4 0,1 0,7 B5 0,5 0,7 B6 1 0,7 B7 0,1 1 B8 0,5 1 B9 1 1 B10 0,1 1,5 B11 0,5 1,5 B12 1 1,5 B13 0,1 2 B14 0,5 2 B15 1 2 Caùc loaïi moâi tröôøng treân sau khi boå sung caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng ñöôïc ñieàu chænh veà pH = 5,8 (baèng NaOH 1 N hay HCl 1 N) vaø haáp khöû truøng baèng autoclave trong 30 phuùt ôû nhieät ñoä 1210C vaø aùp suaát 1 atm. Ñieàu kieän nuoâi caáy trong phoøng nuoâi caáy in vitro Thôøi gian chieáu saùng : 10 giôø/ngaøy Cöôøng ñoä chieáu saùng : 2500lux Nhieät ñoä : 25 ± 20C Phöông phaùp boá trí thí nghieäm Thí nghieäm 1: Khaûo saùt thôøi gian khöû truøng maãu caáy baèng dung dòch Javel (NaOCl) 7% Muïc ñích thí nghieäm: Xaùc ñònh thôøi gian khöû truøng thích hôïp ñoái vôùi maãu caáy laù ñeå tìm ra thôøi gian khöû truøng cho tæ leä nhieãm thaáp nhaát vaø maãu caáy vaãn coøn coù khaû naêng taêng tröôûng ñeå aùp duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Tieán haønh thí nghieäm: Maãu sau khi thu nhaän ñöôïc khöû truøng sô boä vaø ñöa vaøo tuû caáy, tieán haønh khöû truøng baèng dung dòch Javel 7% vôùi caùc khoaûng thôøi gian laàn löôït nhö sau: 3, 4, 5, 6, 7 vaø 8 phuùt. Chæ tieâu theo doõi: Tæ leä nhieãm cuûa maãu caáy öùng vôùi caùc khoaûng thôøi gian khöû truøng khaùc nhau. Ghi nhaän keát quaû vaø choïn thôøi gian khöû truøng coù tæ leä maãy caáy nhieãm ít nhaát ñoàng thôøi tæ leä maãu soáng soùt phaûi cao ñeå aùp duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Thí nghieäm 2: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùch ñaët maãu laù leân moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán khaû naêng phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu Muïc ñích thí nghieäm: Khaûo saùt caùch ñaët maãu laù cuûa Kim Ngaân Hoa ñeå tìm ra caùch ñaët maãu cho khaû naêng phaùt sinh hình thaùi nhanh vaø toát nhaát phuïc vuï cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Tieán haønh thí nghieäm: Khi tieán haønh caáy maãu laù leân moâi tröôøng nuoâi caáy ta chia thaønh 2 caùch ñaët maãu: ñaët maët treân cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng vaø ñaët maët döôùi cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa caùch ñaët maãu leân khaû naêng phaùt sinh hình thaùi. Chæ tieâu ñaùnh giaù: Quan saùt söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy, so saùnh söï phaùt trieån cuûa maãu ñoái vôùi 2 caùch ñaët maãu khaùc nhau, tìm ra caùch ñaët maãu cho phaùt sinh hình thaùi toát nhaát. Thí nghieäm 3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Muïc ñích thí nghieäm: Ñaùnh giaù taùc ñoäng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng (BA, 2,4-D, NAA) ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy. Tieán haønh thí nghieäm: Maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa sau khi khöû truøng ñöôïc caét boû rìa laù bò traéng hoaëc naâu do taùc ñoäng cuûa chaát khöû truøng vaø caét phieán laù daøi 1 – 2 cm seõ ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung 30 g/l ñöôøng sucrose, 9g/l agar, vaø caùc chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng thöïc vaät nhö trong baûng 3.1 vaø baûng 3.2. Sau 1 thaùng, ghi nhaän söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy vaø thu soá lieäu. Ñaùnh giaù hình thaùi cuûa töøng maãu trong moãi noàng ñoä khaùc nhau. Chæ tieâu theo doõi: Khoái löôïng moâ seïo taêng sinh, maøu saéc, hình daïng moâ seïo phaùt sinh sau 1 thaùng theo doõi. Ñaùnh giaù khaû naêng phaùt sinh thaønh choài vaø reã cuûa moâ seïo. Phaân tích thoáng keâ Soá lieäu thu thaäp ñöôïc xöû lyù treân maùy vi tính baèng chöông trình thoáng keâ Statgraphic 7.0. Ñoïc keát quaû döïa vaøo baûng ANOVA, baûng trung bình vaø baûng so saùnh khaùc bieät giöõa caùc nghieäm thöùc (Baèng phöông phaùp LSD). Thí nghieäm 1: Khaûo saùt thôøi gian khöû truøng maãu caáy baèng dung dòch Javel (NaOCl) 7% Maãu laù Kim Ngaân sau khi ñöôïc khöû truøng sô boä beân ngoaøi tuû caáy döôùi voøi nöôùc chaûy vaø nöôùc röûa cheùn pha loaõng seõ laøm giaûm ñaùng keå nguoàn gaây nhieãm, giuùp cho söï khöû truøng ñöôïc deã daøng hôn, sau ñoù ñöôïc ñöa vaøo tuû caáy ñeå tieán haønh khöû truøng maãu caáy baèng dung dòch Javel 7% coù boå sung vaøi gioït Tween 20 vôùi caùc khoaûng thôøi gian khaùc nhau. Maãu laù sau khi khöû truøng seõ ñöôïc caét boû vieàn xung quanh laù bò traéng, naâu do taùc duïng cuûa chaát khöû truøng, caét ñoâi laù theo ñöôøng gaân chính thu ñöôïc maãu coù kích thöôùc 1 – 2 cm vaø caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung 1 mg/l BA vaø 1 mg/l NAA. Tæ leä maãu bò nhieãm ñöôïc ghi nhaän sau 1 tuaàn vaø tieáp tuïc ñaùnh giaù tæ leä maãu taùi sinh sau 4 tuaàn nuoâi caáy. Trong 1 tuaàn nuoâi caáy ñaàu tieân cho keát quaû khöû truøng nhö baûng 4 Bảng 4.1. Keát quaû khaûo saùt thôøi gian khöû truøng maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa Nghieäm thöùc Thôøi gian (phuùt) Tæ leä maãu nhieãm(%) Tæ leä maãu cheát (%) Tæ leä maãu soáng (%) 1 3 20a (*) 0b 80b 2 4 8ab 0b 92ab 3 5 0b 0b 100a 4 6 0b 4ab 96a 5 7 0b 8ab 92ab 6 8 0b 12a 88ab (*) Trong cuøng moät coät, caùc giaù trò trung bình theo sau bôûi caùc chöõ caùi khoâng cuøng kí töï thì coù söï khaùc bieät raát coù yù nghóa veà maët thoáng keâ vôùi möùc xaùc suaát P = 0,05 Khi tieán haønh nuoâi caáy moâ thöïc vaät thì vaán ñeà lôùn nhaát laø phaûi taïo ñöôïc nguoàn maãu nuoâi caáy ñaûm baûo voâ truøng. Muïc ñích cuûa vieäc khöû truøng maãu caáy laø thu ñöôïc moät löôïng lôùn caùc maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa voâ truøng vaø vaãn coøn khaû naêng taêng tröôûng ñeå taïo ra nguoàn nguyeân lieäu cho caùc caùc thí nghieäm sau. Moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät coù chöùa ñöôøng, muoái khoaùng vaø vitamin thì raát thích hôïp cho caùc loaøi naám, vi khuaån phaùt trieån do toác ñoä phaân chia teá baøo cuûa naám vaø vi khuaån lôùn hôn raát nhieàu so vôùi teá baøo thöïc vaät. Neáu do naám, chuùng ta thaáy söï phaùt trieån cuûa khuaån ty coù caáu truùc sôïi, thöôøng maøu traéng hoaëc hôi xaùm. Neáu sôïi khuaån ty maøu xanh, chaéc chaén laø do naám penicillium. Neáu sôïi theå hieän caùc haït ñen nhoû (daïng quaû), coù theå laø do naám rhizopus nigricans, naám naøy seõ sinh soâi raát nhanh. Neáu do khuaån, thì chuùng ta seõ thaáy moät maøng coù daïng söõa, phaùt trieån beân trong moâi tröôøng vaø ôû beà maët. Maøng naøy ñoâi luùc coù maøu (nhö hoàng, vaøng,…). Vaøi loaøi vi khuaån thöôøng gaây nhieãm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. Neáu vieäc nhieãm truøng phaùt ñi töø vuøng tieáp xuùc giöõa moâ vaø moâi tröôøng caáy thì ñaây laø nhieãm do moâ. Neáu söï nhieãm khôûi ñi töø moät ñieåm baát kyø naøo ñoù trong moâi tröôøng thì nguoàn nhieãm coù theå do khoâng khí hoaëc söï khöû truøng moâi tröôøng khoâng toát hoaëc do nhieãm töø khoâng khí xung quanh. (Döông Coâng Kieân, 2002) Do ñoù, caùc maãu caáy caàn phaûi ñöôïc khöû truøng baèng caùc taùc nhaân khöû truøng hoùa hoïc. Caùc chaát khöû truøng phaûi öùc cheá hoaëc phaù huûy söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät. Hieäu löïc cuûa caùc chaát khöû truøng phuï thuoäc vaøo thôøi gian xöû lyù, noàng ñoä vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chuùng vaøo caùc keõ ngaùch loài loõm treân beà maët moâ caáy, khaû naêng ñaåy heát caùc boït khí baùm treân beà maët moâ caáy vaø coù ñoäc tính thaáp ñoái vôùi moâ caáy. Ñeå taêng tính linh ñoäng vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chaát dieät khuaån thì ta coù theå theâm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vaøo dung dòch khöû truøng seõ laøm taêng hieäu quaû khöû truøng vì laøm giaûm söùc caêng beà maët giöõa nöôùc vaø moâ thöïc vaät, nhö vaäy, beà maët maãu tieáp xuùc vôùi chaát khöû truøng toát hôn. (Nguyeãn Ñöùc Löôïng – Leâ Thò Thuûy Tieân, 2006) Töø baûng 4.1 cho thaáy, khi thôøi gian khöû truøng 3 – 4 phuùt thì chöa ñuû ñeå taïo ra ñöôïc maãu caáy voâ truøng, tæ leä maãu bò nhieãm naám vaø vi khuaån khaù cao. Trong khi ñoù, thôøi gian khaûo saùt 5 phuùt cho thaáy keát quaû khaû quan, ñuû ñeå tieâu dieät vi khuaån vaø caùc baøo töû naám maø khoâng laøm aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa maãu caáy, taïo ñöôïc khoái löôïng lôùn caùc maãu laù voâ truøng. Cô cheá taùc ñoäng cuûa chaát khöû truøng laø: phaù huûy lôùp maøng phospholipid, phaân huûy lipid vaø acid beùo, hình thaønh chloramine – caûn trôû quaù trình bieán döôõng cuûa teá baøo vi sinh vaät; gaây oxy hoùa öùc cheá khoâng thuaän nghòch caùc loaïi enzyme cuûa vi sinh vaät caàn thieát cho quaù trình bieán döôõng, phaân chia teá baøo, hình thaønh vaùch teá baøo, sinh toång hôïp lipid, vaän chuyeån caùc electron trong quaù trình hoâ haáp cuûa teá baøo vi sinh vaät. Khi hypoclorit hoaø tan trong nöôùc, chuùng sinh ra acid hypoclorô (HOCl), chaát naøy seõ toàn taïi trong dung dòch ôû 2 daïng OCl- vaø H+. Hai daïng naøy seõ chuyeån hoaù qua laïi, tuøy theo ñoä pH cuûa dung dòch. Acid hypoclorô toàn taïi trong dung dòch, seõ taùc ñoäng ñeán caùc chaát höõu cô nhö laø moät chaát hoaø tan, hình thaønh clorua laø moät chaát oxy hoaù maïnh seõ thay theá nhoùm hydro (H) trong nhoùm amino (NH) cuûa protein hình thaønh chloramine daãn ñeán söï phaù huyû amino acid, laøm bieán tính protein. Tính nguyeân veïn cuûa maøng nguyeân sinh chaát bò thay ñoåi, phospholipid hoaëc caùc acid beùo khoâng no cuûa maøng teá baøo vi sinh vaät bò phaân huyû do quaù trình xaø phoøng hoaù (Estrela vaø coäng söï, 2002). Keát quaû cuõng cho thaáy, khi taêng thôøi gian khöû truøng maãu caáy 6 – 8 phuùt thì maãu khoâng bò nhieãm nhöng tæ leä maãu soáng thaáp. Maãu bò cheát do Javel ngaám saâu vaøo moâ teá baøo laøm cho moâ teá baøo bò phaù huûy. Nhö vaäy, thôøi gian khöû truøng thích hôïp nhaát ñoái vôùi maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa laø 5 phuùt vôùi tæ leä maãu coù khaû naêng soáng soùt vaø taùi sinh laø 100%. (Baûng 4.1) Baûng 4.2. AÛnh höôûng cuûa caùch ñaët maãu caáy leân söï phaùt sinh hình thaùi sau 1 thaùng nuoâi caáy Caùch ñaët maãu laù treân moâi tröôøng Troïng löôïng töôi moâ seïo (g) UÙp 0.103017b Ngöûa 0.229317a Muïc ñích thí nghieäm ñaët ra laø nhaèm xaùc ñònh ñöôïc caùch ñaët maãu caáy leân beà maët moâi tröôøng ñeå thu ñöôïc keát quaû cho phaùt sinh moâ seïo toát nhaát trong thôøi gian ngaén nhaát. Sau 1 thaùng nuoâi caáy trong moâi tröôøng MS coù boå sung 1 BA – 1 NAA, keát quaû cho thaáy khi ñaët maët döôùi cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng (ñaët ngöûa) thì maãu caáy phaùt sinh moâ seïo töø veát caét, gaân laù vaø treân beà maët cuûa laù. Caùc maãu caáy khaùc khi ñaët maët treân cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng (ñaët uùp) thì trong 1 thaùng nuoâi caáy ñaàu tieân moâ seïo chæ phaùt sinh töø veát caét, maët treân cuûa laù laïi raát ít vaø chaäm hôn raát nhieàu, ñoâi khi khoâng coù söï phaùt sinh moâ seïo so vôùi khi ñaët maët döôùi cuûa laù leân moâi tröôøng. ÔÛ caây Cydonia oblong, Morini vaø coäng söï (2001) ñaõ nghieân cöùu söï phaùt sinh moâ seïo töø maãu caáy laù, keát quaû cho thaáy moâ seïo chæ hình thaønh treân beà maët cuûa laù Cydonia oblong. Töông töï nhö nghieân cöùu cuûa Rita and Floh (1995) vôùi maãu caáy laù Cuphea ericoides. Nhö vaäy, söï hình thaønh moâ seïo trong 1 vaøi tröôøng hôïp thì bò aûnh höôûng bôûi söï ñònh höôùng cuûa maãu caáy treân moâi tröôøng nuoâi caáy (Warren, 1991). Söï khaùc bieät giöõa 2 caùch ñaët maãu laù treân moâi tröôøng coù theå giaûi thích döïa vaøo caáu truùc cuûa laù. Maët döôùi laù thöôøng coù lôùp cutin moûng hôn vaø nhieàu khí khoång hôn (Buøi Trang Vieät, 2002; Nguyeãn Ñình Giaäu, 2000). Do ñoù, khi ñaët trong moâi tröôøng nuoâi caáy, maãu laù ñaët ngöûa seõ haáp thu nhieàu chaát dinh döôõng cuõng nhö caùc thaønh phaàn khaùc cuûa moâi tröôøng hôn. Taùc duïng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy deã daøng phaùt huy hôn. Treân laù, chuû yeáu phaàn gaân cuoái laù bò toån thöông do söï caét ra khoûi cuoáng. Khi ñaët maãu laù ngöûa, phaàn gaân naøy ñöôïc tieáp xuùc nhieàu vôùi moâi tröôøng vaø haáp thu caùc chaát nhanh hôn nhöõng vò trí khaùc cuûa laù. Vaø luùc naøy, chuùng trôû thaønh caùc "beå" thu huùt chaát dinh döôõng cuõng nhö nhöõng chaát khaùc töø caùc nôi ñoå veà. Ñoàng thôøi khi quan saùt laù trong thôøi gian ñaàu nuoâi caáy nhaän thaáy coù söï cong ñaëc tröng cuûa phieán laù. Laù coù xu höôùng cong leân khi ñaët ngöûa vaø cong xuoáng khi ñaët uùp. Töø ñoù coù theå keát luaän caùc teá baøo laù ôû maët treân nhaïy caûm vaø phaûn öùng toát hôn. Pierik vaø Zwart chöùng minh raèng söï taïo choài baát ñònh cuûa maãu caáy laù taêng nhieàu khi ñeå cho lôùp bieåu bì döôùi cuûa phieán laù Kalanchoe farinacea tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy (ñaët ngöûa). Töø baûng 4.2 cuõng cho thaáy troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo ñaït ñöôïc trong 1 thaùng cuõng coù söï cheânh leänh ñaùng keå. Ñoái vôùi maãu caáy ñaët ngöûa thì troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo taêng leân laø 0.229317 g/maãu trong khi ñaët uùp thì chæ coù 0.103017 g/maãu. Ñieàu naøy chöùng toû raèng, söï ñònh höôùng cuûa maãu caáy aûnh höôûng raát lôùn ñoái vôùi söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa. Nhö vaäy, ñoái vôùi maãu laù Kim Ngaân Hoa thì khi ñaët ngöûa thì khaû naêng maãu phaùt sinh moâ seïo töø veát caét, gaân laù vaø treân caû beà maët cuûa laù toát hôn vaø khoái löôïng moâ seïo taêng sinh nhanh so vôùi khi ñaët uùp. Thí nghieäm 3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Thí nghieäm 3.1: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi 2,4-D leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Baûng 4.3. Aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp 2,4-D leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa ñöôïc ghi nhaän sau 1 thaùng nuoâi caáy Nghieäm thöùc Noàng ñoä (mg/l) Troïng löôïng töôi moâ seïo (g) 1 A1 0.5335 e 2 A2 0.78006 bc 3 A3 0.68716 cd 4 A4 0.53418 e 5 A5 1.28192 a 6 A6 0.77308 bc 7 A7 0.6321 e 8 A8 1.21554 a 9 A9 0.77334 bc 10 A10 0.53132 e 11 A11 0.49182 e 12 A12 0.7692 bc 13 A13 0.35552 e 14 A14 0.68274 cd 15 A15 0.85406 b Keát quaû ghi nhaän sau 1 thaùng nuoâi caáy cho thaáy caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät coù aûnh höôûng chuyeân bieät leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa. Ña soá maãu caáy thöïc vaät thuoäc nhoùm song töû dieäp khoâng coù khaû naêng taïo moâ seïo trong moâi tröôøng chæ coù auxin maø caàn phaûi coù moät söï phoái hôïp giöõa cytokinin vaø auxin. Ñoái vôùi Kim Ngaân Hoa laø caây buïi hay daây leo, ít thaáy caây thaân thaûo thì quaù trình nuoâi caáy in vitro seõ khoù caûm öùng hôn caùc daïng caây thaân thaûo neân söï keát hôïp giöõa auxin vaø cytokinin laø ñieàu caàn thieát. Ñieàu naøy cuõng ñöôïc chöùng minh bôûi Shrikhande vaø coäng söï, 1993 khi nghieân cöùu treân töû dieäp caây maàm Azadirachta indica A. caàn IAA ôû noàng ñoä 0,5 mg/l vaø BA 1,0 mg/l ñeå coù theå taïo moâ seïo ; laù cuûa Solanum tuberosum L. caàn coù söï phoái hôïp giöõa 2,4-D 3,0 mg/l, NAA 1,0 mg/l vaø kinetin 0,2 mg/l cho söï taïo moâ seïo (Nguyeãn Ñöùc Thaønh, 1983). Coù moät soá coâng trình nghieân cöùu cuûa Libbenga vaø Torrey, 1973 ; Simpson vaø Torrey, 1977 treân moâ reã caây ñaäu naønh, ghi nhaän coù söï toång hôïp DNA tröôùc khi phaân baøo thì caàn auxin vaø cytokinin. Neáu moâi tröôøng chæ coù auxin, thì haøm löôïng DNA ñöôïc ghi nhaän laø khoâng thay ñoåi. 100% maãu laù phaùt sinh moâ seïo khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung BA vaø 2,4-D. Moâ seïo laø moät ñaùm teá baøo khoâng phaân hoùa, coù ñaëc tính phaân chia maïnh, thöôøng ñöôïc taïo ra do nhöõng xaùo troän trong quaù trình taïo cô quan (Buøi Trang Vieät, 2000). Moâ seïo hình thaønh ôû haàu heát caùc boä phaän cuûa caây (thaân, laù, reã), khi nôi ñoù coù veát caét (Street, 1969). Tuy nhieân, khaû naêng taïo moâ seïo cuûa moâ vaø cô quan phuï thuoäc raát nhieàu vaøo traïng thaùi sinh lyù, sinh hoùa vaø kieåu gen (Torres, 1989). Chæ coù caây non hay nhöõng maûnh thaân non cuûa caây tröôûng thaønh laø deã cho moâ seïo döôùi taùc ñoäng cuûa auxin maïnh ñöôïc aùp duïng rieâng leõ hay keát hôïp vôùi cytokinin, coøn nhöõng maûnh cô quan tröôûng thaønh thöôøng khoâng coù khaû naêng naøy. Öùng vôùi moãi loaïi moâ hay cô quan, thöôøng phaûi söû duïng caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät vôùi loaïi vaø noàng ñoä khaùc nhau tuøy theo möùc ñoä nhaïy caûm cuûa caùc teá baøo trong moâ hay cô quan ñoù (Ochatt vaø Caso, 1986) Ñoái vôùi Kim Ngaân Hoa thì laù laø cô quan cho phaùt sinh moâ seïo toát nhaát bôûi ñoä ñoàng ñeàu cuûa caùc teá baøo laù cao hôn do caùc teá baøo laù phaân chia ñeàu khaép beà maët (Buøi Trang Vieät, 2000), cuõng laø cô quan cho phaùt sinh choài nhieàu nhaát. Neáu tính theo soá löôïng teá baøo bieåu bì, döôùi bieåu bì (choài baát ñònh thöôøng phaùt sinh töø nhöõng teá baøo naøy, theo Joy IV vaø Thorpe, 1999; Buøi Trang Vieät, 2000) thì maãu laù coù soá löôïng lôùn hôn thaân vaø reã. Do ñoù, choài phaùt sinh cô baûn laø nhieàu hôn. Ñieàu naøy ñaõ ñöôïc chöùng minh bôûi nghieân cöùu cuûa D. Georges (1993) vaø coäng söï treân caây Kim Ngaân Hoa. Beà maët tieáp xuùc cuûa maãu laù vôùi moâi tröôøng lôùn hôn, beà daøy maãu caáy nhoû hôn neân cheânh leäch gradient cuûa caùc chaát caûm öùng cuõng ít hôn. Theo Joy IV vaø Thorpe (1999), söï töông taùc giöõa gradient caùc chaát caûm öùng laø moät yeáu toá quan troïng trong quaù trình phaùt sinh cô quan. Maãu caáy caøng ñoàng ñeàu veà gradient seõ cho phaûn öùng caøng thoáng nhaát vaø hieäu quaû. Ñieàu quan troïng ñöôïc nhaän thaáy ôû ñaëc tính cuûa moâ seïo laø moâ seïo phaùt trieån khoâng theo quy luaät nhöng coù khaû naêng bieät hoùa thaønh reã, choài vaø phoâi ñeå coù theå hình thaønh caây hoaøn chænh. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa moâ seïo coù quan heä vôùi cô quan hình thaønh moâ seïo, thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vaø ñieàu kieän nuoâi caáy. Söï hình thaønh moâ seïo chia ra 3 giai ñoaïn : phaùt sinh moâ seïo, phaân chia teá baøo vaø bieät hoùa. Trong phase phaùt sinh moâ seïo, söï trao ñoåi chaát kích thích teá baøo chuaån bò phaân chia, giai ñoaïn naøy daøi hay ngaén phuï thuoäc vaøo tình traïng sinh lyù cuûa moâ ñöôïc ñöa vaøo nuoâi caáy vaø ñieàu kieän nuoâi caáy. Teá baøo ñi vaøo giai ñoaïn phaân chia taêng sinh khoái. Teá baøo ñi vaøo quaù trình bieät hoùa, xuaát hieän söï bieät hoùa teá baøo vaø söï xuaát hieän caùc con ñöôøng trao ñoåi chaát daãn ñeán söï saûn xuaát caùc hôïp chaát thöù caáp coù hoaït tính sinh hoïc (Aitchison, 1997). Moâ seïo thöôøng coù maøu vaøng, traéng, xanh hay maøu saéc toá anthocyanin. Söï bieät hoùa cuûa teá baøo hình thaønh nhöõng chaát lieäu caáu taïo nhu moâ caùc loaïi, caùc teá baøo raây... hôn nöõa hình thaønh vuøng moâ phaân sinh, trung taâm cuûa söï taïo neân choài vaø reã. Khi ñaët maãu laù trong moâi tröôøng MS cô baûn, khoâng boå sung chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät thì maãu laù phoàng leân, xanh nhöng sau 1 thôøi gian thì maãu laù baét ñaàu hoùa naâu vaø cheát, ñieàu naøy coù theå laø do löôïng hormon noäi sinh trong maãu caáy ít, khoâng ñuû ñeå caûm öùng quaù trình phaùt sinh hình thaùi. Ñieàu naøy cuõng ñöôïc ghi nhaän bôûi Klimaszewska vaø Keller (1985) khi nuoâi caáy caùc TLC cuûa caây Brassica napus treân moâi tröôøng khoâng chöùa chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng. Khi maãu laù ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng coù boå sung caùc loaïi chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng khaùc nhau cho thaáy caùc keát quaû coù söï khaùc bieät roõ raøng. Auxin coù vai troø quan troïng trong söï taïo moâ seïo (Ahloowalia, 1991 ; Komamin vaø coäng söï, 1992 ; Liu vaø coäng söï, 1993 ; Zimmerman, 1993). 2,4-D ñaõ ñöôïc chöùng minh coù vai troø quyeát ñònh ñeán söï phaùt sinh moâ seïo coù khaû naêng phaùt sinh phoâi ôû caây caø roát (Borkid vaø coäng söï, 1986) vaø söï phaùt sinh phoâi sinh döôõng ôû haàu heát caùc loaøi thöïc vaät (Halperin vaø Whetherell, 1964 ; Ammirato, 1983). Keát quaû ghi nhaän cho thaáy 2,4-D vôùi noàng ñoä 0,1 mg/l keát hôïp vôùi BA cho khaû naêng phaùt sinh moâ seïo toát nhaát, moâ seïo hình thaønh xung quanh veát caét vaø treân khaép beà maët cuûa laù, taïo thaønh boâng traéng, vaø naâu, noát xanh treân beà maët laù, maãu laù seõ uoán cong thaønh daïng V vôùi gaân chính laø ñieåm maáu choát do söï taêng sinh teá baøo, maãu laù chaéc, maëc duø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo ôû noàng ñoä naøy laø 0.6321 g/maãu thaáp hôn so vôùi caùc noàng ñoä coøn laïi. Khi noàng ñoä 2,4-D caøng cao (0,5 – 1 mg/l) thì moâ seïo trôû neân traéng ñuïc, nhaõo khoâng coù khaû naêng taùi sinh, nhöng troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo laïi taêng leân ñaùng keå, nhöõng loaïi moâ seïo daïng nhö vaäy taêng sinh raát nhanh vaø caàn phaûi ñöôïc loaïi boû. Toác ñoä taêng tröôûng cuûa moâ seïo phuï thuoäc vaøo thaønh phaàn cuõng nhö noàng ñoä cuûa auxin (Bonner vaø Galston, 1959 ; De Garcia vaø Martnez, 1995 ; Grant vaø Fuller, 1968). Noàng ñoä auxin taêng cao kích thích taïo söï taïo moâ seïo daïng bôû nhöng khi giaûm noàng ñoä auxin thì moâ seïo coù daïng noát vaø chaéc (Ceriani vaø coäng söï, 1992). Neáu giöõ nguyeân noàng ñoä vaø loaïi auxin trong moâi tröôøng nuoâi caáy, nhöng thay ñoåi thaønh phaàn vaø noàng ñoä cytokinin thì hình thaùi moâ seïo thay ñoåi (Mehra vaø Jaidka, 1985 ; Pal vaø coäng söï, 1985 ; Shrikhande vaø coäng söï, 1993). Keát quaû cho thaáy noàng ñoä BA 1 mg/l cho khaû naêng taùi sinh tốt hôn caùc noàng ñoä coøn laïi. Nhö vaäy, noàng ñoä 0,1 mg/l 2,4-D keát hôïp vôùi 1 mg/l BA laø noàng ñoä thích hôïp cho söï phaùt sinh moâ seïo ôû maãu laù Kim Ngaân Hoa. Ñaây laø tieàn ñeà cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ñôn vaø nuoâi caáy phoâi soma, saûn xuaát caùc hôïp chaát sinh hoïc thöù caáp ôû caây Kim Ngaân Hoa. Thí nghieäm 3.2 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Baûng 4.4. Aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa ñöôïc ghi nhaän sau 1 thaùng nuoâi caáy Nghieäm thöùc Noàng ñoä (mg/l) Troïng löôïng töôi moâ seïo (g) 1 B1 0.192228 e 2 B2 0.94526 cd 3 B3 1.0575 b 4 B4 0.5967 e 5 B5 0.84984 e 6 B6 0.98806 bc 7 B7 0.817 e 8 B8 0.8757 e 9 B9 1.5339 a 10 B10 0.73264 e 11 B11 0.8935 e 12 B12 0.97728 bc 13 B13 0.62436 e 14 B14 0.754506 e 15 B15 0.89754 e Töø baûng 4.4 cho thaáy söï keát hôïp giöõa BA vaø NAA cho phaùt sinh moâ seïo toát hôn raát nhieàu so vôùi khi BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cuõng taêng leân ñaùng keå. 100% moâ seïo cuõng ñöôïc phaùt sinh töø söï keát hôïp naøy. Ñieàu naøy chöùng toû, ôû caây Kim Ngaân Hoa thì laù laø cô quan raát deã caûm öùng taïo moâ seïo. Moät tieán trình phaûn bieän hoùa phaùt sinh daãn ñeán keát quaû hình thaønh moâ seïo coù tính caïnh tranh doïc theo bìa veát caét. Taát caû moâ seïo thu ñöôïc ñeàu raén chaéc, moâ seïo naâu, traéng, vaøng, vaø coù nhieàu noát xanh treân beà maët cuûa laù. Khoâng coù söï taùi sinh choài trong suoát quaù trình khôûi ñaàu cuûa moâ seïo nhöng reã xuaát hieän thöôøng xuyeân treân moâi tröôøng cô baûn chöùa NAA. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích vì haøm löôïng auxin noäi sinh cuûa caây khaù cao, ñoàng thôøi NAA laø moät auxin nhaân taïo, coù hoaït tính maïnh neân khi boå sung 1 haøm löôïng raát nhoû cuûa NAA cuõng ñaõ coù khaû naêng caûm öùng moâ seïo phaùt sinh reã. ÔÛ noàng ñoä 0,5 mg/l NAA thì cho söï phaùt sinh reã töø khoái moâ seïo naâu vaø söï phaùt sinh reã caøng nhieàu treân moâi tröôøng chöùa (0,5 mg/l BA + 1 mg/l NAA) coù troïng löôïng töôi laø 1.0575 g/maãu hoaëc (0.7 mg/l BA + 1 mg/l NAA) coù troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo laø 0.98806 g/maãu, tæ leä A/C cao thì kích thích taïo reã (Bùi Trang Việt, 2000). Ñieàu naøy cuõng ñöôïc baét gaëp khi nuoâi caáy maãu laù Crassula argentea ñaùp öùng vôùi veát thöông baèng caùch taïo moâ seïo, sau ñoù seõ taïo reã vaø tieáp theo laø taïo choài (Paterson vaø Rost, 1981) Söï hình thaønh reã baát ñònh chia laøm 3 giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu laø söï taùi phaân chia cuûa moâ phaân sinh beân töùc laø moät soá teá baøo xaûy ra söï phaûn phaân hoaù maïnh ôû vuøng xuaát hieän reã taïo neân moät ñaùm teá baøo loän xoän ñoù laø maàm moáng cuûa reã. Giai ñoaïn tieáp theo laø söï xuaát hieän maàm reã. Giai ñoaïn cuoái cuøng laø söï sinh tröôûng vaø keùo daøi cuûa reã, reã chui qua voû ngoaøi taïo neân reã baát ñònh. Caùc giai ñoaïn naøy khaùc nhau veà yeâu caàu ñoái vôùi auxin. Giai ñoaïn ñaàu ñoøi hoûi haøm löôïng auxin cao ñeå khôûi xöôùng söï phaûn phaân hoaù teá baøo maïnh meõ. Giai ñoaïn hai caàn haøm löôïng auxin thaáp hôn cho söï xuaát hieän reã. Giai ñoaïn ba söï sinh tröôûng cuûa maàm reã ñeå hình thaønh reã ñoøi hoûi haøm löôïng auxin raát thaáp, thaäm chí auxin coù theå gaây öùc cheá söï sinh tröôûng cuûa reã. Ñoái vôùi caây Kim Ngaân Hoa, söï phaùt sinh reã coøn chòu taùc ñoäng raát lôùn bôûi nhieät ñoä cao (> 300C) vaø trong ñieàu kieän toái thì reã seõ phaùt sinh nhieàu vaø toát hôn trong ñieàu kieän ngöôïc laïi (D. Georges vaø coäng söï, 1993). Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø do khi duy trì maãu caáy trong ñieàu kieän nhieät ñoä cao baát thöôøng thì laøm giaûm hieäu quaû cuûa cytokinin nhöng coù theå laøm taêng hieäu quaû cuûa auxin. Töông töï nhö tröôøng hôïp ñoái vôùi maãu caáy laù Begonia khi Heide (1965) quan saùt thaáy raèng möùc ñoä hoaït ñoäng cuûa cytokinin seõ giaûm xuoáng khi maãu caáy ñöôïc nuoâi trong ñieàu kieän 270C so vôùi khi ñöôïc nuoâi ôû nhieät ñoä 150C. Khi taêng noàng ñoä BA leân 1 mg/l keát hôïp vôùi 1 mg/l NAA thì maãu laù phaùt sinh moâ seïo toát nhaát vôùi troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cao nhaát laø 1.5339 g/maãu so vôùi caùc noàng ñoä coøn laïi. Moâ seïo hình thaønh nhanh vaø nhieàu khaép beà maët vaø xung quanh veát caét cuûa laù, moâ seïo xanh, vaøng nhaït, naâu nhaït, khoái löôïng moâ seïo taêng sinh noåi baät, moâ seïo xoáp chaéc thaønh khoái, maãu laù cöùng vaø khoâng coù söï phaùt sinh reã töø noàng ñoä naøy. Theo Skoog, tæ leä A/C gaàn moät ñôn vò seõ thu ñöôïc sinh taïo moâ seïo. Khi noàng ñoä auxin taêng thì nhaän thaáy troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cuõng taêng leân, do auxin kích thích raát maïnh söï phaân chia teá baøo töôïng taàng nhöng haàu nhö khoâng taùc ñoäng treân moâ phaân sinh sô caáp, neân auxin taùc ñoäng leân söï taêng tröôûng theo ñöôøng kính. Sau 1 thôøi gian nuoâi caáy thì noàng ñoä auxin noäi sinh seõ töø töø taêng leân (Phan Hoaøng Anh, 2000). Söï phaùt sinh choài ôû Torenia cuõng tuaân theo nguyeân taéc veà tæ leä A/C: A/C cao: kích thích taïo reã, A/C tieán gaàn veà 1: kích thích taïo moâ seïo, töø nhöõng moâ seïo naøy sau ñoù hình thaønh choài giaùn tieáp, A/C thaáp: kích thích taïo choài tröïc tieáp. Tæ leä giöõa A/C seõ xaùc ñònh söï taïo cô quan : tyû leä cao : taïo choài, tæ leä thaáp : taïo reã. (Skoog vaø Tsui, 1948 ; Miller vaø Skoog, 1953 ; Paulet, 1965 ; Gautheret, 1959). Trong nuoâi caáy moâ, cytokinin caàn thieát cho söï phaân chia cuûa teá baøo maãu caáy. Khi khoâng coù cytokinin trong moâi tröôøng nuoâi caáy thì metaphase cuûa chu trình teá baøo seõ bò keùo daøi vì vaäy cytokinin caàn thieát trong söï ñieàu hoøa sinh toång hôïp protein teá baøo trong söï taêng tröôûng vaø phaùt trieån cuûa teá baøo. Khi taêng noàng ñoä cuûa BA leân 1,5 mg/l keát hôïp vôùi 0,5 mg/l NAA thì khoâng thaáy söï phaùt sinh reã, vaø vôùi noàng ñoä 1 mg/l NAA thì söï phaùt sinh reã ít, moâ seïo naâu hình thaønh nhanh vaø nhieàu xung quanh veát caét, caùc noát xanh hình thaønh treân beà maët cuûa laù, khoái boâng traéng xuaát hieän töø veát caét, maãu laù cöùng, xanh, chaéc, phaùt sinh toát. Khi gia taêng haøm löôïng cytokinin trong moâ thì hieän töôïng öu tính ngoïn bò phaù vôõ söï baät choài ñöôïc kích thích bôûi cytokinin; traùi ngöôïc vôùi taùc ñoäng cuûa auxin (Buøi Trang Vieät, 2000). Trong nuoâi caáy moâ, neáu löôïng cytokinin khoâng ñuû thì söï phaân chia cuûa nhaân teá baøo seõ bò chaën laïi taïi moät giai ñoaïn trong chu trình teá baøo. BA laø loaïi cytokinin coù hieäu quaû cao trong söï caûm öùng taïo choài ôû nhieàu loaøi thöïc vaät, tuy nhieân khi sử dụng BA với nồng độ cao thì sẽ tạo ra những chồi không bình thường. Khi phoái hôïp cuøng vôùi auxin thì cytokinin seõ kích thích söï phaân chia teá baøo vaø ñieàu khieån söï phaùt sinh hình thaùi. Caùc thí nghieäm taïo choài baát ñònh thöôøng cho keát quaû cao khi söû duïng cytokinin ôû noàng ñoä cao vaø auxin töø noàng ñoä thaáp ñeán trung bình (Gaspar vaø coäng söï, 2003). Keát quaû naøy ñaõ ñöôïc ghi nhaän treân nhieàu ñoái töôïng nhö Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), caø chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa keøn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai taây (Yasmin, 2003). Trong söï khôûi ñaàu vaø ñieàu hoaø söï taêng tröôûng cuûa cô quan chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng thöïc vaät coù vai troø quan troïng. Khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng coù cytokinin vaø auxin thì söï phaùt trieån choài ñöôïc kích thích. Caàn coù moät söï caân baèng veà noàng ñoä cuûa töøng loaïi hormone trong töøng loaïi moâ, ôû töøng vò trí chuyeân bieät. Nhieàu loaïi thöïc vaät nhö caây thuoác laù ñoøi hoûi auxin vaø cytokinin ngoaïi sinh vôùi tyû leä hôïp lyù ñeå taïo choài. Sau 1 thaùng nuoâi caáy, moâ seïo ñöôïc caáy chuyeån sang moâi tröôøng chöùa BA coù noàng ñoä cao hôn, cho thaáy moâ seïo caûm öùng toát, nhöng vaãn chöa thaáy söï phaùt sinh choài trong suoát thôøi gian nuoâi caáy, tuy nhieân ñaây laø tieàn ñeà cho vieäc nghieân cöùu söï taïo choài vaø taùi sinh caây hoaøn chænh cho caây Kim Ngaân Hoa sau naøy. Kim Ngaân Hoa laø daïng caây daây leo, thaân goã neân khaû naêng caûm öùng choài töø moâ seïo khoù hôn caùc loaøi caây thaân thaûo khaùc vaø phaûi caàn raát nhieàu thôøi gian. Theo nghieân cöùu bôûi D. Georges (1993) vaø coäng söï cho thaáy sau 6 thaùng treân moâi tröôøng nuoâi caáy moâ seïo thì moâ seïo töø laù môùi hình thaønh choài vaø cho tæ leä hình thaønh choài cao hôn so với moâ seïo töø reã, thaân vaø thôøi gian hình thaønh choài ít nhaát (75 ngaøy). Vôùi nhöõng böôùc tieán veà vi nhaân gioáng vaø kyõ thuaät di truyeàn, ñaõ coù haøng traêm loaøi thöïc vaät ñaõ ñöôïc nuoâi caáy thaønh coâng in vitro treân nhieàu loaïi moâ khaùc nhau vaø phaùt sinh cô quan coù caáu truùc (Bajaj, 1986). Tuy nhieân, coù nhieàu loaøi thöïc vaät khoù nuoâi caáy, khoâng hình thaønh reã, choài hay phoâi trong nhieàu ñieàu kieän nuoâi caáy khaùc nhau. Ñieàu quan troïng laø caàn nghieân cöùu khaû naêng taùi sinh thaønh caây hoaøn chænh neáu khaû naêng phaùt trieån kyõ thuaät di truyeàn mang tính khaû thi. Ñaõ coù nhieàu baùo caùo vôùi nhöõng phöông phaùp nghieân cöùu taùi sinh caùc loaøi thöïc vaät ñaëc bieät, nhöõng phöông phaùp naøy caàn nhieàu thôøi gian ñeå phaùt trieån vì chuùng ta khoâng coù moät neàn taûng kieán thöùc cô baûn ñeå coù theå hieåu roõ tieán trình taùi sinh phaùt sinh hình thaùi. Hôn nöõa, kieán thöùc chuùng ta thu nhaän ñöôïc qua vieäc vaän duïng thaønh coâng moät loaøi thöïc vaät hay moät gioáng caây troàng troït thì thöôøng khoâng theå naøo aùp duïng cho caùc loaøi thöïc vaät hay caùc gioáng caây troàng khaùc maëc duø thöïc vaät gaàn nhau veà maët di truyeàn. Vieäc phaùt trieån caùc moâ hình nuoâi caáy taùi sinh thaønh coâng in vitro ôû nhöõng loaøi thöïc vaät khoù taùi sinh seõ höõu ích trong vieäc naâng cao taàm hieåu bieát cuûa chuùng ta veà nhöõng cô cheá cô baûn ñieàu khieån phaùt sinh hình thaùi. Keát luaän Qua quaù trình tieán haønh thí nghieäm ñoái vôùi maãu laù Kim Ngaân Hoa, chuùng toâi ruùt ra ñöôïc moät soá keát luaän sau : Vaán ñeà khoù khaên nhaát khi baét ñaàu tieán haønh nuoâi caáy in vitro ñoái vôùi maãu laù Kim Ngaân Hoa laø phaûi taïo ñöôïc nguoàn maãu caáy voâ truøng vaø vaãn coøn khaû naêng taêng tröôûng. Thôøi gian 5 phuùt trong dung dòch khöû truøng Javel 7% cho thaáy keát quaû khaû quan, ñuû ñeå tieâu dieät vi khuaån vaø caùc baøo töû naám maø khoâng laøm aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa maãu caáy, taïo ñöôïc khoái löôïng lôùn caùc maãu laù voâ truøng vôùi tæ leä maãu soáng soùt coù khaû naêng taùi sinh laø 100%. Ñoái vôùi maãu caáy töø laù, caùch ñaët maãu laù treân moâi tröôøng nuoâi caáy aûnh höôûng lôùn ñeán khaû naêng phaùt sinh hình thaùi cuûa caây. Quaù trình thí nghieäm cho thaáy khi ñaët ngöûa thì khaû naêng maãu phaùt sinh moâ seïo töø veát caét, gaân laù vaø treân caû beà maët cuûa laù toát hôn vaø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo taêng sinh nhanh so vôùi khi ñaët uùp. Quaù trình phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù coøn chòu aûnh höôûng ñaùng keå cuûa chaát kích thích taêng tröôûng thöïc vaät khi boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. 100% maãu laù phaùt sinh moâ seïo treân moâi tröôøng boå sung BA keát hôïp vôùi NAA vaø 2,4-D. Noàng ñoä 0,1 mg/l 2,4-D keát hôïp vôùi 1 mg/l BA laø noàng ñoä thích hôïp cho söï phaùt sinh moâ seïo ôû maãu laù Kim Ngaân Hoa. Ñaây laø tieàn ñeà cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ñôn vaø nuoâi caáy phoâi soma, saûn xuaát caùc hôïp chaát sinh hoïc thöù caáp ôû caây Kim Ngaân Hoa. Söï keát hôïp giöõa BA vaø NAA cho phaùt sinh moâ seïo toát hôn so vôùi khi BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cuõng taêng leân ñaùng keå. Noàng ñoä 1mg/l BA - 1 NAA thì maãu laù phaùt sinh moâ seïo toát nhaát vôùi troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cao nhaát ; 0,5 mg/l BA – 1 mg/l NAA moâ seïo phaùt sinh reã ; moâ seïo trong noàng ñoä BA cao chöa khaúng ñònh ñöôïc khaû naêng phaùt sinh choài trong nghieân cöùu naøy. Ñeà nghò Do thôøi gian tieán haønh thí nghieäm chæ trong 3 thaùng vaø thieát bò söû duïng coù haïn neân caùc thí nghieäm ñaõ tieán haønh laø tieàn ñeà cho caùc nghieân cöùu sau naøy veà caây Kim Ngaân Hoa. Chuùng toâi xin ñöa ra moät soá ñeà nghò ñeå nghieân cöùu naøy ñöôïc hoaøn thieän hôn. Khaûo saùt theâm caùc yeáu toá lieân quan trong quaù trình khöû truøng maãu nhö : tuoåi moâ caáy, thôøi ñieåm thu maãu khöû truøng nhaèm naâng cao hieäu quaû khöû truøng. Nghieân cöùu theâm veà caùc loaïi hoùa chaát khöû truøng khaùc khi ñöa maãu töø beân ngoaøi vaøo. Khaûo saùt theâm aûnh höôûng cuûa moät soá chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng khaùc leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy laù vaø khaû naêng phaùt sinh choài cuûa maãu laù. Khaûo saùt khaû naêng phaùt sinh choài töø caùc boä phaän khaùc cuûa caây ñeå tìm ñöôïc nguoàn maãu caáy coù khaû naêng taùi sinh choài toát nhaát, trong thôøi gian nhanh nhaát. Kim Ngaân Hoa laø caây döôïc lieäu chöùa nhieàu hôïp chaát sinh hoïc nhö saponin vaø flavonoid, nghieân cöùu naøy laø tieàn ñeà cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ñôn vaø nuoâi caáy phoâi soma, saûn xuaát caùc hôïp chaát sinh hoïc thöù caáp ôû caây Kim Ngaân Hoa. Xaây döïng hoaøn chænh qui trình nhaân gioáng in vitro vaø ñöa ra vöôøn öôm caây Kim Ngaân Hoa. Tieán haønh giaûi phaåu hình thaùi ñoái vôùi maãu caáy ñeå nghieân cöùu nhöõng thay ñoåi veà moâ hoïc beân trong maãu caáy theo thôøi gian, töø ñoù ta coù theå hieåu roõ hôn veà taùc ñoäng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng thöïc vaät leân söï phaùt trieån cuûa moâ trong quaù trình nuoâi caáy.