Đồ án Đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm Chitosan đối với tuyến trùng hại tiêu tại Bình Phước

idogyne và có ý nghĩa kinh tế. Tuyến trùng nốt sần rễ thường gây hại đối với nhiều loại cây trồng điển hình là cây hồ tiêu. Chúng chủ yếu sống trong đất, các dạng sợi hạch, bào tử nang, quả nấm… có sức chống chịu lớn, chúng cũng tồn tại trong rễ, xác thực vật nằm trong đất. Tại Đăk Nông, rệp sáp hại rễ và quả, tuyến trùng Pratylenchus, Meloidogyne hại rễ, các loại nấm Pythium, Phytophthora… gây thối rễ, héo cây là những tác nhân chủ yếu hạn chế năng suất và sản lượng hồ tiêu ở vùng này. Ngoài ra các loại bệnh do vi rút, nấm thán thư, tảo… cũng gây hại đáng kể ở nhiều vùng trồng hồ tiêu trong tỉnh. Thành phần bệnh hại tiêu ở các tỉnh Miền Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long gồm có 2 nhóm bệnh hại chính là nhóm bệnh hại thân lá (bao gồm: bệnh thán thư, bệnh đen lá, bệnh đốm lá, bệnh khô vằn, bệnh gỉ lá) và nhóm bệnh hại rễ và gốc thân. Phạm Văn Biên (1989). Kết quả điều tra tại các vùng trồng hồ tiêu khác nhau đã ghi nhận, cây hồ tiêu không chỉ bị bệnh do nấm mà còn có sự hiện diện của nhiều loại tuyến trùng ký sinh trên rễ (Nguyễn Ngọc Châu, 1993) như: Meloidogyne, Radophonus, Rotylencholus… cùng tác động gây hại lên bộ rễ của cây tiêu còn có một số nấm như: Fusarium, Rhizoctonia… những thao tác trong khi bón phân, xới xáo đất và đặc biệt trong mùa mưa nếu tạo ra các vết thuơng cho bộ rễ là điều kiện cho nấm bệnh xâm nhiễm và gây hại bộ rễ, cuối cùng cây bị chết. Mới đây, kết quả điều tra của Nguyễn Thị Thu Thủy, Lê Lương Tề và CTV (2006) cho biết, có 29 loài tuyến trùng thuộc các họ khác nhau có mặt ở các vùng trồng tiêu của Việt Nam. Trong đó, chủ yếu và phổ biến nhất là loài Meloidogyne incognita. Nhóm tác giả cũng nhấn mạnh rằng tuyến trùng Meloidogyne spp. là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh nốt sưng rễ – vàng lá chết cây ở các vùng trồng tiêu, gây tác hại đáng kể cần được quan tâm nghiên cứu phòng trừ. Yuji Oka, Rivka Offenbach và Shimon Pivonia (2004) cho rằng: Tất cả các giai đoạn sinh trưởng đều bị tấn công, các triệu chứng phát triển dần dần theo thời gian và không nhận thấy cho đến khi cây trồng biểu hiện ra bên ngoài. Bao gồm các triệu chứng héo vàng và toàn bộ cây kém phát triển; thối và chết có thể xảy ra trong điều kiện trời nóng và khô. Cây sẽ giảm diện tích lá, quả dẫn đến năng suất thấp. Bên dưới mặt đất, các rễ trụ và rễ tơ có hiện tượng u sưng, rễ chuyển sang màu nâu do tế bào bị tác động. Chúng ngăn cản nước và chất dinh dưỡng lên trên lá làm cho cây bị héo vàng. Cây bị tuyến trùng hại rễ dễ dàng bị nấm và vi khuẩn xâm nhập. Ảnh hưởng thứ hai là làm cho lá vàng rụng và cuối cùng cây chết nhanh chóng. Erwin và O.K.Ribeiro (1996) cho rằng, vào giai đoạn kinh doanh, cây hồ tiêu bị bệnh thường có biểu hiện héo nhẹ. Sau đó, lá chuyển vàng và rụng sớm. Sau khi lá rụng, quả bị khô, bộ rễ của cây bị thối. Triệu chứng của bệnh hại là cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, rụng đốt, ra hoa và đậu quả kém. Tạo thành những nốt sần ở rễ tiêu là đặc điểm rất cơ bản và đặc trưng của bệnh này, nếu bệnh nặng cây có thể chết. Nhìn chung các biểu hiện của bệnh ở phần cây trên mặt đất rất khác nhau tùy theo mức độ bệnh nặng hay nhẹ (Nguyễn Ngọc Châu và CTV, 1990). Phạm Văn Biên (1989) cho rằng, cây tiêu bị tuyến trùng hại nặng lúc đầu có hiện tượng vàng đều các lá ở nửa dưới tán lá. Lá có màu vàng tươi và không có những vết nâu đen như ở bệnh nấm. Dần dần lá chuyển khô vàng, kém phát triển như khi cây bị hạn hoặc thiếu phân. 1.2.1. Đặc điểm sinh học của tuyến trùng Meloidogyne spp. Tuyến trùng Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919), (Chitwood, 1949) là loài tuyến trùng nội ký sinh rễ thuộc: giống Meloidogyne, Họ Meloidogynidae, Bộ Tylenchida Cũng như các loài tuyến trùng gây hại cây khác, tuyến trùng Meloidogyne incognita con cái nhiều hơn con đực, đẻ trứng thành từng bọc, trứng nở ra tuyến trùng non. M. incognita sinh sản đơn tính, mặc dù con đực phổ biến và có thể tập hợp ở giai đoạn cuối để dẫn dụ con cái (Whitehead, 1998). Vòng đời của tuyến trùng M. incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính: Trứng - Ấu trùng tuổi 1 - Ấu trùng tuổi 2 - Ấu trùng tuổi 3 - Ấu trùng tuổi 4 - Tuyến trùng trưởng thành. Trong 5 giai đoạn này thì ấu trùng tuổi 2 và tuyến trùng M. incognita cái thường dùng để xác định loài. Khi nghiên cứu đặc điểm hình thái của tuyến trùng M.i ở vùng Tân Lâm, Quảng Trị cho thấy chiều dài của ấu trùng tuổi 2 biến thiên từ 390 - 520 mm (Nguyễn Vũ Thanh, Nguyễn Ngọc Châu, 1993) Chiều rộng của ấu trùng tuổi 2 biến thiên từ 10,0 - 17,5 mm, trung bình từ 13,6 ± 1,3 mm. Chiều dài kim chích biến thiên từ 10 - 15 mm, trung bình 13,05 ± 0,90 mm. Tuyến trùng cái có dạng quả lê, lúc nhỏ có màu trắng sữa, khi trưởng thành cơ thể trong suốt, chiều dài biến thiên từ 570 - 970 mm, trung bình 785 ± 49,45 mm. So với chiều dài của tuyến trùng M. incognita ở Tân Lâm, Quảng Trị (510 - 740 mm) (Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu, 1993) thì chiều dài của tuyến trùng M. incognita ở Đắk Lắk có phần dài hơn. Chiều dài kim chích từ 15 - 17 mm, trung bình 16,10 ± 0,40 mm. Theo Phạm Văn Biên (1989) chiều dài kim chích của tuyến trùng M. incognita cái từ 15 - 17 mm. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu (1993) chiều dài kim chích của tuyến trùng M. incognita cái ở Quảng Trị là 15 mm. 1.2.2. Quá trình phát triển của bệnh do tuyến trùng gây ra trên cây tiêu Tuyến trùng ký sinh không những tạo thành nốt sần mà còn làm cho rễ hồ tiêu biến đổi màu sắc và hủy hoại chức năng. Theo Nguyễn Ngọc Châu và CTV (1991) có thể chia quá trình phát triển của bệnh làm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Khi tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, rễ tiêu vẫn còn màu sáng, chức năng của rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều. Giai đoạn 2: Rễ chuyển sang màu nâu, chức năng dinh dưỡng và vận chuyển nước của rễ đã bị ảnh hưởng. Giai đoạn 3: Rễ chuyển thành màu đen, chức năng của rễ bị phá hủy hoàn toàn. Từ giai đoạn 2, do rễ bị tổn thương và xảy ra quá trình hoại sinh, tạo điều kiện cho nấm, vi khuẩn xâm nhập và có thể gây thêm các bệnh khác cho cây. Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây vàng mà còn cả những cây trông bề ngoài còn xanh tốt. Sở dĩ cây còn xanh là do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, chức năng của rễ chưa bị hủy hoại, còn những cây vàng thường bệnh đã phát triển ở giai đoạn cuối, lúc này bộ rễ đã bị phá hủy nhiều, tạo điều kiện để các bệnh nấm, vi khuẩn cùng phát triển và gây hại cho cây. Tuyến trùng có thể lan truyền qua các con đường sau: + Tiêu giống từ trong vườn ươm đã bị nhiễm bệnh + Qua người sản xuất, súc vật, dụng cụ, máy móc canh tác Lan truyền theo dòng chảy tự nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1991), (Nguyễn Ngọc Châu, 1995). Nguồn bệnh có sẵn ở lô trước khi trồng tiêu: do các cây ký chủ của M. incognita như bí đỏ, cà chua, thuốc lá, cỏ hôi (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1991). 1.2.3. Các biện pháp quản lý tuyến trùng hại tiêu Theo Feldphoto (2004), việc quản lý tuyến trùng hại tiêu ở Úc chủ yếu dựa vào giống kháng cộng với luân canh hoặc xử lý đất bằng biện pháp xông hơi. Tuy nhiên, việc chọn lọc giống tiêu kháng tuyến trùng là một vấn đề tương đối khó khăn cho nhiều quốc gia. Vì vậy, các biện pháp canh tác được quan tâm nhiều hơn. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, bón phân đạm với liều lượng cao (56 – 147 kg/hecta), phân vi lượng (Bo, Mangan, đồng, molipđen) làm giảm 50 – 60% mật độ tuyến trùng nốt sưng và tăng năng suất lên từ 30 đến 40% (Treskova, 1962). Biện pháp kiểm dịch thực vật được cho rằng có hiệu quả cao trong phòng trừ tuyến trùng hại tiêu tại Canada (Ray Cerkauskas, 2005). Theo tác giả, biện pháp này bao gồm: Kiểm dịch nghiêm ngặt khi chuyển giống từ vùng này sang vùng khác, chọn giống thích hợp cho từng vùng và khi phát hiện khu vực nhiễm bệnh cần cách ly lây lang sang các khu vực khác và không trồng những loại cây dễ nhiễm bệnh tuyến trùng như: Cây hành, tỏi; Giữ đất khô, cây lật đất vào cuối mùa khô để tiêu diệt trứng của tuyến trùng, kiểm soát cỏ dại trên đồng ruộng để cắt đứt ký chủ của tuyến trùng cho phép mật độ tuyến trùng trong đất không vượt quả giới hạn cho phép, không nhập giống ở những nơi bị bệnh tuyến trùng; Sau khi thu hoạch quả thu nhặt những cây bị bệnh đem đi xử lý, bón phân hữu cơ để tăng vi sinh vật đất để giảm mật độ tuyến trùng; Bón phân hữu cơ với lượng 4-10 tấn/ ha. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng bánh dầu neem vào việc kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật. Những công bố đầu tiên đã cho thấy những hoạt chất sinh học của dầu neem có tác dụng phòng trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne incognita trên cây đậu tương (dẫn theo Nguyễn Thơ và CTV , 2009). Việc phòng trừ tuyến trùng hại tiêu ở nước ta chủ yếu là dựa vào biện pháp hóa học (Viện khoa học kỹ thuật NN miền Nam, 2008). Tuy nhiên, sau khi dùng thuốc hóa học 60 ngày thì tuyến trùng ở vùng rễ đã phục hồi. Một số sản phẩm trừ tuyến trùng phổ biến được dùng hiện nay ở Việt Nam như Cytokinin (thuốc Sincocin), nấm Paecilomyces lilacinus (thuốc Palina), chế phẩm bột rễ Derris... Gần đây, Viện Bảo Vệ Thực vật đã phát triển chế phẩm MT1 như một dạng hữu cơ vi sinh có tác dụng hạn chế tuyến trùng và một số nấm bệnh trong đất. Thành phần cơ bản của chế phẩm gồm chất hữu cơ và bột thảo mộc, có khả năng ức chế tuyến trùng. Các thí nghiệm cho thấy, sử dụng MT1 với liều lượng 1kg/nọc, sau 6 tháng có thể hạn chế được 73,4% tuyến trùng trong đất (dẫn theo Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam, 2008). Trong hoàn cảnh toàn cầu hoá, yêu cầu chất lượng của nông sản ngày càng tăng. Trước tình hình đó, để tăng giá trị của cây tiêu, Việt Nam đang triển khai nhìều chương trình sản sản xuất tiêu theo tiêu chuẩn VietGAP, EURAP. Việc quản lý tuyến trùng nói riêng và dịch hại hồ tiêu nói chung đã có nhiều chuyển biến. Các biện pháp được thực hiện theo hướng quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) Canh tác: Đào mương thoát úng trong vườn tiêu triệt để. Đây là biện pháp rất quan trọng để hạn chế bệnh nấm trong đất. Phủ rác hoặc cây xanh trong vườn tiêu, không để mặt đất trơ bị rửa trôi, xói mòn. Dùng choái tiêu sống, có thể dùng cây neem làm choái thay cho cây vông (cây vông hiện nay bị một loại ong đục ngọn, gây chết rất nghiêm trọng). Phân bón: Bón phân hữu cơ có chất lượng ủ hoai triệt để, và phân hữu cơ sinh học là chính (phân bón gốc, bón lá). Chỉ bón thêm phân hóa học cho cân đối dinh dưỡng. Biện pháp này tạo dinh dưỡng tối ưu cho cây tiêu phát triển, tạo sức đề kháng sâu bệnh cho cây, kìm hãm rất hiệu quả nguồn nấm bệnh và tuyến trùng có từ trong đất. Sử dụng thuốc BVTV: Dùng nấm đối kháng Trichoderma bón vào đất (ủ chung với phân bón), phun Trichoderma nước vào đất và phun lên cây để trừ nấm bệnh. Bón bã dầu neem cùng với phân bón. Sử dụng chất kích thích tính kháng. Sử dụng thuốc trừ sâu sinh học. Sử dụng thuốc hóa học hạn chế khi thật cần thiết, không đổ thuốc độc hóa học xuống gốc tiêu. Mô hình IPM/ICM nói trên là biện pháp chẳng những rất có hiệu quả quản lý dịch hại trên cây hồ tiêu mà còn làm tăng chất lượng của sản phẩm hồ tiêu Việt Nam hiện nay. Hướng giải quyết vấn đề kiểm soát mầm bệnh và bảo vệ đất đai: Tiến sĩ Paul Sultie (người mỹ) chuyên gia nghiên cứu độ phì nhiêu của đất đã đưa ra quan điểm: Quản lý đất đai tổng hợp và cây trồng (IPSM : Integrated Plant Soil Management). Hướng giải quyết này lúc đầu chưa được chú ý nhiều, nhưng sau đó không những các nhà khoa học mà nông dân ngày càng quan tâm ủng hộ nhiều hơn nhờ tính xác thực của nó. Theo nguyên lý của TS. Paul Sultie, giải quyết vấn đề tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật và phân bón vô cơ có 2 cách như sau: - Dùng tác nhân sinh học để làm vệ sinh đất, giúp lông hút của cây trồng không bị sự cản ngại của tuyến trùng và các mầm bệnh, để có thể hút hữu hiệu phân bón và nước sẵn có trong đất hoặc được cung cấp vào. Nhờ vậy giảm hẳn nhu cầu bón đạm của cây trồng cạn. - Dùng tác nhân sinh học để khởi động trực tiếp hoạt động của rễ và khởi động hoạt động của vi sinh vật vùng rễ, giúp cho đất tơi xốp, dễ thoát hơi nước, hòa tan lân, vi lượng, phân hủy hữu cơ… và vì vậy sinh khối rễ tăng lên, nuôi được thân rễ, củ, quả, lá tốt hơn. Sinh khối rễ gia tăng cũng có nghĩa là đã bón hữu cơ vào trong đất. Bên trên mặt, nếu là các loài cây trồng được thu hoạch hết như các loại rau cải, ta cần bón loại phân hữu cơ. Nếu còn dư thừa xác bã ta cần vùi hoặc ủ phân để tái tạo nhu cầu mới. Với nhiều tiến bộ của khoa học kỹ thuật ngành công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp, người ta nghiên cứu sản xuất ra nhiều chế phẩm phân bón, thuốc trừ sâu sinh học có hiệu quả cao. Đặc biệt là các chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc từ cây Neem (Azadirachta Indica A.Juss) tên Việt Nam là xoan chịu hạn rất được chú ý. Các hoạt chất sinh học từ hạt Neem có tác dụng diệt trừ sâu rầy, tuyến trùng phá rễ và không độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, người dân có thể dễ dàng tự cách chiết dầu Neem để phun xịt, diệt trừ vật gây hại hoa màu. 1.3. Các nghiên cứu chiết xuất và sử dụng Chitosan 1.3.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin - chitosan trong tự nhiên Chitin - Chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xenllulose). Trong tự nhiên Chitosan tồn tại trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số loài động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp sát và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liến các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Chitin - Chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1.1 – Chitin, Chitosan và vỏ tôm Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose. 1.3.2. Tính chất lý hóa và độc tính của chitosan Cấu trúc hóa học. Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan rất đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là Chitosan, nếu DD < 50% thì gọi là chitin. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-b-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết b- (1-4) glucozit. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: MChitosan = (161,01)n Công thức cấu tạo của Chitosan: Hình 1.2 – Công thức cấu tạo Chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-b-D-glucose; Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-b-D-glucopyranose,3 Qua cấu trúc của Chitin – Chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là –OH (H ở nhóm hydroxit bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn Chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2, do đó, Chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn Chitin. Trong thực tế các mạch Chitin – Chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp. Hình 1.3 – Chitin, Chitosan và một số dẫn xuất Tính chất hóa học. Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110 C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hòa tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic..., tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hòa tan trong dung dịch axit acetic 1 – 1,5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãnh liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polime). Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với Iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Tính chất sinh học. Chitosan không độc, dùng an toàn cho người. Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u. Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid trong máu, hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit – insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung thư, chống tia tử ngoại, chống ngứa... của chitosan. Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định Chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn. Nghiên cứu tiêm Chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: Chitosan là vật liệu hòa hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô. Dùng Chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích lũy ở gan. Loại chitosan có DD » 50%, có khả năng phân hủy sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách. Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của Chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất của Chitosan ở Việt Nam và trên thế giới Các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh, trong vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chất chitin này, họ có thể chiết tách thành chất chitosan để ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế: hoá dược, mỹ phẩm và đặc biệt trong ngành dược phẩm, chất chitosan đã hỗ trợ đắc lực trong việc bào chế ra rất nhiều sản phẩm thuốc chữa được nhiều loại bệnh khác nhau. Trước đây, người ta thử chiết tách Chitosan từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ đáp ứng cho nhu cầu sản xuất. Trữ lượng Chitosan phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian các chất phế thải này không được thu hồi mà thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977, Viện Kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitosan và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần protien thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần Chitosan sẽ được dùng như một chất khởi đầu để diều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp. Năm 1961, nhà khoa học Nga BousBeloisov đã khởi xướng việc bào chế thuốc chống nhiễm xạ từ Chitosan. Các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm tiêm thuốc cho động vật chó và khỉ trước khi chúng bị nhiễm xạ, kết quả cho thấy, khả năng sống sót tới 45%. Rất tiếc, trong thảm hoạ hạt nhân Chernobyl năm 1968, các thuốc chống xạ trên chưa được công bố rộng nên không được áp dụng cứu người. Đến sau thảm hoạ tàu nguyên tử Komsomlets, các nhà khoa học đã lên tiếng kêu gọi nên sử dụng chitosan làm vật liệu kết cấu trong xây dựng các lò phản ứng nguyên tử và làm vỏ cách ngăn cho các con tàu nguyên tử. Tại Nhật Bản, năm 1975, Chitosan đã được đưa vào làm chất xúc tác để xử lý nước thải. Hiện nay, các hãng mỹ phẩm trên thế giới đã ứng dụng thành phần chitosan vào hàng loạt các sản phẩm của mình. Chúng ta có thể tìm thấy chất này trong các sản phẩm kem đánh răng, kem chống nắng, phấn mắt, nước xúc miệng, kẹo chewing-gun... Riêng hãng Mỹ phẩm Wella đã dùng Chitin-Chitosan trong ít nhất 15 sản phẩm bảo vệ tóc, và hãng Shiseido, thương hiệu nổi tiếng có mặt nhiều năm tại thị trường Việt Nam cũng đã dùng chất này trong 13 sản phẩm mỹ phẩm của hãng. Thế giới ngày càng có xu hướng sử dụng dược phẩm chiết xuất từ nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, trong nhiều năm qua, các nhà khoa học trên thế giới và cả ở Việt Nam đã tích cực nghiên cứu chiết tách chitosan từ hàng ngàn tấn vỏ tôm đang được thải ra tại các cơ sở chế biến đông lạnh, để sản xuất ra nhiều loại thuốc điều trị bệnh phục vụ cho cuộc sống con người. Điển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang được thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh. Vì thế, chỉ trong năm 1998, nước Mỹ đã tiêu thụ được hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin. Thậm chí tại các siêu thị, thuốc bán không cần đơn, chúng được coi như một loại thực phẩm chức năng. Những năm gần đây, loại thuốc chữa khớp này còn đựợc phổ cập rộng ở nhiều nước như: Nhật, Pháp, ấn Độ, Thái Lan và cả Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất chitosan và ứng dụng trong sản xuất phục vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 – 1980 Trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của Kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay, ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Trung tâm nghiên cứu Polyme – Viện Khoa học Việt Nam, Viện Hóa thuộc Phân viện Khoa học Việt Nam tại TP.HCM, Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2. Ở Miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Ở Miền Nam, Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại học Y dược TP.HCM, Phân viện Khoa học Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam,... đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng Chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm. 1.3.4. Ứng dụng của chitosan trong BVTV Một trong những tồn tại lớn của sản xuất nông nghiệp đang được quan tâm hiện nay là việc sử dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc hóa học. Tình trạng này nếu cứ tiếp diễn sẽ đi ngược lại mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn mà chúng ta đang nỗ lực tiến tới. Để góp phần hạn chế tồn tại trên, nhiều chế phẩm BVTV có nguồn gốc sinh học đã được đăng ký sử dụng. Tuy vậy, trong thực tế sản xuất, việc sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng trừ sâu bệnh còn nhiều hạn chế. Một trong những lý do chủ yếu là các chế phẩm sinh học thường chỉ được sử dụng riêng lẻ với mục tiêu diệt trừ ngay sâu bệnh khi chúng đã phát sinh gây hại. Kết quả là trong đa số các trường hợp hiệu quả diệt trừ sâu bệnh tỏ ra không bằng so với sử dụng thuốc hóa học nên chưa được nhiều nông dân chấp nhận. Để hiệu quả phòng trừ sâu bệnh hại của các chế phẩm sinh học thể hiện rõ, các chế phẩm sinh học cần phải được sử dụng theo quy trình xác định trong từng điều kiện cụ thể. Theo nghiên cứu của Halina Kurzawinska (2007) Khoa bảo vệ thực vật trường Đại học Nông nghệp Ba Lan chứng minh rằng: Ảnh hưởng lớn của Chitosan trong việc bảo vệ rau và cho rằng bệnh về rễ (Pythium của Dưa chuột) được khống chế khi sử dụng chitosan sử dụng với liều lượng 100 - 400 mg/ml. Biochikol 020 PC khi được tưới vào đất thì tốt hơn việc xịt lên cây để chống các loài nấm thuộc dòng Phytopthora và Fusarium. Ngoài ra chitosan là hoạt chất của Biochikol 020 PC và hoạt động kích thích miễn dịch của cây, chống lại hoạt động của nấm tác động đến cây. Chitosan còn là nhân tố giúp cây có phản ứng tự vệ ở trong cây. Khi phun lên lá và tưới gốc, Chitosan được cây hấp thụ nhanh và lưu dẫn trong toàn cây. Chitosan kích thích hoạt động của hệ thống kháng bệnh trong cây, giống như một loại vắc xin thực vật, tăng khả năng đề kháng của cây với các loài vi sinh vật gây bệnh, bao gồm cả nấm, vi khuẩn, tuyến trùng và virus. Ngoài ra, khi tiếp xúc với vi sinh vật, chất Chitosan có thể phá hủy màng tế bào làm vi sinh vật không phát triển được. Chitosan còn có tác dụng như một chất kích thích tăng trưởng cây trồng.     Ở nước ta hiện nay chất Chitosan bước đầu đã được đăng ký phòng trừ nhiều loại bệnh cho nhiều loại cây trồng như các bệnh đạo ôn, đốm vằn, bạc lá, lem lép hạt hại lúa, bệnh sương mai hại dưa, bắp cải, khoai tây, thán thư hại ớt, bệnh héo rũ, lở cổ rễ, bệnh chết nhanh hồ tiêu, bệnh gỉ sắt cà phê, bệnh thối quả xoài, bệnh do tuyến trùng trên nhiều loại cây như thanh long, cà phê, hồ tiêu, chè, hoa cúc, hoa huệ… Đối với cây có múi, chất Chitosan có thể hạn chế tác hại nhiều loại bệnh như thán thư, loét, tuyến trùng… Ngoài ra, Chitosan còn được sử dụng kích thích sinh trưởng cho nhiều loại cây như lúa, cà chua, chè, mía... Khi phun lên cây dung dịch được pha với nồng độ 0,1 – 0,3%, phun phòng bệnh với nồng độ thấp hơn khi phun trừ bệnh (Nguyễn Mạnh Hùng và Phạm Anh Cường Nam, 2006). Các kết quả thử nghiệm cho thấy, Chitosan hoàn toàn không độc với người và môi trường nên đã được phép sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và trên thế giới. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ Chitosan đã được đăng ký sử dụng ở Việt Nam như: thuốc trừ bệnh Olicide, humb 0.5 SL (hoạt chất Chitosan) phòng trừ bệnh sương mai cà chua, thán thư ớt, đốm vàng dưa leo, phấn trắng bí xanh (dẫn theo Cục Bảo vệ Thực vật, 2008). CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Mật độ của tuyến trùng trong vườn tiêu bị hại tại Bình Phước. Hiệu quả của Chitosan trong việc phòng trị tuyến trùng hại tiêu. Độc tính của Chitosan đến cây hồ tiêu. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Giống tiêu: Tiêu sẻ tại Bình Phước. Dụng cụ thí nghiệm: Phễu lọc, giá đỡ phễu, giấy lọc, ống cao su, rây lọc (bằng sắt), kính hiển vi, đĩa petri, cốc thủy tinh, cân phân tích, bình phun thuốc. Thuốc BVTV: Abamectin 5 WP. Sincocin 0.56 SL: 0,2 % Oligo Sacarit (Chitosan): 50 g/lít (được Cục Bảo Vệ Thực Vật nhập nội từ Trung Quốc) 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được bố trí dưới dạng khảo nghiệm diện rộng. Khảo nghiệm được bố trí trên những khu vực trồng cây tiêu đang có biểu hiện bị tuyến trùng gây hại (vàng lá, còi cọc). Các điều kiện trồng trọt như đất đai, phân bón, mật độ cây, chế độ chăm sóc… được tiến hành đồng đều trên mọi ô khảo nghiệm và phù hợp với tập quán canh tác của địa phương. Khảo nghiệm được chia thành 8 lô, mỗi ô có 10 cây (10 nọc), tổng số lượng cây tiêu thí nghiệm là 80 cây, gồm 7 lô sử dụng thuốc và một lô đối chứng không xử lý thuốc được trình bày như sau: Nghiệm thức Nồng độ sử dụng Cách xử lý 1 Chitosan 0,5% Tưới vào gốc + phun lên lá 2 Chitosan 1% Tưới vào gốc + phun lên lá 3 Chitosan 1,5% Tưới vào gốc + phun lên lá 4 Chitosan 0,5% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 5 Chitosan 1% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 6 Chitosan 1,5% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 7 Sincocin 0.56 SL (0,2 %) Tưới đẫm quanh gốc 8 Đối chứng Không tưới Chitosan và không phun thuốc Phương pháp xử lý: Đào rảnh xung quanh gốc cây (cách gốc khoảng 20 cm), sau đó tưới thuốc vào rảnh với liều lượng 1 lít/gốc (tránh nước chảy tràn ra ngoài) rồi lấp đất lại. Sau khi xử lý thuốc dưới gốc, dung dịch (cùng nồng độ với dung dịch tưới dưới gốc) được phun ướt đều trên tán lá tiêu cũng với liều lượng 1 lít/gốc. Mẫu rễ và đất được lấy cố định trên 3 cây tiêu thí nghiệm. Mỗi công thức theo dõi 10 cây tiêu. Phương pháp theo dõi thí nghiệm: - Đếm mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu rễ và đất ở các thời điểm trước lúc xử lý thuốc và 5, 15, 30 ngày sau khi xử lý thuốc. - Cách lấy mẫu rễ và mẫu đất: Mỗi công thức chọn cố định 3 cây để lấy mẫu rễ và đất bằng cách đào xung quanh vùng cây cách gốc 50 cm, sâu 15 cm. Mỗi cây lấy 3 điểm theo hình tam giác đều mà gốc cây là trung tâm. Trộn tất cả các mẫu của 3 cây trong cùng một công thức lại với nhau, sau đó lấy ra 1 mẫu đựng trong bao nilông dán nhãn để phân tích . - Phương pháp xác định tuyến trùng. Tuyến trùng trong rễ và trong đất được lọc bằng phương pháp phễu lọc Bermann. Trong rễ: Rửa sạch mẫu rễ dưới vòi nước mạnh, để khô và cân 0,5 gam rễ rồi cắt thành từng đoạn dài 0,5 cm. Đặt mẫu bệnh vào phễu, phía dưới đặt một cái rây và một lớp giấy lọc phía trên, cổ phễu được gắn ống cao su có kẹp ở cuối ống. Đổ nước từ từ vào miệng phễu sao cho nước vừa ngập mẫu rễ và tiến hành lọc trong 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Khi đã đủ thời gian, ta sẽ mở kẹp và lấy ra 10 ml nước chứa tuyến trùng cho vào đĩa petri sạch, dùng kính hiển vi có độ phóng đại 4X/ 0.10 để đếm số lượng tuyến trùng. Trong đất: Cân 10 gam đất cho vào lớp giấy lọc sau đó đặt vào phiễu và lọc như phương pháp lọc rễ. Hiệu lực của thuốc Hiệu lực của thuốc được tính theo công thức Henderson – Tilton (1955) Q (%) = .100 Trong đó: Ta: Mật độ tuyến trùng của lô thí nghiệm sau xử lý. Tb: Mật độ tuyến trùng của lô thí nghiệm trước xử lý. Ca: Mật độ tuyến trùng của lô đối chứng sau xử lý. Cb: Mật độ tuyến trùng của lô đối chứng trước xử lý. Độc tính của thuốc đối với cây tiêu Nếu cây tiêu có biểu hiện ngộ độc thì cần quan sát nhiều lần cho đến khi cây phục hồi hoặc chết. Các triệu chứng ngộ độc có thể đánh giá bằng mắt như biến vàng, cháy, biến dạng… thì ước lượng độ độc cho toàn ô dựa theo thang đánh giá sau. Cấp Triệu chứng 1 Cây bình thường. 2 Triệu chứng ngộ độc rất nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ. 3 Triệu chứng ngộ độc nhẹ, nhưng thấy được bằng mắt. 4 Triệu chứng ngộ nặng hơn (ví dụ mất diệp lục) nhưng có thể chưa ảnh hưởng đến năng suất. 5 Cây biến màu, cháy lá nặng. Có ảnh hưởng đến năng suất. 6,7,8,9 Thiệt hại cho đến mức cây chết hoàn toàn. Nguồn: TCN 579 – 2003 Chỉ tiêu quan sát - Mật độ tuyến trùng (số tuyến trùng/10ml dịch lọc) - Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng (%) - Độc tính của thuốc Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphic 7.0 để xử lý số liệu CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu rễ và trong mẫu đất ở các thời điểm Trước khi xử lý thuốc, hầu hết các lô tiêu đều có hiện tượng cây bị vàng lá, rễ có nốt sưng... Theo các tác giả, đây chính là bệnh do tuyến trùng Meloidogyne spp. gây ra (Nguyễn Văn Biên và CTV, 2003; Nguyễn Thơ, 2008). Như vậy, liệu trong thí nghiệm này, tuyến trùng Meloidogyne spp. có mặt hay không và với mật số như thế nào? Kết quả theo dõi được trình bày như sau: Trước khi xử lý thuốc Bảng 3.1 – Mật độ tuyến trùng trước lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 7 ± 1,53 27 ± 2,08 2. Chitosan nồng độ 1% 10 ± 1.53 32 ± 2,08 3. Chitosan nồng độ 1,5% 9 ± 2 34 ± 2 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 13 ± 2,51 92 ± 3,06 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 8 ± 2,08 58 ± 7,23 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 11 ± 1,53 99 ± 2,08 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 9 ± 1,53 62 ± 1,53 8. Đối chứng 7 ± 1 21 ± 2,08 Ghi chú: Biện pháp xử lý: tưới vào gốc Kết quả theo dõi ở bảng 3.1 cho thấy, tuyến trùng có mặt ở trong rễ của tất cả các cây tiêu ở các công thức thực nghiệm. Trong rễ, mật độ tuyến trùng biến động từ 7 – 13 con/10 ml dịch lọc. Tương tự, mật độ tuyến trùng trong đất cũng rất cao và phân bố ở tất cả các công thức. Điều này cho thấy, tuyến trùng Meloidogyne spp. rất phổ biến trong đất và trong rễ cây tiêu có biểu hiện bị bệnh tại vùng thí nghiệm với mật độ khá cao Hình 3.1: Hình lấy mẫu đất và mẫu rễ để quan sát tuyến trùng Hình 3.2: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc rễ ở lô đối chứng (ảnh chụp dưới kính hiển vi) Hình 3.3: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc đất ở lô đối chứng (ảnh chụp dưới kính hiển vi) Hình 3.4: Mẫu rễ tiêu sau khi cắt thành đoạn dài 0.5 cm Hình 3.5: Lọc tuyến trùng trong mẫu rễ cây tiêu Hình 3.6 : Mẫu đất (10 gam) dùng để lọc tuyến trùng Hình 3.7: Lọc tuyến trùng trong mẫu đất trồng tiêu Sau khi xử lý thuốc 5, 15 và 30 ngày, rễ và đất xung quanh gốc tiêu được lấy mẫu để kiểm tra sự hiện diện của tuyến trùng. Kết quả được trình bày ở các bảng sau: Sau 5 ngày xử lý thuốc Bảng 3.2 – Mật độ tuyến trùng sau 5 ngày lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 1 ± 0,58 12 ± 1 2. Chitosan nồng độ 1% 2 ± 1,53 28 ± 1,53 3. Chitosan nồng độ 1,5% 0 ± 0,58 27 ± 1,53 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 0 ± 0,58 42 ± 1 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 0 ± 0,58 23 ± 13,45 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 0 ± 0 46 ± 2 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 0 ± 0,58 26 ± 2,65 8. Đối chứng 8 ± 1 27 ± 2 Số liệu trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị 1 cho thấy: - Trong rễ: Mật độ tuyến trùng rất thấp trong dịch lọc rễ tiêu ở nghiệm thức 1(Chitosan 0,5%) và nghiệm thức 2 (Chitosan 1%). Trong dịch lọc rễ của các nghiệm thức 3 (Chitosan 1,5%), nghiệm thức 4 (Chitosan 0,5% + Abamectin 5WP 2 %), nghiệm thức 5 (Chitosan 1% + Abamectin 5WP 2%), nghiệm thức 6 (Chitosan 1.5 % + Abamectin 5WP 2%) và nghiệm thức 7 (Sincocin 0.56 SL 0,2 %) không tìm thấy tuyến trùng. Trong khi đó ở đối chứng, có đến 8 tuyến trùng/10ml dịch lọc, không giảm nhưng lại có xu hướng tăng hơn so với trước đó 5 ngày. - Trong đất: Mật độ tuyến trùng ở tất cả các công thức đều giảm so với trước khi xử lý, trừ công thức đối chứng, có xu hướng tăng hơn so với trước khi xử lý. Điều này cho thấy rằng, chế phẩm Chitosan thể hiện hiệu quả phòng trừ tuyến trùng hại tiêu khá nhanh, chỉ trong vòng 5 ngày sau khi xử lý. Hình 3.8: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc rễ sau 5 ngày xử lý thuốc Hình 3.9: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc đất sau 5 ngày xử lý thuốc Sau 15 ngày xử lý thuốc Bảng 3.3 – Mật độ tuyến trùng sau 15 ngày lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 0 ± 0 9 ± 0,71 2. Chitosan nồng độ 1% 0 ± 0,58 6 ± 0,71 3. Chitosan nồng độ 1,5% 0 ± 0,58 11 ± 0,71 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 0 ± 0,58 12 ± 0,71 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 0 ± 0 16 ± 1,41 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 0 ± 0 17 ± 2,12 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 0 ± 0,58 8 ± 2,83 8. Đối chứng 8 ± 1,53 28 ± 2,83 Kết quả ở bảng 3.3 và đồ thị 1 cho thấy: - Trong rễ tiêu: Vào thời điểm 15 ngày sau khi xử lý, hầu như không tìm thấy tuyến trùng ở các công thức xử lý bằng Chitonsan và công thức dùng thuốc Sincocin. Trong khi đó, mật độ tuyến trùng trong rễ tiêu ở công thức đối chứng vẫn duy trì như thời điểm 5 ngày sau xử lý. - Trong đất: Mật độ tuyến trùng trong đất ở các công thức xử lý Chitosan và thuốc hóa học còn rất thấp và giảm nhiều so với với so trước khi xử lý cũng như ở thời điểm 5 ngày sau khi xử lý. Trong khi đó, ở công thức đối chứng, mật độ tuyến trùng vẫn còn cao như trước khi xử lý và sau khi xử lý 5 ngày. Điều này cho thấy rằng, Chitosan tiếp tục duy trì hiệu quả phòng trị tuyến trùng cao đến tận 15 ngày sau khi xử lý. Hình 3.10: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc đất sau 15 ngày sử dụng thuốc Sau 30 ngày xử lý thuốc Bảng 3.4 – Mật độ tuyến trùng sau 30 ngày lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 0 1 ± 1,53 2. Chitosan nồng độ 1% 0 5 ± 1,53 3. Chitosan nồng độ 1,5% 0 3 ± 1,53 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 0 8 ± 2,08 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 0 6 ± 2,08 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 0 10 ± 4,16 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 0 5 ± 1,53 8. Đối chứng 10 ± 2,08 33 ± 2,52 Số liệu ở bảng 3.4 cho thấy: - Trong rễ: Trong dịch lọc của rễ tiêu ở các công thức xử lý Chitosan và thuốc hóa học đều không tìm thấy tuyến trùng. Trong khi đó, ở công thức đối chứng, mật độ tuyến trùng lại có xu hướng tăng hơn so với các thời điểm trước đó. Điều này cho thấy, trong rễ cây, thuốc Chitosan vẫn còn hiệu lực đến tận 30 ngày sau khi xử lý nên tuyến trùng không thể tấn công trở lại rễ. - Trong đất: Mặc dù, ở một số công thức, mật độ tuyến trùng trước khi xử lý rất cao. Tuy nhiên, sau khi xử lý 30 ngày, mật số tuyến trùng ở các công thức xử lý Chitosan và thuốc hóa học còn rất thấp và thấp hơn so với giai đoạn 15 ngày sau xử lý. Điều này cho thấy, trong đất, Chitosan cho hiệu lực phòng trị tuyến trùng hại tiêu rất tốt và duy trì đến tận 30 ngày sau khi xử lý. Hình 3.11: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc đất sau 30 ngày sử dụng thuốc 3.2. Hiệu lực diệt tuyến trùng của Chitosan Hiệu lực là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá, chọn lọc các chế phẩm. Hiệu lực này được tính toán dựa vào số liệu mật độ tuyến trong dịch lọc ở các lần quan sát như đã nêu trên. Kết quả được trình bày ở các phần sau: Sau 5 ngày xử lý thuốc Bảng 3.5 - Hiệu lực (%) diệt tuyến trùng của thuốc sau 5 ngày xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 82,17 ± 7,25a 66,38 ± 2,78b 2. Chitosan nồng độ 1% 85,81 ± 13,41ab 43,53 ± 16,92ab 3. Chitosan nồng độ 1,5% 97,35 ± 4,59b 39,96 ± 4,01a 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 97,80 ± 3,80b 64,82 ± 4,05b 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 97,08 ± 5,05b 66,28 ± 27,33b 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 100 64,57 ± 2,38b 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 96,3 ± 6,41b 67,79 ± 3,00b - Trong rễ: Như đã trình bày ở các phần trên, Chitosan thể hiện hiệu lực phòng trị tuyến trùng trong rễ tiêu rất tốt, ngay trong vòng 5 ngày sau khi xử lý. Hiệu lực vào thời điểm này đã lên > 82%, tương đương với thuốc hóa học (bảng 3.5). Trong đó, công thức xử lý Chitosan với nồng độ 0,5% cho hiệu lực có xu hướng thấp hơn các công thức xử lý Chitosan nồng độ 1% và thấp hơn hẳn so với các công thức còn lại khoảng 14 – 18% (bảng 3.5). Mặt khác, số liệu ở bảng 3.5 cũng cho thấy, hiệu lực phòng trừ tuyến trùng hại tiêu của Chitosan dùng ở liều 1% và 1,5% không sai khác so với có phối trộn thêm với Abamectin 5WP 2%. Như vậy, Chitosan dùng xử lý ở nồng độ 1% và 1,5% có khả năng diệt trừ > 90% tuyến trùng trong rễ của cây tiêu bị bệnh ngay trong vòng 5 ngày sau khi xử lý. Việc phối trộn thêm thuốc Abamectin 5WP 2% vào Chitosan ở các nồng độ này không làm thay đổi hiệu lực diệt trừ tuyến trùng. Hay có thể nói rằng, nếu chỉ để trừ tuyến trùng hại tiêu thì không cần phối trộn thêm thuốc Abamectin 5WP 2% vào Chitosan 1% và 1,5%. Hoặc việc phối trộn thêm Abamectin 5WP 2% vào Chitosan (nồng độ 1%; 1,5%) để trừ rệp hại trong rễ, không làm giảm hiệu lực phòng trừ tuyến trùng của Chitosan. - Trong đất: Tuy không thể hiện hiệu lực cao như trong rễ, nhưng lúc này đã có từ 40 – 68% tuyến trùng bị tiêu diệt. Hiệu lực diệt tuyến trùng của Chitosan tương đương với thuốc hóa học. Tuy vậy, số liệu ở bảng 3.5 cho thấy, hiệu lực có xu hướng thấp ở công thức 2 và thấp nhất ở công thức 3. Theo chúng tôi, có lẽ lúc này thuốc đang thể hiện hiệu lực, tuyến trùng còn sống có sự di chuyển tập trung không đều (có sự biến động khá lớn trong mẫu đất ở các lô xử lý Chitosan) và một phần là do thí nghiệm bố trí trên đồng nên không tránh khỏi những sai số thí nghiệm. Sau 15 ngày xử lý thuốc Bảng 3.6 - Hiệu lực (%) diệt tuyến trùng của thuốc sau 15 ngày xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 100 73,52 ± 11,48 2. Chitosan nồng độ 1% 96,97 ± 5,25 84,17 ± 8,42 3. Chitosan nồng độ 1,5% 96,97 ± 5,25 75,12 ± 12,82 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 97,78 ± 3,85 89,53 ± 4,49 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 100 76,67 ± 15,93 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 100 85,81 ± 7,47 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 95,83 ± 7,22 90,49 ± 2,91 Dựa vào số liệu ở bảng 3.6 cho thấy: - Trong rễ: Như đã trình bày, hiệu lực của thuốc trong rễ thể hiện khá nhanh. Ở 5 ngày sau khi xử lý, hiệu lực ở tất cả các công thức đều đạt > 82%, có công thức đã đến 100%. Số liệu ở bảng 3.6 cho thấy, ở thời điểm 15 ngày sau xử lý, hiệu lực ở các công thức đều đạt > 95% và không có sự khác biệt giữa các công thức. Như vậy, tính đến 15 ngày sau khi xử lý, hiệu lực phòng trừ tuyến trùng trong rễ cây tiêu của Chitosan ở nồng độ 0,5%, 1% và 1.5% không sai khác so với thuốc Sincocin 0.56SL 0,2%. Mặt khác, việc phối trộn Abamectin 5WP 2% vào với Chitosan không làm thay đổi hiệu lực diệt trừ tuyến trùng hại tiêu của Chitosan. - Trong đất: Hiệu lực diệt tuyến trùng trong đất ở các công thức đều đạt hơn 74%. Tương tự như trong rễ, hiệu lực phòng trừ tuyến trùng không có sự sai khác giữa các công thức xử lý (bảng 3.6). Điều này một lần nữa khẳng định, Chitosan dùng xử lý ở nồng độ từ 0,5 đến 1,5% cho hiệu quả diệt trừ tuyến trùng tương đương với thuốc hóa học Sincocin 0.56SL 0,2%. Mặt khác, tính đến 15 ngày sau xử lý, việc tăng nồng độ của Chitosan từ 0,5 đến 1,5% cũng như trộn thêm thuốc Abamectin 5WP 2%, không làm thay đổi hiệu quả phòng trừ tuyến trùng của Chitosan (bảng 3.6). Sau 30 ngày xử lý thuốc Bảng 3.7 - Hiệu lực (%) diệt tuyến trùng của thuốc sau 30 ngày xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 100 97,13 ± 3,32b 2. Chitosan nồng độ 1% 100 91,06 ± 2,13a 3. Chitosan nồng độ 1,5% 100 93.36 ± 2,98ab 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 100 93,76 ± 0,43ab 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 100 93,38 ± 0,45ab 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 100 93,06 ± 3,96ab 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 100 94,6 ± 1,17ab Số liệu ở bảng 3.7 cho thấy: - Trong rễ: Như đã trình bày, trong rễ tiêu ở các công thức, đến thời điểm này vẫn chưa có tuyến trùng xuất hiện. Trong khi tuyến trùng trong rễ ở công thức đối chứng vẫn cao. Như vây, hiệu lực của Chitosan lúc này vẫn còn rất cao (100%) nên ngăn chặn sự xuất hiện trở lại của tuyến trùng có trong đất (bảng 4.7). - Trong đất: Tương tự như trong rễ, hiệu lực trong đất vẫn còn được duy trì và tiếp tục tăng cao. Hiệu lực lúc này đã lên đến hơn 91% ở các công thức. Đây là điều rất quý đối với các chế phẩm sinh học. Số liệu ở bảng 3.7 cũng cho thấy rằng, Chitosan xử lý ở nồng độ 0,5%, 1% và 1,5% đều cho hiệu lực phòng trị rất cao (>91%) đối với tuyến trùng hại tiêu có trong đất. Như vậy, xu hướng chung của thí nghiệm cho thấy, chỉ cần sử dụng Chitosan ở nồng độ 0,5% là đủ. Hơn nữa, nếu chỉ sử dụng để trừ tuyến trùng thì không cần trộn thêm thuốc trừ rệp (Abamectin) hoặc nếu phối trộn thêm thuốc Abamectin để trừ rệp thì cũng không làm giảm hiệu lực phòng trừ tuyến trùng của Chitosan trong kết quả thí nghiệm. 3.3. Ảnh hưởng của thuốc đến cây tiêu Ngoài tác động đến sinh vật gây hại, một số loại thuốc bảo vệ thực vật còn gây ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Vì vậy, bên cạnh việc khảo sát hiệu lực diệt trừ dịch hại, các loại thuốc còn phải được kiểm tra độc tính trước khi giới thiệu cho sản xuất. Kết quả theo dõi được trình bày ở các phần sau: 3.3.1. Sau 5 ngày xử lý thuốc Bảng 3.8 – Độc tính của thuốc đối với cây tiêu sau 5 ngày sử dụng thuốc Cây số Công thức 1 2 3 4 5 6 7 I Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 II C C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 III Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 IV Cấp 1 C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 V Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 VI Cấp 1 C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 C VII Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 VIII Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 IX Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 X Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Ghi chú: C là cây chết ban đầu. Như đã trình bày, trước khi tiến hành thử nghiệm, cây tiêu ở các công thức đều có biểu hiện vàng lá do tuyến trùng gây hại. Sau khi phun 5 ngày, các cây tiêu ở công thức đối chứng (công thức 8) vẫn còn biểu hiện vàng lá và còi cọc. Trong khi đó, các cây tiêu ở các công thức xử lý Chitosan có chiều hướng phục hồi, tán lá xanh hơn so với trước khi xử lý và xanh hơn so với công thức đối chứng (hình 3.12 và 3.13). Dựa theo tiêu chuẩn đánh giá như đã nêu, các cây tiêu ở các công thức xử lý Chitosan cũng như phun thuốc đều được xếp vào cấp 1 và không có biểu hiện ngộ độc (bảng 3.8). Như vậy, sau 5 ngày xử lý, chế phẩm Chitosan không gây ngộ độc cho cây tiêu. Hình 3.12 – Lô tiêu đối chứng sau 5 ngày Hình 3.13 – Lô tiêu sau 5 ngày xử lý thuốc ở công thức 1 3.3.2. Sau 15 ngày xử lý thuốc Tương tự như ở thời điểm 5 ngày sau khi xử lý thuốc, kết quả quan sát trình bày ở bảng 3.9 cho thấy cây tiêu hoàn toàn không có biểu hiện ngộ độc thuốc. Mặt khác, do vẫn bị tuyến trùng gây hại nên cây tiêu ở công thức đối chứng vẫn bị vàng lá, cây còi cọc. Trong khi đó, cây tiêu ở các công thức xử lý thuốc đều có biểu hiện xanh tươi hơn trước và có chiều hướng tốt hơn so với định kỳ điều tra trước (hình 3.14 và 3.15). Điều này có thể hiểu được là do không còn tuyến trùng gây hại nên cây phục hồi trở lại. Bảng 3.9: Độc tính của thuốc đối với cây tiêu sau 15 ngày sử dụng thuốc Cây số Công thức 1 2 3 4 5 6 7 I Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 II C C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 III Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 IV Cấp 1 C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 V Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 VI Cấp 1 C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 C VII Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 VIII Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 IX Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 X Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Ghi chú: C là cây chết ban đầu Hình 3.14 – Lô tiêu đối chứng sau 15 ngày Hình 3.15 – Lô tiêu sau 15 ngày xử lý thuốc ở công thức 1 và 2 3.3.3. Sau 30 ngày xử lý thuốc Việc đánh giá độc tính của thuốc đối với cây tiêu cũng được tiến hành tiếp tục vào thời điểm 30 ngày sau khi xử lý. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 cho thấy, tất cả các cây tiêu trong lô thử nghiệm đều ở cấp 1 và không có biểu hiện ngộ độc. Hơn thế nữa, hình 3.16 và 3.17 cho thấy, tán lá của cây tiêu ở các công thức xử lý Chitosan xanh tươi và phát triển tốt hơn hẳn so với trước và so với công thức đối chứng. Như vậy, nhờ tuyến trùng đã bị tiêu diệt nên cây ngày càng được phục hồi và phát triển trở lại. Điều này một lần nữa khẳng định rằng Chitosan an toàn đối với cây tiêu và có hiệu quả tốt để trừ tuyến trùng hại tiêu Bảng 3.10 – Độc tính của thuốc đối với cây tiêu sau 30 ngày sử dụng thuốc Cây số Công thức 1 2 3 4 5 6 7 I Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 II C C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 III Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 IV Cấp 1 C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 V Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 VI Cấp 1 C Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 C VII Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 VIII Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 IX Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 X Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Ghi chú: C là cây chết ban đầu. Tóm lại: Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng tại Bình Phước đã cho thấy, chế phẩm Chitosan sử dụng ở nồng độ 0,5% ; 1% và 1,5% cho hiệu quả rất tốt để trừ tuyến trùng hại tiêu. Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng ở các nồng độ này không khác nhau và cũng không khác so với có phối trộn thêm thuốc trừ rệp (Abamectin) hay so với công thức xử lý thuốc Sincocin. Cây tiêu sau khi được xử lý Chitosan đã phục hồi và phát triển trở lại hình 3.17, 3.18 và chế phẩm này không gây ngộ độc cho cây. Hình 3.16 – Lô tiêu đối chứng sau 30 ngày Hình 3.17 – Lô tiêu sau 30 ngày xử lý thuốc ở công thức 1, 2 và 3 Hình 3.18 – Lô tiêu sau 30 ngày xử lý thuốc công thức 3, 4 và 5 Hình 3.19 – Lô tiêu sau 30 ngày xử lý thuốc công thức 7 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Tuyến trùng Meloidogyne spp. có mặt phổ biến trong rễ và đất trồng của các cây tiêu có biểu hiện vàng lá, xoắn lá với mật số cao. - Sử dụng Chitosan với nồng độ 0,5%; 1% và 1,5% để tưới vào gốc tiêu cho hiệu quả cao trong phòng trừ tuyến trùng hại tiêu, tương đương với thuốc Sincocin 0,56 SL nồng độ 0,2%. - Hiệu lực phòng trị tuyến trùng hại tiêu của Chitosan ở các nồng độ 0,5%, 1% và 3% không có sự sai khác nhau. - Việc phối trộn với Abamectin 5WP 2% không làm thay đổi hiệu lực phòng trị tuyến trùng của chế phẩm Chitosan. - Thuốc Chitosan dùng tưới gốc với nồng độ 0,5%; 1% và 1,5% không gây độc cho cây trồng. - Cây tiêu bị tuyến trùng gây hại nặng có thể phục hồi trở lại sau khi được xử lý bằng Chitosan Kiến nghị Đưa thuốc sinh học Chitosan (chiết xuất từ vỏ tôm) nồng độ 0,5% vào phòng trừ tuyến trùng trên cây tiêu.