Đồ án Đánh giá mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại các quầy thịt ở chợ Văn Thánh

hóa: Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính, Voges – Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, Lysine Decarboxylase dương tính. Kích thướt tế bào và khuẩn lạc phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc thay đổi theo môi trường nuôi cấy. Trong môi trường NA : khuẩn lạc tròn, ẩm ướt, mặt láng, có nếp nhăn. Trong môi trường EMB : khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc đen. Môi trường MacConkey: khuẩn lạc màu đỏ mận chín. E.coli có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7-50oC. Nhiệt độ và pH phát triển tối ưu của E.coli là 37-38oC, pH: 7,2 - 7,4. Riêng loài Enterotoxigenic (ETEC) có thể phát triển ở 4oC. Giá trị D của E.coli là 60oC trong 0,1 phút. E.coli sống trong ruột già của động vật. Theo phân người và động vật ra ngoài thiên nhiên. Bị ức chế bởi một số loại hóa chất như chlorine, mối mật, brillian green…. e. Cơ chế gây bệnh E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và F41.Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotype. Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli.  E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có. Bình thường, vi khuẩn không gây tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân). Khi mật số tăng lên cao (106- 109CFU/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh. Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường miệng. Ở dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn. Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động lên nhung mao ruột. Nhiễm trùng huyết: bằng tính xuyên mạch, E.coli xâm nhập vào máu, đi đến các cơ quan nội tạng khác, tiết độc tố gây độc cho cơ thể, quan trọng nhất là làm viêm não, bại não. f. Các triệu chứng khi nhiễm Có nhiều loại E.coli, nhưng phần lớn chúng có thể nói là vô hại.  Tuy nhiên, một số E.coli có thể gây tiêu chảy, và loại phổ biến nhất trong nhóm E.coli có hại này là E.coli O157:H7.  Ở vài bệnh nhân, vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli.  Người bị nhiễm cũng có thể cảm thấy đau thắt bao tử và nôn ói.  Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4 ngày sau khi bị phơi nhiễm vi khuẩn E.coli.  Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh.  Phần lớn bệnh nhân cũng chẳng cần đến bác sĩ vì họ không biết mình bị nhiễm E.coli.  Ngoài ra, nhiều người bị nhiễm mà không có triệu chứng và cũng không mắc bệnh. Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu và suy thận), một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận: Da trở nên xanh xao Cảm lạnh Cảm thấy yếu cơ Có những vết thâm tím trên người Đi tiểu rất ít nước tiểu 2.3.2. Staphylococcus aureus a. Lịch sử phát hiện Staphylococcus aureus ( hay còn gọi là tụ cầu vàng ) do Robert Koch (1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus thuộc họ Micrococcaceae. Tụ cầu vàng có rải rác trong tự nhiên như trong đất, nước, không khí, đặc biệt người là nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu là ở vùng mũi họng (30%), nách, âm đạo, mụn nước trên da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn. Tỷ lệ mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, có bệnh tiểu đường type 1, chích xì ke, nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính. Sau 2 tuần nằm viện, tỉ lệ này lên đến 30%-50% và thường nhiễm chủng kháng thuốc. b. Phân loại Về phân loại khoa học, Staphylococcus aureus được xếp vào : Giới : Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp : Cocci Bộ : Bacillales Họ : Staphylococcaceae Chi : Staphylococcus Loài : Staphylococcus aureus Tên khoa học: Staphyococcus aureus Rosenbach 1884 c. Hình thái cấu trúc Staphylococcus aureus là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8 – 1,0 µm và đứng thành hình chùm nho, Gram dương, không có lông, không sinh nha bào, thường không có vỏ, hiếu khí hay kị khí tuỳ nghi. Staphylococcus aureus có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide và acid teichoic của vách. Các kháng nguyên trên bề mặt tế bào được quan tâm như: - Acid teichoic ( kháng nguyên O ): là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của Staphylococcus, là chất bám dính của Staphylococcus aureus vào niêm mạc mũi. Acid này gắn polysaccharide vách Staphylococcus aureus. - Protein A: là những protein bao quanh bề mặt Staphylococcus aureus và là tiêu chuẩn để xác định Staphylococcus aureus, 100% các chủng Staphylococcus aureus có protein này. - Vỏ polysaccharide: một số ít chủng Staphylococcus aureus có vỏ và có thể quang sát được bằng phương pháp nhuộm vỏ. Lớp vỏ này có nhiều kháng nguyên đặc hiệu và có thể chứng minh bằng phương pháp huyết thanh học. Vỏ của Staphylococcus aureus có tác dụng chống thực bào bởi vỏ đã che phủ peptidoglycan của vách, làm cho cơ thể này không có chổ bám để hoạt hóa theo con đường tắt. Hình 2.6: Vi khuẩn Staphylococcus aureus d. Đặc điểm sinh hóa, sinh trưởng Staphylococcus aureus có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau và phát triển rất mạnh trên môi trường có chứa chất hữu cơ. Nguồn nitơ được sử dụng là nguồn acid amin. Khi phát chúng triển trong điều kiện yếm khí chúng cần uracin. Trong điều kiện hiếu khí chúng cần glutamate natri để tổng hợp enterotoxin. Nếu trong môi trường có ba loại acid amin như arginin, cystin, phenylalanine và bốn vitamine như: pantothenate, biotin, niacin, thiamine là môi trường rất thuận lợi cho Staphylococcus phát triển.(Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm) Có các thử nghiệm Catalase và Coagulase dương tính, lên men đường Mannitol. Khi phát triển trong môi trường, chúng có khả năng tạo ra sắc tố từ màu trắng tới vàng sậm, nhiệt độ thích hợp để tạo màu là 20 – 250C. Nhiệt độ thích hợp nhất cho Staphylococcus phát triển là 370C. Staphylococcus chịu được khô hạn, hơi nóng ( ở nhiệt độ 500C chúng vẫn sống trong 30 phút). Chúng có khả năng sống ở nồng độ muối 9 – 10%. Bị ức chế ở 3% hexachlorophene, tím gertian. e. Cơ chế gây bệnh Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn. Ÿ Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Ÿ Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho các đại thực bào. Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào. Ÿ Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm, tụ cầu còn sản xuất một số men quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này. Ÿ Hyaluronidase: men này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức. Ÿ Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào. Ÿ Exfoliatine: là các men phá hủy lớp thượng bì. Men này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Ÿ Năm độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E) bền với nhiệt. Các độc tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Ÿ Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta-lactamase). Men này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. f. Các triệu chứng khi nhiễm Con đường xâm nhiễm thường nhất là da và các phần phụ của da, hay gặp trong các bệnh da mãn tính như chàm và vẩy nến, vết rách da do chọc chích hay trầy xướt các phần phụ của da như nang lông và móng. Ngoài ra, tụ cầu vàng còn có thể xâm nhập qua đường hô hấp sau khi hít sặc, tắc nghẽn hay giảm chức năng nhung mao trong viêm phế quản mãn hay nhiễm siêu vi cấp tính. Đặt nội khí quản cũng có thể đưa tụ cầu từ thường trú ở đường hô hấp trên đến đường hô hấp dưới. Nhiễm trùng da và mô mềm: Tụ cầu vàng là nguyên nhân gây nhiễm trùng da và mô mềm thường gặp nhất, các biểu hiện có thể gặp gồm: - Viêm nang lông. - Nhọt da: thường ở mông, mặt hay cổ. - Hậu bối: thường gặp ở vùng sau cổ, vai , hông và đùi, điển hình xảy ra ở đàn ông trung niên hay già yếu. - Viêm quanh móng. - Tróc bóng nước ở trẻ em. - Viêm mô tế bào: có khi do tụ cầu vàng nhưng thường do liên cầu tan huyết β gây ra hơn. Nhiễm trùng hô hấp: Tụ cầu vàng đến nhu mô phổi qua hai đường hít từ đường hô hấp trên hay lan theo đường máu gây: - Viêm phổi, biến chứng tràn mủ màng phổi. - Viêm họng xuất tiết kèm phát ban và có thể gây nhiễm độc toàn thân. - Viêm khí quản ở trẻ em kèm theo biểu hiện nhiễm độc toàn thân. - Viêm xoang mãn. - Viêm xoang bướm. Nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương: - Abcès não sau viêm nội tâm mạc. - Viêm màng não mủ. - Tràn mủ dưới màng cứng. - Abcès ngoài màng cứng tủy sống hay trong não. - Viêm tắc tĩnh mạch nội sọ, nhiễm trùng sau viêm xoang, viêm xương chũm hay nhiễm trùng mô mềm ở mặt. Viêm tắc tĩnh mạch xoang hang biểu hiện bởi dấu hiệu thần kinh khu trú, đặc biệt là liệt các dây thần kinh sọ. Viêm tắc xoang tĩnh mạch dọc biểu hiện bởi yếu tay và chân, thay đổi tri giác. Nhiễm trùng tiểu: thường xảy ra sau khi soi bàng quang hay đặt thông tiểu. Còn trong các trường hợp khác nếu tìm thấy sự hiện diện của tụ cầu vàng trong nước tiểu dù cho số lượng ít chứng tỏ có tình trạng du khuẩn huyết và vi khuẩn đến thận bằng đường máu có hay không kèm theo abcès. Nhiễm trùng cơ xương: tụ cầu vàng là nguyên nhân thường gặp nhất của cốt tủy viêm cấp ở người lớn và cũng là một trong các nguyên nhân hàng đầu ở trẻ em. Ở người lớn vị trí hay gặp là thân đốt sống, ở trẻ em vị trí hay gặp là các hành xương dài giàu mạch máu. Ngoài ra, tụ cầu vàng cũng hay gây cốt tủy viêm mãn trên các vùng chấn thương hay vùng phẫu thuật cũ, gây viêm khớp nhiễm trùng ở người lớn, thường gặp ở khớp gối, hông và khớp cùng chậu, gây viêm mủ cơ (thường nhất là abcès cơ chậu). Du khuẩn huyết: biến chứng của du khuẩn huyết do tụ cầu vàng bao gồm abcès các tạng trong ổ bụng, abcès não, viêm màng não, viêm khớp nhiễm trùng, cốt tủy viêm, abcès ngoài màng cứng, phình mạch nấm. Tỷ lệ tử vong là 11%-43%. 2.3.3.3. Salmonella spp a. Lịch sử phát hiện Salmonella được lấy tên từ nhà khoa học người Mỹ, Daniel Elmer Salmon- một nhà nghiên cứu bệnh lý động vật. Nhưng thực chất ông không phải là phát hiện đầu tiên mà là nhà khoa học Theobald Smith. D.E.Salmon đã công bố trước.T.Smith là bạn đồng nghiệp của D.E.Salmon, cùng làm việc ở Bureau of Animal Industry (BAI) vào năm 1884. T.Smith phát hiện ra vi khuẩn Salmonella từ thịt vào năm 1885. b. Phân loại Về phân loại khoa học, Salmonella được xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Salmonella lignieres 1900 Loài: S. bongori và S. Enterica Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S. typhi hay S. paratyphi A, B, C ( typhoid = bệnh thương hàn, para = phó ), hoặc theo vật chủ như S. typhimurium gây bệnh ở chuột ( murine = chuột ) , về sau người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau. Vì những lý do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S. teheran, S. congo, S. London. Salmonella đã từng được chia thành các chi phụ và nhiều loài, mỗi loài lại có khả năng có chi phụ. Ví dụ như loài Salmonella enterica được chia thành 6 loài phụ gồm S. enterica, S. salamae, S. arizonae, S. diarizonae, S. houtenae và S. Indica. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu sau này cho phép xếp tất cả các loại Salmonella vào một loài duy nhất. Mặc dù ý kiến này đã được nêu ra nhưng cách truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa riêng nên nó không được chấp nhận Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H, Salmonella được chia thành các nhóm và các type huyết thanh. Hiện nay được xác định gồm trên 2500 type huyết thanh Salmonella  c. Hình thái cấu trúc Salmonella spp là trực khuẩn Gram âm, kị khí tuỳ nghi, không có nha bào, có khả năng di động (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có kích thước 0,7 – 1,5 x 2 – 5 µ. Hình2.7: Vi khuẩn Salmlonella spp Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn ( S.typhi ) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu. - Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O): + Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide. + Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lipo polysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài. Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài Kháng nguyên lông ( kháng nguyên H ): + Kháng nguyên H (KN-H): Chỉ có ở Salmonella có lông. Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. KN-H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O. KN-H rất dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu. + Kháng nguyên H chia làm 2 phase : Pha 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữa số La tinh thường: a, b, c… Pha 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x… - Kháng nguyên vỏ K: Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi. Kháng nguyên Vi – angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, kháng nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh. d. Đặc điểm sinh hóa, sinh trưởng Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA ( deoxycholate citrate agar ) và XLD ( xylose lysine deoxycholate ), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ. Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi. Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môn trường Simmons. Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella được thể hiện ở bảng 2.13. Nhiệt độ phát triển của Salmonella là từ 15-45oC, nhiệt độ thích hợp nhất là ở 37oC, pH thích hợp ở 7,6, nhưng nó có thể phát triển ở được ở pH từ 6 – 9 . Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: ở 50oC trong 1 giờ, ở 70oC trong 15 phút và 100oC trong 5 phút. Như vậy diệt khuẩn thực phẩm bằng phương pháp Pasteur có tác dụng tốt. Ở nồng độ muối 6-8% vi khuẩn phát triển chậm và ở nồng độ muối 8-19% thì sự phát triển của vi khuẩn bi ngừng lại. Tuy vậy với vi khuẩn gây ngộ độc thực ăn chỉ bị chết khi ướp muối với nồng độ bão hoà trong thời gian dài. Như vậy thịt cá ướp muối, các món ăn kho mặn chưa thể là an toàn đối với vi khuẩn Salmonella. Salmonella spp hiện diện trong tất cả các loài thực phẩm: trứng, thịt, thuỷ hải sản, sữa, rau quả,… Bảng 2.13: Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella Tính chất Kết quả Ghi chú - Khử Nitrate (+) - Lên men Glucid (+) Kèm theo sự tổng hợp acid - Lên men Glucose sinh khí (+) Trừ một số chủng thuộc loài S.typhi và S. gallinarum - Sử dụng Citrate (+) Trừ S. typhi và S. paratyphi A - Sinh H2S (+) Trừ một số chủng thuộc loài S. paratyphi A và S. choleraesuis - Sử dụng Lactose (-) Trừ S. anizonae - Sử dụng Saccharose (-) - Hệ enzyme: + Catalase (+) + Beta –galactosidase (-) Trừ một số loài phụ + Urease (-) + Decarboxylase Lysine (LDC) (+) Trừ S. paratyphi A Ornithine (ODC) (+/-) + Arginine dihydrolase (ADH) (-) + Desaminase Phenylalanine (-) Tryptophane (-) + Tetrathionate reductase (+) - Các tính chất khác + Mannitol (+) + Indole (-) + Acetylmethylcarbinol (VP) (-) (+): dương tính; (-): âm tính;(+/-): có thể âm tính hay dương tính tùy theo chủng (Lê Văn Việt Mẫn và Lại Mai Hương )  e. Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố. + Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. + Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột. Khả năng gây ngộ độc thức ăn của Salmonella spp cần có 2 điều kiện: Ÿ Thức ăn phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc của Salmonella yếu Ÿ Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. vấn đề này phụ thuộc nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người. điều này giải thích hiện tượng nhiều người cùng ăn một loại thức ăn như nhau nhưng có người bị ngộ độc có người không bị, có người nhẹ, có người bị nặng…Thông thường những người già, người yếu và trẻ em bao giờ cũng bị nặng hơn Salmonella spp theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh sản ở đó, một số khác đi vào hệ bạch huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Nhưng vì Salmonella spp là vi khuẩn ưa môi trường ruột nên nhanh chóng trở về ruột. Sau đó, Salmonella spp chui qua màng nhày và vào thành ruột. Nội độc tố sẽ được thoát ra khi vi khuẩn bị phân huỷ trong máu cũng như ở ruột, gây nhiễm độc cấp bằng một hội chứng rối loạn tiêu hoá khá nặng nề, nhưng chỉ sau 1-2 ngày bệnh nhân nhanh chóng trở lại bình thường không để lại di chứng, vì các tế bào niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Nhưng ở người già yếu và trẻ nhỏ có thể bị rối loại tiêu hoá nặng hơn, đôi khi bị tử vong. f. Các triệu chứng khi nhiễm Vi khuẩn Salmonella spp là nguyên nhân thường gây ra bệnh tiêu chảy, nhưng cũng có thể nhiễm bệnh đến các bộ phận khác của cơ thể bao gồm máu (bệnh thương hàn hay phó thương hàn), xương và khớp xương (bệnh viêm khớp mãn tính). Thời gian ủ bệnh thường từ 12-24 giờ sau khi khuẩn Salmonella spp vào cơ thể, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài sau vài ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy buồn nôn, nhức đầu choáng váng khó chịu, thân nhiệt tăng lên ít (37-38oC) sau đó xuất hiện nôn mửa, đau bụng quặn thắt, ỉa chảy nhiều lần, phân toàn nước, đôi khi có máu, đó là triệu chứng của viêm dạ dày ruột cấp tính. Đa số bệnh nhân trở lại bình thường sau 1 đến 2 ngày mà không để lai di chứng. Trong trường hợp đối với người già, trẻ em, người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu do bị bệnh có thể có biểu hiện bệnh nặng hơn, như là bệnh thương hàn hay phó thương hàn, cảm cúm, nghĩa là sốt rất cao 39-40oC mệt mỏi toàn thân, đau ở vùng thắt lưng và cơ bắp. Nếu hội chứng này kéo dài nhiều tháng hay nhiều năm có thể dẫn tới bệnh viêm khớp mãn tính. Một số người khác bị nhiễm Salmonella spp nhưng không có triệu chứng gì vẫn có thể truyền bệnh cho người khác. Ngoài ra khi Salmonella spp gây bệnh thương hàn có thể có nhiều biến chứng sau: Biến chứng ở đường tiêu hóa: Xuất huyết tiêu hóa Thủng ruột Biến chứng đường gan mật : viêm túi mật, viêm gan Các biến chứng khác : viêm đại tràng, viêm ruột thừa, viêm phúc mạc mật, viêm dạ dày, viêm tụy cấp, viêm lưỡi thường ít gặp. Biến chứng tim mạch : Viêm cơ tim Viêm tắc động mạch tĩnh mạch Viêm màng ngoài tim Biến chứng đường tiết niệu : Viêm vi cầu thận, hội chứng thận nhiễm mỡ Suy thận cấp Biến chứng nhiễm trùng khu trú cơ quan : hầu hết các cơ quan đều có thể tụ mủ bởi vi trùng thương hàn. Viêm màng não mủ Viêm họng, viêm tuyến mang tai có mủ Viêm đài bể thận, viêm bàng quang Viêm xương : xương sườn, xương sống Viêm gây nhọt ở tuyến vú Viêm hạch cổ. 2.4. Các phương pháp phát hiện Salmonella 2.4.1. Phương pháp truyền thống 2.4.1.1. Nguyên tắc Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella. + Bước tăng sinh : tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỷ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1 : 9, tuy nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ này có thể thay đổi + Bước tăng sinh chọn lọc : Các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis ( RV ), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth ( TT )… Các nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác để phân tích nhiều mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường TT thường được dùng để phân tích các mẫu thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm cao, các mẫu thức ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu. + Bước phân lập : nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các giống của nhóm này dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là môi trường Xylose Lysine Deoxycholate Agar ( XLD ) được khuyến khích sử dụng + Bước khẳng định : nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, indol, LDC ( Lysine decarboxylase ), ODC ( Ornithine decarboxylase ), Urea, Manitol, Sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá. 2.4.1.2. Môi trường và hóa chất + Buffered Pepton Water ( BPW ) + Rappaport Vassiliadis Soya Pepton ( RV ) + Malachite Green Magnesium Chloride + Tetrethionate Muller – Kauffmanm + Xylose Lysine Deoxycholate ( XLD ) + Hektoen Entric Agar ( HE ) + Bismuth Sulphite Agar ( BS ) + Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose ( BPLS ) + Triple Sugar Iron ( TSI ) + Urea + Lysine Decarboxylase + Ornithine Decarboxylase + Manitol + Sucrose + Sorbitol + Tryptone + Thuốc thử Kovac’s + Kháng huyết thanh Salmonella đa giá 2.4.1.3. Phương pháp thực hiện Tăng sinh : Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ứ chế sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào một túi PE lớn, cho them 1 lít BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn bộ mẫu Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho thêm 225ml BPW, để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút. Sau đó lắc cho tan hoàn toàn Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị : đồng nhất mẫu với tỷ lệ 1/100 trong BPW ( thay vì 1/10 như bình thường ) trước khi tăng sinh. Biện pháp này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác : thực hiện dồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 400C Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 400C Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2 – 3 giọt Triton X – 100 trước khi ủ tăng sinh Tăng sinh chọn lọc: Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm đến 420C. Ủ ở 420C trong 18 – 24 giờ, khi cần thiết có thể kéo dài ủ thêm 24 giờ Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi trường khác. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau Phân lập và nhận diện: Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ Khẳng định: Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa và huyết thanh Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau Thử nghiệm H2S ( KIA hay TSI ): Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường, vì vậy phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các chủng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có các vạch màu đen trong môi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc môi trường bị đẩy lên để lại một khoảng hở dưới đáy ống nghiệm Thử nghiệm LDC ( + ): sau khi nuôi cấy, môi trường bị kiềm hóa, màu không đổi ( màu tím hay xanh ) Thử nghiệm urea ( - ): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH của môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu Lên men manitol, sorbitol ( + ): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng. Thử nghiệm indol và VP ( - ) Các thử nghiệm kháng nguyên: cần được thử nghiệm song song với mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng ( + ) khi chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối sinh lý Phương pháp hiện đại Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm người ta đã kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. 2.4.2.1. Phương pháp PCR Phương pháp PCR là phương pháp tổng hợp DNA in vitro dựa trên khuôn là một trình từ DNA đích ban đầu, sau đó trình tự này được khuếch đại và nhân lên thành hàng triệu bản sao. Một phản ứng PCR để có thể thực hiện được phải có: DNA mẫu. Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược. Taq polymerase dNTP’s ( các nucleotide tự do) Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ là một quá trình gồm ba bước: Bước 1 (biến tính, denaturation): hỗn hợp được gia nhiệt lên đến 94 – 950C. Mục đích của giai đoạn này là làm cho DNA mạch đôi tách ra thành hai mạch đơn. Bước 2 (bắt cặp): ở giai đoạn này nhiệt độ hạ xuống khoảng 55 – 650C. giai đoạn này, các primer sẽ bắt cặp với trình tự thích hợp. Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ ở giai đoạn này được nâng lên 720C, đây là nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của Taq polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm ba bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỗi chu kỳ thì số lượng DNA mẫu lại tăng lên gấp đôi. Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, đem sản phẩm DNA điện di trên gel agarose và nhuộm với ethydium bromide, sau đó quan sát dưới tia UV. Phương pháp ELISA Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là dực trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Tín hiệu của phản ứng kết hợp này được nhận biết thông qua sự phát quang. Trong số các phương pháp miễn dịch thì phương pháp hấp thụ miễm dịch sử dụng enzyme ( Enzyme Link ImmunoSorbent Assy – ELISA ) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất vì phương pháp này đơn giản và cho hiệu quả khá cao. Nguyên tắc của phương pháp ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng để bắt các kháng nguyên mục tiêu. Các kháng nguyên mục tiêu được pháp hiện nhờ một kháng thể thứ hai có gắn với enzyme. Sau đó, bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hay phát quang. Bằng cách theo dõi sự thay đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. ELISA hiện nay đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng bộ các bộ kit thương mại ( như kit phát hiện Salmonella, Escherichia coli, Listeria…) 2.4.2.3 Phương pháp màng PETRI (Petrifilms) Môi trường dinh dưỡng ở dạng đông khô, được cố định vào màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào đo 1ml dịch mẫu rồi đậy lại. Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khuôn tròn. Môi trường dinh dưỡng sẽ hổ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực tiếp khuẩn lạc trên Petrifilm. Petrifilm được sử dụng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, coliform, feacal coliform, tổng số nấm men, nấm mốc. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm thời gian ủ và bảo quản. Thời gian sử dụng lâu là do môi trường ở dạng đông khô và không cần xử lý nhiệt như môi trường thông thường. có thể sử dụng nước cất vô trùng để làm ướt môi trường đông khô. Sau khi môi trường đông lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn trên bề mặt. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian 3.1.1. Địa điểm thực hiện Tiến hành lấy mẫu thịt tại các quầy thịt heo ở chợ Văn Thánh, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh. Thực hiện phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm vi sinh của trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM. 3.1.2. Thời gian Ngày 05 tháng 04 năm 2010 và kết thúc ngày 28 tháng 06 năm 2010. Vật liệu 3.2.1. Mẫu Lấy các mẫu thịt heo được bán ở các quầy thịt tại chợ Văn Thánh, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh. Lấy mẫu thịt đại diện của mỗi quầy, lấy cùng một loại thịt (thịt đùi). 3.2.2. Hóa chất, môi trường Môi trường canh RV ( Rappaport Vassiliadis Soya Pepton ) (Ấn Độ) Môi trường pha loãng mẫu BPW( Buffered Peptone Water ) (Ấn Độ) Môi trường XLD ( Xylose Lysine Desoxycholate Agar ) (Ấn Độ) Môi trường TSA ( Tryptone Soya Agar ) (Ấn Độ) Môi trường TSI ( Triple Sugar Iron Agar ) (Ấn Độ) Canh LDC ( Lysine Decarboxylase ) Môi trường MR-VP Broth(Ấn Độ) Môi trường Urea Broth(Ấn Độ) Môi trường Mannitol ( Phenol Red Broth base) (Ấn Độ) Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Barritt Cồn 70 % và cồn 96 % Nước cất 3.2.3. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Đĩa petri vô trùng Pipette Cân điện tử Bình tam giác Cóc thủy tinh Kéo Đũa khuấy Túi nilong vô khuẩn Đèn cồn Que cấy vòng Que cấy thẳng Bình chứa môi trường 3.2.4. Thiết bị Autoclave Tủ lạnh Bếp từ Bể điều nhiệt 42oC Tủ ấm 37oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt 3.3. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Sơ đồ các quầy thịt ở chợ Văn Thánh Quầy 1 Quầy 2 Quầy 3 Quầy 4 Quầy 5 Quầy 6 Quầy 7 Quầy 8 Quầy 9 Quầy 10 Quầy 11 Quầy 12 Quầy 13 Quầy 14 Quầy 15 Quầy 16 Quầy 17 Quầy 18 Quầy 19 Quầy 20 Quầy 21 Quầy 22 Quầy 24 ĐƯỜNG D2 ĐƯỜNG ĐIỆN BIÊN PHỦ Hình 3.1: Bố trí các quầy thịt ở chợ Văn Thánh 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm Thu mẫu tại các quầy thịt khảo sát Đánh giá các chỉ tiêu Thịt heo Cảm quan Vi sinh Salmonella Nhận xét, Kết luận Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm Ở mỗi quầy, tiến hành thu mẫu thịt heo với độ lặp lại là 3 lần. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu Thu mẫu: dụng cụ lấy mẫu phải vô trùng,. Mẫu sau khi lấy cho vào bọc nilong sạch và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Các mẫu thịt heo sau khi lấy phải đảm bảo không nhiễm lẩn nhau. Bảo quản mẫu: Khối lượng mẫu tối thiểu từ 100-250g tùy vào yêu cầu phân tích. Mẫu lấy tại nhiều vị trí trên bề mặt sản phẩm. Sau khi mang về phòng thí nghiêm nếu không phân tích ngay thì mẫu được bảo quản ở 0-4oC và thời gian bảo quản không quá 36 giờ. 3.4.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu Rã đông trước khi phân tích: rã đông tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng cho đến khi đạt 13-150C Cân mẫu: các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần dảm bảo vô trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích. Trong dề tài này khối khối lượng mẫu cân là 25g (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có). Đồng nhất mẫu khi phân tích: sự phân phối của vi sinh vật không đồng đều nhau, để đảm bảo tính đồng nhất trong mẫu các mẫu lỏng phải lắc đều trước khi phân tích. Cắt mẫu hay nghiền mẫu bằng thiết bị chuyên dùng. 3.5. Phương pháp phân tích Định tính Salmonella bằng phương pháp trãi đĩa và test sinh hóa Biểu diễn kết quả bằng bảng biểu và các dạng biểu đồ 3.5.1. Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. 3.5.2. Nguyên tắc Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong một lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh chọn lọc RV, phân lập trên môi trường XLD và khẳng định bằng các môi trường thử nghiệm sinh hoá (môi trường TSI, Ure Broth, lên men Mannitol, LDC both, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer) 3.5.3. Quy trình phân tích Quy trình phân tích định tính Salmonell được mô tả ở hình 3.3 Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Kết luân: Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu. Biểu hiện đặc trưng của Salmonella: trên TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/Gas(+); Ure Broth(-), lên men mannitol(+), LDC both(+), thử nghiệm Indol(-), thử nghiệm Voges-Proskauer(-) Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Ure Broth, lên men mannitol, LDC both, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer. Cân 25g mẫu + 225 ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 0,1ml mẫu trên vào 10ml môi trường RV Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng để cấy sang môi trường TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Ủ ở 42 ± 0,5oC trong 24 giờ Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ. Hình 3.3: Quy trình phân tích định tính Salmonella  Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường PBW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Cấy mẫu. Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ. Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)…. Hình 3.4: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Thử nghiệm khẳng định. Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Thực hiện như sau: Thử nghiệm trên môi trường TSI: Hấp khử trùng môi trường TSI ở 1210C trong 15 phút và phân phối môi trường vào các ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng. Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của giống thuần sâu vào đáy của ống thạch nghiêng. Sau khi cấy xong thì ủ ở 370C trong vòng 24h – 48h. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI ð phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Salmonella có khả năng H2S ð xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường TSI. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm. Positive Negative Hình 3.5: Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI Negative Thử nghiệm Urea Broth: Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple Ủ ở 370C trong khoảng 12h – 18h Thử nghiệm(+): môi trường chuyển sang màu vàng. Thử nghiệm(-): môi trường không đổi màu. ð Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường. Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím. Negative Negative Negative Hình 3.6: Thử nghiệm Urea Broth Lên men mannitol: Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8. Môi trường đã bổ sung đường được chứa trong bình tam giác được khử trùng bằng 1 trong 3 cách: Ÿ Lọc vô trùng qua màng lọc có kích thước 0.45 mm Ÿ Hấp 116 – 1180C trong vòng 15 phút( trừ lactose, saccharose, salicin, xylose, arabinose, trehalose, maltose ). Ÿ Hấp 1210C trong 15 phút. Sau khi khử trùng xong, để nguội và phân phối vào ống nghiệm. Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định. Ủ 370C trong 18 – 24h. Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng. Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham. ð Môi trường sau khi nuôi cấy Salmonella bị acid hóa và chuyển thành màu vàng. Negative Negative Positive Hình 3.7: Lên men Mannitol Thử nghiệm LDC (Lysine Decarboxylase): Sử dụng môi trường Falkow . Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định. Chất chỉ thị màu trong môi trường là Bromocresol purple. Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục. Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng. ð Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu. Negative Hình 3.8: Thử nghiệm LDC Thử nghiệm khả năng sinh Indol: Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s Quan sát sau vài phút. Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ. Hình 3.9: Thử nghiệm Indol Negative Negative Positive Thử nghiệm Voges – Proskauer: Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth) Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng từ 2-5 ngày Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1. Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút. Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt môi trường. Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu. Hình 3.10: Thử nghiệm Voges – Proskauer Negative 3.4.5. Nhận định tính sinh hoá đặc hiệu: Tính chất sinh hoá Dương hoặc âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactos - 99,2 TSI sucros - 99,5 TSI glucos + 100 TSI glucos sinh hơi + 91,2 TSI hydro-sulfua + 91,6 Phân giải urê - 100,0 Lên men mannitol + Phản ứng Indol - 98,2 Phản ứng V.P - 100,0 Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25g mẫu CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả đánh giá cảm quan mẫu thịt Về màu sắc của mẫu, có màu sắc đặc trưng của thịt heo, lớp thịt có màu hồng nhạt. Lớp mỡ có màu trắng, vàng tự nhiên. Không có mảng bầm tím, tụ máu. Về mùi của mẫu, mùi đặc trưng của thịt heo, không có mùi ôi thiu, không có mùi thuốc kháng sinh. Về trạng thái của mẫu, bề mặt ngoài của mẫu thịt hơi ướt, có nước, không bị nhớt, không được sạch, có dính lông và tạp chất lạ. Mặt cắt mịn. khối thịt rắn chất, có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thấy thịt mềm, có độ dính và không để lại dấu ấn trên bề mặt thịt khi bỏ tay ra. Hình 4.1: Trạng thái bên ngoài của thịt heo Tóm lại, các mẫu thịt được lấy tại các quầy ở chợ Văn Thánh, quận Bình Thạnh vẫn trong tình trạng rất tốt, màu sắc và mùi không có biểu hiện của sự hư hỏng hay ôi thiu sau khi được vận chuyển từ nơi giết mổ đến chợ để bán cho người tiêu dùng. Điều này chứng tỏ quầy thịt vừa được giết mổ và đưa ra thị trường. Tuy nhiên, những giá trị cảm quan này không có mối quan hệ với khả năng bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên thịt. Do đó, những giá trị cảm quan này chỉ cung cấp các thông tin về trạng thái bên ngoài của mẫu. 4.2. Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7064: 2002 – Thịt tươi – Quy định kỹ thuật thì các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi được thể hiện ở bảng 4.1. Bảng 4.1: Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi Tên chỉ tiêu Giới hạn tối đa 1.  Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm 106 2.  E.coli, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102 3.  Salmonella, số vi khuẩn trong 25 g sản phẩm 0 4.  B. cereus, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102 5.  Staphylococcus aureus, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 102 6.  Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 10 7.  Clostridium botulinum, số vi khuẩn trong 1 g sản phẩm 0 Trong đó, vi khuẩn Salmonella không cho phép hiện diện trong mẫu thịt heo. 4.2.1. Thí nghiệm đợt 1 Chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại 11 quầy thịt, mỗi quầy được kiểm tra lặp lại 3 lần. Kết quả được thể hiện ở hình 4.2. Hình 4.2: Mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại các quầy thịt ở chợ Văn Thánh ( thí nghiệm đợt 1 ). Từ kết quả ở hình 4.2 chúng tôi nhận thấy rằng, tỷ lệ nhiễm Salmonella tại 11 quầy thịt được khảo sát thì có đến 6 quầy thịt (quầy 2, quầy 5, quầy 6, quầy 7, quầy 10 và quầy 11) có chỉ tiêu Salmonella vượt tiêu chuẩn cho phép của tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046: 2002. Tỷ lệ nhiễm Salmonella của 6 quầy thịt heo khảo sát (quầy 2, quầy 5, quầy 6, quầy 7, quầy 10 và quầy 11) ở đợt thí nghiệm 1 chiếm 33,33% tổng số mẫu khảo sát và 4 quầy thịt heo còn lại (quầy 1, quầy 3, quầy 4, quầy 8 và quầy 9) không phát hiện thấy có sự hiện diện của Salmonella. 4.2.2. Thí nghiệm đợt 2 Cũng giống như đợt thí nghiệm 1, chúng tôi tiến hành khảo sát mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo của 12 quầy còn lại ở chợ Văn Thánh. Mỗi quầy được kiểm tra lặp lại 3 lần. Kết quả được thể hiện ở hình 4.3. Hình 4.3: Mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại các quầy thịt ở chợ Văn Thánh ( thí nghiệm đợt 2 ). Từ kết quả ở hình 4.3 chúng tôi nhận thấy rằng, ở đợt 2 tỷ lệ nhiễm Salmonella tại 12 quầy thịt được khảo sát thì có đến 4 quầy thịt có chỉ tiêu Salmonella vượt mức tiêu chuẩn cho phép của tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046: 2002. Tỷ lệ nhiễm Salmonella của 4 quầy thịt heo (quầy 15, quầy 20, quầy 22 và quầy 24 ) ở đợt thí nghiệm 2 chiếm 33,33% tổng số mẫu khảo sát và 8 quầy thịt heo còn lại (quầy 12, quầy 13, quầy 14, quầy 16, quầy 17, quầy 18, quầy 19 và quầy 21) không phát hiện thấy có sự hiện diện của Salmonella trong mẫu. Tóm lại, trong 23 quầy thịt heo được kiểm tra chỉ tiêu Salmonella thì có đến 10 quầy nhiễm Salmonella vượt mức chỉ tiêu cho phép của tiêu chuẩn Việt Nam, chiếm tỷ lệ 43,48% tổng số quầy được kiểm tra. Mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại các quầy thịt bán ở chợ Văn Thánh được thể hiện ở hình 4.4. Hình 4.4: Số quầy thịt bị nhiễm vi khuẩn Salmonella Như vậy, mức độ nhiễm Salmonella trên các quầy bán thịt heo tại chợ Văn Thánh là tương đối cao( chiếm gần 50% số quầy khảo sát ). Điều này có thể là do vị trí các quầy. Các quầy bán thịt heo ở chợ tuy được đặt ở các vị trí cách xa nhau, nhưng gần các quầy bán cá, các quầy bán gia cầm, các quầy bán rau quả và gần các cống thoát nước của chợ, đặc biệt là các quầy bán gia cầm. Đây là nguồn lây nhiễm Samonella chủ yếu cho thịt heo vì Salmonella hiện diện rất nhiều trên gia cầm. Bên cạnh đó, không khí ở những quầy thịt đó thiếu sự thoáng mát, lưu lượng người vào chợ tương đối đông làm nguy cơ lây nhiễm chéo từ quầy này sang quầy khác rất dễ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ bình thường. Do đó, trong một khoảng thời gian nhất định, các quầy thịt này sẽ bị nhiễm. Điều đó rất ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng khi sử dụng thịt bị nhiễm Salmonella. Ngoài ra, thịt bị nhiễm Salmonella cũng có thể do quá trình giết mổ. Thịt heo bị nhiễm Salmonella có thể bắt nguồn từ lò giết mổ có vệ sinh không tốt hoặc bị nhiễm Salmonella trong quá trình vận chuyển thịt heo từ nơi giết mổ đến chợ hoặc bị nhiễm Salmonella do thiết bị vận chuyển thịt đã bị nhiễm Salmonella. Phần lớn quá trình giết mổ thịt heo chủ yếu ở dạng mổ nằm, với mặt bằng nhỏ hẹp, thiết bị thô sơ, nước rửa nhiều nơi không đảm bảo chất lượng, thịt heo bị nhiễm phân….dẫn đến việc giết mổ không đảm bảo yêu cầu vệ sinh. Đây chính là nguyên nhân làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn trên thịt heo. Đặc biệt là vi khuẩn Salmonella làm ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Vì vậy quá trình giết mổ đóng vai trò sản xuất thịt sạch đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng. Hơn nữa, mọi thao tác của người bán như: bàn tay của người bán tiếp xúc với thịt không được sạch, bị nhiễm vi khuẩn Salmonella; quá trình trao đổi tiền giữa người bán và người mua, trong tiền có chứa vi khuẩn Salmonella; trong quá trình cân thịt, giá cân bị nhiễm Salmonella , dụng cụ dung để cắt thit bị nhiễm Salmonella….. đều làm tăng khả năng nhiễm Salmonella vào thịt. \ CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Mức độ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại các quầy thịt là tương đối cao, chiếm 43,48% tổng số quầy thịt được kiểm tra. Điều này không thể chấp nhận so với mức tiêu chuẩn cho phép của tiêu chuẩn Việt Nam. - Những giá trị cảm quan của thịt không có mối quan hệ với khả năng bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên quầy thịt. Do đó, những giá trị cảm quan này chỉ cung cấp các thông tin về trạng thái bên ngoài của mẫu. 5.2. Kiến nghị - Tiến hành thử nghiệm với một số lượng mẫu lớn hơn. - Tiến hành thêm các thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh và nhuộm Gram. - Ngoài ra, cần tiến hành nhiều thử nghiệm kiểm tra chỉ tiêu samonella trên các loại thực phẩm khác như thịt đông lạnh, thịt xoay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến, trứng tươi, cá và thủy sản tươi sống…..