Đồ án Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym -Galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16

ậy, việc nghiên cứu nhằm sản xuất ra các chế phẩm enzym b-galactosidaza là hết sức cần thiết, nhất là trong công nghiệp chế biến sữa. Đề tài “Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16” nhằm những mục đích sau: Khảo sát đặc tính sinh enzym của chủng S. paucimobilis BK16. Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza chủng S. paucimobilis BK16. Xác định một số đặc tính của enzym b-galactosidaza thu được từ chủng S. paucimobilis BK16. Nghiên cứu khả năng thu enzym kỹ thuật. Phần I Tổng quan I.1. Sơ lược về enzym b-galactosidaza: Enzym b-galactosidaza là enzym xúc tác cho quá trình thuỷ phân và chuyển hóa các gốc b-D-galactozyl, trong đó có sự thủy phân lactoza thành glucoza và galactoza [6]. Enym b-galactosidaza có trong nhiều tổ chức bao gồm các vi sinh vật, thực vật và động vật. Các enzym này đã được ứng dụng trong nhiều quá trình công nghệ sinh học, đặc biệt là các enzym từ vi sinh vật được sử dụng để thủy phân lactoza nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức năng của các sản phẩm từ sữa. Phản ứng chuyển hoá galactozyl cũng thường được sử dụng để tạo ra các galacto-oligosaccrit nhằm cải biến về mặt chức năng và cấu trúc của nguyên liệu thực phẩm, dược phẩm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác [6]. Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzym b-galactosidaza, chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó, đặc tính enzym, phương pháp tách chiết, tinh chế và ứng dụng nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp thực phẩm, trong y học và dược phẩm cũng như cả trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản. Mặc dù vậy, ở nước ta, việc nghiên cứu về enzym này mới chỉ là bước đầu và ứng dụng của chúng rất ít được đề cập đến. I.1.1. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp b-galactosidaza : Hiện nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra được nhiều chủng loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza với hoạt lực cao. Enzym khi được tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngoài môi trường) hoặc nội bào (tích tụ trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc lyzosome của tế bào…) [6]. Bảng 1: Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym b-galactosidaza: Nấm men Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurentii, Kluyverromyces lactics, K.fragilis, K.marxianus, Torulopsis sphaerica, T.versalitis… Nấm mốc Asperigillus awmori, A.cellulosae, A.foetidus, A.niger, A.oryzae, Chaetomium globosum, C.funicola, Fusarium maniforme, Penicillum canescens, Rhizopus acidus, R.niveus,… Vi khuẩn Vi khuẩn gram âm: Sphigomonas Paucimobilis, Aeromonas cavie, A.formicans, Agrobacterrium rediobacter, Enterobacter cloacae, Escerichia coli, Fibrobacter succinogenes, Xanthomonas campertris,… Vi khuẩn gram dương: Bacillus acidocaldarius, B.circulans, B.coagulans, B.macerans, B.subtilis, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterrium murisepticum, Lactococcus pneumonira,… I.2 Đặc tính của enzym b-galactosidaza từ vi sinh vật: Khối lượng phân tử của enzym dao động từ 19.000 đến 630.000 Dalton. Cấu trúc dưới phân tử của các enzym này bao gồm nhiều loại khác nhau từ monomer (enzym từ Kluyveromces lactic) đến octamer (enzym từ E.coli) [4]. Tuỳ thuộc vào nguồn thu enzym mà tính đặc hiệu phân tử của từng loại enzym là khác nhau. Các enzym b-galactosidaza có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ưu thuộc vùng trung tính, trong khi đó hầu hết các enzym b-galactosidaza từ nấm mốc có pH thuộc vùng axit, có một số chủng đạt tới pH tối ưu là pH=2 [15]. Một số enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có mặt các ion hoá trị 1 và các ion hoá trị 2, ví dụ như enzym b-galactosidaza từ S. rectivirgula cần phải có mặt nhiều ion kim loại hoá trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối đa. Tuy nhiên một số enzym b-galactosidaza khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại như enzym từ Rhizobium melioti [15]. Những điểm trên cho ta thấy tính đa dạng của enzym b-galactosidaza vi sinh vật. I.2. Các nguồn enzym b-galactosidaza: Mặc dù rất nhiều enzym b-galactosidaza từ vi sinh vật được biết đến nhưng chỉ có một số ít các vi sinh vật được lựa chọn làm nguồn sinh enzym trong công nghiệp. Hầu hết các vi sinh vật này có nguồn gốc từ nấm mốc như là Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và A.oryzae hoặc từ vi khuẩn như E.coli. Những loài vi sinh vật đó được lựa chọn chính vì chúng có thể tạo ra enzym b-galactosidaza với giá rẻ và an toàn khi cho thêm vào thực phẩm [5]. Enzym từ vi sinh vật, thực vật được ứng dụng rất rộng rãi trong các quá trình công nghệ sinh học. I.2.1. Enzym từ vi khuẩn: Vi khuẩn E.coli là đối tượng được nghiên cứu đầu tiên. Cấu trúc bậc ba của enzym từ E.coli cũng như cơ chế điều hoà phiên mã của gen lacZ đã được khẳng định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ hơn về cơ chế xúc tác của enzym này. Mặc dù vậy, việc sử dụng enzym này vào các quá trình sinh học chỉ được kiểm nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm do vi khuẩn này không được phép có mặt trong các sản phẩm thực phẩm. Lĩnh vực chủ yếu của enzym từ vi khuẩn E.coli này là trong nghiên cứu sinh học phân tử, trong kỹ nghệ và trong hóa miễn dịch. Enzym b-galactosidaza từ Steptcoccus thermophilus – một trong những vi khuẩn được sử dụng ở công nghệ chế biến các sản phẩm lên men từ sữa cũng đã được sử dụng để thủy phân lactoza trong sữa ở quy mô công nghiệp do tính bền nhiệt và độ an toàn khi được sử dụng dưới dạng phụ gia sản phẩm. Nó cũng được dùng làm chất xúc tác cho quá trình sản xuất các galacto-oligosaccarit từ lactoza do hoạt tính chuyển hóa galactozyl của nó cao. Đối với vi khuẩn chúng có thể phát triển tối ưu trong dải pH từ 6,5 đến 7,5. Chúng kém phát triển ở pH dưới 4 hoặc trên 8,5 [5]. I.2.2. Ezym từ nấm mốc: Enzym từ nấm mốc như Kluyveromyces lactic, K.fragilis, Aspergillus niger và A.oryae đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. Đặc biệt enzym từ A.orytococcuss laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển hóa galactozyl cao do vậy được dùng để sản xuất các galato-oligosaccarit từ lactoza. Nấm mốc phát triển tối ưu trong phạm vi pH từ 5 đến 7, chúng có thể phát triển ở dải pH từ 3 đến 8,5 [6]. I.2.3. Enzym từ thực vật – lá bina: Các nhà khoa học đã tách chiết và tinh chế được enzym b-galactosidaza từ lá cây bina. Enzym b-galactosidaza tách từ nguồn thực vật này có khả năng thủy phân các loại cơ chất khác nhau ở các tốc độ khác nhau. Cụ thể là thủy phân lactoza với tốc độ bằng 2% so với thủy phân p-nitrophenyl-b-galactozit. Monogalactozyldiglyxerit được hấp thụ vào trong celit bị thủy phân bởi b-galactosidaza tại tốc độ nhỏ hơn 250 lần so với thủy phân p-nitrophenyl-b-galactozit [8]. I.3. Một số cơ chế của các phản ứng được xúc tác bởi enzym b-galactosidaza : I.3.1. Cơ chế động học của phản ứng với ONPG: Cơ chế động học của phản ứng với sự xúc tác của enzym b-galactosidaza từ Escerichia coli có thể được thể hiện đơn giản nhất bằng phản ứng với 2-nitrophenyl-b-D-galatopyranozit (ONPG). ONPG là cơ chất tổng hợp trong đó aglycon đóng vai trò là nhóm chuyển dời. ONPG (được ký hiệu là S) gắn với enzym để hình thành phức chất Michaelis ES (bước a). 2-nitrophenolat nhanh chóng được giải phóng để tạo thành hợp chất trung gian enzym-galatozyl (bước b), một phần hợp chất này được thuỷ phân tiếp theo (bước c) và phần còn lại được chuyển hoá galatozyl (g,h). Đối với phản ứng thuỷ phân phân tử H2O phản ứng với hợp chất trung gian enzym galatozyl để tạo ra galatoza và enzym ở dạng tự do (bước c). Đối với phản ứng chuyển hoá galatozyl, chất nhận galatozil (kí hiệu là Nu) có mặt trong hỗn hợp phản ứng gắn vào vị trí glucoza của enzym để tạo thành phức chất gồm 3 cấu tử (bước g), sau đó tạo thành sản phẩm phụ Gal-Nu (bước h). Trong phản ứng chuyển hoá galatozil, khi nồng độ chất nhận tăng thì tỷ lệ 2-nitrophenol giải phóng ra cũng tăng, giảm hoặc không đổi tùy thuộc vào bản chất của chất nhận và các hằng số Michaelis (k2, k3 và k6). Kí hiệu: E: enzym S: cơ chất NP: 2-nitrophenol Gal: galactoza Glu: glucoza Nu: chất nhận galactozyl I.3.2. Cơ chế động học của phản ứng với lactoza: Cơ chế động học của phản ứng với lactoza (một cơ chất tự nhiên) khác so với phản ứng với ONPG ở trên (hình 1). Bước (b) được thay thế bằng các bước (d, e) và (f) do glucoza (sản phẩm của quá trình thuỷ phân lactoza) có ái lực đối với vị trí glucozyl trên enzym này, vì vậy glucoza được giải phóng ra có thể kết hợp ngược lại để hình thành một phức chất gồm 3 cấu tử và sau đó phản ứng với galactoza để tạo allolactoza. Trong suốt quá trình thủy phân lactoza, allactoza chỉ được hình thành tạm thời do nó cũng là một cơ chất trong enzym này. Khi nồng độ lactoza tham gia phản ứng cao, lactoza cũng đóng vai trò chất nhận lactozyl (Nu) và sản phẩm chuyển hoá là lactozyllactoza. Ngược lại, galactozyllactoza có thể đóng vai trò làm chất nhận galactozyl để tạo ra các tetrasaccarit. Bằng cách này, hỗn hợp các oligosaccarid bao gồm các di-, tri- và các saccarit cao hơn sẽ được hình thành từ lactoza. I.3.3 Cơ chế thuỷ phân lactoza của b-galactosidaza có pH trung tính: Nhóm sulfhydryl nằm ở vị trí hoạt hóa của b-galactosidaza đóng vai trò làm axit chung để proton hoá nguyên tử oxy của liên kết galactozyt, một nhóm imidazol đóng vai trò làm nhóm ái nhân và tấn công vào vị trí C-1 của glycon này. Phản ứng đã dẫn đến sự hình thành một phức chất trung gian enzym-galactozyl nhờ liên kết đồng hóa trị. Galatoza sau đó tách khỏi enzym nhờ sự hấp thụ một proton từ nước bởi anion sulfhydryl đóng vai trò như một bazơ và giúp cho nhóm OH tấn công vào vị trí C-1 (hình bên). Hình 2: Cơ chế thuỷ phân lactoza của b-galactosidaza có pH trung tính I.4. sự Điều hoà sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza của vi sinh vật : Trong điều kiện tự nhiên, các vi sinh vật tạo ra các sản phẩm vừa đủ mức cần thiết cho hoạt động sống, sinh sản và phát triển của chúng. Vận tốc sinh tổng hợp enzym được điều chỉnh một phần bằng bộ máy di truyền, còn một phần là do các yếu tố của môi trường bên ngoài quyết định. Sự tổng hợp enzym trong tế bào sống có thể được tăng cường (kích thích) hoặc có thể bị kìm chế (trấn áp). Sự tăng cường sinh tổng hợp một enzym nào đó hoặc một nhóm enzym cùng tham gia vào việc xúc tác một trình phản ứng dưới ảnh hưởng của hợp chất hóa học (mà thường là cơ chất phản ứng) gọi là sự phản ứng sinh tổng hợp. Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp (gây nên sự gia tăng enzym nào đó) gọi là chất cảm ứng (yếu tố cảm ứng), còn enzym được tạo thành bằng cơ chế cảm ứng được gọi là enzym cảm ứng. Chất gây kìm hãm sự sinh tổng hợp một enzym nào đó gọi là chất kìm toả phụ, các enzym bị kìm hãm không được tổng hợp gọi là enzym bị kìm toả. Sự tạo thành các enzym dị hoá (enzym xúc tác sự phân giải cơ chất) được điều chỉnh bằng cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp. Một trong những ví dụ điển hình về cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzym đã được nghiên cứu khá cặn kẽ là sự tổng hợp enzym b-galactosidaza cần để sử dụng lactoza của tế bào E.coli. Các tế bào E.coli nguyên thuỷ có thể sinh trưởng trên nhiều cơ chất chỉ chứa một lượng rất nhỏ b-galactosidaza. Nếu cho thêm vào môi trường lactoza hay b-galactosidaza khác trong trong một ít thời gian thì hoạt lực b-galactosidaza của chúng tăng lên 1.000 lần. Trong trường hợp như vậy có đến 3% toàn bộ protein tế bào là b-galactosidaza. I. 5. Tách chiết và tinh chế enzym : I.5.1 Tách chiết: Để tách chiết và thu hồi enzym cần phải sử dụng nguồn nguyên liệu có khả năng tách chiết được một lượng lớn enzym bằng các quy trình thông thường. Đối với enzym từ một số nguồn cơ chất nhất định cần phải sử dụng phương pháp tách chiết nhất định, không thay thế bằng phương pháp khác. Nguyên tắc chung của quá trình tách chiết enzym là cần phải biết rõ vị trí enzym nằm trong tế bào (enzym có mặt ở dạng tự do hoặc dạng liên kết với màng) để xác định phương pháp tách chiết phù hợp. Đặc biệt trong trường hợp enzym là enzym nội bào thì trước hết phải phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa), bằng tác dụng của hóa chất (rượu butylic, axeton, glixerin, clorofom, SDS… ), bằng sóng siêu âm… Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. I.5.2 Tinh chế: Sau khi tách chiết, trong dịch ngoài enzym còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng thường sử dụng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác thường dùng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel… Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH môi trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzym bền nhiệt hoặc bền axit. Dịch enzym được giữ ở 50 đến 700C hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzym. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ. tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ chọn dùng. Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (00C). Phương pháp hấp thụ chọn lọc được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Chất hấp thụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao. Hấp thụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách là chất hấp thụ protein tạp hoặc hấp thụ enzym. Quá trình hấp thụ thường được tiến hành ở 00C. Enzym sau đó dược chiết bằng các dung môi thích hợp. Phương pháp sắc ký và trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc dẫn xuất este của xelluloza. Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE – xenlluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ cả các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixinsufat thường dùng trước đây. Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp một hỗn hợp gồm nhièu chất trên cột sephadex, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong cột, các phân tử có kích thước lớn không có khả năng đi vào sẽ được chiết ra khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các chất trong hỗn hợp. Sự chênh lệch nhiều về phân tử lượng của các enzym (12.700 – 1.000.000 Da) cho phép tách và làm sạch enzym bằng phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng [1]. Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho mọi enzym. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzym nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau. I.6. ứng dụng của enzym b-galactosidaza: I.6.1 ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa: Enzym b-galactosidaza thuỷ phân các gốc b-galactosidaza tận cùng đều không khử của các b-D-galactosit thành các oligosaccarit bao gồm cả lactoza. Lactoza là disaccarrit bao gồm galactoza và glucoza, trong sữa bò nó chiếm khoảng 40% trọng lượng chất khô. Việc tách loại lactoza khỏi các sản phẩm thực phẩm là cần thiết đối với đại đa số người tiêu dùng - những người bị thiểu năng chuyển hoá lactoza với các triệu chứng đau bụng, khó tiêu khi dùng lactoza. Tuy nhiên, các sản phẩm thủy phân của lactoza bao gồm glucoza và galactoza đều dễ hấp thụ qua đường tiêu hoá và dễ đồng hoá. Lactoza trong sữa cũng có thể gây ra một số khó khăn trong quá trình chế biến phomat. Quá trình sản xuất phomat tạo ra một lượng lớn dịch sữa “whey” dưới dạng sản phẩm phụ, dịch sữa này chứa lactoza có sẵn trong sữa tự nhiên. Dịch sữa này là nguồn cacbonhydrat tốt và có tiềm năng lớn đối với lĩnh vực thực phẩm cũng như thức ăn gia súc. Vấn đề là lactoza không hoà tan hoàn toàn và có xu hướng kết tinh từ dung dịch này. Điều này làm cho việc vận chuyển dich sữa là khó khăn, đồng thời làm hạn chế việc tái sử dụng dịch sữa này, do vậy mỗi năm người ta phải đổ đi một lượng lớn dịch sữa. Lactoza có thể được thuỷ phân bằng cách sử dụng axit, song việc thuỷ phân bằng axit gây ra màu và làm tắc nghẽn nhựa trao đổi ion trong quá trình chế biến. Cách tốt hơn là sử dụng enzym b-galactosidaza. Enzym này đã được tìm thấy trong nhiều hệ vi sinh vật. Tuy nhiên để sử dụng cho mục đích này thì nấm men, nấm mốc và vi khuẩn vẫn là những nguồn khai thác thương mại chính. Một quá trình khả thi về mặt kỹ thuật và công nghệ khi sử dụng enzym này để thuỷ phân lactoza cũng cho phép sử dụng dịch sau đông tụ sữa chua hoặc dịch permeate, đồng thời hạn chế một số khó khăn về công nghệ như hiện tượng “lên cát” ở kem, hoặc hiện tượng tái kết tinh các sản phẩm từ sữa như dịch sau đông tụ phomat. Một trong những tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học của enzym b-galactosidaza là khả năng thuỷ phân lactoza – thành phần chính phụ của ngành công nghiệp chế biến sữa. Đặc biệt các nghiên cứu về lâm sàng đã cho thấy những người bệnh bị thiểu năng chuyển hoá lactoza có thể sử dụng các sản phẩm sữa đã qua thuỷ phân này, đồng thời làm giảm triệu chứng bệnh. Vì vậy, người ta mong muốn sản xuất ra sữa có hàm lượng lactoza thấp sao cho mọi người đều có thể dụng các sản phẩm từ nó. Việc lựa chọn công nghệ cho quá trình thuỷ phân tuỳ thuộc chủ yếu vào đặc tính và các chi phí sản xuất, tàng trữ và tiếp thị sản phẩm. Quy trình công nghệ khả thi bao gồm bổ sung trực tiếp enzym hoà, tan, tái tuần hoàn enzym hoà tan bằng quy trình màng hoặc sử dụng enzym cố định. Mặt khác, ở những phân xưởng nhỏ sản xuất các sản phẩm từ sữa cũng có thể sử dụng các sản phẩm enzym ở dưới dạng canh trường nuôi cấy một cách đơn giản. Vấn đề khó nhất khi sử dụng b-galactosidaza là khó đạt được thuỷ phân hoàn toàn vì 2 lý do sau: Enzym này là sản phẩm bị ức chế bởi glucoza được tạo ra trong quá trình phản ứng. Enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hoá tổng hợp các đồng phân liên kết b 1-6 của lactoza và các chất khác ngoài lactoza. Đối với mục đích sử dụng thuỷ phân lactoza các hướng chính hiện nay là: Sử dụng enzym cố định Có rất nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về sử dụng enzym b-galactosidaza cố định nhưng cho đến nay áp dụng nó vào quy mô công nghiệp vẫn gặp nhiều khó khăn. Enzym này được cố định trên một loạt các chất mang vô cơ, Shepadex, DEAE-xenllulose, thuỷ tinh xốp hoặc bẫy vào trong gel polyacrylamit… Enzym cố định được sử dụng cả trong các thiết bị phản ứng liên tục và gián đoạn [9]. Sử dụng ở dạng liposom sấy khô có chứa b-galactosidaza để thuỷ phân lactoza trong sữa. Liposom bao gồm một màng kép lipit giống như màng sinh học có khả năng ứng dụng rộng rãi trong y học. Enzym b-galactosidaza được thêm vào giữa dưới dạng các liposom sấy khô có khả năng thuỷ phân lactoza trong sữa nhờ sự phân giải liposom với sự có mặt của các muối hoá trị 2 và được hoàn nguyên gần như hoàn toàn bằng cách hydrat hoá lại [10]. Sử dụng vi sinh vật chịu nhiệt để sinh tổng hợp nên enzym có tính bền nhiệt cao có thể sử dụng trong các quá trình chế biến đòi hỏi nhiệt độ cao. Hạn chế lớn nhất của các enzym này là để vô hoạt enzym sau quá trình chế biến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao, điều này đôi khi dẫn đến chất lượng sản phẩm thay đổi. Sử dụng vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp để sinh tổng hợp enzym có khả năng ở nhiệt độ thấp. Người ta mong muốn các enzym hoạt động ở nhiệt độ thấp này có phân tử linh động hơn, cho phép biến đổi thuận nghịch về cấu tạo nhằm tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác. Tính linh động hơn về cấu trúc cũng khiến cho enzym này nhạy đối với sự phá huỷ bởi nhiệt và hóa chất. Các enzym này cũng góp phần đáng kể trong việc nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và sự ổn định của các phân tử protein. Khi sản xuất các enzym này thì công nghệ tách cần phải thực hiện trong các điều kiện nhẹ nhàng và giảm thiểu số bớt tinh chế nhằm hạn chế sự hao hụt enzym [8]. 1.6.2 Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza: Oligosaccharid còn được gọi là galactoligosacchatit (GO), là sản phẩm của chuyển hoá nội phân tử. Trong những thập kỷ qua người ta đã phát hiện ra GO có tác dụng tốt đối với sức khoẻ con người, GO có khả năng chống lại được chất gây ung thư, giảm lượng cholesterol và tốt cho đường ruột, GO còn được sử dụng làm chất tạo ngọt, chất hoà tan… Vì vậy nó được dùng làm nguyên liệu thực phẩm. Để có sản phẩm GO lactoza, rất nhiều thử nghiệm được nghiên cứu trên những vi sinh vật có khả năng sinh GO cao hoặc enzym b-galactosidaza có hoạt tính chuyển hoá galatozyl cao. Ngày nay, có rất nhiều loài vi sinh vật được tìm thấy có khả năng sinh enzym có thể chuyển hoá galatozyl cao như là Bacillus circulans, Steptococcus thermophuluss, Aspergillus oryzae. Những tế bào nấm men và vi khuẩn lactic cũng có thể sinh enzym chuyển hoá lactoza thành GO [12]. Vào những năm 1950 phát hiện oligosaccharid được hình thành trong quá trình thuỷ phân nhờ enzym b-galactosidaza. Có 12 loại oligosaccharid được tạo thành tuỳ thuộc vào nguồn enzym và cấu trúc của các oligosaccharid đó đã được các nhà khoa học phân tích. Nakanishi đã đưa giả thiết sự tổng hợp oligosaccharid nhờ phản ứng chuyển hoá glycozyl từ enzym b-galactosidaza của vi khuẩn Bacillus circulans, nhưng ông vẫn chưa đưa ra được cấu trúc của các oligosaccharid đó. Xa hơn, Usui et al. đã chỉ ra sự chuyển hoá đặc hiệu mối liên kết b-(1-4) galatozyl-disaccharit nhờ enzym b-galactosidaza từ Bacillus circulans. Có 11 oligosaccharit tạo ra nhờ enzym b-galactosidaza của vi khuẩn Bacillus circulans với cơ chất là lactoza đã được phát hiện và làm sáng tỏ. việc Việc điều tra nghiên cứu cấu trúc của các galatoligosaccharit nhờ phản ứng chuyển hoá glycozyl của enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn Bacillus circulans sử dụng pNP-galactoza như là một chất cho galatozyl và glucoza như một chất nhận đã được nghiên cứu. I.6.3 Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein: Enzym b-galactosidaza là enzym xúc tác cho quá trình thuỷ phân và chuyển hoá các gốc b-D-galactozyl. Các gen b-galactosidaza đã được tạo dòng và tách chiết từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Chúng có những cấu trúc bậc một, cáu trúc bậc bốn, khối lượng phân tử, tính đặc hiệu cơ chất và tính đặc hiệu xúc tác khác nhau rõ rệt. Chúng được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến do khả năng ứng dụng rộng rãi làm các gen thông báo trong nhiều hệ thống, chúng thường liên quan đến các bệnh di truyền của người như bệnh GMY-gangliosidosis và bệnh Morquio typ B. Kỹ nghệ Protein là một lĩnh vực cực kỳ phát triển nhằm tạo ra các protein đa chức năng, tạo ra các dạng đột biến của enzym với các đặc tính tốt và số lượng ngày một gia tăng. Enzym b-galactosidaza từ E.coli từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi làm các maker phân tử. Bằng cách cài cho phép xác định rõ vị trí dung nạp đối với sự điều tiết của các peptit chức năng lạ và sự biểu hiện của chúng trên bề mặt tiếp xúc với dung dịch của enzym có hoạt tính. Hơn nữa việc định vị peptit kháng thể từ virut trên vòng hoạt hoá của b-galactosidaza tạo ra một phân tử cảm biến nhằm phát hiện định tính các kháng thể đặc hiệu. Việc gắn kết của enzym này với huyết thanh hoặc kháng thể đơn dòng được cho là ngăn chặn sự cài gắn peptit. Hoạt tính được phục hồi này có thể được xác định một cách chính xác, nhanh chóng và dễ dàng bằng phương pháp so màu quang phổ. Vì các lý do trên, b-galactosidaza trước đây được gọi là phosphataza kiềm có thể trở thành nền tảng cho một thế hệ phân tử cảm ứng mới từ enzym . I.7. Nguồn thu từ enzym công nghiệp trong tương lai: Mặc dù việc sản xuất và ứng dụng b-galactosidaza ngày một phát triển, người ta vẫn cố gắng giảm chi phí sản xuất, tối thiểu hoá lượng enzym cần sử dụng, nhưng nâng cao tốc độ và hiệu suất thuỷ phân. Nguồn enzym trong tương lai sẽ là enzym được sử dụng ở dạng vi năng, enzym được cải biến bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp di truyền đối với chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó. I.8. Khả năng ứng dụng của enzym b-galactosidaza trong tương lai: Do tầm quan trọng của enzym b-galactosidaza trong các quá trình sinh học, trong các ứng dụng trị liệu và chế biến thực phẩm nên việc đánh gia và tối ưu hoá phương pháp tổng hợp nhằm tạo ra phương pháp đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả là mục tiêu của các nhà sản xuất và nghiên cứu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tổng hợp nên các oligosaccarit mới có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Các glicoprotein chứa duy nhất một loại gốc đường tham gia vào việc xác định loại nhóm máu, đóng vai trò trong các bệnh truyền nhiễm virut và nhiễm khuẩn, chịu trách nhiệm đối với các nhận biết tế bào – tế bào, nằm trên các vị trí thụ thể tế bào. Các galactozit có thể được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với nhiều mục đích, chức năng khác nhau như làm chất tạo ngọt, chất ổn định, chất hoà tan… Trong tương lai, các ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và y học tập trung vào các quá trình chuyển hoá galatozyl nhằm tổng hợp nên các hợp chất chức năng duy nhất bằng cách thêm vào các phần tử nhận. Phần II Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu II.1 Nguyên liệu: II.1.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập: II.1.1.1 Môi trường thạch dùng để phân lập (môi trường Lactoza-Broth): Thành phần: Cao thịt bò: 3g Pepton: 5g Lactoza: 5g Agar: 15 á 20g Nước thêm đạt 1000 ml Thanh trùng ở 110oC/ 30 phút II.1.1.2 Môi trường nuôi cấy cơ bản (môi trường Lactoza): Lactoza: 20g Pepton: 3g NaCo3: 3g KCl: 0.5g MgSO4.7H2O: 0.5g KH2PO4: 0.1g FeSO4.7 H2O: 0.01g ZnSO4.7H2O: 0.01g CuSO4.5H2O: 0.005g Nước thêm đạt 1000 ml Thanh trùng ở 110oC/ 30 phút Môi trường thạch dùng để cấy chuyền và giữ giống còn có thêm Agar-Agar với hàm lượng 15 á 20g/lít môi trường. II.2 Hoá chất: II.2.1 Nguồn Cacbon: - Nguồn cacbon sử dụng Lactoza, Glucoza, Saccaroza. II.2.2 Nguồn Nitơ: - Nguồn Nitơ vô cơ sử dụng: NaNO3, (NH4)2SO4. - Nguồn Nitơ hữu cơ sử dụng: Pepton, cao thịt bò. II.2.3 Các hoá chất khác: - Cơ chất ONPG (o-nitrophenil-b-D-galactopyranoside): sản phẩm của hãng Sigma Alrich-Germany. - Thuốc thử X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-b-D-galactoside): sản phẩm của hãng USBTM- Italia. - Clorofrom tinh khiết. - Dung dịch SDS (sodium dodecyl sunfate): 0.1%. - Dung dịch Na2C03. 1M. - 2-mecaptoetanol. - Các hoá chất khác. Ghi chú: Tất cả các hoá chất phân tích đều là hoá chất tinh khiết. II.3 Thiết bị: - Kính hiển vi Nikon eclipse E800, camera Fujix Digital HC-300Zi, Japan. - Thiết bị so màu quang phổ Ultrospecõ 2000, Amersham pharmacia biotech, Germany. - Máy ly tâm lạnh Allegra TM 64R Centrifuge-Beckman, Germany. - Máy ly tâm thường EBA 20 – Hettich zentrifugen, Germany. - Máy ly tâm eppendof IK15 – Sigma laborzentrifugen 1999, Germany. - Thiết bị siêu âm phá vỡ tế bào. - Tủ nuôi ổn nhiệt B12 Heracus-Kendo laboratory Products. - Thiết bị hấp tiệt trùng Medizinische Geratefabrik, Berlin. - Máy nuôi cấy ổn nhiệt Shaking incubator, Korea. - Máy đo pH MP 220 – Mettler Toledo. II.4 Các phương pháp nghiên cưú: II.4.1 Nhuộm gram: [2] Với phương pháp nhuộm này, người ta có thể phân biệt sự khác nhau giữa hai loại vi sinh vật giống nhau về hình thái và kích thước. Nguyên nhân của hiện tượng này là do cấu tạo hoá học của những vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có nhiều giả thiết về cơ chế nhuộm gram (giả thuyết về điểm đẳng điện, cấu tạo tế bào, thành phần hoá học… ). Nhưng cho đến nay, giả thuyết về cấu tạo hoá học vẫn được chấp nhận tuyệt đối hơn cả. Thuyết này cho rằng khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan tới muối magiê của axit ribonucleic. Khi nhuộm màu phức tạp (nhuộm gram) muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại triphenymetan (như gential violet, kristal violet hoặc metyl violet…) chịu được tác dụng của cồn, nghĩa là không mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật gram dương. Ngược lại những vi sinh vật không giữ màu khi xử lý bằng cồn là vi sinh vật gram âm. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng trong việc phân loại vi sinh vật. Dựa vào khả năng nhuộm màu gram của vi sinh vật mà người ta chia chúng ra thành 2 nhóm: - Vi sinh vật gram dương (G+): gồm hầu hết các loại cầu khuẩn, trực khuẩn hiếu khí có nha bào; Vi sinh vật gram âm (G-): gồm vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn axetic. Hoá chất: + Dung dịch tím gential + Dung dịch lugol + Cồn 950 + Dung dịch fucsin + Dầu séc + Toluen Tiến hành: + Làm tiêu bản vi sinh vật, cố định vết bôi + Nhuộm bằng tím gential (gential violet): nhỏ tím gential lên vết bôi, giữ trong 1-2 phút rồi đổ hết thuốc nhuộm đi. + Nhuộm bằng dung dịch lugol: nhỏ lugol lên tiêu bản, để trong 1 phút rồi đổ thuốc nhuộm đi. + Rửa bằng cồn 950 trong 30 giây. + Rửa lại bằng nước rồi làm khô vết bôi bưàng sứa nóng đèn cồn. + Nhuộm bổ sung bằng fucsin trong 1 phúỏngồi rửa lại bằng nước, đợi khô sau đó đem quan sát. Tế bào vi sinh vật nhuộm gram dương bắt màu tím, còn gram âm bắt màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung [2]. II.4.2 Xác định tính enzym b-galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal [15]: Sự có mặt của b-galactosidaza được xác định dựa trên nguyên tắc sau: b-galactosidaza thuỷ phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh Blue kiểu indigo. Vì vậy vi khuẩn dương tính với enzym này tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy với sự có mặt của chỉ thị X-Gal. X-Gal được hoà tan trong dimethylformamide ở nồng độ 20 mg/ml. Dung dịch gốc này phải được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 40C. Môi trường thạch dùng để cấy hoặc phân lập bình thường được hấp vô trùng và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 550C, sau đó thêm chỉ thị X-Gal vào đến nồng độ cuối là 4 mg/ml (dung dịch gốc pha loãng 500 lần). Cần chú ý không thêm chỉ thị X-Gal vào khi nhiệt độ môi trường lớn hơn 550C do tại nhiệt độ lớn hơn 550C chỉ thị này không bền và sẽ bị phân huỷ. Đĩa thạch chỉ thị này được dùng để nuôi vi khuẩn. Sau một thời gian nuôi cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có màu xanh trên đĩa chỉ thị là chủng có khả năng sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza. Cần chú ý là các đĩa thạch sau khi đã thêm chất chỉ thị phải được bảo quản trong tối ở 4oC và chỉ dùng được trong khoảng thời gian là 1 tháng. II.4.3 Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza nội bào [9]: Hoá chất: - Dung dịch đệm Z (pha cho 1 lít, bảo quản ở 40C vô hạn định), thành phần trong dung dịch đệm Z là như sau: + Na2HPO4 0,06M (ở dạng ngậm 12H2O, phân tử lượng là 358,14) + NaH2PO4 0,04M (ở dạng ngậm 2H2O, phân tử lượng là 156.01) + KCL 0,01M + MgSO4 0.001M Dung dịch đệm Z được pha trong nước, trước khi sử dụng thêm 2- mercaptoetanol với hàm lượng 0,27 ml 2- mercaptoetanol/100ml dung dịch đệm. - Dung dịch Na2CO3 1M (bảo quản vô hạn định ở nhiệt độ phòng) - Dung dịch cơ chất ONPG. - Dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH = 7,0 có thành phần như sau: Na2HPO4.7H2O 0,06M NaH2PO4.H2O 0,04M Điều chỉnh đến pH 7,0 bằng NaOH hoặc H3PO4. Dung dịch này ổn định ở nhiệt độ phòng và không cần phải pha mới hàng ngày. Dung dịch cơ chất nồng độ 4 mg/ml được pha trong đệm photphat 0,1M, pH 7,0 nêu trên, được lọc và bảo quản ở 40C cho đến khi bắt đầu ngả sang màu vàng. tốt hơn là dung dịch cơ chất này được pha mới hàng ngày. - Dung dịch SDS 0.1% - Dung dịch clorofom tinh khiết. Thiết bị và dụng cụ: - Thiết bị li tâm - Thiết bị so màu quang phổ - Thiết bị ổn nhiệt - Các dụng cụ khác Tiến hành: - Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật: + Ly tâm ít nhất 2ml dịch nuôi cấy vi sinh vật, quá trình ly tâm ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút. + Loại bỏ phần dịch trong, phần cặn bã được tái tạo huyền phù bằng cùng một thể tích dung dịch đệm Z đã làm lạnh. - Đo độ hấp thụ OD tại 600nm với mẫu trắng lá dung dịch đệm Z. - Pha loãng dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật bằng dung dịch đệm Z, tuỳ thuộc vào hoạt độ của enzym trong mẫu dịch nuôi cấy vi sinh vật mà cần pha loãng ở các tỷ lệ nhất định. - Làm tăng tính thấm của các tế bào vi sinh vật đã pha loãng này bằng cách thêm 100 ml Cloroform và 50 ml dung dịch SDS 0,1% vào 1ml huyền phù đã pha loãng ở trên. - Lắc đều và để ổn định ở 280C trong 5 phút. Phân tích: - Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 0,2 ml dung dịch cơ chất ONPG ở trên vào mẫu thí nghiệm. - Giữ mẫu ở 280C cho đến khi thấy xuất hiện màu vàng tương tự như màu của màu dịch chiết bò thì dừng phản ứng enzym và đọc thời gian phản ứng tính từ lúc thêm dung dịch cơ chất. - Dừng phản ứng enzym bằng cách thêm vào 0,5 ml dung dịch Na2CO3 1M. - Đọc mật độ quang tại 420 nm và 550 nm vỡi mẫu trắng có thành phần giống như mẫu phân tích nhưng thứ tự thêm cơ chất và thêm chất dừng phản ứng là ngược nhau, nghĩa là ban đầu thêm chất dừng phản ứng, thêm tiếp cơ chất rồi mới ủ ở 280C. Tính kết quả: Tính toán số đơn vị hoạt độ có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau: 1000 (OD420 – 1,75.OD550) E = V.T.OD600 Trong đó: E: Hoạt độ enzym (MU/ml) V: thể tích của mẫu đem phản ứng (ml) T: thời gian phản ứng (phút) OD420 và OD550: giá trị đo mật độ quang của dung dịch mẫu mẫu sau phản ứng ở các bước sóng 420 nm và 550 nm so với mẫu trắng. OD600: giá trị mật độ quang của dịch mẫu ở bước sóng 600 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm Z. II.4.4 Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza ngoại bào [9 ] Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza ngoại bào trong mẫu dịch lên men bằng phương pháp tương tự như trên, chỉ khác ở những điểm sau: Chuẩn bị mẫu: - Mẫu dùng xác định là dịch lên men đem ly tâm ở nhiệt độ 40C, tốc độ 8000 vóng/phút để thu lấy dịch trong. - Pha loãng mẫu bằng dung dịch đệm Z (không cần bước tăng tính thấm của thành tế bào bằng Cloroform và SDS). - Lắc đều và để ổn định ở 280C trong 5 phút. Phân tích: - Các bước phân tích tương tự như trên, chỉ khác là không cần xác định giá trị mật độ quang tại các bước sóng 550 và 600 nm do dịch mẫu phân tích là dịch trong hoàn toàn. Tính toán kết quả: Tính kết quả như sau (đơn vị: MU/ml): 1000. OD420 E = V.T Trong đó: E: Hoạt độ enzym (MU/ml) OD420: Giá trị mật độ quang tại bước sóng 420 nm V: Thể tích thực của mẫu đem phản ứng (ml) T: Thời gian phản ứng (phút) Phần III: Kết quả và thảo luận III.1 Vài nét về chủng vi khuẩn sử dụng: Nguồn gốc: Đây là chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn sữa chua tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội, mang ký hiệu BK16. Tên khoa học: Sphingomonas paucimobilis BK16. Đặc điểm tế bào: Gram âm, kích thước khuẩn lạc 2 mm. Hình 3: Chủng S. paucimobilis BK16 (độ phóng đại 1000 lần) Hình 4: Hình thái khuẩn lạc S. paucimobilis BK16 khi nuôi trên mô hình thạch III.2. Nghiên cứu khả năng đồng hoá các nguồn cacbon khác nhau: Tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chủng BK16 trên các nguồn cacbon: lactoza, glucoza và saccroza với hàm lượng 20g/l. Các thành phần khác của môi trường nuôi cấy giống như môi trường cơ bản. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 2: Sự thay đổi mật độ tế bào khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 OD 600 nm Lactoza 0.434 0.922 1.441 1.640 1.627 1.604 1.574 Glucoza 0.336 0.492 0.894 1.007 1.003 0.940 0.747 Saccaroza 0.346 0.680 1.108 1.054 1.002 0.892 0.874 Hình 5: Sự thay đổi mật độ tế bào khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Nhận xét: - Trên tất cả các nguồn cacbon, pha logarit đều nằm trong khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 36. - Mật độ tế bào bắt đầu giảm từ giờ thứ 60 sau khi cấy giống. - Chủng BK16 có khả năng phát triển mạnh với nguồn cacbon là lactoza. Trên nguồn cacbon là glucoza chủng này kém phát triển. Bảng 3: Sự thay đổi hoạt độ enzym khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 Hoạt độ enzym (mU/ml) Lactoza 15.12 235.8 343.85 393.39 383.76 257.79 153.45 Glucoza 0 5.78 12.95 30.42 23.31 12.57 0 Saccaroza 0 4.02 20.85 37.99 71.40 48.54 15.57 Hình 6: Sự thay đổi hoạt độ enzym khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Nhận xét: - Chủng BK16 có khả năng sinh tổng hợp enzym b-Galactosidaza cao nhất trên nguồn cacbon lactoza, khả năng sinh tổng hợp enzym trên các nguồn cacbon còn lại là thấp đặc biệt là trên nguồn cacbon glucoza. Vì vậy chúng tôi chọn nguồn cacbon lactoza làm môi trường để nuôi sinh tổng hợp enzym b-Galactosidaza. III.3 Khảo sát sự thay đổi pH, mật độ tế bào, hoạt độ enym của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men: Nguồn cacbon: lactoza. Giống trước khi cấy được hoạt hoá trong ống nghiệm chứa 10ml dịch có thành phần giống như môi trường lên men ở 300C trong 24 giờ. Nhiệt độ nuôi cấy 300C. Tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau mỗi khoảng thời gian 12 giờ lấy mẫu một lần, đem xác định giá trị pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym nội bào. Bảng 4: Sự thay đổi pH của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 pH 4.83 4.26 3.69 3.27 3.15 3.10 2.82 Hình 7: Sự thay đổi pH của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men Nhận xét: Chủng BK16 có giá trị pH giảm dần trong suốt quá trình lên men (từ 4.83 đến 2.82). Bảng 5: Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng BK16 trong quá trình lên men: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 OD 600 nm 0.434 0.922 1.441 1.640 1.637 1.624 1.574 Hình 8: Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng BK16 trong quá trình lên men: Nhận xét: - Giai đoạn phát triển logarit của BK16 bắt đầu từ giờ thứ 6 và kết thúc ở giờ thứ 36. - Mật độ tế bào đạt nhiều nhất ở giờ lên men thứ 36 thể hiện ở giá trị OD 600 nm = 1.640. Bảng 6: Sự thay đổi hoạt độ enzym của chủng BK 16 trong quá trình lên men Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 Hoạt độ enzym (MU/ml) 15.12 238.98 343.39 393.39 383.76 254.79 153.45 Hình 9: Sự thay đổi hoạt độ enzym của chủng BK 16 trong quá trình lên men 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 12 24 36 48 60 72 84 Thời gian lên men (h) Hoạt độ enzym (MU/ml) Nhận xét: - Hoạt độ enzym tăng rất nhanh ở giai đoạn đầu (trong khoảng thời gian từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12). - Hoạt độ enzym cao nhất đạt 393.39 mU/ml với thời gian lên men là 36 giờ. Kết quả này gần với công trình nghiên cứu về enzym có nguồn gốc từ vi khuẩn cho rằng enzym này được tổng hợp mạnh nhất ở cuối pha logarit và đầu pha cân bằng. III.4 Xác định một số đặc tính enzym b-Galactosidaza thu được từ chủng BK16: III.4.1 ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ enzym: Giá trị pH có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của enzym, mỗi enzym hoạt động mạnh ở một giá trị pH khác nhau. Giá trị pH mà tại đó mà enzym hoạt động mạnh nhất được gọi là pH tối ưu. Để khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt độ của enzym thu được từ chủng BK16, ta xác định hoạt độ của chế phẩm thô khi tham gia phản ứng với cơ chất oNPG tại các giá trị pH lần lượt bằng: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9. Bảng 7: ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ enzym pH 4 5 6 6.5 7 7.5 8 9 Hoạt độ enzym (MU/ml) 95.38 213.84 301.13 360.15 360.69 352.25 254.03 86.14 Hình 10: ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ enzym Nhận xét: - Hoạt độ enzym b-Galactosidaza tăng dần từ pH = 5 và đạt cực đại ở ph = 7 (hoạt độ enzym = 360.69 MU/ml) sau đó giảm mạnh từ pH = 7.5 tại giá trị pH = 9 hoạt độ enzym chỉ còn 86.14 MU/ml, tương đương 23.86% hoạt độ cực đại của nó tại pH = 7. Như vậy pH phản ứng tối ưu của enzym b-Galactosidaza là 7. III.4.2 ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ enzym: Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng có tác động mạnh mẽ tới hoạt độ của enzym. Nhiệt độ và vận tốc phản ứng enzym không tỷ lệ thuận hoàn toàn. Khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng enzym tăng nhưng chỉ đến một mức nào đó thì nhiệt độ tiếp tục tăng thì vận tốc phản ứng enzym sẽ giảm do nhiệt độ cao gây biến tính protein dẫn đến bất hoạt enzym. Nhiệt độ mà ở đó enzym hoạt động mạnh nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Các enzym thuộc cùng loại nhưng có nguồn gốc khác nhau sẽ có nhiệt độ tối ưu khác. Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ của chủng S. paucimobilis BK16, ta xác định hoạt độ của dịch phế phẩm thô khi tham gia phản ứng với cơ chất ONPG trong thời gian 30 phút ở pH 7.0 tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 300C, 450C, 500C, 600C và 700C. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên bảng và đồ thị sau: Bảng 8: ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ enzym: Nhiệt độ 30 40 45 50 60 70 Hoạt độ enzym (MU/ml) 333.39 454.10 472.81 426.32 253.24 54.33 Hình 11: ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ enzym: Nhận xét: Hoạt độ enzym tăng dần từ 300C đến 450C và giảm dần đến 500C, giảm mạnh từ 500C đến 700C. Như vậy nhiệt độ tối ưu của phản ứng enzym là 450C. III.4.3 ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym: Các enzym có nguồn gốc khác nhau có tính bền pH khác nhau. Để xác định tính bền của dich enzym thô tại các giá trị pH khác nhau, chúng ta tiến hành chuẩn bị 6 mẫu dịch enzym thô lần lượt có các giá trị pH là 4, 5, 6, 7, 8, 9. Các mẫu dịch enzym thô này được giữ ở 300C trong 72 giờ và cứ 12 giờ đem xác định hoạt lực enzym 1 lần. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 9: ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym Hoạt độ enzym (%) Thời gian (h) Mẫu 0 12 24 36 48 60 72 pH=4 100 94.5 86.1 78.3 70.8 61.2 50.3 pH=5 100 98.4 89.2 80.6 74.2 67.8 62.5 pH=6 100 96.7 85.3 78.1 74.0 65.2 60.9 pH=7 100 90.4 80.8 75.3 66.1 60.3 51.8 pH=8 100 87.5 76.6 62.4 57.2 51.6 45.9 pH=9 100 83.4 72.0 60.7 55.1 48.4 41.5 Hình 12: ảnh hưởng của pH tới tính bền của enzym Nhận xét: Khi giữ dịch enzym thô ở pH=5 sau 72 giờ hoạt độ enzym còn giữ được tới 62.5% và ở pH=6 hoạt độ còn giữ được 60.9%. Khi pH tăng lên đến 9, sau 72 giờ hoạt độ enzym chỉ còn lại 41.5%. Như vậy enzym b-Galactosidaza của chủng S. paucimobilis BK16 bền trong môi trường có pH nằm trong khoảng từ 5 đến 6. III.4.4 ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của enzym: Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới tính bền của enzym, gây ảnh hưởng đến protein enzym. Để xác định tính bền nhiệt của enzym ta tiến hành chuẩn bị 5 mẫu dịch enzym thô lần lượt giữ ở các nhiệt độ: 300C, 400C, 500C, 600C, 700C. Các mẫu dịch enzym thô này được giữ ở pH=5 trong 3 giờ và cứ 30 phút đem xác định hoạt lực enzym 1 lần. Bảng 10: ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của enzym Hoạt độ enzym (%) Thời gian (phút) Mẫu 0 30 60 90 120 150 180 T=300C 100 100 98 95 85 80 78 T=400C 100 98 95 90 82 77 69 T=500C 100 90 84 70 55 45 30 T=600C 100 81 70 60 48 31 20 T=700C 100 75 65 55 43 25 16 Hình 13: ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của enzym Nhận xét: ở nhiệt độ thường (300C), enzym tương đối bền, sau 180 phút hoạt độ enzym còn lại đạt 78% so với ban đầu. Khi nhiệt độ tăng lên đên 500C, hoạt độ enzym giảm nhanh ở 700C sau thời gian 180 phút, hoạt độ enzym chỉ còn 16% so với nhiệt độ ban đầu. Như vậy có thể kết luận enzym này chỉ bền ở vùng nhiệt độ thường từ 300C đến 400C. III.5 Nghiên cứu khả năng thu enzym nội bào: Enzym b-Galactosidaza của vi khuẩn S. paucimobilis BK16 là enzym nội bào, vì vậy việc thu dịch enzym thô có hoạt độ cao là rất quan trọng. Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng tế bào. Do đó để có thể chiết xuất enzym nội bào, có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thuỷ tinh hoặc làm đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá), bằng tác dụng của hoá chất (axeton, atylaxetat, clorofom… ), dùng sóng siêu âm… [2]. Ta tiến hành khảo sát khả năng thu enzym b-Galactosidaza bằng hoá chất và sóng siêu âm. Hoá chất sử dụng là SDS 0.1% và cloroform. Chế độ siêu âm là 18 kHz trong thời gian 15 phút, mỗi chu kỳ là 30 giây, nghỉ 30 giây. Trong quá trình siêu âm, dịch enzym được làm lạnh bên ngoài bằng đá. Chuẩn bị 3 mẫu dịch lên men, ly tâm thu cặn hoà vào cùng thể tích lượng Z, bổ sung SDS và Clorofom. M1: dịch sau siêu âm ly tâm thu dịch trong. M2: dịch sau siêu âm ly tâm thu cặn M3: dịch không siêu âm Bảng 11: Khảo sát khả năng thu enzym nội bào bằng hoá chất và sóng siêu âm Mẫu thí nghiệm M1 M2 M3 Hoạt độ enzym (mU/ml) 443.62 167.19 383.69 Hình 14: Khảo sát khả năng thu enzym nội bào bằng hoá chất và sóng siêu âm Nhận xét: Cả hai phương pháp hoá chất và sóng siêu âm đều có khả năng tách enzym nội bào. Tuy nhiên việc kết hợp cả hai phương pháp trên sẽ cho hiệu suất thu enzym nội bào cao nhất (64%). III.6 Nghiên cứu khả năng kết tủa enzym thô bằng muối amonsunfat: Dịch enzym thô sau tách ngoài enzym còn chứa nhiều tạp chất (protein tạp, DNA, vỏ tế bào… ). Để loại bỏ tạp chất, người ta thường dùng phương pháp kết tủa enzym bằng muối amonsunfat, sau đó đem thẩm tích loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex. Tiến hành thí nghiệm tìm nồng độ muối amonsunfat thích hợp để kết tủa được enzym b-Galactosidaza ở các nồng độ bão hoà 50%, 60%, 70%. Kết tủa được để qua đêm ở 40C, ly tâm thu cặn, hoà tan vào đệm photphat rồi lại thẩm tích qua đệm, sau đó đem xác định hoạt độ enzym. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 12: Khả năng kết tủa enzym thô bằng muối amonsunfat: Nồng độ muối bão hoà (%) Hoạt độ enzym (% so với trước khi kết tủa) 50 54.27 60 60.56 70 44.78 Hình 15: Khả năng kết tủa enzym thô bằng muối amonsunfat: Nhận xét: Nồng độ muối anmonsunfat bão hoà là 60% thì enzym b-Galactosidaza được kết tủa nhiều nhất. Sản phẩm sau khi kết tủa bằng muối thẩm tích loại muối, đem đông khô được gọi là enzym kỹ thuật. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu thu được, cho phép rút ra những kết luận sau: Đã thử nghiệm trên 3 nguồn cacbon khác nhau với chủng S.paucimobilis BK16 và xác định được nguồn cacbon thích hợp để nuôi cấy sinh tổng hợp enzym b-Galactosidaza là lactoza. Mật độ tế bào lớn nhất sau 36 giờ lên men thể hiện ở giá trị OD 600 nm là 1.640. ở nhiệt độ 300C, tốc độ lắc 200 vòng/phút thời gian sinh enzym b-Galactosidaza cao nhất là sau 36 giờ nuôi với hoạt độ enzym đạt tới 393.39 MU/ml. Đã xác định được một số đặc tính của enzym b-Galactosidaza thu được từ chủng S.paucimobilis BK16, cụ thể: - Giá trị pH tối ưu là 7,0 - Giá trị nhiệt độ tối ưu là 450C - Đọ bền pH nằm trong khoảng pH=5 đến pH=6, giữ được hoạt độ 62.5% sau 72 giờ ở 300C. - Bền trong vùng nhiệt độ dưới 400C, giữ được 78% hoạt độ ở pH = 5. Đã xác định khả năng thu enzym nội bào bằng hoá chất và sóng siêu âm. Kết quả cho thấy cả hai phương pháp trên đều có khả năng thu enzym nội bào tuy nhiên kết hợp cả hai phương pháp cho hiệu quả cao nhất (thu được 64% enzym nội bào). Bước đầu khảo sát khả năng tạo chế phẩm enzym kỹ thuật bằng việc kết tủa enzym b-Galactosidaza bằng muối amonsunfat bão hoà. Đã xác định được nồng độ muối amonsunfat bão hoà thích hợp nhất là 60%. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Văn Mùi. Thực hành hoá sinh học. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội 2001, 20-24. 2. Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Trọng. Thí nghiệm vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Bách Khoa, Hà Nội 1992, 41-51. 3. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên. Hoá sinh học công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 1997, 20-35. 4.Agrawal, S; Garg, S.K. and Dutta. Microbial b-Galactosidaza production, properties and industrial application. Indian jorunal of Dary Scien, 1989, 251-262. 5. Coenen, T.M.M; Bertens, A.M.C; Hoog, S.C.M.de, Verspeek Rip, C.M.. Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from Kluyveromyces lactis. Food-and-Chemical-Technology, 2000, 671-677. 6. Davail, S.; Feller, G.; Narinx, E.; Gerday, C.; Cold adaptation of protein. J Biol Chem, 269, 1994. 7. D’Haese, E.; Nelis, HJ. and Reybroeck, W. Inhibition of b-Galactosidaza biosynthesis in Escherichia coli by tetracycline residues in milk. Applied-and Envỉonmental-Microbiology, 1997, 4116-4119. 8. Kim, C.K., Jcong, E.J.; Enhanced lymph node delivery and immunogenicity of hepatitis B suface antigen entrapped in galactosylated luposomos. Int., J.Pham, 1997, 143-151. 9. Marian Price-Carterr. b-Galactosidaza Activity Assay (derivered from J.H. Miller in “Experiments in Molecular Genetics”). Clod Spring Harbor laboratotries; 1972. 10. Marshall, C.J.; Cold-addapted enzymes. Trends Biotechnol, 1997, 359-364. 11. Palimbo, M.S.; Smith, P.W.; Strange, E.D.; Van hekken, D.L.; Turnik, M.H and Holsinger, V.H.; Stability of b-Galactosidaza from Aspergillus oryzae and Kluyveromyces lactis in dairy milk power. Journal of Food Science, 1995. 12. Peppler, H.J. Reed. G.; Enzymes in food and feed processing. Biotechnology, vol 7a, VCH. Weinheim, 1978, 578-580. 13. Shimon, G and Elizabeth, A.B, Purification and separationb-Galactosidaza from spnach leaves. Biochim biophys, Acta, 1970, 125-135. 14. Shuichi Yanahira, Tomoko Kobayashi, Toshiaki Suguri, Masamichi Nakakoshi, Susumu Miura, Hidetoshi Ishikawa, and Ichiro Nakajima. b-Galactosidaza from bacterium . Biochem, 1995,1021-1026. 15. Toru Nakayama, Teruo Amachi, b-Galactosidaza enzymology Encyclopaedia of Food science, food technology and nutrion. Vol.3.Academic Press, 1996, 1291-1305. 16. Zadow, J.G., Economic cosiderattión related to the production of lactose and lactose by broducts. Cold Sping Harbor, NewYork,1998, 10-15.