Đồ án Khảo sát khả năng giải độc của Glutamat trên cây cải bị bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani

ên sinh chất để hút các chất dinh dưỡng trong tế bào. Vòi hút của nấm thường có nhiều hình dạng khác nhau: hình dùi trống, hình trụ ngắn đâm nhánh giống chùm rễ, hình chiếc xẻng, hình bàn tay… (nấm phấn trắng - Erysiphe), (nấm sương mai - Peronospora), (nấm gỉ sắt - Puccinia). 1.4.4 Dinh dưỡng và trao đổi chất ở nấm. Trao đổi chất là cơ sở của sự sống và sự phát triển của nấm. Sợi nấm là cơ quan sinh trưởng, dinh dưỡng, chúng tiết ra các enzyme, để phân giải nguồn hợp chất hữu cơ phức tạp ở bên ngoài thành hợp chất đơn giản dễ hoà tan, nhờ tính bán thấm chọn lọc của màng tế bào chất chúng hấp thụ các chất dinh dưỡng có sẵn vào cơ thể. Ngoại enzyme được nấm tiết ra môi trường để phân giải các hợp chất phức tạp thành các chất đơn giản dễ hấp thụ. Đó là các men thủy phân (Cutinase, Cellulase, Pectinase, Amylase,…). Nội enzyme dùng để tổng hợp các chất đã hấp thụ được thành những hợp chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và sinh sản của nấm, chủ yếu là các enzyme oxy hoá khử (oxydase, dehydrase…). Trong quá trình sinh trưởng, tế bào nấm cần hấp thụ nhiều nguyên tố khoáng (17 nguyên tố) như: C, N, O, S, H, P. Mg, Cu, Fe, Zn, Mn, Ca… các nguyên tố vi lượng như Bo, Mo,… và một số Vitamin (B1, B6…). trong đó các nguồn dinh dưỡng chủ yếu là Cacbon (Gluxit), nguồn đạm (axit amin) và những axit hữu cơ khác. - Nguồn cacbon: nấm cần nhiều hơn nguồn đạm và các chất khoáng, chủ yếu là các loại đường C6, C5, tinh bột, axit hữu cơ và axit béo. Đa số các loại nấm sử dụng tốt nhất đường glucose (C6). - Nguồn đạm: rất quan trọng song số lượng cần cho nấm ít hơn nguồn Cacbon. Một số loài nấm như: Helminthosporium, Colletotrichum và Rhizoctonia có khả năng khử đạm Nitrat thành NH3 à NO3 à NO2 à NH4OH à NH3 Một số nấm có thể tự tổng hợp Vitamin cần thiết cho cơ thể nếu không có trong môi trường. Ví dụ: nấm Pythium, nấm Aspergillus… Ngoài hệ thống enzyme, nhiều loại nấm còn sản sinh ra các độc tố, là những sản phẩm trao đổi chất của nấm có tác động làm tổn thương hoạt động sống của tế bào thực vật ở một nồng độ rất thấp. Căn cứ vào phổ tác động của độc tố nấm người ta thường phân thành 2 nhóm Pathotoxin và Vivotoxin. Độc tố của nấm có tác động kìm hãm hoạt động của hệ thống men tế bào ký chủ, kìm hãm hoạt động hô hấp của cây, phá vỡ tính thẩm thấu chọn lọc của màng tế bào chất, phá huỷ diệp lục và quá trình trao đổi chất của tế bào làm giảm khả năng đề kháng của cây. Về thành phần hoá học có thể phân chia độc tố của nấm hại cây thành các nhóm axit hữu cơ (axit oxalic, axit fusarinic, axit alternaric, axit pycolinic), nhóm polysaccarit (Licomarasmin, Colletotin, Piricularin), nhóm Protein và các sản phẩm phân giải của protein (NH3, Victorin) và nhóm các chất bay hơi (axit xianic). Một loài nấm có thể sản sinh nhiều độc tố ở các nhóm khác nhau. Ví dụ: nấm đạo ôn (Pyricularia oryzae) có hai loại độc tố là axit pycolinic và Pyricularin ở hai nhóm khác nhau. Nấm Fusarium sp. có các loại độc tố như axit fusarinic, fumonisin B1 và fumonisin B2, Licomarasmin. Ngoài độc tố, nấm còn sản sinh ra những hoạt chất sinh học khác như kháng sinh có khả năng đối kháng, ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật khác loài (ví dụ Penicillin là chất kháng sinh từ nấm Penicillium). Một số kháng sinh có hoạt tính đối kháng với các loài nấm gây bệnh cây. Ví dụ: Gliotoxin của nấm Trichoderma có thể tiêu diệt một số nấm gây bệnh cây như Fusarium, Sclerotium, Rhizoctonia… Dựa vào đặc tính đối kháng, và chất kháng sinh của nấm người ta tạo ra nhiều chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh hại cây trồng. Trong tế bào chất của cây còn có các loại sắc tố cũng là các sản phẩm trao đổi chất của nấm. Sắc tố nấm thường ở các nhóm: Anthraquinon, Naphtaquinon (Nấm túi, nấm bất toàn), Carotinoide (Nấm mốc, nấm rỉ sắt), Melanin (nấm đạm). Nhờ có sắc tố làm tản nấm có màu sắc khác nhau và biến đổi môi trường sống. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm phụ thuộc vào đặc tính ký sinh của từng loài nấm và các yếu tố ngoại cảnh, chủ yếu là nhiệt độ, ẩm độ, pH môi trường… Nhiệt độ thích hợp cho hầu hết các loài nấm sinh trưởng khoảng 20 - 280C, pH thích hợp từ 6 – 6.5. 1.4.5 Sinh sản của nấm. Nấm sinh sản bằng nhiều phương pháp khác nhau và với tốc độ nhanh, số lượng nhiều. Sản phẩm hình thành trong quá trình sinh sản gọi là bào tử. Do có các hình thức sinh sản khác nhau nên bào tử cũng khác nhau về hình thức, màu sắc, kích thước và chất lượng. 1.4.5.1. Sinh sản từ cơ quan sinh trưởng. Ở hình thức sinh sản này, nấm không hình thành cơ quan sinh sản riêng biệt mà sợi nấm trực tiếp làm nhiệm vụ sinh sản. Hình thức sinh sản này thường cho các dạng bào tử sau: - Bào tử hậu (Chlamydospore): Khi bước vào giai đoạn sinh sản, một số tế bào trên sợi nấm được các tế bào bên cạnh dồn tế bào chất, sang trở thành tế bào có sức sống mạnh, chất dự trữ nhiều, màng dày lên, thay đổi hình dạng chút ít và trở thành bào tử hậu (nấm Fusarium spp.). Bào tử hậu có sức chịu đựng ở điều kiện khí hậu bất lợi trong thời gian dài, do vậy, một số loại nấm, bào tử hậu có thể là giai đoạn bắt buộc trong chu kỳ phát triển của nấm (hình 1.6). Hình 1.6 : Sinh sản từ cơ quan sinh trưởng. 1. Bào tử chồi; 2. Bào tử phấn; 3. Bào tử hậu - Bào tử phấn (Oidium): là những bào tử hình trứng hoặc hình bầu dục hình thành từ những tế bào sợi nấm tích lũy chất dự trữ, có màng ngăn riêng và đứt ra trở thành các bào tử phấn. - Bào tử chồi (Blastospore): bào tử này thường có ở các loại nấm men bia, rượu. Khi sinh sản, trên tế bào cũ mọc ra một hoặc nhiều chồi nhỏ, chồi lớn dần và tách thành bào từ chồi. - Bào tử khí (Arthrospore): Các bào tử khí hình thành từng chuỗi trên đầu các sợi nấm, mọc vươn cao lên và tung vào trong không khí khi chín. Dạng bào tử này thường gặp ở nấm phấn trắng. 1.4.5.2 Sinh sản vô tính. Đặc điểm của hình thức sinh sản này là các bào tử được sinh ra trên cơ quan sinh sản riêng biệt do sợi nấm sinh trưởng đến giai đoạn thuần thục hình thành nên. Tuỳ theo đặc điểm hình thành bào tử vô tính bên ngoài hoặc bên trong cơ quan sinh sản, mà phân biệt hai hình thức sinh sản vô tính nội sinh và ngoại sinh. - Sinh sản vô tính nội sinh: Khi nấm đã thuần thục bước vào sinh sản, tế bào trên đầu sợi nấm phình to hình thành cơ quan sinh sản có dạng cái bọc (sporang), khi thuần thục nhân của tế bào bọc và chất nguyên sinh phân chia nhiều lần để tạo thành các bào tử vô tính nội sinh gọi là bào tử bọc (không lông roi) hoặc bào tử động (có lông roi) Zoospore (hình 1.7). Khi chín bọc vỡ ra và bào tử được giải phóng ra ngoài. Hình 1.7 : Bọc và bọc bào tử động. 1 - 2: Bọc và bào tử bọc. 3 - 4: Bọc bào tử động và bào tử động - Sinh sản vô tính ngoại sinh: Ở các nấm bậc cao và một số nấm bậc thấp, sinh sản vô tính bằng hình thức ngoại sinh. Cơ quan sinh sản được hình thành trên sợi nấm thuần thục là cành bào tử phân sinh (Conidiophore) và tạo ra các bào tử phân sinh (Conidium) ở bên ngoài. Tùy loại nấm mà bào tử phân sinh có thể là đơn bào hay đa bào, có dạng hình trứng, hình lưỡi liềm, hình bầu dục, hình quả lê,… và màu sắc cũng khác nhau (màu nâu, vàng…) hoặc không có màu. Bào tử phân sinh có thể hình thành đơn độc từng chiếc hoặc từng chuỗi trên đầu cành bào tử phân sinh. Các loại nấm khác nhau các cành bào tử phân sinh cũng có cấu tạo và hình thái rất khác nhau, nó cũng có thể đơn bào, đa bào, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có thể mọc riêng rẽ từng chiếc hoặc mọc thành từng cụm có cấu trúc đặc biệt khác nhau gồm 3 loại bó cành, đĩa cành và quả cành (hình 1.8). Các đặc điểm trên của bào tử phân sinh và cành bào tử phân sinh là một trong những chỉ tiêu để phân loại nấm. Hình 1.8 : Dạng cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh. 1. Cành bào tử phân sinh đâm nhánh và bào tử phân sinh (Phytophthora). 2. Cành bào tử phân sinh không đâm nhánh và bào tử phân sinh (Erysiphe). 3. Cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh (Macrosporium sp.). 4. Đĩa cành. 5. Quả cành. 1.4.5.3 Sinh sản hữu tính của nấm. Sinh sản hữu tính của nấm rất phức tạp, nó không giống các hình thức sinh sản hữu tính ở các sinh vật khác. Sinh sản hữu tính ở nấm là hiện tượng phối giao giữa các tế bào giao tử hoặc các bộ phận đặc biệt của nấm với nhau theo nhiều hình thức khác nhau, gồm đẳng giao và bất đẳng giao. - Sinh sản hữu tính đẳng giao: - Đẳng giao di động: Là hình thức sinh sản hữu tính đơn giản nhất (nấm cổ sinh), là quá trình giao phối giữa 2 giao tử (gamete) có hình dạng kích thước hoàn toàn giống nhau, là các bào tử động có lông roi di động được. Sau phối giao tạo thành hợp tử (zygote). - Đẳng giao bất động: Là hình thức sinh sản hữu tính phức tạp hơn, là quá trình tiếp hợp giữa tế bào 2 sợi nấm hoàn toàn giống nhau về hình dạng và kích thước. Ở giai đoạn thuần thục do sự tiếp xúc của 2 sợi nấm màng bào ở chỗ tiếp giáp dần dần tan ra tạo một tế bào chung hòa hợp tế bào chất và hai nhân với nhau, tế bào đó sẽ phình to, có dạng hình cầu, vỏ dày gọi là bào tử tiếp hợp (zygospore). Bào tử tiếp hợp có khả năng tồn tại lâu dài, gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm tạo thành bọc và bào tử bọc. - Sinh sản hữu tính bất đẳng giao: Là hình thức sinh sản hữu tính phức tạp hơn cả ở các nấm bậc cao và các nấm bậc thấp đã phát triển. Nấm sinh sản bằng các cơ quan sinh sản nhất định khác nhau cả về hình thái bên ngoài lẫn tính chất bên trong, các lớp nấm khác nhau có dạng bào tử hình thành có đặc điểm khác nhau. - Bào tử trứng (Oospore): Trên sợi nấm sinh ra các cơ quan sinh sản riêng biệt là bao cái (Oogonium) và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao toàn bộ nhân và chất tế bào của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh và hình thành một bào tử trứng. - Bào tử túi (Ascospore): Đối với các nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes) cơ quan sinh sản là túi (Ascus) được hình thành trong quá trình phối hợp chất tế bào và nhân giữa bao đực và bao cái (ascogone). Sau giai đoạn chất phối và giai đoạn song hạch từ bao cái mọc ra sợi sinh túi phình to tạo thành túi (Ascus). Hình 1.9 : Sinh sản hữu tính của nấm và các loại quả thể của nấm túi. A. Nấm trứng: 1. Bao trứng (Oogonium); 2. Bao đực (Antheridium). 3. Phối giao (giao tử đực, giao tử cái); 4. Bào tử trứng. 5. Hình thành “Bào tử tiếp hợp”. B. Nấm túi: 6. Bao cái (Carpogonium) và bao đực (Antheridium). 7. Phối giao (giao tử đực, giao tử cái). 8. Sợi sinh túi và hình thành túi với tám bào tử túi. C. Quả thể: 9. Quả thể kín. 10. Quả thể bầu (quả thể mở). 11. Quả thể đĩa (a), (b). Trong khi nhân nhị bội tiến hành giảm phân (thường 3 lần) tạo thành bào tử hữu tính ở trong túi (bệnh phấn trắng bầu bí, bệnh lúa von) gọi là bào tử túi. Hình 1.10 : Quá trình hình thành đảm và bào tử đảm (Basidiospore). Các nấm thuộc lớp nấm Đảm khi sinh sản hữu tính hầu như không có cơ quan sinh sản riêng biệt mà cơ quan sinh sản là đảm (Basidium) được hình thành trên sợi nấm hai nhân. Đảm là một tế bào hai nhân, sau giai đoạn phối hạch thành nhân nhị bội thể rồi phân bào giảm nhiễm 1 đến 2 lần tạo ra 2 hoặc 4 nhân đơn bội thể hình thành 2 hoặc 4 bào tử hữu tính gọi là bào tử đảm (hình 1.10). Ngoài ra với một số nấm, đảm được hình thành trực tiếp từ trên bào tử hậu, bào tử đông (Teleutospore) (nấm than đen và nấm gỉ sắt). Ở nước ta mới chỉ thấy một số nấm sinh sản hữu tính, còn nói chung đa số sinh sản vô tính chiếm ưu thế tuyệt đối trong năm. Ở một số loại nấm, từ sợi nấm một nhân hoặc sợi nấm hai nhân có khả năng trực tiếp hình thành các loại bào tử hậu, bào tử xuân, bào tử hạ, bào tử đông. (vd: nấm gỉ sắt). Sinh sản vô tính sinh ra các cơ quan sinh sản vô tính và các bào tử vô tính với số lượng rất nhiều có thể lộ thiên, có thể được bảo vệ bao bọc trong các cấu trúc rất đặc biệt khác nhau tuỳ loại nấm gọi là “bó cành bào tử” (Coremium), “đĩa cành bào tử” (Acervulus) và “quả cành bào tử” (Pycnidium). Đây cũng là một trong những cơ sở để phân loại nấm. Sinh sản hữu tính của nấm túi hoặc nấm đảm cũng sinh ra các cấu trúc đặc biệt gọi là “quả thể” khác nhau như quả thể hình cầu (cleistocarp), quả thể hình bầu nậm là loại quả thể mở (có lỗ) (perithecium), quả thể đĩa (apotét) (Apothecium) đối với nấm túi hoặc quả nấm (nấm mũ) đối với nấm đảm. Căn cứ vào đặc tính chung về hình thái, sinh trưởng, sinh sản nói trên người ta phân loại toàn bộ các loại nấm thành những lớp nấm khác nhau để giám định chẩn đoán nấm bệnh. 1.4.6 Chu kỳ phát triển của nấm. Nấm không có diệp lục, sử dụng các chất hữu cơ sẵn có chủ yếu là các hợp chất nguồn cácbon, nguồn đạm, chất khoáng và vitamin của cây thông qua tác động của một hệ thống nội enzyme, ngoại enzyme và độc tố để hoàn thành chu kỳ phát triển của chúng trên cây trồng. Chu kỳ phát triển của nấm là một vòng đời bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát dục, sinh sản, tiến hành tuần tự kế tiếp nhau theo một trình tự nhất định để lắp lại giai đoạn ban đầu. Giai đoạn ban đầu của chu kỳ phát triển thường là bào tử (mầm bệnh). Sau khi nảy mầm xâm nhập tiến tới giai đoạn sinh trưởng thể dinh dưỡng (thể sợi) ký sinh phát ra triệu chứng bệnh rồi tới giai đoạn phát dục hình thành các cơ quan sinh sản và tạo ra các bào tử thế hệ mới vô tính để tái xâm nhiễm và hữu tính (bảo tồn). Tuy nhiên, do đặc điểm phát triển khác nhau và ảnh hưởng của các điều kiện địa lý sinh thái mà trong chu kỳ phát triển nhiều loại nấm không thấy xuất hiện giai đoạn hữu tính hoặc bỏ qua một giai đoạn phát triển nào đó gọi là chu kỳ phát triển không hoàn toàn. Chu kỳ phát triển của nấm có thể hoàn thành trên một loài cây ký chủ trong một vụ, một năm (nấm Sương mai) song có loại phải tiến hành trên cây ký chủ chính và trên ký chủ trung gian (bệnh nấm gỉ sắt lúa mì). 1.4.7 Xâm nhiễm và truyền lan của nấm. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm vào cây trồng bao gồm các giai đoạn kế tiếp nhau như sau: - Giai đoạn tiếp xúc và xâm nhập của mầm bệnh (Bào tử nấm) - Giai đoạn tiềm dục của bệnh (giai đoạn ủ bệnh) - Giai đoạn phát triển bệnh Giai đoạn tiếp xúc - xâm nhập: Đây là giai đoạn đầu tiên kể từ khi mầm bệnh (bào tử nấm) tiếp xúc được trên bề mặt cây trồng. Trước tiên bào tử nấm tiến hành nẩy mầm khi có nhiệt độ và ẩm độ thích hợp. Khác với vi khuẩn, nấm có thể xâm nhập được vào các bộ phận của cây để thiết lập quan hệ ký sinh với cây ký chủ ngoài cách thụ động như qua các lỗ hở tự nhiên (thủy khổng, khí khổng hoặc các vết thương cơ giới,…) nấm còn có thể chủ động xâm nhập trực tiếp qua lớp chitin, và biểu bì của lá nhờ các men thủy phân. Trong nhiều trường hợp, để thực hiện xâm nhập dễ dàng nấm cần phải có số lượng mầm bệnh nhất định gọi là "lượng xâm nhiễm tối thiểu". Ở giai đoạn này, điều kiện ngoại cảnh có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nảy mầm của bào tử và sự xâm nhập của chúng vào cây trồng, độ ẩm có tác dụng quyết định. Ví dụ: nhiều loại bào tử nấm chỉ có thể nảy mầm trong điều kiện có giọt nước hoặc độ ẩm rất cao (nấm đạo ôn, nấm mốc sương cà chua, khoai tây… ), cá biệt có loài nấm chỉ cần độ ẩm thấp (nấm phấn trắng). Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ nảy mầm, tốc độ nảy mầm, và kiểu nảy mầm của bào tử nấm. Ví dụ: nấm Phytophthora infestans có tỷ lệ nảy mầm cao nhất ở 14 - 180C với kiểu nảy mầm gián tiếp hình thành bào tử động (Zoospore), còn ở nhiệt độ 20 - 220C bào tử nảy mầm trực tiếp thành ống mầm. Nhiều loài nấm ngoài ẩm, nhiệt độ còn cần điều kiện pH môi trường, oxi và ánh sáng thích hợp. Một số nấm ký sinh: rỉ sắt (Phakopsora, Puccinia), phấn trắng (Erysiphe) và nấm sương mai (Phytophthora) có thể nảy mầm xâm nhập trực tiếp qua lớp biểu bì còn nguyên vẹn của cây nhờ vũ khí cơ học (giác bám) và vũ khí hoá học (các enzyme thuỷ phân). Giai đoạn ủ bệnh (tiềm dục). Là thời gian từ sau giai đoạn nấm xâm nhập đến khi xuất hiện triệu chứng ban đầu của bệnh. Trong giai đoạn này nấm gây bệnh sinh trưởng phát triển tiềm tàng ở bên trong mô cây, gây ra những biến đổi sâu sắc và phá huỷ tế bào cây bệnh. Ngược lại cây trồng cũng có những phản ứng chống đối lại nhất là ở những giống cây có gen kháng bệnh. Các phản ứng tự vệ của cây có thể là thụ động, hoặc chủ động nhờ các đặc điểm cấu tạo hình thái, thành phần hoá học hoặc có những phản ứng siêu nhạy, phản ứng phản độc tố, phản men (enzyme) hoặc phản ứng phytoalexin dẫn đến thời kỳ tiềm dục của bệnh có thể ngắn hay dài, nhanh hay chậm cùng với sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh khác. Mối quan hệ ký sinh - ký chủ xảy ra rất phức tạp. Để ngăn chặn hoặc làm giảm khả năng xâm nhập của nấm các yếu tố cấu tạo hình thái như độ dày lớp biểu bì, lớp sáp trên bề mặt biểu bì, số lượng và kích thước khí khổng, độ mở khí khổng, lớp lông trên bề mặt, góc độ lá với thân cây... đều ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập qua bề mặt tế bào ký chủ của tất cả các loại nấm gây bệnh trên cây. Cơ chế bảo vệ của cây gồm nhiều phản ứng và những biến đổi của tế bào cây chủ như: thay đổi độ pH tế bào, sản sinh Phytoalexin và các chất hóa học độc có tác dụng kháng nấm như: Glycoankaloid, Tanin, Phenol, Hydroquinol, Anthocyanin… Các cơ chế bảo vệ chủ động của cây như phản ứng siêu nhạy, hiện tượng tự chết của mô tế bào nhằm bao vây, cô lập các loại nấm ký sinh chuyên tính, như hiện tượng tạo lớp bần, lớp vỏ bao, tầng rời… để cách biệt với nấm gây bệnh. Giai đoạn phát triển bệnh. Tiếp theo sau giai đoạn tiềm dục, kể từ khi xuất hiện rõ triệu chứng bên ngoài, bệnh tiếp tục phát triển cho đến khi kết thúc. Đây là thời gian kéo dài để nấm sinh sản hình thành các đợt bào tử mới, phát tán lây lan tạo tiền đề cho các đợt tái xâm nhiễm tiếp theo làm bệnh gia tăng, phát triển thành dịch trên đồng ruộng. Lây truyền của nấm. Trong tự nhiên, nấm lây truyền bằng nhiều hình thức khác nhau. Sự lây truyền của bào tử nấm có thể chủ động hay thụ động tùy thuộc vào đặc điểm sinh học của mỗi loại nấm và chịu ảnh hưởng lớn của các yếu tố môi trường. Lây truyền chủ động: (bào tử hữu tính từ quả thể đĩa, quả thể bầu tự phóng vào không khí). Lây truyền thụ động: Bào tử nấm lan truyền theo: - Mưa và nước tưới làm bắn bào tử tung tóe (bào tử nấm Colletotrichum) - Gió, bão thổi bào tử nấm đi xa (bào tử nấm phấn trắng, rỉ sắt) - Côn trùng mang truyền bào tử (ví dụ: Bọ cánh cứng Carpophilus spp) - Các yếu tố lan truyền khác (tàn dư, đất, hạt giống, cây giống, vật liệu làm giống, động vật và con người). 1.5 Rhizoctonia solani. 1.5.1 Vị trí phân loại. Vào 1858, Julius Kuhn đã phân lập được nấm Rhizoctonia solani trên rễ cây khoai tây và đã mô tả nó. Hệ thống phân loại: - Giới: Nấm thật.(fungi). - Ngành: Deuteromycotina (nấm bất toàn). - Lớp: Mycelia Sterilia (Agonomycetes): Nấm trơ. - Bộ: Myceliales (Agonomycetales). - Họ: Myceliaceae (Agonomycetaceae). - Chi: Rhizoctonia. - Loài: Rhizoctonia solani. Rhizoctonia solani là loài lớn nhất của giống Rhizoctonia. Bệnh phát sinh trên cổ rễ và rễ. Vết bệnh đầu tiên là những vết màu nâu sáng, sau phát triển và làm thắt cổ rễ. Đối với Rhizoctonia solani cũng như các loài khác của Rhizoctonia, chúng không tạo bào tử phân sinh và rất hiếm tạo bào tử đảm. Rhizoctonia solani sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ từ 280C – 320C, là loại chuyên kí sinh, có phổ kí chủ rộng trên 180 loài khác nhau: lúa, đại mạch, ngô, mía, đậu, rau, dâu, rau cải họ thập tự,… Theo (Khangua, R.K, Barbetti, M.J và Sweetngham 1999), nấm Rhizoctonia solani được phân lập gồm 6 nhóm: 54%ZG5 (AG2-1), 8%ZG6 (AG2-1), 1%ZG9 (AG10), 12%CZG1 (CAG1), 4%CZG4, 6%CZG5 (AGK). Trong đó, nhóm ZG1 và ZG5 gây nhiễm cao, làm giảm khả năng mọc của cây con và là nguyên nhân gây lỡ cổ rễ rất nghiêm trọng. Nhóm ZG5 có khả năng gây nhiễm cao ở hầu hết các loài cây trồng đặc biệt là các loài cây họ thập tự. 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nấm Rhizoctonia trên cây trồng. Ở nước ta bệnh do nấm Rhizocotnia solani Kuhn được nghiên cứu khác chi tiết trên cây lúa từ những năm 30 của thế kỉ 20 (Vicens (1921), Bougnicourt (1935), Đường Hồng Dật (1958)). Theo Phạm Văn Lợi (1991) các nguồn nấm Rhizoctonia solani được thu thập từ cá nguồn ở những nơi khác nhau có sự khác biệt về khả năng sinh trường trên các môi trường nhân tạo, nhiệt độ và khả năng gây bệnh,… Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), Rhizoctonia solani Kuhn là nấm gây bệnh hại phổ biến ở các vùng trồng trọt trên thế giới. Bệnh làm chết cây con hàng loạt, là nguyên nhân gây nên các bệnh như: thối gốc, lở cổ rễ, thối nhũn, thâm đen,… gây hại nặng trong giai đoạn vườn ươm và sản xuất. 1.5.3 Đặc điểm. Các sợi nấm sinh dưỡng dễ dàng quan sát trên môi trường nhân tạo khi còn non không có màu, nhưng khi khuẩn lạc phát triển và trưởng thành có màu nâu. Sợi nấm trưởng thành có thành dầy màu nâu, các tế bào sợi nấm có dạng hình ống kết hợp lại thành những cấu trúc rắn chắc khô, cứng, gọi là hạch nấm, nhìn dược bằng mắt thường, hạch nấm và sợi nấm tồn tại trong đất và trong các tàn dư trong vườn là nguồn lan truyền bệnh. Nấm Rhizoctonia solani Kuhn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ từ 280 – 320C, nhiệt độ thấp hơn 100C và cao hơn 380C thì nấm ngừng sinh trưởng, hạch nấm hình thành ở nhiệt độ từ 300C – 320C, khi nhiệt độ thấp hơn 100C và cao hơn 400C thì nấm không hình thành hạch nấm. Theo Nguyễn Văn Tường và các cộng sự (1996) thì nấm Rhizoctoni solani Kuhn có khả năng tấn công gây hại trên tất cả các bộ phận của cây. 1.5.4 Phân lập. Nấm bệnh có thể được phân lập dễ dàng từ mẫu bệnh khô vằn lúa, khô vằn ngô và thối bắp cải bằng cách khử trùng bề mặt mô bệnh, cấy lên môi trường thạch nước cất và cấy truyền lên môi trường thạch đường khoai tây có bổ sung kháng sinh. Việc phân lập từ rễ hoặc rễ con bị thối khó khăn hơn: 1. Rửa rễ cho sạch đất. 2. Khử trùng bề mặt trong cồn êtylic 70% trong 5 giây. 3. Rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. 4. Cấy các mẩu rễ nhỏ (1 - 2 mm chiều dài) cắt từ ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe lên môi trường thạch nước cất. 5. Cấy truyền lên môi trường thạch đường khoai tây. Rhizoctonia có thể phân biệt được với Pythium và Phytophthora trên môi trường thạch nước cất bằng đặc điểm hình thái sợi nấm phân nhánh vuông góc và sự có mặt của các sợi nấm sợi lớn có vách ngăn. Hạch nấm có thể hình thành trong môi trường nhân tạo, đặc biệt trên môi trường thạch thân lúa. 1.5.5 Các bệnh do Rhizoctonina gây ra trên cây trồng. Ở Việt Nam có nhiều bệnh do Rhizoctonia gây ra (Hình 1.11). Một số loài phát triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm, mưa hoặc ẩm độ cao. Ví dụ, một loài Rhizoctonia xâm nhiễm vào lá ngô và gây ra triệu chứng bệnh khô vằn điển hình trên lá (Hình 1.11d). Người ta cho rằng cũng loài đó, hoặc một loài tương tự, gây thối bắp cải bắp. Những nấm này có thể sinh ra các hạch nấm màu nâu với hình dạng bất định trên bề mặt cây bị bệnh. Rhizoctonia oryzae gây bệnh khô vằn trên lúa, một bệnh rất phổ biến. Các loài Rhizoctonia cũng gây hiện tượng lở cổ rễ cây con như đậu cô ve, cải bắp, lạc và bông. Triệu chứng lở cổ rễ do nấm xâm nhiễm ở phần cổ rễ sát mặt đất có thể làm chết cây con. Bệnh thối rễ Rhizoctonia hình thành do nấm xâm nhập vào cây ở đỉnh sinh trưởng của các rễ phụ nhỏ. Nấm sau đó phát triển từ đầu rễ và lan vào rễ chính làm thối rễ. Rhizoctonia xâm nhiễm ở đỉnh sinh trưởng của rễ con thường đưa đến triệu chứng “đầu mác” ở rễ (Hình1.11a). Hình 1.11. Các ví dụ về bệnh do Rhizoctonia: (a) triệu chứng nhọn như “đầu mác” ở rễ bệnh. (b) bệnh khô vằn trên lúa do Rhizoctonia. (c) hạch nấm của Rhizoctonia trên cải bắp bị bệnh. (d) bệnh do Rhizoctonia trên vỏ ngô. - Triệu chứng chính: Các triệu chứng phụ thuộc vào loài, chủng nấm và cây ký chủ, bao gồm lở cổ rễ cây con, héo, chết cây con, thối rễ con và thối rễ. Thối bắp cải do Rhizoctonia gây ra những vết thối đen trên lá. Bệnh khô vằn lúa và khô vằn ngô gây ra các vết bệnh màu vàng và các vết mất màu bất thường xen kẽ. - Dấu hiệu chẩn đoán: phụ thuộc vào quá trình phân lập và giám định nấm thuần trên môi trường nhân tạo. Các hạch nấm điển hình màu nâu, hình dạng bất định được hình thành ở một số loài trên các mô ký chủ bị bệnh. - Phổ ký chủ: đa dạng, tùy thuộc loài và chủng nấm. - Thời tiết: các bệnh ở cây con và thối rễ lại gây hại nặng hơn trên cây trồng ảnh hưởng bởi những điều kiện thời tiết không thuận lợi. Ví dụ, cây con đậu cô ve dễ mẫn cảm với bệnh lở cổ rễ khi trời lạnh vì nhiệt độ thấp làm chậm việc nảy mầm và nhú chồi. - Bảo tồn: các loài Rhizoctonia tồn tại trong đất dưới dạng hạch nấm hoặc sợi nấm trong tàn dư cây ký chủ. - Xâm nhiễm: sợi nấm Rhizoctonia trong tàn dư cây bệnh xâm nhiễm trực tiếp vào mô cây và một số tạo các cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt. Hạch nấm nảy mầm tạo ra sợi nấm xâm nhiễm vào cây. - Phòng trừ: bệnh chết rạp cây con (lở cổ rễ) có thể được giảm thiểu bằng cách xử lý hạt với thuốc trừ nấm như Quintozene (pentachloronitrobenzene) và thay đổi thời vụ (ngày) trồng sao cho nhiệt độ và độ ẩm đất có lợi cho nảy mầm và nhú chồi nhanh. Hiệu quả của việc luân canh tùy thuộc vào phổ ký chủ của các loài Rhizoctonia là đối tượng phòng trừ. 1.5.6 Bệnh chết rạp (bệnh lở cổ rễ) do Rhizoctonia solani. 1.5.6.1 Bệnh chết rạp (chết ẻo hay bệnh lở cổ rễ). Bệnh phân bố rộng rãi, bệnh gây hại phổ biến ở nhiều nước trên thế giới và cả ở nước ta. Bệnh phá hoại suốt thời kì sinh trường của cây nhưng chủ yếu là vào giai đoạn cây con. Bệnh làm cây con chết hàng loạt, có khi phải gieo trồng lại toàn bộ, làm mất nhiều thời gian và công chăm sóc. 1.5.6.2 Triệu chứng. Biểu hiện đặc trưng nhất của bệnh là: rễ, cổ rễ và gốc thân sát mặt đất bị thâm đen, thối mục, cây bị héo, đổ gục xuống. Lúc đầu vết bệnh chỉ là một chấm nhỏ màu đen ở gốc thân, cổ rễ, sau đó lan ra rất nhanh bao bọc quanh cổ rễ. Bộ phận bị bệnh thối mục có màu nâu đen, ủng nước hoặc hơi khô, cổ rễ teo tóp, lá thân bị héo rũ nhưng vẫn còn màu xanh. Sau 5 – 6 ngày, cây héo rũ đổ gục và chết hàng loạt. Trên vết bệnh ở cổ rễ thối nhũng hình thành một lớp nấm màu trắng xám, có hạch nấm màu nâu đỏ, hình tròn dẹt, nằm rãi rác hoặc thành từng đám. Nhổ cây lên thường bị đứt ở gốc thân hoặc cổ rễ. 1.5.6.3 Đặc điểm phát sinh bệnh. Bệnh lở cổ rễ (chết rạp) ngoài nấm Rhizoctonia, một số loài nấm khác như: Thielaviopsis hoặc Fusarium… cũng có thể gây bệnh. Bệnh phát sinh trong điều kiện độ ẩm cao (mưa phùn), mưa nhiều, đất bị ẩm, và nhiệt độ thấp 18 – 250C, hoặc thời tiết nóng lạnh thất thường. Khi nhiệt độ trên 250C, khả năng gây bệnh giảm nhiều, khi nhiệt độ trên 300C thì cây ít khi bị bệnh. Bệnh thường gây hại nặng nề trên những vùng đất trũng, ứ đọng nước. Đất thịch dẽ chặt, dễ đóng váng sau khi mưa. Mặt khác, trên những loại đất này, thì cây trồng cũng sinh trưởng yếu nên sức chống chịu bị giảm đi. Sự phát triển của bệnh ngoài việc liên quan nhiều về nước còn có liên quan đền chế độ bón phân. Trong canh tác, nếu chúng ta bón phân không cân đối, bón phân quá nhiều đạm cũng góp phần làm gia tăng nguy cơ nhiễm bệnh, do đó, nên bón phân cân đối, đặc biệt bón thêm Kali có tác dụng làm cây cứng cáp làm giảm mức độ nhiễm bệnh. Ngoài ra, bệnh còn phát triển mạnh do làm không tốt các khâu trong kĩ thuật trồng cây: làm đất không tốt, hạt gieo quá sâu, sử dụng hạt giống có chất lượng kém, sức nảy mầm thấp hoặc độc canh một loại cây trồng trong nhiều năm liên tiếp. 1.5.6.4 Các biện pháp phòng trừ hiện nay. Bệnh lở cỗ rễ do các loại nấm trong đất đặc biệt là Rhizoctonia solani gây ra, bệnh chủ yếu tấn công vào cây con nên để phòng trừ bệnh này ta cần áp dụng một số biện pháp phòng trừ như sau: - Làm đất kĩ, lên luống cao, san phẳng mặt luống không để ứ đọng nước. - Sử dụng hạt giống tốt, có sức nảy mầm cao, không nên gieo hạt giống quá sâu. Nên xử lý hạt giống bằng thuốc trước khi gieo và phun thuốc khi bệnh mới vừa xuất hiện. - Luân canh nhiều loại cây trồng, không nên độc canh một loại cây nào đó. - Gieo trồng đúng thời vụ với từng loại cây trồng. - Bón phân thích hợp, cân đối. Chú ý, phải làm đất, bón lót bằng phân hữu cơ và vôi trước khi gieo trồng. Tránh bón phân quá nhiều đạm. - Có thể dùng thêm các loại thuốc sau để phòng trừ: Ridomil MZ72 WB, Topsin M, Rovral,… theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. - Đặc biệt, nên sử dụng các chế phẩm sinh học (Trichoderma). Phần 2: PHẦN THỰC NGHIỆM. 2.1 Các dụng cụ - phương tiện thí nghiệm. 2.1.1 Dụng cụ - thiết bị. + Bình xịt thuốc lọai 0.5l và 2.5l. + Khay xốp. + Ống nghiệm các loại. + Erlen các loại. + Dĩa Petri. + Bếp đun. + Đèn cồn. + Máy đo quang phổ tử ngoại. + Máy đo OD. 2.1.2 Hóa chất. + Acetone 80%. + Cloroform. + Nước cất. + Cồn 700 và 900. 2.1.3 Vật liệu thí nghiệm. + Cải xanh. 2.1.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo. Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Việc lây bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để: • Khẳng định một sinh vật nào đó được phân lập là tác nhân gây bệnh (theo quy tắc Koch). • Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh. • Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh. Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên - các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh. Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm: • Nhiệt độ. • Độ ẩm. • Dinh dưỡng. • Nguồn bệnh (quá ít hoặc quá nhiều) • Các điều kiện trồng nói chung. Nếu tất cả thí nghiệm và công thức lây bệnh đều được bố trí các công thức đối chứng (không lây bệnh) để so sánh với các công thức được lây bệnh, ảnh hưởng của những yếu tố này có thể được đo và giải thích. Công thức đối chứng cũng là một phương tiện để so sánh và có thể làm nổi bật các thiếu sót trong thí nghiệm nếu có. Một phần quan trọng của việc chẩn đoán bệnh là việc tái tạo bệnh trong quá trình lây bệnh nhân tạo nhằm hoàn tất các quy tắc Koch. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm (Bảng 2.1). Bảng 2.1: Phương pháp lây nhiễm thích hợp. 2.1.4.1 Lây bệnh vào đất. Có thể lây bệnh trực tiếp vào đất bằng dung dịch bào tử lấy từ môi trường thuần hoặc từ sinh khối vi sinh vật gây bệnh được nhân trong bình tam giác (Hình 2.1). Dịch bào tử nấm hoặc dịch khuẩn có thể được tưới vào đất sau khi nảy mầm sao cho chúng được tiếp xúc trực tiếp với hệ thống rễ. Phương pháp này được thực hiện để lây bệnh nhanh ban đầu. Hỗn hợp Lớp mỏng Dịch bào tử Hình 2.1 Các phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng cách đưa vi sinh vật vào đất. Một quá trình lây nhiễm tự nhiên hơn được thực hiện bằng phương pháp hỗn hợp hoặc phương pháp lớp mỏng. Cả hai phương pháp này đều yêu cầu nhân sinh khối nguồn bệnh trên một giá thể tự nhiên, như hạt kê hoặc vỏ trấu. Việc nhân sinh khối mẫu cấy trên các giá thể này trong bình tam giác cần thời gian khoảng 2-3 tuần. Một lượng sinh khối nguồn bệnh tiêu chuẩn được dùng cho cả hai phương pháp. Tuy nhiên do tác nhân gây bệnh được đưa vào đất cùng thời điểm trồng cây nên cây có thể nhiễm bệnh khi còn ở giai đoạn cây con - việc này có thể gây ra các kết quả sai lệch nếu mục đích của lây bệnh nhân tạo là để tái tạo bệnh trên cây trưởng thành. 2.1.4.2 Chuẩn bị nguồn bệnh cho quá trình lây bệnh nhân tạo. Dịch bào tử. Chuẩn bị nguồn nấm bệnh cho việc tạo dịch bào tử bằng cách nuôi nấm trên môi trường thạch nước cất chứa hạt, mẩu thân hoặc lá đã khử trùng, trên môi trường thạch lá cẩm chướng, hoặc trên môi trường thạch đường khoai tây. Một cách đơn giản là cạo các bào tử và sợi nấm ra khỏi đĩa cấy và cho vào nước vô trùng. Dịch bào tử này có thể được đổ lên trên đất. Môi trường lúa/cám (thể tích 50:50). 1. Ngâm hạt lúa trong nước vài giờ để hạt ngấm nước. 2. Chắt bỏ phần nước, trộn cám vào, cho thêm nước. 3. Cho khoảng 150ml giá thể vào một bình tam giác thể tích 250 ml. 4. Cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn để nút chặt miệng bình tam giác. Hình 2.2 Bình lúa/cám. 5. Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng 6. Để bình nguội. 7. Cấy các miếng thạch có sợi nấm hoặc dịch bào tử vào giá thể trong bình tam giác, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. 8. Đặt các bình tam giác ở nhiệt độ khoảng 250C trong 2 tuần trong điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình nhân sinh khối nấm trên giá thể. 9. Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể. 2.2 Quá trình thí nghiệm – kết quả. Hình 2.3 Bịch hạt giống. Cải dùng làm thí nghiệm được trồng từ hạt giống mua ở công ty Gino. Được trồng trong các khay xốp, giá thể để trồng là xơ dừa trộn với đất và phân trùng quế. Hình 2.4 Khay xốp trồng cải. Tiến hành trồng cải trong 4 khay xốp khác nhau (K1, K2, K3, K4) với mật độ vừa phải và theo hướng dẫn của nhà cung cấp và một số tài liệu tham khảo được. Hình 2.5 Cải dùng làm thí nghiệm. Trong 5 ngày đầu (từ khi hạt được gieo cho đến khi nảy mầm) cây được tưới nước mỗi ngày. Sau đó cây cải được tưới nước cách nhật (1 ngày tưới – 1 ngày ngưng). Các cây cải sau khi trồng được 15 ngày, cây có chiều cao khoảng 5cm, tiến hành phun riêng các hóa chất Na-Glutamat, K-Glutamat và Mg-Glutamat (với nồng độ 0.5 g/l) trên 3 khay khác nhau (K1, K2, K3) và 1 đối chứng (K4) không phun hóa chất gì cả. Sau 3 ngày phun thuốc, tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng nấm Rhizoctonia Solani (được nhân giống từ trước) vào 3 khay đã phun hóa chất (K1, K2, K3) và 1 khay đối chứng (K4). Sau vài ngày, các cây cải đã có dấu hiệu xuất hiện bệnh. Ta tiến hành chọn ngẫu nhiên một số cây mang đi phân tích môt số chỉ tiêu sau: 2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hàm lượng Chlorophyll. - Bố trí thí nghiệm: Các mẫu lá (5 lá) được lấy một cách ngẫu nhiên, sau đó cắt mỗi lá một phần nhỏ và cân đủ 25 mg. Các mẩu lá được lấy theo sơ đồ như sau: Khay trồng cải. Các vị trí lấy mẫu. 50 cm. 27 cm. Hình 2.6. Sơ đồ các vị trí lấy mẫu. - Mô tả thí nghiệm: Phương pháp đo Chlorophyll (Arnon D. I, 1949). - Mỗi nghiệm thức lấy 10 mẫu. Mỗi mẫu cân 25 mg lá (lá xanh tốt) và cắt nhuyễn. Cho từng mẫu vào ống nghiệm, sau đó dùng pipet 10 ml hút và cho vào mỗi ống nghiệm 10 ml aceton 80%. Đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc và nilon và để các mẫu không tiếp xúc ánh sáng trong 72 giờ. - Đồng thời cân mỗi nghiệm thức 10 mẫu lá có trọng lượng mỗi mẫu là 25 mg. Gói giấy và đem sấy khô ở nhiệt độ 800C trong 72 giờ. Suy ra trọng lượng khô trung bình A của mỗi mẫu đo Chlorophyll. - Sau 72 giờ, mang đi đo mật độ quang của từng ống nghiệm ở 2 bước sóng 645 nm và 663 nm bằng máy đo quang phổ. - Hàm lượng chlorophyll a và b được tính theo công thức sau: + Chl a (mg/g TLK lá) = + Chl b (mg/g TLK lá) = + Chl a+b (mg/g TLK lá) = + Tỷ lệ Chlorophyll a/b = Chl a / Chl b. - Trong đó: mA: Trọng lượng khô của lá. Chl a: Chlorophyll a. Chl b: Chlorophyll b. - Chỉ tiêu ghi nhận: các số liệu đo được dùng để đánh giá mối tương quan về hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll b trong các nghiệm thức. 2.2.2 Thí nghiệm 2: Đo quang phổ tử ngoại. - Bố trí thí nghiệm: Các lá đuợc lấy một cách ngẫu nhiên như sơ đồ lấy mẫu ở (hình 2.6). - Mô tả thí nghiệm: Cân 1g lá, giã nhuyễn cho thêm 10ml nước cất, lọc và cho vào ống nghiệm, sau đó mang đi đo. Về thí nghiệm này, các kết quả được đo bằng máy chuyên dụng, và được xử lí bằng một phần mềm chuyên dụng riêng. Quá trình đo quang bằng máy chuyên dụng, sinh viên thực tập không được sử dụng máy, chỉ được đứng quan sát. Quá trình xử lí số liệu của kết quả đo này thì vô cùng phức tạp và phải dùng phần mềm chuyên biệt, sinh viên thực tập không có được. Sau khi có kết quả đo, số liệu sau đó được KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn thực tập chính của chúng tôi) xử lí riêng sau đó đưa kết quả (ở phần 3) cho chúng tôi. Sau đó, ông (KS. HỨA QUYẾT CHIẾN) đã hướng dẫn chúng tôi đọc các kết quả và rút ra kết luận từ các số liệu này. + Protein = 1552*A280 – 757.3*A260 (µg/ml). + Axit Nucleic = -36*A280 + 62.9*A260 (µg/ml). Trong đó: A280 và A260 là cường độ thu được ở bước sóng 280 nm và 260 nm. - Chỉ tiêu ghi nhận: Ghi nhận sự thay đổi về hàm lượng Protein và Axit nucleic có trong các nghiệm thức. Phần 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ. 3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hàm lượng Chlorophyll. Thực vật là những sinh vật có khả năng tạo cho mình những chất dinh dưỡng từ những hợp chất vô cơ đơn giản và tổng hợp thành những phần tử phức tạp nhờ quá trình quang hợp. Quá trình quang hợp sử dụng năng lượng của ánh sáng mặt trời được hấp thụ bởi chất diệp lục (Chlorophyll), phân tách nước thành hydro và oxy sau đó tổng hợp thành các chất hữu cơ - chất dinh dưỡng phục vụ cho bản thân chúng và hầu hết các sinh vật trên trái đất, đồng thời tạo ra oxy và thiết lập sự cân bằng Oxy-Nitơ-Cacbonic cho bầu khí quyển. Cấu trúc hóa học của Chlorophyll gần giống Hemoglobin ở máu người, cũng gồm 4 nhóm heme gắn với một nguyên tố kim loại, ở người là nguyên tố sắt, còn ở thực vật và tảo, nguyên tố Magnesium thay thế cho nguyên tố Sắt. Người ta còn gọi chất diệp lục (Chlorophyll) là máu của thực vật. Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của Chl a và Chl b. Tác dụng chính yếu của Chlorophyll là phân tách nước, một số hợp chất vô cơ đơn giản mà thực vật hút từ đất, tạo ra Hydro, Oxy, hình thành ATP là nguồn năng lượng hoạt động quan trọng của sinh vật và NADPH - các nguyên liệu để tạo ra các chất đạm, dinh dưỡng cho thực vật. Do có tác dụng tạo ra nguyên tử Oxy bề mặt mà Chlorophyll có tác dụng diệt khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí. Về cơ bản công thức hóa học của 2 loại Chlorophyll chỉ khác nhau ở gốc -CH3 (của Chl a) và gốc –CH=O (của Chl b). Diệp lục có khả năng hấp thu rất mạnh các tia sáng có bước sóng xác định. Chl a có đỉnh hấp thu ở bước sóng λ= 410 nm, 429 nm ở ánh sáng xanh và 660 nm ở ánh sáng đỏ. Chl b có đỉnh hấp thu ở bước sóng λ= 430 nm, 453nm ở ánh sáng xanh và 642 ở ánh sáng đỏ. - Kết quả thí nghiệm: hàm lượng Chlorophyll được ghi nhận ở bảng 3.1: Bảng 3.1 Kết quả đo OD ở 2 bước sóng 645 nm và 663 nm. Bước sóng Hóa chất 645 nm 663 nm BT 0.245 0.562 K 0.181 0.429 Na 0.202 0.559 Mg 0.191 0.426 . + BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. + Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. Hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll b sau khi tính bằng các công thức trên, ta có bản sau đây: Ta chỉ tính hàm lượng Chlorophyll mẫu làm thí nghiệm. Bảng 3.2. Hàm lượng Chlorophyll trong các cây cải thí nghiệm. Chl a (mg) Chl b (mg) Chl a + Chl b Chl a / Chl b BT 6.47835 2.98034 9.47829 2.17 Na 6.55592 2.00968 8.58176 3.26 K 4.96141 2.13718 7.11307 2.32 Mg 4.89641 2.38022 7.29191 2.06 + BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. + Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. Biểu đồ 3.1 Hàm lượng Chl a và Chl b trong từng mẫu thí nghiệm. Ở đây, ta chỉ tính hàm lượng của Chlorophyll a và Chlorophyll b trong lá, vì trong các kết quả của thí nghiệm này ta chỉ quan tâm đến hàm lượng của các loại Chlorophyll mà thôi, không quan tâm đến kết quả Chlorophyll /TLK của lá. Trong kết quả của thí nghiệm này, ta thấy: + Hàm lượng Chl a trong cả thí nghiệm và đối chứng đều cao hơn nhiều so với Chl b. + Hàm lượng Chl a trong mẫu có phun Natri Glutamat gần bằng với hàm lượng Chl a trong mẫu đối chứng (BT). + Hàm lượng Chl a trong mẫu có phun Kali Glutamat và Mg Glutamat thì gần như nhau và thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng (BT). + Trong khi đó, hàm lượng Chl b trong các mẫu có phun thuốc thì thấp hơn nhiều so với mẫu BT, trong đó, mẫu có phun Natri Glutamat có hàm lượng thấp nhất và mẫu có phun Mg Glutamat thì lại có hàm lượng cao nhất. Nhưng nếu chúng ta xét về tổng thể, có thể thấy rằng hàm lượng Chlorophyll tổng cộng (Chl a + Chl b) trong mẫu (BT) là cao nhất (9.47829 mg) và trong mẫu (K) là thấp nhất (7.11307 mg). 3.2 Thí nghiệm 2: Đo quang phổ tử ngoại. - Kết quả thí nghiệm: khi tiến hành đo quang phổ tử ngoại ở vùng bước sóng của ánh sáng tử ngoại ta thu được các cường độ ở các bước sóng như (bảng 3.3) Bảng 3.3 Cường độ thu được ở các bước sóng. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A260 nm 0.28913 0.18475 0.58852 0.16855 A280 nm 0.39337 0.3166 0.79952 0.4479 A320 nm 3.2191 1.6377 3.5421 2.4438 A340 nm 2.8624 1.3591 3.1894 2.0676 A360 nm 1.8604 0.8311 2.3912 1.3212 A380nm 1.0282 0.45263 1.7192 0.75532 Trong đó: + BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. + Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. + A: bước sóng. (nm). Áp dụng công thức xác định nồng độ (µg/ml) Protein và Axit nucleic: + Protein = 1552*A280 – 757.3*A260 (µg/ml). + Axit Nucleic = -36*A280 + 62.9*A260 (µg/ml). ta được kết quả như bảng 3.4 Bảng 3.4 Nồng độ Protein và axit nucleic. Nồng độ Hóa chất Protein (µg/ml). Axit nucleic (µg/ml). BT 392.064251 4.013077 K 795.168844 8.235188 Na 351.452025 0.223175 Mg 567.497885 Không xác định. Trong kết quả thí nghiệm này, ta thấy các mẫu cây cải lấy từ nghiệm thức có phun Kali Glutamat lại có sự khác biệt lớn với các nghiệm thức còn lại. Nồng độ (µg/ml) Protein và Axit Nucleic cao gần như gấp đôi so với mẫu đối chứng (BT). (dựa vào bảng 3.4 , hình 3.4 , hình 3.5 ) Biểu đồ 3.2 Nồng độ (µg/ml) Protein. Biểu đồ 3.3 Nồng độ (µg/ml) Axit nucleic. Với nghiệm thức được phun Mg Glutamat, nồng độ Protein tuy có cao nhưng nồng độ Axit nucleic lại không xác định được. Do đó, ta không thể có kết luận về tác dụng tích cực của hóa chất Mg Glutamat này. Với nghiệm thức được phun Na Glutamat, so với các nghiệm thức còn lại, kể cả so với nghiệm thức đối chứng (BT), nồng độ (µg/ml) Protein thì bằng so với đối chứng (BT), nhưng nồng độ (µg/ml) Axit Nucleic thì lại quá thấp và thấp hơn nhiều so với đối chứng (BT). Do đó, có thể thấy tác dụng của Na Glutamat là không đáng kệ trong thí nghiệm này. Lúc này ta xét riêng cường độ thu được ở các bước sóng khác nhau: Ứng với các bước sóng khác nhau, sẽ là các chất khác nhau. + Ở bước sóng 260 nm. Bảng 3.5 Cường độ thu được ở bước sóng 260 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A260 nm 0.28913 0.18475 0.58852 0.16855 Biểu đồ 3.4 Cường độ thu được ở bước sóng 260 nm. Ở bước sóng này: + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat là cao nhất cao gấp đôi so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat gần như nhau. + Ở bước sóng 280 nm. Bảng 3.6 Cường độ thu được ở bước sóng 280 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A280 nm 0.39337 0.3166 0.79952 0.4479 Biểu đồ 3.5 Cường độ thu được ở bước sóng 280 nm. Ở bước sóng này: + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat là cao nhất cao gấp đôi so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat cao hơn Natri Glutamat một ít. + Ở bước sóng 320 nm. Bảng 3.7 Cường độ thu được ở bước sóng 320 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A320 nm 3.2191 1.6377 3.5421 2.4438 Biểu đồ 3.6 Cường độ thu được ở bước sóng 320 nm. Ở bước sóng này: có sự thai đổi so với các bước sóng ở trên: + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, nhưng không còn cao hơn nhiều so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat đã thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat nhưng đã có sự chênh lệch lớn. + Ở bước sóng 340 nm. Bảng 3.8 Cường độ thu được ở bước sóng 340 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A340 nm 2.8624 1.3591 3.1894 2.0676 Biểu đồ 3.7 Cường độ thu được ở bước sóng 340 nm. Ở bước sóng này: kết quả cũng tương tự như ở bước sóng 320 nm. + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, nhưng không còn cao hơn nhiều so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat đã thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat nhưng đã có sự chênh lệch lớn. + Ở bước sóng 360 nm. Bảng 3.9 Cường độ thu được ở bước sóng 360 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A360 nm 1.8604 0.8311 2.3912 1.3212 Biểu đồ 3.8 Cường độ thu được ở bước sóng 360 nm. Ở bước sóng này: kết quả cũng tương tự như ở bước sóng 340 nm. + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, nhưng không còn cao hơn nhiều so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn cả so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat đã thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat nhưng sự chênh lệch đã giảm đi. + Ở bước sóng 380 nm. Bảng 3.10 Cường độ thu được ở bước sóng 380 nm. Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A380nm 1.0282 0.45263 1.7192 0.75532 Biểu đồ 3.9 Cường độ thu được ở bước sóng 380 nm. Ở bước sóng này: kết quả lại có sự thai đổi, kết quả này lại tượng tự so với kết quả đo được ở các bước sóng ngắn (260 nm và 280 nm). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Kali Glutamat vẫn cao nhất, cao gần gấp đôi so với đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Natri Glutamat là thấp nhất. Thấp hơn rất nhiều so với đối chứng (BT). Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat và Natri Glutamat vẫn thấp hơn đối chứng (BT). + Cường độ đo được ở nghiệm thức được phun Mg Glutamat vẫn cao hơn Natri Glutamat, sự chênh lệch này đã tăng lên.. Phần 4: KẾT LUẬN. Sau 3 tháng làm đồ án tốt nghiệp, các kết quả thí nghiệm được lặp lại 3 lần với cùng một thí nghiệm, chúng tôi nhận được các kết quả tương tự nhau. Do đó, có thể các kết quả thí nghiệm này sẽ chứng tỏ cùng một kết quả. Hình 4.1 Quá trình biến đổi Glutamat thành Glutamin. Qua 3 lần làm thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng: các cây cải thường bị bệnh nhất vào giai đoạn cây được 10 – 15 ngày tuổi. Các cây được chọn làm thí nghiệm cũng được lấy trong giai đoạn này. Trong giai đoạn cây bị bệnh, các cây cải bị chết rất nhiều, nhưng nếu cây sống được qua 20 – 25 ngày tuổi thì cây vẫn phát triển bình thường. Cây vẫn lớn. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng khay (K4) (khay làm thí nghiệm được cho lây nhiễm nhân tạo, nhưng không phun thuốc mà chỉ tưới nước) có tỉ lê cây chết nhiều hơn, những cây còn sống sót qua 25 ngày tuổi còn ít hơn những khay làm thí nghiệm còn lại. Do đó, có thể các loại glutamat đã có tác dụng ở một mức độ nào đó kiềm hãm việc gây chết do bệnh lở cổ rễ gây ra. 4.1. Kết luận về hàm lượng Chlorophyll. Trong các thí nghiệm trên, chúng ta nhận thấy rằng hàm lượng Chl a, Chl b, và Chl tổng số trong nghiệm thức có sử dụng các loại Glutamat thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (BT). Trong đó, nghiệm thức sử dụng Kali Glutamat là cho các kết quả thấp nhất. Điều này, chúng ta không thể kết luận được hiện tượng gì, do đó, chúng ta có quyền “nghi ngờ” rằng Kali Glutamat có một tác dụng gì đó. Do chưa có kết luận cụ thể trong thí nghiệm này, chúng ta chỉ đang “nghi ngờ” một tác dụng nào đó của Kali Glutamat nên ta tiến hành tiếp thí nghiệm 2. 4.2 Kết luận về kết quả đo quang phổ tử ngoại. Dựa vào số liệu sau khi được KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn thực tập chính của chúng tôi) xử lí riêng sau đó đưa kết quả (ở phần 3) cho chúng tôi. Sau đó, ông (KS. HỨA QUYẾT CHIẾN) đã hướng dẫn chúng tôi đọc các kết quả và rút ra kết luận từ các số liệu này. Trong quá trình cây bị bệnh, các quá trình xảy ra trong cây có thể bị biến đổi, các chất có thể bị phá hủy nhanh hơn, trong đó protein sẽ bị phân hủy nhanh hơn do các quá trình khác tăng lên (GS. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề). Khi protein bị phân hủy nhanh sẽ tạo ra NH4+ (hay NH3 tự do) là chất gây độc cho cây. Dựa vào kết quả xử lí và ghi nhận được ở bảng 3.4: ta thấy rằng nồng độ Protein trong nghiệm thức sử dụng Kali Glutamat là cao nhất. Do đó, có thể Kali Glutamat đã góp phần vào việc hạn chế sự phân hủy nhanh protein trong các cây bị bệnh. Vì vậy, nếu các loại Glutamat có tác dụng “giải độc” thì Kali Glutamat cho kết quả tốt nhất. 4.3 Kết quả chung – kết luận. Dựa vào kết luận của 2 thí nghiệm trên, có thể thấy rằng Kali Glutamat là chất có khả năng nhất, có tác dụng lớn nhất trong việc hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra. Phần 5: KIẾN NGHỊ - HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Trong khoảng thời gian 3 tháng để thực hiện đề tài, khoảng thời gian ấy có thể không ngắn, nhưng cũng không dài cho một quá trình khảo sát, nghiên cứu khoa học. Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi đã gặp không ít khó khăn, nhưng nhờ sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn chính), CN. LÊ NGỌC THẠCH, CN. ĐỖ THỊ TUYẾN…, chúng tôi đã hoàn thành được các mục tiêu do thầy KS. HỨA QUYẾT CHIẾN đặt ra. Trong thời gian tới, chúng ta cần tiến hành điều tra, khảo sát để làm rõ hơn qui luật phát sinh và phát triển của bệnh này trên cây cải, từ đó có thể tìm ra cách phòng trừ tốt nhất. Tiếp tục thử nghiệm, khảo sát hiệu quả của các loại Glutamat khác, nhằm tìm ra loại Glutamat nào có khả năng, hiệu quả giải độc cao hơn Kali Glutamat trong quá trình khảo sát này. Tiếp tục một số thử nghiệm phức tạp hơn nhằm tìm ra được nguyên nhân của khả năng giải độc của Glutamat. Khả năng ứng dụng các hoạt chất sinh học đang có một tìm năng lớn, do đó, cần khảo sát khả năng này trên một số loài thực vật khác xem hiệu quả thu được như thế nào?? Có thể chúng ta phải tiến hành nhiều khảo sát hơn nữa, nhiều thí nghiệm hơn nữa để tìm ra những chất phụ gia bổ sung thêm vào có khả năng làm tăng lên hoạt tính giải độc của Glutamat.