Đồ án Khảo sát khả năng nhiễm Coliforms và E.coli trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận Bình Thạnh, TP. Hồ Chí Minh

phẩm (Bộ Y tế) cho biết, miếng bánh của thị trường nước giải khát Việt Nam còn khá nhiều đối với doanh nghiệp trong nước. (Nguyễn Thị Tuyết (2008), Giáo trình Thương phẩm hàng thực phẩm và đồ uống). Hiện nay, đa số người tiêu dùng đều hướng tới nhu cầu sử dụng những thực phẩm từ tự nhiên. Những sản phẩm này không chỉ có lợi cho sức khỏe mà còn thân thiện với môi trường. Nhiều doanh nghiệp Việt Nam sản xuất nước giải khát đang triển khai những sản phẩm với thành phần tự nhiên, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu thực tế của người dân trong nước. Trước sự thay đổi thị hiếu của thị trường, các doanh nghiệp sản xuất nước giải khát đã lập tức thay đổi cơ cấu sản xuất, đầu tư dây chuyền sản xuất ngày càng hiện đại, đồng thời nghiên cứu và cho ra đời những sản phẩm với hương vị mới. Các đại gia: Vinamilk, Tribeco, Wonderfarm, Number One… đã tung ra thị trường nhiều loại nước trái cây: táo, xoài, nho, mãng cầu, trà xanh, trà thảo mộc không đường dành cho người mắc bệnh tiểu đường hay không thích thức uống có đường...để đáp ứng nhu cầu khách hàng. Hiện các doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng vượt mức so với năm ngoái: Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn hiệu Fresh, Pepsi tăng 30% sản lượng nước giải khát không gas. Các nhà nhập khẩu cũng làm đa dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu: Ligo, Welch"s, Regain, Berri, Drwitt... Công ty Delta cũng khẳng định sẽ sản xuất nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên liệu có tác dụng thanh nhiệt: atisô, mía lau, sâm, bí đao...(Lê Văn Nam (2007), Thị trường đồ uống). 2.1.5. Mức độ vệ sinh an toàn của nước giải khát hiện nay Theo ông Nguyễn Thanh Phong cho biết, miếng bánh của thị trường nước giải khát Việt Nam còn khá nhiều đối với doanh nghiệp trong nước. Tuy nhiên, theo ông Phong, không vì thế mà doanh nghiệp Việt Nam lơ là việc nâng cao chất lượng, nhằm đem đến những sản phẩm tốt nhất cho người tiêu dùng. Sự cạnh tranh trên thị trường đồ uống ngày càng trở nên khốc liệt, đòi hỏi doanh nghiệp không ngừng đẩy mạnh nghiên cứu, nhằm đưa ra những sản phẩm mới có chất lượng cao. Chính vì thế, ngày càng nhiều các cơ sở sản xuất, các doanh nghiệp nước giải khát mọc lên. Bên cạnh những đại gia: Vinamilk, Pepsi, Tribeco, Coca Cola…luôn luôn tung ra thị trường những sản phẩm mới cạnh tranh, hạ giá thành, đáp ứng nhu cầu khách hàng. Tuy nhiên, không ít sản phẩm có giá cạnh tranh nhưng chất lượng “trời ơi”. Đầu tháng 05/2010, một sản phẩm nổi tiếng nước khoáng Joy của công ty TNHH Coca Cola Việt Nam đã xuất hiện nhiều mảng rêu màu xanh đen bằng đầu ngón tay út. Qua xác nhận của công ty cho thấy sản phẩm bị nhiễm mốc. Đến giữa tháng 05/2010, xuất hiện một mùi lạ trong nước uống Vĩnh Hảo, một thương hiệu uy tín. Đại diện công ty, sau khi lấy mẫu nước về phân tích xác nhận, đó là mùi hôi thối từ xác chết chuột. Và cũng gần đây ngày 20/05/2010, theo kết quả nghiên cứu Bang Virginia (Mỹ) đăng trên tạp chí Quốc tế Food Microbiology, 48% thức uống từ chiếc máy bán nước giải khát có chứa Coliforms và 11% chứa E.coli (có thể gây bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiểu, bệnh về hô hấp và viêm phổi…). Điều đó cho thấy khả năng thức uống này đã bị làm nhiễm bẩn. Những trường hợp nêu trên đều thuộc các thương hiệu nổi tiếng, thế còn những sản phẩm bán rong ngoài đường phố thì sao? Các sản phẩm nước uống đường phố hiện nay bày bán tràn lan mà không được kiểm soát. Các đợt thanh tra về loại nước uống đường phố cho thấy đa số các loại nước uống này bị nhiễm khuẩn rất cao, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Theo kết quả khảo sát 50 mẫu thực phẩm giải khát (tháng 07/2003) của Viện Y tế vệ sinh công cộng thành phố Hồ Chí Minh cho thấy: 75% mẫu sữa, 55% mẫu nước giải khát trái cây tươi không đạt tiêu chuẩn vi sinh vì trong đó có nhiều loại vi khuẩn như: C.perringens, Coliforms, E.coli, S.faecalis, Staphylococcus aureus, P.aeruginosa vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Trong số mặt hàng sử dụng nước đá có 93% sử dụng đá cây là loại đá chưa được kiểm soát nguồn nước xem có đạt tiêu chuẩn vệ sinh hay không. Hơn 47% điểm bán thức ăn, nước uống đường phố không che đậy, 27% điểm bán có thừa được sử dụng lại để bán tiếp cho ngày hôm sau. Kết quả cho biết: 29% khách hàng khi được hỏi đã bị đau bụng, ói mửa hoặc tiêu chảy sau khi ăn hay uống loại thức ăn đồ uống đường phố này và tỷ lệ nhập viện vì ngộ độ là 3,5%. Cũng trong một lần khảo sát mới đây của Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minh trên 400 người mua, 400 người bán thức ăn, đồ uống đường phố cho thấy: 85,7% là bán cố định trên vỉa hè, lề đường, 29% điểm bán gần các khu cống, rãnh, bãi rác hoặc nhà vệ sinh. (Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minh (7/2009), Báo cáo An toàn vệ sinh thực phẩm TP. Hồ Chí Minh). 2.2. Một số vi sinh vật liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm 2.2.1. Coliforms 2.2.1.1. Khái niệm Coliforms và Feacal coliforms (Coliforms phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Hay nói cách khác Coliforms có nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL). 2.2.1.2. Phân loại Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, Coliforms được chia thành 2 nhóm nhỏ là Coliforms và Coliforms phân. Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia với một loài duy nhất đó là E.coli, Klebsiella và Enterobacter. Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh khoảng 16 giờ, trong môi trường dinh dưỡng ở 440C. Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc từ thủy sinh hay từ đất, mọc nhanh ở 40C trong 3 – 4 ngày và trong 100C trong 1 ngày. Không mọc ở 410C, 440C ức chế hoàn toàn. 2.2.1.3. Đặc điểm a. Đặc điểm chung Coliforms là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong 24 – 48 giờ. b. Đặc điểm sinh hóa Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong môi trường canh BGBL. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol trong canh trypton. E.coli chính là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC + + - - (Indol +, Methyl Red +, Voges – Proskauer -, Citrate -). Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm Coliforms được thể hiện qua các thử nghiệm IMViC. Bảng 2.1: Tính chất sinh hóa của Coliforms Phản ứng Indol Methyl red Voges Proskauer Citrate Escherichia Citrobacter Klebsilla Enterobacter +(-) -(+) -(+) -(+) + + - - - - + + - + + + Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số là phản ứng dương tính và -(+): đa số là phản ứng âm tính. c. Đặc điểm nuôi cấy Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh BGBL. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 440C trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indol khi được ở 44,50C khoảng 24 giờ trong canh trypton. Coliforms phân được dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản…. E.coli chính là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC + + - - (Indol +, Methyl Red +, Voges – Proskauer -, Citrate -). 2.2.1.4. Vai trò của Coliforms trong thực phẩm Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi. 2.2.2. E.coli 2.2.2.1. Khái niệm Escherichia coli (E.coli) là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi hiện diện trong đường ruột của người và các loại động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên, có 5 dòng có thể gây bệnh cho người chẳng hạn rối loạn đường tiêu hóa và một số loài động vật. Chúng hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. 2.2.2.2. Phân loại Dựa vào đặc điểm gây bệnh gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh. E.coli được chia thành 5 nhóm: VTEC (Verotoxigenic E.coli) hoặc STEC (Shiga toxin – producing E.coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli), E.coli gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropathogenic E.coli), E.coli gây bệnh đường ruột. ETEC (Enterotoxigenic E.coli), E.coli sinh độc tố ruột. EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli), E.coli kết tập ở ruột. EIEC (Enteroinvasive E.coli), E.coli xâm lấn niêm mạc ruột. 2.2.2.3. Đặc điểm a. Đặc điểm chung E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước trung bình từ 0,5 x 1 – 3µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại không có động lực thì không có vỏ bao capsule. Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc: Lớp: Schgzomycetes Bộ: Eubacteriales Họ: Enterobacteriaceae Gống: Escherichia Loài: Eschierchia Coli Hình 2.1: Vi khuẩn Escherichia E.coli Escherichia coli còn có tên là Bacteriam colic được ông Theodor Eschrich nhà nghiên cứu người Đức phát hiện và phân lập năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em. b. Đặc điểm sinh hóa E.coli lên men sinh hơi lactose, glucose, manitol, galactose, không sinh hơi đường maltose, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin, glycogen. E.coli không sinh H2S, không tan chảy gelatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên nitrate thành nitrite. Phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác thông qua thử nghiệm IMViC: + + - -; phản ứng Indol dương tính (+), phản ứng Methyl Red (MR) dương tính (+), phản ứng Voges – Proskauer (VP) âm tính (-) và Citrate âm tính (-). c. Đặc điểm nuôi cấy E.coli là loại hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển từ 35 – 370C, nhưng có thể phát triển trên 400C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 nhưng pH tối ưu nhất từ 7,2 – 7,4. Trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) tạo khuẩn lạc tròn ướt (dạng S) sau 24 giờ, màu trắng đục hơi lồi, kích thước khoảng 2 – 3mm, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn (dạng R). Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β. Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methylen Blue) tạo khuẩn lạc có ánh kim tím. Trên môi trường Rapid có khuẩn lạc màu tím. Trên môi trường MacConkey (MCK) khuẩn lạc màu hồng đỏ. Trên thạch Gelatin không tan chảy. Trên môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron Agar: E.coli tạo acid/acid màu vàng/vàng. Trên môi trường Kliger Iron Agar (KIA) lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H2S. Trên môi trường Brilliant Green Agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ. Trên môi trường canh dinh dưỡng: sau 4 – 5giờ E.coli làm đục nhẹ môi trường, để càng lâu càng đục, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt hay xám, sinh H2S có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng nổi trên mặt môi trường. 2.2.2.4. Kháng nguyên E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Năm 1947 Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm huyết thanh (serotype) dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O, H, K. a. Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đung nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ. Kháng nguyên O có thể phát hiện được bằng phản ứng ngưng kết. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc phân loại serogroup của E.coli. Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O và được chia làm 4 nhóm chính OI, OII, OIII, OIV. Trong mỗi serogroup có một hay nhiều serotype, kháng nguyên O bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ. b. Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo nên khả năng di động của E.coli, kém chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5% , có khoảng 50 type kháng nguyên H. c. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu được xác định bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác định có sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng nguyên huyết thanh O khi bị đun nóng. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type là A, L và B. Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 loại kháng nguyên K được xác định. Hình 2.2: Vị trí các loại kháng nguyên trên E.coli 2.2.2.5. Độc tố a. Khả năng gây bệnh của STEC STEC sản xuất độc tố Shiga toxin (Stx). Họ độc tố Stx gồm 2 nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, Stx1 có tính bảo tồn cao, trong khi đó Stx2 rất thay đổi về trình tự. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, thậm chí nhiều dạng của Stx2. Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7kDa và 1 tiểu đơn vị A 32kDa. Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28kDa và peptide A2 4kDa nối với nhau bằng cầu disulfur. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N – glycosidase cắt một gốc adenine khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho tổng hợp ribosome. Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết màng xuất huyết (haemorrhagic colits – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2 gây ra sẽ dấn đến hiện tượng phù thủng. Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng huyết niệu (haemolytic uraemic syndrome) – HUS) ở người. b. Khả năng gây bệnh của EPEC EPEC là nhóm E.coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy ở trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển. Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay những thú nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào. Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự dính kết chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô. Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn thương này liên quan rộng rãi đến EPEC thì thuật ngữ “ngắn kết và gây hư hại” (“attaching và effacing” – A/E) mới được đưa ra. Gen cần thiết cho việc tạo ra tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC. Đáp ứng viêm tại chỗ và sự tăng tính thấm của ruột trong đáp ứng với EPEC góp phần vào tiêu chảy. Điểm đáng lưu ý nhất về mặt dịch tễ học của bệnh do EPEC về sự phân bố về lứa tuổi của người bệnh. Bệnh chủ yếu xảy ra tên trẻ em dưới 2 tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng. Lý do liên quan đến khả năng đề kháng được với người trưởng thành và trẻ em lớn còn chưa được biết rõ nhưng có lẽ là do mất các receptor đặc hiệu. Tuy nhiên EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ lớn. c. Khả năng gây bệnh của Enterotoxigenic E.coli (ETEC) Nhóm ETEC gồm có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (Enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization facter – CF). Độc tố ruột Enterotoxin Nhóm ETEC gồm những E.coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường ruột ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhày ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua việc tiết độc tố đường ruột ST và LT. E.coli, nhóm này có thể chỉ tiết độc tố ST hay LT hoặc cả hai. Độc tố không chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): độc tố LT của E.coli là oligopeptide gồm có hai serogroup chính là LT – I và LT – II, chúng không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch. LT – I được tiết bởi những dòng E.coli gây bệnh trên người và thú, còn LT – II được tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên thú và hiếm khi ở người. LT – I là một oligopeptide khoảng 86kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính enzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết với nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kiết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là các receptor của LT. Gen mã hóa cho LT là elt hay LT – I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và hoặc cả gen mã hóa kháng nguyên chứa yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA). Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển Golgi. Đích của LT trong tế bào là enzyme andenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A có hoạt tính ADP – ribosyltransferase chuyển phần ADP – rybosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP là Gs, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. Vì vậy, enzyme cAMP – dependent protein kinase (A kinase) được hoạt hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột gây tiêu chảy. LT – II: nhóm LT – II giống với LT – I khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn vị A nhưng không giống ở tiểu đơn vị B, LT – II không liên quan đến bệnh trên người và thú. Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST): ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm chủ yếu được tìm thấy trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. STa và STb đều được tạo bởi ETEC. STa là một peptide gồm 18 – 19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 2kDa. Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cylase C (GC – C). Sự kết hợp của STa vào GC – C kích thích hoạt tính GC dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây sự tiết chất lỏng trong ruột. STb không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào. Không tạo ra sự tiết Cl- như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng canxi nội bào từ ngoại bào. Yếu tố định vị (colonization factor – CF) Để gây tiêu chảy ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ lông trên bề mặt của vi khuẩn gọi là yếu tố định vị (CF). d. Enteroaggregative E.coli (EAEC hay EAggEC) EAEC hay EAggEC là nhóm E.coli không sinh enterotoxin và bám dính vào tế bào Hep – 2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhetion – A/A). Nhóm EAEC gồm cả dòng E.coli gây bệnh và không gây bệnh. Tất cả các EAEC đều có 60MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A và mã hóa A/A trên plasmid cần thiết cho quá trình gây bệnh. EAEC gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày). Trong hầu hết các báo cáo đều mô tả EAEC ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ nhưng cũng có thể là tác nhân gây thành ổ dịch. e. Khả năng gây bệnh của Enteroinvasive E.coli (EIEC) Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những E.coli dòng EIEC bao gồm sốt, đau bụng quặn, khó chịu, nhiễm trùng máu và tiêu chảy nước hay bệnh lỵ điển hình với máu, dịch nhày và nhiều bạch cầu trong phân. EIEC có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng điều tiết một hay nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy. EIEC cũng có thể gây tiêu chảy ở khách du lịch và liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm. Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E.coli bao gồm: Bảng 2.2: Các gen độc lực quan trọng của E.coli STT Gen độc lực Nhóm E.coli 1 2 3 4 5 6 7 8 Eae Hly Stx1 Stx2 Stx2e Sta Stb LT - I EPEC, STEC STEC STEC STEC STEC ETEC ETEC ETEC 2.2.2.6. Tình hình nhiễm Coliforms và E.coli là vi khuẩn thường thấy trong ruột người và động vật máu nóng. Coliforms là vi sinh vật chỉ thị an toàn thực phẩm, trong khi đó hầu hết các chủng E.coli vô hại. tuy nhiên, một số chủng có thể gây bệnh nghiêm trọng. Nó xâm nhiễm vào con người chủ yếu thông qua tiêu thụ thức ăn, thức uống bị ô nhiễm, chẳng hạn như sản phẩm thịt chưa nấu chín dính bụi bẩn hay các loại nước giải khát nhiễm khuẩn hoặc các loại rau củ quả chưa được ngâm và rửa sạch. E.coli O157: H7 là EHEC serotype quan trọng nhất liên quan đến các dịch bệnh. Các triệu chứng của bệnh gây ra bởi EHEC bao gồm đau bụng và tiêu chảy có thể có trong một số trường hợp tiến triển thành bệnh tiêu chảy máu (xuất huyết viêm đại tràng), sốt và ói mửa cũng có thể xảy ra. Ngoài ra, tiêu chảy là một nguyên nhân chính của suy dinh dưỡng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Tỷ lệ nhiễm khuẩn EHEC thay đổi theo nhóm tuổi nhưng tỷ lệ mắc cao nhất thường xảy ra ở trẻ em độ tuổi dưới 15 với khoảng 100000 trường hợp tại tại Hoa Kỳ năm 1982. Năm 1996, một ổ dịch của E.coli O157: H7 liên quan đế thức ăn và đồ uống đường phố tại Nhật Bản làm hơn 6300 học sinh bị ảnh hưởng và kết quả là 2 ca tử vong. Ngày 15/5/2000, tại Ontario, Canada. Các đơn vị y tế công cộng cho biết tại thị trấn Walkerton với dân số 5000 đã có một ổ dịch của E.coli O157: H7 làm 5 người thiệt mạng và 27 ca nằm viện. Số lượng ca mắc ngộ độc thực phẩm và đồ uống là khó xác định chính xác, nhưng một được báo cáo của WHO nói rằng trong năm 2005 đã làm 1.800.000 người chết vì bệnh tiêu chảy. Ở các nước công nghiệp hóa, tỷ lệ phần trăm của dân số bị bệnh từ thực phẩm mỗi năm đã được báo cáo để được lên đến 30%. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm này ở các nước đang phát triển chắc chắn sẽ còn cao hơn nhiều so với các nước phát triển và điều này đã gây thiệt hại nặng về người và tổn hại nền kinh tế. Sự xuất hiện lại của dịch tả tại Peru vào năm 1991 có trong xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản và cá dẫn đến sự mất mát của Mỹ 500000000 USD năm đó. Tại Mỹ, các dịch bệnh liên quan ước tính chi phí lên đến 35 tỷ USD hàng năm. (Theo Tổ chức Y tế thế giới) Trong khi đó, tháng 7/2007 tại Đà Nẵng, Việt Nam 53% mẫu thức ăn và đồ uống đường phố nhiễm Coliforms và 25,3% thức ăn nhiễm E.coli, đó là con số thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng qua đợt kiểm tra gần 400 cơ sở thức ăn và đồ uống đường phố trong thời gian vừa qua. (Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng (2007), Báo cáo vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố). 2.3. Một số phương pháp định lượng vi sinh vật trong nước 2.3.1. Phương pháp đổ đĩa 2.3.1.1. Khái niệm Phương pháp đổ đĩa hay còn gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống, hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể thực hiện bằng kỹ thuật hộp đổ hay hộp trải với các thiết bị hỗ trợ đọc kết quả. Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ chưa đủ dài. Thông thường trong điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa. Phương pháp đếm khuẩn lạc được cho là tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Ngoài ra, phương pháp này còn có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm. 2.3.1.2. Quy trình thực hiện a. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10-1, 10-2,…. Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9ml nước hoặc môi trường trong ống nghiệm. Hình 2.3: Hệ thống pha loãng mẫu b. Kỹ thuật đổ đĩa Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. Đổ khoảng 15 – 20ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 – 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu. Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngược đĩa lại mang ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. 2.3.1.3. Cách tính kết quả Công thức tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu nước như sau: A = N / (n1v1f1 + n2v2f2 + n3v3f3 + … + nivifi) Trong đó: A: tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong 1ml (g) mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1: số đĩa ở độ pha loãng f1 ni: số đĩa ở độ pha loãng fi vi: thể tích mẫu lấy ở mỗi độ pha loãng fi: độ pha loãng 2.3.2. Phương pháp màng lọc Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh tương đối thấp. Phương pháp này bao gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh cần kiểm tra. Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật, người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích. Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích thước lỗ là 0,45µm hoặc 0,2µm được chế tạo từ các nguyên liệu là các sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng. Ngoài màng lọc bình thường hiện nay, người ta còn sử dụng màng lọc kỵ nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. Các vạch chia ô bằng vật liệu này ngăn càn sự mọc lan của các khuẩn lạc. Khác với trường hợp màng lọc bình thường, từ số các ô vuông có khuẩn lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu được tính và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích theo mẫu công thức: MPN = Nln(N/N – x) Trong đó: N: tổng số các ô vuông x: ô có số khuẩn lạc mọc 2.3.3. Phương pháp MPN (Most Probable Number) 2.3.3.1. Khái niệm Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương định lượng dựa trên kết quả tính của một loạt thí nghiệm lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. 2.3.3.2. Quy trình thực hiện Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục...), ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng số liệu này nà dựa vào bảng Mac Cardy suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. 2.3.3.3. Cách lập chỉ số MPN Trường hợp 1: có ít nhất ba ống dương tính cho một độ pha loãng. Chọn độ pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho ba ống dương tính, cùng với hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp (tức là độ pha loãng này có nồng độ mẫu là 1/10 và 1/100 của độ pha loãng thứ nhất đã được chọn). Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũng cho ba ống dương tính thì chọn tiếp ba độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất). Trường hợp 2: không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính. Chọn ba độ pha loãng cao nhất trong dãy pha loãng (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), trong số đó ít nhất thu được một kết quả dương tính. Các trường hợp đặc biệt: trong tất cả các trường hợp khi có nhiều hơn một trong ba độ pha loãng được chọn theo trường hợp 1 và 2 không cho ống dương tính, thì hãy chọn từ các độ pha loãng này độ pha loãng thấp nhất không cho các ống dương tính (tức là độ pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất) và hai độ pha loãng thấp hơn kế tiếp trong dãy pha loãng (tức là có nồng độ mẫu gấp 10 lần và 100 lần độ pha loãng thứ nhất đã chọn), trừ khi các ống dương tính chỉ tìm thấy ở mức pha loãng đầu tiên được chuẩn bị từ mẫu thử trong trường hợp cuối cùng này cần chọn ra ba độ pha loãng đầu tiên để tính MPN thậm chí loạt ống này bao gồm hai độ pha loãng không cho các ống dương tính nào. 2.3.3.4. Cách tính kết quả Số vi sinh vật trên ml hoặc trên gam của sản phẩm được tính bằng cách nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất). Khi độ pha loãng thấp nhất được chọn tương ứng với các ống được chuẩn bị với môi trường nồng độ kép (tức là cấy với 10ml), thì trước hết hãy chia chỉ số MPN cho 10. Hình 2.4: Hệ thống định lượng vi sinh vật bằng MPN Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian 3.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Vi sinh, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ 05/04/2010 đến 05/07/2010. Vật liệu Mẫu Mẫu được lấy tại các quán nước giải khát trên địa bàn quận Bình Thạnh. Các mẫu gồm: Mẫu nước không đóng chai: nước mía, sâm và rau má. Mẫu nước đóng chai có gas: nước khoáng Vĩnh Hảo, Pepsi, và 7up Revive. Mẫu nước đóng chai không có gas: trà xanh không độ O0, trà xanh C2, nước khoáng Joy và Sapuwa. Hóa chất và môi trường 3.2.2.1. Hóa chất Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, dung dịch α – naphthol, KOH 40%, cồn 960, 700 và nước cất. 3.2.2.2. Môi trường a. Môi trường lỏng Lactose Broth (LB) b. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL) c. Môi trường EB Broth (canh EC) d. Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB) e. Môi trường canh Trypton (Tryptophane) Borth 1% f. Môi trường MR – VP Broth g. Môi trường Simmon Citrate Agar Dụng cụ và thiết bị 3.2.3.1. Dụng cụ Bình các loại 500ml, 250ml, 100ml… Cốc thủy tinh loại 200ml, 100ml Ống nghiệm, ống durham Đĩa petri Pipet các loại 10ml, 1ml, 0,1ml Pipetman Đầu týp Đèn cồn Que cấy vòng, thẳng Giá ống nghiệm Quẹt gas Bông gòn (loại thấm và không thấm nước) Bao PE vô trùng Giấy dầu Đũa khuấy 3.2.3.2. Thiết bị Tủ ấm 370C Tủ ủ Tủ lạnh Nồi hấp Autoclave Cân phân tích Bể điều nhiệt Tủ cấy 3.3. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Thu mẫu Mẫu được lấy vào buổi sáng tại các quán nước giải khát trên địa bàn quận Bình Thạnh. 3.3.2. Thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên. Các mẫu nước được lấy tại những nơi khác nhau và mỗi mẫu lặp lại 3 lần tại cùng một nơi đã chọn ban đầu trên địa bàn quận Bình Thạnh. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) 3.4.1.1. Thử nghiệm giả định Đối với mẫu nước không đóng chai: chọn dãy nồng độ pha loãng kế tiếp nhau (10-2, 10-3, 10-4). Xếp 9 ống nghiệm chứa 10ml môi trường Lactose Broth vô trùng có ống durham lên giá ống nghiệm làm 3 dãy. Dùng 1 pipet 1ml khử trùng hút 1ml mẫu nước tại nồng độ 10-2 vào 3 ống dãy 1, tiếp tục lấy pipet 1ml vô trùng hút 1ml mẫu 10-3 vào 3 ống dãy 2. Tương tự, dùng pipet 1ml đã vô trùng hút 1ml mẫu 10-4 vào 3 ống dãy 3. Lắc nhẹ mỗi ống để trộn đều mẫu nước với môi trường nuôi cấy, tránh tạo bọt khí. Cần lưu ý, mỗi độ pha loãng là 1 pipet 1ml mới. Thực hiện tương tự như vậy cho 2 mẫu nước không đóng chai còn lại. Đối với mẫu nước đóng chai: cũng thực hiện tương tự như trên nhưng chọn dãy nồng độ kế tiếp nhau (10ml; 1ml; 0,1ml). Xếp 9 ống nghiệm chứa 10ml môi trường Lactose Broth vô trùng có ống durham lên giá làm 3 dãy. Dùng pipet khử trùng loại 10ml hút 10ml mẫu cho vào 3 ống dãy 1, lấy pipet khử trùng 1ml hút 1ml mẫu vào 3 ống dãy 2, cuối cùng dùng đầu týp khử trùng hút 0,1ml mẫu vào 3 ống dãy 3. Mỗi độ pha loãng dùng 1 pipet mới và cứ thế tiếp tục thực hiện cho hết 7 mẫu nước đóng chai. Tất cả 90 ống nghiệm (10 mẫu x 9 ống) này, được ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ quan sát sự sinh hơi và ghi nhận lại những ống sinh hơi chứng tỏ thử nghiệm giả định dương tính (+). Số lượng ống nghiệm dương tính được chia làm hai để tiến hành thử nghiệm xác định Coliform và tiếp tục thử nghiệm giả định E.coli. Tiếp tục thử nghiệm giả định E.coli Lắc đều và dùng que cấy vòng lấy từ các ống thử nghiệm giả định dương tính cấy chuyển vào các ống chứa 10ml môi trường EC vô trùng có ống durham. Sau đó đem ủ ở 440C trong 24 giờ, quan sát sự sinh hơi chứng tỏ thử nghiệm giả định dương tính. Các ống nghiệm dương được lắc đều và cấy chuyển sang môi trường thạch EMB, mang ủ ở 370C trong 24 giờ xem khuẩn lạc E.coli giả định (khuẩn lạc E.coli có ánh kim tím, tròn và dẹt). Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thử nghiệm IMViC: canh trypton, canh MR – VP, môi trường thạch nghiêng Simmon Citrate. Mang ủ các môi trường đã cấy ở 370C trong 24 giờ rồi tiến hành thử nghiệm sinh hóa. 3.4.1.2. Thử nghiệm xác định Coliforms Lắc đều và dùng que cấy vòng lấy từ các ống thử nghiệm giả định dương tính cấy chuyển vào các ống chứa 10ml môi trường BGBL vô trùng có ống durham. Sau đó, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Quan sát sự sinh hơi và ghi nhận các ống dương chứng tỏ thử nghiệm xác định dương tính. 3.4.1.3. Thử nghiệm sinh hóa đối với E.coli a. Thử nghiệm Indol Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn trong môi trường canh trypton. Phản ứng (+) khi bề mặt có vóng tròn đỏ cánh sen xuất hiện, phản ứng (-) khi không có vòng tròn đỏ xuất hiện. b. Thử nghiệm Methyl Red Nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn lỏng môi trường MR – VP, lắc đều. Phản ứng (+) khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng (-) khi canh khuẩn không đổi màu. c. Thử nghiệm Voges Proskauer (VP) Cho 2 – 3 giọt thuốc thử α – naphthol 5% vào canh khuẩn, lắc đều và cho tiếp vào đó 6 – 9 giọt KOH 40%. Quan sát màu sắc của canh khuẩn trong 10 – 30 phút. Phản ứng (+) khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng (-) khi canh khuẩn không đổi màu. d. Thử nghiệm Citrate Quan sát trên môi trường Simmon Citrate: phản ứng (+) khi môi trường thạch nghiêng chuyển sang màu xanh dương, phản ứng (-) khi môi trường không đổi màu (màu xanh lục). Bảng 3.1: Biểu hiện trên môi trường của E.coli Môi trường Phản ứng Biểu hiện môi trường Canh Trypton Thử nghiệm Methyl Red Thử nghiệm Voges Proskauer Citrate + + - - Vòng đỏ cánh sen xuất hiện bề mặt. Môi trường chuyển sang đỏ. Môi trường không chuyển màu. Không có sinh khối và môi trường không chuyển màu. 3.4.1.4. Đọc kết quả Dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. 3.4.2. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel. Mẫu nước không đóng chai pha loãng có nồng độ 10-2, 10-3, 10-4 hút 1ml. Mẫu nước đóng chai không pha loãng hút 10ml, 1ml, 0.1ml Hút tương ứng với 1 nồng độ vào ống 10ml Lactose Broth, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, ủ ở 370C trong 24 giờ. Ghi nhận số ống dương (+) Lactose Broth Cấy vào ống 10ml BGBL, ủ ở 370C trong 24 giờ. Ghi nhận số ống dương. Đọc kết quả, tra bảng Mac Cardy. Cấy vào ống 10ml EC Broth, ủ 440C trong 24 giờ. Ghi nhận số ống dương. Cấy vào môi trường thạch đĩa EMB, ủ 370C trong 24 giờ. Quan sát khuẩn lạc E.coli có ánh kim tím, tròn, dẹt. Cấy khuẩn lạc đặc trưng vào môi trường thử nghiệm IMViC (môi trường Trypton, Methyl Red, Voges Proskauer, Simmon Citrate), ủ ở 370C trong 24 giờ. Tiến hành thử nghiệm IMViC. Đọc kết quả, tra bảng Mac Cardy. Hình 3.1: Quy trình định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp MPN Hình 3.2: Biểu hiện E.coli và Coliforms lần lượng trong EC Broth và BGBL 1: mẫu đối chứng không, 2: mẫu dương; 3: mẫu không, 4: mẫu dương Hình 3.3: Khuẩn lạc E.coli trên EMB Hình 3.4: Biểu hiện sinh hóa của E.coli 1: Indol (+), 2: Methyl Red (+), 3: Voges Prokauer (-), 4: Citrate (-) Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá cảm quan các mẫu nước 4.1.1. Các mẫu nước không đóng chai 4.1.1.1. Nước sâm Nước sâm có màu nâu với thành phần gồm sài đất, cỏ tranh, mía lau, râu bắp và thuốc dòi (sát trùng thảo), có vị ngọt dịu, không có chứa cặn. Nước sâm được đựng trong ly nhựa có đậy nắp và đem về phòng thí nghiệm. 4.1.1.2. Nước mía Nước mía có màu vàng hoa mai, có vị ngọt của đường saccharose. Mẫu nước mía có chứa cặn được mua đựng trong ly nhựa đậy nắp và được vận chuyển về phòng thí nghiệm. 4.1.1.3. Nước rau má Nước rau má có màu xanh lá, có vị đắng, hơi ngọt, có nhiều dưỡng chất như beta caroten, alkaloid, flavonol, các vitamin nhóm B, K, C…có khả năng chống oxy hóa. Sau khi mua về mẫu nước rau má có cặn lơ lửng được trữ trong ly nhựa có nắp đậy. Hình 4.1: Các mẫu nước không đóng chai được phân tích 1: Nước sâm, 2: Nước mía, 3: Nước rau má 4.1.2. Các mẫu nước đóng chai 4.1.2.1. Nước khoáng Vĩnh Hảo Có màu trắng tinh khiết không có mùi vị lạ, không cặn. Nước khoáng Vĩnh Hảo được đựng trong chai 500ml còn nguyên vẹn nắp, không méo mó hay bị rò rỉ nước và hạn dùng vẫn còn ghi trên nắp chai. 4.1.2.2. Nước khoáng Joy Nước khoáng Joy không có mùi vị lạ, không cặn được bảo quản tốt trong chai nhựa đóng nắp và thanh trùng. Hạn sử dụng vẫn còn. 4.1.2.3. Nước khoáng Sapuwa Không có mùi vị lạ và cặn tạp nhiễm, tình trạng nước còn nguyên vẹn trong chai, không bị rò rỉ nước ra ngoài. 4.1.2.4. Nước Pepsi Là loại nước có gas, màu nâu, hương liệu tự nhiên từ cafein và cocain khi uống có sủi bọt tăm. Nước Pepsi được chứa trong chai đậy nắp và thanh trùng, còn nguyên nhãn mác, không bị nhiễu nước ra ngoài, trong nước không thấy nhiễm cặn. Nước trong chai vẫn còn hạn dùng. 4.1.2.5. Nước 7up Revive Là loại nước ngọt có gas với nhiều bọt sủi tăm có màu trắng trong. Trong nước hoàn toàn không thấy có cặn hay mùi vị lạ. Nước 7up Revive được đóng chai 500ml và vô trùng, không bị méo mó hay bị dập hoặc rò rỉ nước ra ngoài và vẫn còn thời hạn sử dụng. 4.1.2.6. Nước trà xanh O0 Có chứa hợp chất chống hóa oxy hóa EGCG (epigallotechin gallate). Có vị ngọt dịu với màu sắc nước trà – màu nâu nhạt, không có mùi vị lạ hay cặn bã lẫn vào. Trà xanh O0 được đóng chai 500ml và vô trùng, không bị dập hay rò rỉ nước và vẫn còn trong thời hạn sử dụng. 4.1.2.7. Nước trà xanh C2 Chứa tinh chất trà chống lão hóa, nước trà xanh C2 có vị ngọt dịu, màu sắc trà là màu nâu nhạt, không bị đổi màu, không có chứa cặn lợn cợn, không thấy có mùi vị lạ. Thao tác chiết rót hoàn toàn vô trùng và đóng chai 300ml, chai không bị dập hay méo mó, vỏ không trày xước, còn nguyên nhẫn mác, không bị rò rỉ nước. Quá trình vận chuyển an toàn và đang trong hạn dùng. Hình 4.2: Một số mẫu nước giải khát đóng chai được phân tích 1: Nước khoáng Joy, 2: Trà xanh C2, 3: Trà xanh O0, 4: Nước Pepsi, 5: Khoáng Sapuwa, 6: Khoáng Vĩnh Hảo và 7: 7up Revive 4.2. Đánh giá mức độ nhiễm Coliforms và E.coli trong các mẫu nước không đóng chai Theo tiêu chuẩn TCVN 6096 : 1995, các chỉ tiêu vi sinh vật trong đồ uống pha chế sẵn không cồn (gồm cả nước khoáng đóng chai) được quy định như sau: Bảng 4.1: Tiêu chuẩn TCVN 6096 : 1995 quy định vi sinh vật trong thức uống không cồn. Chỉ tiêu Giới hạn tối đa 1. E.Coli, số vi khuẩn trong 100 ml sản phẩm 0 MPN 2. Coliforms, số vi khuẩn trong 100 ml sản phẩm 0 MPN 4.2.1. Đánh giá mức độ nhiễm Coliforms trong các mẫu nước không đóng chai Hình 4.3: Mức độ nhiễm Coliforms trong các mẫu nước không đóng chai Dựa vào hình 4.3, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các mẫu nước không đóng chai đều bị nhiễm Coliforms với tỷ lệ rất cao. Mẫu nước mía và nước rau má tỷ lệ nhiễm Coliforms là 100% tổng số mẫu khảo sát. Mẫu nước sâm tuy có mật độ nhiễm thấp so với hai mẫu còn lại nhưng cũng chiếm tỷ lệ cao tới 66,67% tổng số mẫu khảo sát. Tất cả các mẫu nước trên đều có tỷ lệ nhiễm (xem bảng 1 – phụ lục) vượt tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế đưa ra đối với chỉ tiêu Coliforms là không nhiễm. Việc bị nhiễm có thể do sử dụng nguồn nước không đảm bảo vệ sinh vẫn còn chứa các vi sinh vật gây hại, việc chế biến các loại nước giải khát không đóng chai không tuân thủ theo quy trình sản xuất, tay người bán không được vệ sinh sạch sẽ, việc sử dụng các thùng, xô, chậu, các ly...chứa không được rửa sạch. Trong quá trình bày bán hay lưu trữ không đậy nắp các thùng chứa cũng có thể làm nhiễm vi sinh gây hại, lượng nước dư thừa có thể được sử dụng lại để bán cho ngày hôm sau. Trong quá trình vận chuyển có thể làm nhiễu nước ra ngoài nên có thể gây nhiễm. Ngoài ra, việc sử dụng các nguyên liệu mía cây, lá rau má, lá sâm có thể không được cạo hay rửa sạch cũng là nguyên nhân có thể dẫn đến sự nhiễm vi sinh. Coliforms là một vi sinh vật chỉ thị an toàn, do đó sự hiện diện của Coliforms cao trong mẫu nên óc thể sẽ có sự hiện diện của một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột trong mẫu. 4.2.2. Đánh giá mức độ nhiễm E.coli trong các mẫu nước không đóng chai Hình 4.4: Mức độ nhiễm E.coli trong các mẫu nước không đóng chai Từ hình 4.4, chúng tôi nhận thấy rằng trong 3 loại mẫu khảo sát có đến 2 loại mẫu là nước rau má và nước mía bị nhiễm E.coli với các tỷ lệ nhiễm khác nhau. Trong khi đó, mẫu nước sâm mặc dù có tỷ lệ nhiễm Coliforms cao (66,67%) nhưng không bị nhiễm E.coli. Mẫu nước sâm bị nhiễm Coliforms nhưng không bị nhiễm E.coli điều đó có thể do nước sâm là loại nước giải khát được chế biến có qua quá trình gia nhiệt nên có thể làm chết các vi sinh vật gây bệnh. Trong khi đó, mẫu nước rau má và nước mía đều bị nhiễm (xem bảng 1 – phụ lục) không đạt tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế, có thể do nhiều nguyên nhân yếu tố khác nhau chẳng hạn việc sử dụng và xử lý nguồn nước chưa thực sự đúng quy định về an toàn vệ sinh nước uống vẫn còn chứa các vi sinh vật gây hại, lá rau má bám dính đầy bụi bẩn có thể không được ngâm và chỉ rửa rất sơ sài, cây mía được cắt khúc bằng dao dơ bẩn, việc cạo rửa sơ sài, máy xay sinh tố, ly đựng, chai hay thùng chứa bám nhiều cáu bẩn, không khí bụi bặm gió thổi bám vào các dụng cụ không được rửa sạch, người đứng bán mặc trang phục có thể dơ bẩn nên vẫn có thể gây nhiễm, việc không đậy nắp hay đậy nắp xơ xài cũng có thể gây nhiễm vi sinh và lượng nước dư không bán hết được để lại cũng có thể làm nhiễm. Ngoài ra, quá trình vận chuyển cũng có thể làm nhiễm các vi sinh vật có hại. Trong mía còn có đường saccharose dễ bị thủy phân thành đường glucose – một sản phẩm giàu năng lượng và dễ bị đồng hóa. Vì thế mía là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật gây hại, do đó mía dễ bị hư. 4.3. Đánh giá mức độ nhiễm Coliforms và E.coli trong các mẫu nước đóng chai Các mẫu nước đóng chai khảo sát không nhiễm hai loại vi sinh vật gây bệnh đó là E.coli và Coliforms. Do vậy, các sản phẩm nước uống đóng chai này đều đạt tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế về vệ sinh an toàn thức uống. Các mẫu nước đóng chai này không bị nhiễm Coliforms lẫn E.coli có thể là do các doanh nghiệp luôn luôn chú trọng tới việc vệ sinh sạch sẽ các trang thiết bị máy móc, thiết bị chiết chai, các chai nhựa được rửa sạch, thao tác chiết rót hoàn toàn vô trùng, các sản phẩm khi được lấy để tiến hành khảo sát vẫn còn trong thời hạn sử dụng. Ngoài ra, nguồn nước sử dụng có thể đã được xử lý tốt bằng các phương pháp hiện đại như sử dụng ozon, tia UV hay lọc thẩm thấu ngược nhằm tránh sự nhiễm hay sót lại các vi sinh vật gây hại. Theo TCVN tất cả các mẫu nước giải khát không đóng chai đều bị nhiễm vi sinh vật gây hại vượt tiêu chuẩn cho phép. Điều này chứng tỏ rằng các sản phẩm nước uống không đóng chai được bày bán khắp đường phố đều chứa trong nó những nguy cơ gây nhiễm cao, có thể ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng. Lý giải cho vấn đề này có thể do ý thức của người dân cứ “ngon, bổ, rẻ” là dùng. Bên cạnh đó, việc chế biến những loại thức uống kiểu này rất sơ sài, sử dụng nguồn nước không đảm bảo vệ sinh quy định, việc xử lý vi sinh đối với các nguồn nước chưa thực sự được chú trọng, các dụng cụ chứa đựng nước bám nhiều cáu bẩn, có thể do không đậy nắp các thùng hay chai, lọ chứa làm cho các vi sinh vật tồn tại trong không khí, đất, nước xâm nhiễm dễ dàng. Các nguyên liệu đầu vào dùng trong chế biến không được ngâm và rửa sạch, thao tác từ tay người bán cũng có thể làm nhiễm vi sinh, việc bảo quản hay vận chuyển không an toàn, lượng nước dư không bán hết có thể được trữ lại để hôm sau bán tiếp. Trong khi đó tất cả các mẫu nước đóng chai đều đạt tiêu chuẩn quy định của Bộ Y tế, tức là mức độ nhiễm Coliforms và E.coli đều không có. Để đạt được kết quả này, các doanh nghiệp luôn tiến hành kiểm soát chặt chẽ quá trình sản xuất cũng như việc vệ sinh sạch sẽ các trang thiết bị, máy móc, dụng cụ thùng, chai, lọ chứa. Đồng thời kiểm soát chặt chẽ việc thanh trùng sản phẩm, quá trình việc vận chuyển và bảo quản không để xảy ra hiện tượng rò rỉ có thể làm nhiễm. Điều này chứng tỏ rằng, việc bày bán các nước loại nước giải khát không đóng chai trên khắp đường phố quận Bình Thạnh không đạt chuẩn vệ sinh thực phẩm đồ uống, việc người dân sử dụng có thể có nguy cơ nhiễm các mầm bệnh như tiêu chảy, ói mửa, đau bụng… rất cao chứ chưa nói gì tới chất lượng “trời ơi” của những sản phẩm này. Trong khi đó, các loại nước giải khát đóng chai thuộc các thương hiệu nổi tiếng khác luôn luôn đảm bảo không chỉ vệ sinh thực phẩm mà còn cả về chất lượng thức uống. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Tất cả các mẫu nước được lấy phân tích đều có màu sắc, mùi vị đặc trưng theo từng loại sản phẩm. Các mẫu nước đóng chai được đựng trong chai còn nguyên nhãn mác, không rò rỉ, không méo mó. Trong khi đó, các mẫu nước không đóng chai được chứa trong ly nhựa đậy nắp và quá trình vận chuyển bị nhiễu. Mật độ nhiễm Coliforms và E.coli trong các mẫu nước không đóng chai đều vượt tiêu chuẩn quy định của Bộ Y tế. Cụ thể, tỷ lệ nhiễm Coliforms là 100% tổng số mẫu nước khảo sát và mức độ nhiễm E.coli cũng rất cao lên tới 66.67% tổng số mẫu. Các sản phẩm đóng chai thể hiện tính ưu việt nên những sản phẩm này hoàn toàn không bị nhiễm Coliforms và E.coli. 5.2. Đề nghị Cần tiến hành lặp lại việc khảo sát nhiều lần hơn nữa để chứng thực mức độ ô nhiễm vi sinh. Mở rộng phạm vi khảo sát không chỉ đối với các loại nước giải khát mà còn là nước uống sinh hoạt. Từ kết quả đó nhận định được mức độ ô nhiễm trong nguồn nước có nguồn gốc từ đâu đồng thời đưa ra biện pháp khắc phục. Ngoài ra, cần tiến hành khảo sát thêm các chỉ tiêu vi sinh gây bệnh, để có cái nhìn rộng hơn đối với sự nhiễm vi sinh. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Tiến Dũng (2004), Bài giảng kiểm định chất lượng thực phẩm. Ths. Nguyễn Tiến Dũng (2007), Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh. Lê Đình Hùng (1998), Đại cương về phương pháp kiểm tra vi sinh vật thực phẩm, trung tâm Tiêu chuẩn đo lường chất lượng khu vực III, thành phố Hồ Chí Minh. Lê Văn Nam (2007), Thị trường đồ uống, Nxb Thống kê. Lương Đức Phẩm (2002), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội. Trần Linh Thước – chủ biên (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh. Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb Giáo Dục. Nguyễn Thị Tuyết (2008), Giáo trình Thương phẩm hàng thực phẩm và đồ uống, Nxb Hà Nội. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6096 : 1995 (1995), Chỉ tiêu vi sinh vật trong các đồ uống pha chế sẵn không cồn. Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng (2007), Báo cáo Vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố. Viện Y tế thành phố Hồ Chí Minh (7/2009), Báo cáo An toàn vệ sinh thực phẩm TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng anh Fao (1992), Microbiological analysisis inh the food centrol laboratory. Tài liệu Internet www.acedemicjournals.org/AJB www.about-E.coli.com www.epa.gov/OGWDW/certlab/labfront.html#toc www.seafood.ucdavis.edu/organize/rapid www.inventors.com www.vneconomy.vn