Đồ án Khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong nuôi cấy mô sẹo cây kim ngân (Lonicera japonica Thumb)

Waller và cs 1983 Cornus kousa Polyphenols Huyền phù Ishimaru và cs 1993 Corydalis ophiocarpa Isoquinoline alkaloids Mô sẹo Iwasa và Takao 1982 Croton sublyratus Plaunotol Mô sẹo Morimoto và Murai 1989 Cruciata glabra Anthraquinones Huyền phù Dornenburg và Knorr 1996 Cryptolepis buchanani Cryptosin Mô sẹo Venkateswara và cs 1987 Digitalis purpurea Cardenolides Huyền phù Hagimori và cs 1982 Dioscorea deltoidea Diosgenin Huyền phù Heble và Staba 1980 Dioscorea doryophora Diosgenin Huyền phù Huang và cs 1993 Duboisia leichhardtii Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Endo 1984 Ephedra spp. L-Ephedrine, D-pseudoephedrin Huyền phù O’Dowd và cs 1993 Eriobotrya japonica Triterpenes Mô sẹo Taniguchi và cs 2002 Eucalyptus tereticornis Sterol và hợp chất phenolic Mô sẹo Venkateswara và cs 1986 Eucommia ulmoides Chlorogenic acid Huyền phù Wang và cs 2003 Fumaria capreolata Isoquinoline alkaloids Huyền phù Tanahashi và Zenk 1985 Gentiana sp. Secoiridoid glycosides Mô sẹo Skrzypczak và cs 1993 Ginkgo biloba Ginkogolide A Huyền phù Carrier và cs 1991 Glehnia littoralis Furanocoumarin Huyền phù Kitamura và cs 1998 Glycyrrhiza echinata Flavonoids Mô sẹo Ayabe và cs 1986 Glycyrrhiza glabra var. glandulifera Triterpenes Mô sẹo Ayabe và cs 1990 Hyoscyamus niger Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Hashimoto 1982 Isoplexis isabellina Anthraquinones Huyền phù Arrebola và cs 1999 Linum flavum 5-Methoxypodophyllo-toxin Huyền phù Uden và cs 1990 Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1990 Lycium chinense Cerebroside Huyền phù Jang và cs 1998 Giới thiệu chung về Kim ngân hoa Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Tracheobionta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Dipsacales Họ: Caprifoliacea Chi: Lonicera L Loài: Lonicera japonica Thunb Hình 2.14: hoa Kim ngân Mô tả cây Kim ngân là một loại dây leo, thân có thể vươn dài tới 10m hay hơn. Cành lúc còn non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, khi cành già chuyển màu nâu đỏ nhạt, nhẵn. Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng ba lá một, hình trứng dài, đầu hơi tù, phía cuống tròn, cuống ngắn 2 – 3 mm, cả hai mặt đều phủ lông mịn. Vào các tháng 5 – 8, hoa mọc từng đôi ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 1 cuống mang 2 hoa, hai bên lá mọc đối mang 4 hoa, lá bắc giống lá nhưng nhỏ hơn. Hoa hình ống xẻ 2 môi, môi lớn lại xẻ thành 3 hay 4 thùy nhỏ, phiến của tràng dài gần bằng ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau khi nở một thời gian chuyển màu vàng, cùng một lúc trên cây có hoa mới nở màu vàng như bạc, lại có hoa nở đã lâu màu vàng như vàng cho nên có tên là Kim ngân (kim là vàng, ngân là bạc); cây Kim ngân xanh tốt vào mùa đông cho nên còn có tên là nhẫn đông nghĩa là chịu đựng mùa đông, 4 nhị thòi dài cao hơn tràng; vòi nhụy lại thòi dài cao hơn nhị, mùi thơm dễ chịu. Quả hình trứng dài chừng 5mm. Phân bố, thu hái và chế biến Kim ngân là một cây loại mọc hoang dại tại nhiều tỉnh vùng núi nước ta, nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ. Một số nơi người ta bắt đầu trồng lấy hoa và cành lá làm thuốc. Do cây Kim ngân có lá xanh tốt quanh năm, đến tháng 4 -5 lại cho hoa đẹp và thơm cho nên có thể trồng làm cảnh và lấy bóng mát. Kim ngân có thể trồng ở miền núi cũng như ở đồng bằng. Đất đai và khí hậu Hà Nội cũng rất thích hợp. Ta có thể trồng bằng dâm cành: cắt những cành bánh tẻ dài chừng 20–60 cm, khoanh thành khoanh, chôn xuống dưới đất, để chừa đoạn sau cùng; vào thời kỳ đầu cần tưới đều. Có thể trồng quanh năm nhưng tốt nhất vào tháng 9–10 hoặc tháng 2 -3. Sau một năm có thể bắt đầu thu hoạch; thu hoạch lâu năm, càng về những năm sau càng nhiều hoa. Nếu hái hoa cần hái vào lúc hoa sắp nở hay khi hoa mới nở, màu còn trắng chưa chuyển vàng. Có thể hái hoa riêng, cành lá riêng nhưng có thể hái hoa kèm theo một ít cành lá, về nhà mới phân, chia cành lá riêng, hoa riêng. Hoa hay cành lá hái về phơi hay sấy khô là dùng được. Không phải chế biến gì khác. Việc bảo quản hoa lá cành lá Kim ngân tương đối dễ vì ít bị mốc, mọt. Thành phần hóa học Hoa và lá chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid (lonicerin=scolymosid). Một số chất carotenoid: ξ-caroten, β-cryptoxanthin, auroxanthin. Acid chlorogenic và các đồng phân của nó. Lá có loganin và secologanin. (2) (1) Hình 2.15: (1) scolymosid, (2) β-cryptoxanthin (3) (5) (4) Hình 2.16: (3) acid chlorogenic, (4) loganin, (5) secologanin Tác dụng dược lý Tác dụng kháng sinh – tác dụng kháng sinh được nhiều nhà nghiên cứu chú ý và chứng minh trong thực nghiệm. Người ta thấy nước hoa Kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với tụ cầu khuẩn vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga. Nước sắc có tác ụng mạnh hơn các dạng bào chế khác. Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) đã báo cáo dùng nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim ngân thấy có tác dụng khánh sinh rất mạnh đối với vi trùng thương hàn, tả, liên cầu khuẩn tiêu máu (vòng vô khuẩn tới 11–20 mm), vi trùng lỵ, trực khuẩn E.coli, tụ cầu khuẩn, phế cầu khuẩn, đối với bạch hầu cũng có tác dụng nhưng kém hơn (2-10mm). Bảng 2.3: nồng độ loãng nhất có tác dụng ức chế đối với sự phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn Nồng độ pha loãng Vi khuẩn lỵ Shiga 1/640 Vi khuẩn lỵ Flexner 1/1280 Sonnei 1/320 Thương hàn (Samonella) 1/300 Vi khuẩn phó thương hàn A 1/300 Phó thương hàn B 1/300 Tả (Vibrio cholerae) 1/160 Trực khuẩn E.coli 1/160 Dịch hạch (Yersinia pestis) 1/1280 Tụ cẩu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) 1/40 Liên cầu khuẩn tiêu máu A 1/320 Liên cầu khuẩn tiêu máu B 1/160 Bạch hầu (Corynebacterium diphtheriae) 1/80 Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) 1/60 Năm 1960, Sở nghiên cứu Trung y dược tỉnh Giang Tây Trung Quốc có nghiên cứu so sánh tác dụng kháng sinh của nước sắc hoa Kim ngân là nước sắc lá Kim ngân thì đã đi tới kết luận là nước sắc lá Kim ngân với nồng độ 20 – 1.2% có tác dụng ức chế vi trùng lỵ Shiga, nước sắc lá Kim ngân với nồng độ 20 – 5% có tác dụng ức chế đối với vi trùng phó thương hàn A, nồng độ 100% có tác dụng đối với tụ cầu khuẩn, nhưng đặc biệt các tác giả nhận thấy nước sắc hoa Kim ngân lại hoàn toàn không có tác dụng kháng sinh. Các tác giả cho rằng tác dụng kháng sinh còn lệ thuộc vào thời kỳ thu hái hoa, và còn tiếp tục nghiên cứu. Tác dụng trên đường huyết – năm 1930, Mẫn Bính Kỳ (Dược lý đích sinh dược học, 1993) đã thông báo sau khi cho thỏ uống nước sắc hoa Kim ngân thì lượng đường huyết tăng; hiện tượng này kéo dài 5 – 6 giờ mới trở lại bình thường. Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ - năm 1996, Đỗ Tất Lợi, Nguyễn Năng An và Bùi Chí Hiếu (Hội nghị thuốc nam lần thứ 4, Hà Nội) đã báo cáo nước sắc Kim ngân có khả năng chặn choáng phản vệ trên chuột lang được uống Kim ngân, CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2010 tại phòng thí nghiệm CNSH thực vật trường Đại học Kỹ thuật công nghệ TP. HCM, khoa môi trường và công nghệ sinh học. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm: Đối tượng nuôi cấy: lá cây Kim ngân Đối tượng nghiên cứu kháo sát hợp chất thứ cấp: lá, cành tự nhiên, mô sẹo trên hai môi trường, hoa khô. Là và cành tự nhiên của cây Kim ngân (Lonicera japonica) được trồng tại thành phố HCM, phải khỏe, có sức sống tốt, không bị sâu hại và đang trong giai đoạn ra hoa. Mô sẹo được phát sinh từ lá Kim ngân của cây Kim ngân trên và nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4–D kết hợp với 1mg/l BA và môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ kết hợp với 0.05 mg/l IBA. Hoa sấy khô được cung cấp bởi khoa đông y thuộc bệnh viện Gò Vấp Tp. HCM, là loại tốt, không bị mọt và nấm mốc. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: máy nghiền mẫu, cân phân tích, tủ hút, giá ống nghiệm, bộ TLC, tủ sấy, tủ ủ,… Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, đĩa petri, đèn cồn,… Các loại hóa chất sử dụng CHCl3 Hexan Cồn 70o FeCl3 H2SO4 Vanilin Bột Mg kim loại HCl Acid tricloaroacetic Anhydrid acetic Metanol n-butanol Acid acetic NaCl TSA Pepton water Agar, … Phương pháp thí nghiệm Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo Khử trùng mẫu lá Lá Kim ngân được khử trùng theo các bước sau: Khử trùng sơ bộ: Mẫu lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt. Rửa kỹ từng mẫu lá trong nước rửa chén được pha loãng. Rửa lại bằng nước máy từ 4 -5 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng bên trong tủ cấy: Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng. Tiến hành lắc khử trùng mẫu lá bằng dung dịch Javel (NaOCl) 7% có bổ sung thêm vài giọt Tween 20 trong các khoảng 5 phút. Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm tạo mô sẹo. Cảm ứng tạo mô sẹo Mẫu cấy lá Kim ngân Hoa sau khi khử trùng được cắt bỏ rìa lá bị trắng hoặc nâu do do tác động của chất khử trùng và cắt phiến lá dài 1 – 2 cm sẽ được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30g/l đường sucrose, 9g/l agar và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có nồng độ như sau: 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Sau 2 tháng, ghi nhận sự phát sinh hình thái mô sẹo của mẫu cấy. Dùng mẫu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Chuẩn bị mẫu Các mẫu: lá và cành tự nhiên, hoa khô, mô sẹo, được sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60oC trong vòng từ 3 – 4 tiếng, mục đích là khử bớt nước trong vật liệu. Sau đó nghiền mẫu bằng máy nghiền, mục đích làm vật liệu trở nên nhuyễn, nhỏ để dễ dàng tiến hành quá trình chiết. Chiết lấy dịch bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm với cồn 70o: lấy bình erlen 250ml, cho mẫu khoảng 10g vào bình rồi rót cồn 70o cho đến khi xâp xấp bề mặt của lớp bột mẫu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc nhẹ. Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24h là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần lượng ít dung môi. Sau 48h, với 2 lần chiết mỗi lần là 24h, đem tất cả dịch thu được đi cô quay chân không để giúp đuổi bớt dung môi dùng chiết là cồn 70o. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa Mục đích của thí nghiệm: các phản ứng hóa học đặc trưng của từng hợp chất trong thực vật giúp ta có khái niệm sơ bộ về mặt định tính, từ đó định hướng cho việc chiết xuất cũng như việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất trong mẫu thí nghiệm. Nhưng trong thí nghiệm này, chúng tôi tập trung vào phản ứng đặc trưng của flavonoid và saponin triterpenoid vì đây là hợp chất được biết nhiều nhất trong cây Kim ngân. Thực nghiệm: dùng các phản ứng đặc trưng để kiểm tra Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 1ml cho vào từng ống nghiệm để kiểm tra. Khảo sát flavonoid: tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, tác dụng với dung dịch FeCl 5% /ethanol, phản ứng Cyanidin của Wilstatter. Khảo sát saponin: phản ứng Liebermann-Burchard, phản ứng Rosenheim, phản ứng Rosenthaler. Chỉ tiêu đánh giá: các phản ứng màu đặc trưng với các chất chỉ thị. Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Mục đích của thí nghiệm: kiểm tra sự hiện diện của hoạt chất tự nhiên có trong mẫu cần phân tích nhờ khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỉ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Khẳng định lại kết quả của trắc nghiệm sinh hóa ở trên do độ nhạy của phương pháp sắc ký lớp mỏng là cao hơn. Thực nghiệm: Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy từ 0.5 – 1ml để làm dịch chiết chấm sắc ký. Chuẩn bị hệ dung môi giải ly đặc trưng cho từng hợp chất. Chuẩn bị thuốc thử đặc trưng lên từng hợp chất. Chuẩn bị bản sắc ký: là loại tráng sẵn F254 của Merk có kích thước là 20x20 cm được chia làm 4 với mỗi bản có kích thước là 10x10 cm. Dùng viết chì vạch đường xuất phát điểm chấm mẫu cách mép dưới 1cm, cứ cách 2 mép ngoài 0.5 cm. Mẫu được chấm cách nhau 1cm. Vạch đường kết thúc chạy của dung môi triển khai cách mép trên 0.5cm. (Hình 3.1) Maãu 1cm Vạch kết thúc Vạch xuất phát Mẫu 0.5 cm 1cm 1cm 0.5cm Hình 3.1: Hình minh họa bản chấm sắc ký Dùng ống vi quản để chấm mẫu lên bản sắc ký. Mẫu chấm phải nhỏ gọn, không để lan rộng, dùng máy sấy làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần. Tiến hành chạy sắc ký: cho bản sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn dung môi triển khai. Đặt bản sắc ký vào gờ nhỏ ở đáy bình. Phải đảm bảo dung môi tiếp xúc gần sát vạch xuất phát. Đậy nắp bình, dung môi sẽ thấm lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần hoạt chất của mẫu. Chấm dứt chạy mẫu khi dung môi thấm đến vạch kết thúc. Chỉ tiêu đánh giá: sự hiện màu đặc trưng của flavonoid và triterpenoid saponin đó trên bản sắc ký với thuốc thử đặc trưng. Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân Mục đích của thí nghiệm: kiểm tra sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn cụ thể là đối với E. coli và Samonella của mẫu hoa, mẫu mô sẹo, mẫu đối chứng là kháng sinh cefalvidi. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc Thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu: Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 10 ml thể tích dung dịch để thí nghiệm. Một mẫu kháng sinh cefadroxil pha với 10ml nước cất dùng làm dịch đối chứng. Nồng độ là 50mg/ml Giống E.coli và Samonella do phòng thí nghiệm khoa môi trường và công nghệ sinh học cung cấp. Chuẩn bị giấy lọc đường kính 8mm, được hấp khử trùng trước khi sử dụng. Chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy E.coli Chuẩn bị môi trường pepton water có bổ sung 2% agar để nuôi cấy Samonella. Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng 10-5, 10-6, 10-7. Dịch nuôi cấy Samonella (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng ở 10-2, 10-3, 10-4 Đổ đĩa môi trường TSA Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli Đổ đĩa môi trường Pepton water 2% agar KS cefadroxil (T0) Dịch chiết hoa (T1) Dịch chiết mô sẹo 1 (T2) Dịch chiết mô sẹo 2 (T3) Trải 0.1 ml dịch chứa Samonella Đặt giấy thấm Ủ hiếu khí 24h, 37 oC Kiểm tra sự tạo vòng kháng sinh Cách thực hiện: Hình 3.2: sơ đồ thực hiện thí nghiệm khuếch tán qua vòng giấy lọc Mô sẹo 1: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA. Mô sẹo 2: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA. Chỉ tiêu đánh giá: kiểm tra vòng kháng khuẩn do mẫu tạo ra so với đối chứng là nước cất và kháng sinh từ đó kết luận sơ bộ có hay không hoạt tính kháng khuẩn của mẫu. Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu: Mỗi dịch chiết mẫu sau cô quay lấy 10 ml thể tích dung dịch để thí nghiệm Một mẫu kháng sinh cefaldroxil pha trong 10ml nước cất dùng làm dịch đối chứng. Nồng độ là 50mg/ml. Giống E.coli và Samonella do phòng thí nghiệm khoa môi trường và công nghệ sinh học cung cấp. Chuẩn bị ống đục lỗ bằng inox đường kính 8mm, được hấp khử trùng trước khi sử dụng. Chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy E.coli và môi trường pepton water có bổ sung 2% agar để nuôi cấy Samonella. Dịch nuôi cấy E.coli (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng 10-5, 10-6, 10-7. Dịch nuôi cấy Samonella (21h, 37oC) do phòng thí nghiệm cung cấp. Pha loãng ở 10-2, 10-3, 10-4 Cách thực hiện: Đổ đĩa môi trường TSA Trải 0.1 ml dịch chứa E.coli Đổ đĩa môi trường Pepton water 2% agar Trải 0.1 ml dịch chứa Samonella Đục lổ có bán kính 8mm, đổ vào lổ 100μl dung dịch KS cefadroxil (T0) Dịch chiết hoa (T1) Dịch chiết mô sẹo 1 (T2) Dịch chiết mô sẹo 2 (T3) Ủ hiếu khí 24h, 37oC Kiểm tra sự tạo vòng kháng sinh Hình 3.3 : sơ đồ thực hiện thí nghiệm khuếch tán qua giếng thạch Mô sẹo 1: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA. Mô sẹo 2: mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo Lá Kim ngân sau khi khử trùng, cắt thành nhiều mảnh có kích thước 1.0cm x 1.0cm, cấy vào 2 môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D kết hợp với 1mg/l BA và môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ kết hợp với 0.05 mg/l IBA để cảm ứng tạo mô sẹo. Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa có đặc tính phân chia mạnh thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Tuy nhiên, khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Chỉ có cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành là dễ cho mô sẹo dưới tác động của auxin mạnh được áp dụng riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin, còn những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng này. Ứng với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó (Ochatt và Caso, 1986). Sau 2 tháng nuôi cấy thu được kết quả như sau: Trên môi trường MS 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA: mô sẹo hình thành có màu nâu, xốp, tạo thành khối, bông trắng. Trên môi trường MS có sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA: mô sẹo hình thành có màu xanh lục, tạo thành khối, xốp. Hình 4.1: mô sẹo lá Kim ngân trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA Hình 4.2: mô sẹo hình thành từ lá Kim ngân trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học, … . Đặc điểm sinh trường của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia thành 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa. Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối. Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đuờng trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison, 1997). Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa Khảo sát sự hiện diện của flavonoid Tác dụng với H2SO4 đậm đặc Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.1 Bảng 4.1 kết quả thử nghiệm với dung dịch H2SO4 đậm đặc Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Đậm màu Cành lá tự nhiên (M2) Đậm màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Đậm màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Đậm màu M4 M3 M2 M1 Hình 4.3 kết quả phản ứng H2SO4 đậm đặc M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. Tác dụng với FeCl3 5% trong ethanol Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch FeCl3 5% vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2 Bảng 4.2: kết quả thử nghiệm với FeCl3 5% Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện vòng xanh đen Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu M1 M2 ĐC M4 ĐC ĐC ĐC M2 Hình 4.4 kết quả thử nghiệm với FeCl3 5% M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. ĐC: là dịch chiết các mẫu ban đầu Phản ứng Cyanidin của Wilstatter Phản ứng dựa trên sự khử bằng bột Mg trong HCl/ethanol trên các dẫn xuất flavonoid. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.3 Bảng 4.3 kết quả thử nghiệm phản ứng Cyanidin Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu đỏ đậm Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu đỏ Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Không đổi màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu M2 M1 ĐC ĐC ĐC ĐC ĐC M4 M3 Hình 4.5 kết quả thí nghiệm Cyanidin M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA sấy khô. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. ĐC: là dịch chiết mẫu ban đầu. Kết luận sơ bộ Bảng 4.4 tóm tắt kết quả khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonoid bằng phương pháp trắc nghiệm hóa sinh H2SO4 đậm đặc FeCl3 5% Phản ứng Cyanidin Mẫu hoa sấy khô Đậm màu Xanh đen Đỏ Mẫu cành lá tự nhiên Đậm màu Xanh đen Đỏ Mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA Đậm màu Xanh đen Không đổi màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA Đậm màu Không đổi màu Không đổi màu Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận rằng, nếu dịch chiết có chứa hợp chất flavonoid thì: Dịch chiết đậm màu lên khi tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, Dịch chiết xuất hiện màu xanh đen khi tác dụng với FeCl3 5% . Dịch chiết xuất hiện màu đỏ trong phản ứng Cyanidin Từ kết quả của các thí nghiệm (bảng 4.4) cho thấy, trong dịch chiết của hoa sấy khô, cành lá tự nhiên đều cho kết quả dương tính với các phản ứng dung dịch FeCl3 5%, dung dịch H2SO4 đậm đặc và phản ứng Cyanidin . Điều này chứng tỏ, trong dịch chiết của hoa sấy khô có thể có sự hiện diện của hợp chất flavonoid. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi (2004),trong hoa, cành lá cây Kim ngân có chứa lonicerin là hợp chất thuộc nhóm flavonoid. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2002) cũng đã ghi nhận hoa, cành lá tự nhiên của cây Kim ngân chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid. Bằng phương pháp HPLC Wie-Jong Kwak cùng cộng sự (2005) đã xác định được hàm lượng loganin từ 13.9%-41.4% thuộc nhóm flavonoid trong cành lá của cây Kim Ngân. Dưới sự kích thích của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau, mô sẹo hình thành cũng khác nhau về hình thái và màu sắc. Trên môi trường có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA mô sẹo hình thành có màu nâu, xốp, thành khối. Còn trên môi trường có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA mô sẹo hình thành có màu xanh lục, tạo thành khối, cứng. Qua ba phản ứng đặc trưng để khảo sát sự có mặt của nhóm hợp chất flavonoid thì có thể tạm thời kết luận rằng trong dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm flavonoid. Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA cho kết quả âm tính với phản ứng FeCl3 5% và phản ứng Cyanidin nhưng lại dương tính với phản ứng H2SO4 đậm đặc. Tuy nhiên không thể kết luận mô sẹo này có chứa nhóm flavonoid vì H2SO4 đậm đặc là acid mạnh nên có thể có tính phân hủy mạnh đối với một số hợp chất khác ngoài nhóm flavonoid dẫn tới dương tính giả. Từ đó kết luận rằng, dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid. Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin bằng phản ứng Liebermann-Burchard Trong mỗi ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu thêm vào đó: 1ml anhydrid acetic, 1ml cloroform, làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu dịch chiết mẫu đổi thành màu xanh dương lục, cam hoặc đỏ; màu này bền không đổi là dương tính. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết quả thử nghiệm phản ứng Liebermann – Burchard Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu M4 M3 M2 M1 Hình 4.6 kết quả phản ứng Liebermann – Burchard M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. Kết quả thí nghiệm cho thấy: Trong dịch chiết mẫu hoa sấy khô, cành lá tự nhiên có sự xuất thiện vòng cam đỏ. Kết quả cho thấy có thể có sự hiện diện của triterpenoid saponin trong mẫu. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi (1964), trong Kim ngân có nhiều saponin. Wie Jong Kwak và cộng sự (2003) phát hiện Loniceroside C là những hợp chất thuộc nhóm triterpenoid saponin trong Kim ngân bằng phương pháp HPLC. Dịch chiết của mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA có sự xuất hiện vòng cam đỏ ở mặt phân cách. Điều này chứng tỏ rằng có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid trong mô sẹo này. Dịch chiết của mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA trong phản ứng Liebermann-Burchad không đổi màu. Điều này chứng tỏ có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid trong mô sẹo này. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Khảo sát sự hiện diện flavonoid Sắc ký lớp mỏng rất hữu dụng đối với tất cả các loại flavonoid. Các aglycon của flavonol và flavon dễ dàng tách xa nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Vì vậy chỉ cần trong dịch chiết mẫu có một lượng rất nhỏ hợp chất flavonoid thì bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) vẫn có thể phát hiện được bằng cách hiện ra các vết màu đặc trưng với thuốc thử đặc trưng. Hệ dung môi: CHCl3 : metanol = 89 : 11. Hệ dung môi này giúp tách các thành phần flavonoid, anthranoid, coumarin, phenolcarbocyclic acid dưới dạng glycosid có trong dịch chiết (Nguyễn Thị Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi được giải ly sẽ được nhúng qua thuốc thử đặc trưng là FeCl3 5% /ethanol. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.7 Bảng 4.7 kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Vết màu xanh đen Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không có vết M4 M3 M2 M1 Hình 4.7 bản sắc ký sau khi nhúng thuốc thử FeCl3 5% M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá tự nhiên. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA . M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. Hệ dung môi: etyl acetate : methanol : nước = 100 : 17 : 13 Hệ dung môi trên giúp tách phần lớn các acid phenolic, coumarin và flavonoid dưới dạng aglycon (Nguyễn Thị Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi được giải ly đã được nhúng qua thuốc thử là FeCl3 5% / ethanol. Kết quả thu nhận được trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8: kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Vết màu xanh đen Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không có vết M4 M3 M2 M1 Hình 4.8 bản sắc ký sau khi nhúng thuốc thử FeCl3 5% M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. Nhận xét: 2 hệ dung mô khảo sát đều rất phù hợp vì hệ đều cho các vết chính hiện diện trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài triển khái bản mỏng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận các hợp chất thuộc nhóm flavonoid có màu xanh đen đối với thuốc thử đặc trưng là FeCl3 5% . Do vậy từ bảng kết quả 4.7, bảng 4.8 có thể kết luận: Dịch chiết hoa, cành lá tự nhiên, dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid. Còn dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid Khảo sát sự hiện diện triterpenoid Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : H2O = 65 : 35 : 10 Hệ dung môi trên giúp tách các thành phần saponin, terpenoid dạng glycosid, alkaloid (Nguyễn Kim Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi giải ly được nhúng qua thuốc thử là H2SO4 10% / ethanol và sau đó đem sấy ở 110oC từ 5 – 10 phút. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.9 Bảng 4.9: kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Vết màu tím đen Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Có vết màu không rõ ràng M4 M3 M2 M1 Hình 4.8 bản sắc ký sau khi sấy M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. Hệ dung môi n-Butanol : acid acetic : H2O = 4 : 1 : 5 Hệ dung môi trên giúp tách các thành phần đường của saponin triterpenoid, thành phần acid amin, các thành phần phân cực khác (Nguyễn Kim Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi giải ly được nhúng qua thuốc thử là H2SO4 10% / ethanol và sau đó đem sấy ở 110oC từ 5 – 10 phút. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.10. Bảng 4.10: kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Dịch chiết Hiện tượng Hoa sấy khô (M1) Vết màu tím đen Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Có vết màu không rõ ràng M4 M3 M2 M1 Hình 4.9 bản sắc ký sau khi sấy M1: mẫu hoa sấy khô. M2: mẫu cành lá sấy khô. M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA. M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. Nhận xét: 2 hệ dung mô khảo sát đều rất phù hợp vì hệ đều cho các vết chính hiện diện trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài triển khái bản mỏng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận rằng các hợp chất thuộc nhóm saponin triterpenoid hay dẫn xuất của terpen có vết màu tím trên bản sắc ký với thuốc thử đặc trưng là H2SO4 10%. Do vậy từ kết quả của bảng 4.9, bảng 4.10 có thể kết luận sơ bộ: Dịch chiết hoa, cành lá tự nhiên, dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất sapoin triterpenoid. Còn dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc T1 d2 T3 T2 d0 T0 Hình 4.10 kết quả ức chế E.coli sau khi ủ 24h, ở 37oC T0 là kháng sinh cefadroxil. T1 là dịch chiết hoa Kim ngân. T2 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA T3 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Kết quả thí nghiệm thu nhận được trình bày trong bảng 4.11: Bảng 4.11 kết quả thử nghiệm hoạt tính sơ bộ của dịch chiết đối với E.coli Mẫu Đường kính vòng kháng (d) Kháng sinh cefadroxil (T0) 27 mm Dịch chiết hoa (T1) 19 mm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) 0 mm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (T3) 0 mm Kết luận sơ bộ: Với nồng độ pha loãng nước sắc Kim ngân hoa 1/160 đã có tác dụng ứng chế đối với sự phát triển của E.coli (Đỗ Tất Lợi, 2004). Mặc dù chưa thể xác định nồng độ chính xác của các dịch chiết mẫu nhưng với kết quả thu nhận ở bảng 4.11 ta có chỉ có dịch chiết hoa là xuất hiện vòng kháng, với đường kính vòng kháng khuẩn là 19mm nhỏ hơn so với đường kính vòng kháng kháng sinh là 40mm. Bên cạnh đó tại ví trí đặt giấy thấm dịch chiết hoa phía ngoài vòng kháng khuẩn vẫn có sự hiện diện của E.coli mật độ thấp và ở dạng những khuẩn lạc riêng rẻ. Vì có thể trong dịch chiết hoa thành phần kháng khuẩn chủ yếu là flavonoid nhưng không ở dạng tinh khiết nên khả năng kháng khuẩn của dịch chiết yếu cho nên vẫn có những khuẩn lạc phát triển và nồng độ dịch chiết hoa chưa đủ để kháng hoàn toàn E.coli. Còn ở dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA tuy không xuất hiện vòng kháng nhưng có mật độ E.coli thấp nhưng không rõ ràng có thể do nồng độ sử dụng vẫn chưa thích hợp đủ để ức chế được . Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA thì hoàn toàn không có tính kháng khuẩn. Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Phương pháp này có ưu điểm hơn phương pháp khuếch tán qua giấy lọc là nó giúp dịch chiết khuễch tán đều hơn từ trong dưới lòng giếng thạch lên tới bề mặt thạch, còn phương pháp khuếch tán qua giấy lọc chỉ giúp dịch khuếch tán trên bề mặt thạch. Đối với E.coli T4 T2 d1 T1 d0 T0 Hình 4.11 kết quả ức chế E.coli sau 24h ở 37oC T0 là kháng sinh cefadroxil. T1 là dịch chiết hoa Kim ngân. T2 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA T3 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Kết quả thí nghiệm thu nhận được trình bày trong bảng 4.12: Bảng 4.12 kết quả thử nghiệm hoạt tính sơ bộ của dịch chiết đối với E.coli Mẫu Đường kính vòng kháng (d) Kháng sinh cefadroxil (T0) 40 cm Dịch chiết hoa (T1) 19 cm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) 0 cm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (T3) 0 cm Cũng như kết quả của thí nghiệm qua phương pháp khuếch tán qua giấy lọc thì dựa vào bảng kết quả 4. 12 thì dịch chiết hoa cũng xuất hiện vòng kháng khuẩn và có đường kính là 19 mm nhỏ đường kính kháng khuẩn của kháng sinh là 40mm . Và cũng có tính kháng khuẩn yếu và vẫn còn khuẩn lạc phát triển bên ngoài vòng kháng do dịch chiết chưa tinh khiết và nồng độ dịch chưa đủ ức chế . Trong thí nghiệm này thì dịch chiết của mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA không thấy rõ vòng kháng, còn mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA cũng không có xuất hiện vòng kháng khuẩn. Đối với Samonela T3 T2 d1 T1 T0 d0 Hình 4.12 kết quả ức chế Samonell sau 24h, ủ ở 37oC T0 là kháng sinh cefadroxil. T1 là dịch chiết hoa Kim ngân. T2 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA T3 là dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Kết quả thí nghiệm thu nhận được trình bày trong bảng 4.13: Bảng 4.13 kết quả thử nghiệm hoạt tính sơ bộ của dịch chiết đối với Samonella Mẫu Đường kính vòng kháng (d) Kháng sinh cefadroxil (T0) 40 mm Dịch chiết hoa (T1) 24 mm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (T2) 0 cm Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (T3) 0 cm Với nồng độ nước sắc Kim ngân là 1/320 là có tác dụng ức chế đối với sự phát triển của vi khuẩn Samonella (Đỗ Tất Lợi, 2004). Mặc dù chưa có thể xác định nồng độ chính xác của các dịch chiết mẫu nhưng qua bảng kết quả 4.13, dịch chiết hoa là có xuất hiện vòng kháng khuẩn với đường kính là 24 mm nhỏ hơn so với vòng kháng khuẩn của kháng sinh cefadroxil là 40 mm. Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA chưa xuất hiện vòng kháng rõ ràng vì có thể nồng độ của dịch chiết cũng chưa phù hợp để có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Samonella. Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA thì cũng không thấy xuất hiện vòng kháng khuẩn. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua các trắc nghiệm hóa sinh, TLC thì ta có thể kết luận rằng: Mẫu hoa, lá cành tự nhiên, mô sẹo hình thành từ lá của cây Kim ngân tự nhiên trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA đều có thể có sự hiện diện của hợp chất thuộc nhóm flavonoid và saponin triterpenoid với những mức độ khác nhau. Còn mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA là có thể không có sự hiện diện của các hợp chất nhóm flavonoid hay saponin triterpenoid hoặc là chứa một nhóm hợp chất khác. Qua các thí nghiệm khảo sát hoạt tính sơ bộ của dịch chiết hoa, hai dịch mô sẹo và đối chứng là kháng sinh cefadroxil ta có thể kết luận: Dịch chiết hoa có khả năng ức chế sự phát triển cả 2 vi khuẩn là E.coli và Samonella như Đỗ Tất Lợi (2004) đã ghi nhận với nồng độ nước sắc Kim ngân là 1/160 là có khả năng ức chế sự phát triển của E.coli và nồng độ nước sắc Kim ngân là 1/320 là có khả năng ức chế sự phát triển của Samonella . Dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA thì vẫn chưa thể hiện rõ ràng hoạt tính kháng khuẩn mặc dù qua các trắc nghiệm hóa sinh và TLC cho kết quả dương tính với nhóm hoạt chất flavonoid và saponin triterpenoid. Có thể nồng độ của dịch chiết vẫn chưa đủ để ức chế được E.coli và Samonella. Dịch chiết mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA thì hoàn toàn không có khả năng kháng khuẩn phù hợp với kết quả của các thí nghiệm trắc nghiệm hóa sinh, TLC cũng cho kết quả âm tính với hợp chất saponin triterpenoid và nhất là flavonoid vì những hợp chất thuộc nhóm này mới khả năng kháng khuẩn mạnh. Kiến nghị Do điều kiện phòng thí ngiệm, thời gian có hạn nên tôi xin đưa ra một số kiến nghị để nghiên cứu được hoàn thiện hơn: Khảo sát thêm trong mô sẹo phát sinh từ lá của cây Kim Ngân ngoài hai hợp chất trên còn có thêm hoạt chất nào không. Khảo sát thử các phương pháp nuôi cấy khác nhau như nuôi cấy huyền phù, lỏng, lắc,… hoặc trong quá trình nuôi cấy có thể bổ sung tiền chất, elicitor,…để xem khả năng sinh tổng hợp các hợp chấp thứ cấp. Khảo sát khả năng kháng khuẩn và xác định được nồng độ cụ thể đối với từng loài vi khuẩn gây bệnh khác từ dịch chiết hoa hay dịch chiết mô sẹo CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, phần 2 – Phát triển. Nxb Quốc gia TP.HCM. Diệp Quỳnh Như, Đỗ Thị Tuyến, Nguyễn Thị Như Quỳnh (2008), Tài liệu hướng dẫn thực tập môn sinh phẩm chứa hoạt chất thứ cấp, NXB Viện sinh học nhiệt đới, Hồ Chí Minh. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Xuân Thắng(2005), Tác dụng chống viêm của flavonoid cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae) khi kết hợp với a-amylase, Tạp chí Dược học, Hà Nội. Lê Thị Diễm Hồng, Nguyễn Thị Hồng Nhiên, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Xuân Thắng (2007), Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của saponin và flavonoid cây Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)”, Tạp chí Dược học, Hà Nội Nguyễn Kim Bích và cộng sự (2007), Phân tích và xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của dươc liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa,Viện dược liệu. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia thành phố HCM, Hồ Chí Minh. Nguyễn Thái Quỳnh Quyên (2009), Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA và 2, 4–D lên mẫu lá Kim ngân, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Kỹ thuật công nghệ thành phố HCM, Hồ Chí Minh. Phan Minh Giang, Nguyễn Tuấn Minh, Nguyễn Thị Minh Hằng, Phan Tống Sơn (2005), Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ câyKim ngân (Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae), Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 3. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2002), Bài giảng dược liệu (I, II), NXB Y học, Hà Nội. Quách Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2007), Nhân giống in vitro cây bắt ruồi Drosera Burmanni Vahl để thu nhận một hợp chất Quinone có hoạt tính sinh học, Tạp chí phát triển KH&CN, tập 10, số 04, Hồ Chí Minh. Tiếng Anh Berlin J, Sasse F (1985) Selection and screening techniques for plant cell cultures. Advanced Biochemistry and Engineering 31: 99-132. Bruneton J (1995) Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Intercept UK, 522. Choi KT, Ahn IO, Park JC (1994) Production of ginseng saponin in tissue culture of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer). Russian Journal of Plant Physiology. 41: 784-788. Chueh FS, Chen CC, Sagare AP, and Tsay HS (2000) Quantitative determination of secoiridoid glucoside in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var. formosana by high performance liquid chromatography. Planta Medica 67: 70-73. Cragg GM, Schepartz SA, Suffuess M, Grever MR (1993) The taxol supply crisis. New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV agents, Journal of Natural Products 56: 1657-1668. Dicosmo F and Tower GHN (1984) Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells. In: Recent Adv Phytochem 18 (eds) Timmerman SC and Loewus FA. Plenum Press, NewYork: 97-175. Dicosmo F, Misawa M (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolite production, Biotechnology Advance 13 (3): 425-453. Dixon RA (1999) Plant natural products: the molecular genetic basis of biosynthetic diversity. Current Opinion in Biotechnology 10: 192-197. Fett-Neto AG, Stewart JM, Nicholson SA, Pennington JJ, and DiCosmo F (1994) Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and and amino acid feeding to cell cultures of T. cuspidata. Biotechnology Bioengineering 44: 967-971. Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N (1999) Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biological Chemistry 380: 825-839. Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973) Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull 21(1): 98-101. Goleniowski M, Trippi VS (1999) Effect of growth medium composition on psilostachyinolides and altamisine production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 56: 215-218. 13. Hu ZB and Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Phytochemistry 32: 699-703. Issell BF, Rudolph AR, and Louie AC (1984) Etoposide (VP-16-213): An overview. In BF Issell, FM Muggia, and SK Carter (eds.), Etoposide (VP-16-213)-Current status and new developments. Academic Press Inc, Orlando. Kadkade PG (1981) Formation of podophyllotoxin by Podophyllum peltatum tissue cultures. Naturwiss 68: 481-482. Kadkade PG (1982) Growth and podophyllotoxin production in callus tissues of Podophyllum peltatum. Plant Sci Lett 25: 107-115. Lee JM (2001) Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. Lee CY, Lin FL, Yang CT, Wang LH, Wei HL, and Tsay HS (1995) Taxol production by cell cultures of Taxus mairei. Proc. Symp. on Development and Utilization of Resources of Medicinal Plants in Taiwan, Taiwan Agricultural Research Institute, Taiwan. TARI Special Publication 48: 137-148. Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the production of ajmalcine and catharanthine from immobilizes Catharanthus roseus cells. Biotechnology Bioengineering 67: 61-71. Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997) Production of diosgenin by hairy root cultures of Trigonella foenum-graecum L. Plant Cell Reports 16(9): 632-636. Misawa M (1994), “Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite”, FAO Agricultural services bulletin, 108. Miyasaka H, Nasu M, and Yoneda K (1989) Salvia miltiorrhiza: In vitro production of cryptotanshinone and feruginol. In: Biotechnology in agriculture and forestry. 7, Medicinal and Aromatic Plants II ed. By Bajaj YPS. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg: 417- 430. Moreno PRH, Heijden R, Verpoorte R (1993) Effect of terpenoid precusor feeding and elicitation on formation of indole alkaloids in cell suspension cultures of Catharanthus roseus. Plant Cell Reports, 12: 702-705. Mulbagal V, Tsay HS (2004) Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied Science and Engineering 2(1): 29-48. Rao SR (2000) Biotechnological production of phyto-pharmaceuticals. Journal of Biochemistry Molecular Biology Biophysics 4: 73-102. 26. Shimomura K, Kitazawa T, Okamura N, and Yagi A (1991) Tanshinone production in adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza. Journal of Natural Products 54: 1583. Skrzypczak L, Wesolowska M, and Skrzypczak E (1993) Gentiana species XII: In vitro culture, regeneration, and production of secoirridoid glucosides. In Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 172-186. Slichenmyer WJ, Von Horf DD (1991) Taxol: a new and effective anticancer drug. Anti-Cancer Drugs 2: 519-530. Smollny T, Wichers H, De Rijk T, Van Zwam A, Shasavari A, and Alfermann AW (1992) Formation of lignans in suspension cultures of Linum album. Planta Med Suppl 58: A622. Song Jin Lee and et (năm), Loniceroside C , an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica Thunb., SK Chemicals Ltd., Suwon, Korea Srinivasan V, Pestchanker L, Hirasuma MT, Taticek RA, and Shuler ML (1995) Taxol production in bioreactors; kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake, and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata. Biotechnol Bioeng 47: 666-676. Silvestrini A, Pasqua S, Botta B, Monacelli B, Heijden R, Verpoorte R (2002) Effect of alkaloid precusor feeding on a Camptotheca acuminata cell line. Plant Physiology and Biochemistry 40: 749-753. Tabata M, Yamamoto H, and Hiraoka N (1972) Les Cultures de Tissus de Plantes. Colloques internationaux de CNRS. No 193. Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994) The production of imperatorin from Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion culture. J Agric Assoc China. 168: 32-48. Tsay HS (1999) Tissue culture technology of medicinal herbs and its application of medicinal herbs and its application in Taiwan. In: CH Chou, GR Waller, and C Reinhardt (eds.), Biodiversity and Allelopathy: from Organisms to Ecosystems in the Pacific. Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 137-144. Verpoorte R (1998) Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary metabolites as leads in drug development. Drug Discovery Today 3: 232-238. Yamada Y, and Sato F (1981) Production of berberine in cultured cells of Coptis japonica. Phytochemistry 20: 545-547. Yamamoto Y, Mizuguchi R, Yamada Y (1982) Selection of a high and stable pigment-producing strain in cultured Euphorbia millii cells. Theoretical and Applied Genetics 61: 113-116. Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) Tissue culture of Dioscorea doryophora Hance. II. Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin content. Chinese Agronomy Journal 4: 257-268. Wang HQ, Yu JT and Zhong JJ (1999) Significant improvement of taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. Process Biochemistry 35: 479-483. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, and McPhail AT (1971) Plant antitumor agents VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. Journal of American Chemical Society 93: 2325-2327. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization, characterization and taxol production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 35: 181-193. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1994) Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and production of taxol. Journal of Plant Physiology 144: 183-188. Woerdenbag HJ, Van Uden W, Frijlink HW, Lerk CF, Pras N, and Malingre ThM (1990) Increased podophyllotoxin production in Podophyllum hexandrum cell suspension cultures after feeding coniferyl alcohol as a β-cyclodextrin complex. Plant Cell Rep 9: 97-100. Wu CT, Vanisree M, Satish MN, Chen CL, Yang TF, and Tsay HS (2003) Isolation and quantitative analysis of cryptotanshinone, an active quinoid diterpene formed in the callus of Salvia miltiorrhiza Bunge. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26(6): 845-848. Zheng HZ, Dong ZH, and She J (1997) Longdan. In: Modern Study of Traditional Chinese Medicine 2: 1398-1408. Beijing Xue Yuan Press, Beijing, China. Wie-Jong Kwak, Yong-Baik Cho, Chang-Kyun Han, Hee Jae Shin, Keun Ho Ryu, Hunseung Yoo, Hae In Rhe, (năm), Extraction and purification method of active constituents form stem of lonicera japonica thunb., its usage for anti – inflammatory and analgesic drug.