Đồ án Khảo sát quá trình lên men acid lactic bởi Lactobacillus drebrueckii

n lớn chúng rất dễ hòa tan trong nước trừ tiroxin và xixtin.. Nitơ tổng số trong rỉ đường mía của Mỹ xê dịch trong khoảng 0.4 ÷ 1.5% trung bình là 0.7% trọng lượng của rỉ đường Hợp chất phi đường không chứa nitơ bao gồm pectin, araban, galactan hoặc các sản phẩm thủy phân của chúng là arabinoza và galatoza, chất nhầy, chất màu và chất thơm. Pectin bị kết tủa trong quá trình chế biến đường nhưng các chất vừa nói không kết tủa và gần như toàn vẹn đi vào rỉ đường (1.22 – 1.56%). Matubara. K. và Kinoshita, S. đã phân tích định tính các loại acid hữu cơ và cho biết các acid sau đây có trong rỉ đường mía của các nước Đông Nam Á : acid aconitic, lactic, malic, xucxinic, glycolic, xitric và lượng nhỏ fumaric, oxalic và gluconic. Riêng acod aconitric có nồng độ khá cao, xấp xỉ 1.0 – 1.5%. Sự có mặt của acid này càng nhiều thì sản lượng đường càng thấp. Đặc biệt các loại mía có vị chua không thể đưa vào sản xuất được. Mía trồng ở những vùng quá nóng như Louisiana và Florida phát triển rất nhanh nên nồng độ aconitic trong mía là 0.1 – 0.2% và trong rỉ đường là 3 – 7%. Do vậy người ta đã tiến hành thu hồi loại acid này làm phụ phẩm của nhà máy đường trước khi đem rỉ đường đi chế biến. Các chất màu của rỉ đường bao gồm các chất caramen, melanoit, melanin và phức phenol-Fe+2. Cường độ màu tăng ba lần khi nhiệt độ tăng thêm 10 oC. Có thể chia các hợp chất màu thành nhiều nhóm: _ Chất caramen: Xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân sacharoza kèm theo lọai trừ nước và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. _ Phức chất polyphenol -Fe+2: là Fe+2- brenzcatechin có màu vàng xanh không thể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường. _ Melanoidin: Đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và acid amin mà chủ yếu là acid aspactic. Sản phẩm ngưng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đường. _ Melanin: Được hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acid amin thơm nhờ xúc tác của enzyme polyphenol-oxydaza khi có mặt của O2 và Cu+2. Các acid amin thơm thường bị oxy hóa là tiroxin và brenzocatechin. Các melanin thường bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nước đường nên chỉ tìm thấy lượng rất nhỏ trong rỉ đường. _ Humin: Được trùng hợp từ 66 – 68 các đơn vị cấu tạo của acid amin. Từ đó phân tích ra khoảng 52 – 53 gốc acid aspactic, 5 gốc acid amino-β-butyric, 2 gốc acid glutamic, 2 gốc β- amino propionic và 1 gốc acid p- butyric, 2 gốc acid -p- amino- izovaleric. _ Ngoài ra rỉ đường còn chứa hợp chất màu nâu có công thức cấu tạo C17-18H26-27O10N. [3] _ Chất keo: Có trong rỉ đường chủ yếu là pectin, chất sáp và chất nhầy. Các chất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài môi trường. Ngoài ra các chất keo là nguyên nhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. _ Các chất phi đường vô cơ chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ đường. Độ tro của rỉ đường mía thấp hơn độ tro của rỉ đường củ cải đường. Muối Kali có khá nhiều trong rỉ đường tiếp đến là canxi và dư lượng SO2. Điều này dễ hiểu vì muối Kali được dùng để bón cho mía còn muối canxi và gốc sunfat được thêm vào ở giai đoạn xử lý nước mía và tinh luyện đường. Bảng 2.1 Thành phần tro trong chất khô của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (%) [2] Thành phần Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía K2O 3.9 3.5 CaO 0.26 1.5 SiO2 0.10 0.5 P2O5 0.06 0.2 MgO 0.16 0.1 Na2O 1.30 Al2O3 0.07 0.2 Fe2O3 0.02 Dư lượng CO2 3.50 - Dư lượng SO2 0.55 1.6 Cl- 1.60 0.4 Tổng số 11.52 8.0 2.2.2. Thành phần các chất sinh trưởng Ngoài các nguyên tố kim loại và các á kim kể trên, rỉ đường mía còn chứa nhiều các nguyên tố khác với lượng cực kỳ nhỏ chỉ có thể tính bằng mg/kg rỉ đường như: Fe 115 mg, Zn 34 mg, Mn 18 mg, Cu 4.9 mg, B3.0 mg, Co 0.59 mg và Mo 0.2 mg. Rỉ đường mía rất giàu các chất sinh trưởng như acid pantotenic, nicotinic, folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin. Rỉ đường mía Mĩ không thua kém cao ngô là loại vẫn thường dùng làm nguồn cung cấp chất sinh trưởng cho một số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Bảng 2.2 Thành phần một số chất sinh trưởng của rỉ đường mía và cao ngô (µ/100gam) [3] Loại chất sinh trưởng Rỉ đường mía Cao ngô Mexico Cuba Mĩ B1 140 - 830 640 B2 - - 250 510 B6 700 - 650 910 Acid nicotinic - - 2100 8900 Acid pantotenic 12000 - 2140 510 Acid folic - - 3.8 12 Biotin 65 10.8 120 49 2.2.3. Vi sinh vật trong rỉ đường mía: Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía. Đa số chúng từ nguyên liệu, một số nhỏ từ không khí, và đất vào dịch đường. Loại nào chịu được tác dụng nhiệt hay tác dụng của hóa chất thì tồn tại. Có thể phân chúng thành 3 loại: Vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Trong đó lọai đầu là nguy hiểm hơn cả vì nó gồm nhiều giống có khả năng sinh bào tử. Người ta chia rỉ đường làm 3 loại tùy theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm ( Bảng 2.3): Bảng 2.3 Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm[3] Loại rỉ đường Số lượng vi sinh vật trong 1 gram rỉ đường Đánh giá và xử lý I 100,000 Rất tốt, không cần xử lý II 100,000 – 1,000,000 Trung bình, cần thanh trùng. III 1,000,000 – 5,000,000 Nhiễm nặng, cần xử lý nghiêm ngặt bằng hóa chất và tác dụng nhiệt. 2.2.4. Lực đệm của rỉ đường mía Lực đệm là loại lực có sức tự cản sự biến đổi phản ứng của rỉ đường khi bổ sung kiềm hoặc axít. Rỉ đường mía có tính đệm đặc trưng. Bình thường pH của rỉ đường mía nằm trong khỏang 5.3 – 6.0 . Trong quá trình bảo quản pH có thể bị giảm do hoạt động của vi sinh vật tạp nhiễm tạo ra các acid hữu cơ. Khi thêm HCl hay H2SO4 vào rỉ đường, acid sẽ tác dụng với các muối kiềm của các acid hữu cơ tự do, qua đó pH của rỉ đường bị thay đổi rất ít khi tiếp tục thêm acid HCl hay H2SO4. Lực đệm của rỉ đường biểu hiện mạnh nhất ờ pH 3.0 – 5.0, trung bình ở pH5.0 – 6.0 và rất ít ở pH 6.0 – 7.07. Mía đường là thế mạnh của Việt Nam, vào năm 2000 đạt năng suất triệu tấn/năm. Do đó khả năng tận dụng nguồn rỉ đường là rất lớn. Hiện nay rỉ đường chủ yếu được ứng dụng sản xuất acid lactic và ethanol. Nghiên cứu của Arti Dumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and Digambar Gokhale tại Ấn Độ, sử dụng nguồn rỉ đường để lên men sản xuất acid lactic, tác giả đã sử dụng nguồn đường trong rỉ đường cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii subsp, do trong rỉ đường hàm lượng protein rất thấp do đó cần bổ sung cao nấm men cung cấp nitơ cho vi khuẩn. Kết quả khảo sát hàm lượng cao nấm men 0.5g/l cho hàm lượng acid lactic đạt nồng độ tối ưu là 166g/l.[8] 2.3. Cố định tế bào vi sinh vật: 2.3.1. Định nghĩa: Sự cố định tế bào vi sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên. Phase chứa tế bào thong thường không tan trong nước và là polymer cao phân tử có tính ưa nước. Tế bào sau khi cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng nếu mong muốn. 2.3.2. Ưu điểm và nhược điểm của tế bào vi sinh vật cố định: Ưu điểm: Enzyme của tế bào ổn định hơn enzyme ở dạng tự do khi tế bào được gắn trên chất mang polymer tự nhiên, cố định tế bào vi sinh vật không đòi hỏi khâu tách chiết và tinh sạch enzyme, tế bào vi sinh vật cố định có khả năng thực hiện các quá trình gồm nhiều phản ứng enzyme kế tiếp nhau và có thể được sử dụng nhiều lần theo chu kỳ hoặc liên tục, trong tế bào vi sinh vật cố định ,song song với quá trình trao đổi chất còn diễn ra quá trình tái tạo cofactor. Nhược điểm: Protease có mặt trong tế bào vi sinh vật có thể gây hiện tượng thủy giải đối với enzyme mà ta quan tâm, trong tế bào vi sinh vật cố định có thể xảy ra các phản ứng phụ không đặc hiệu, tế bào vi sinh vật cố định gây cản trở khuếch tán bổ sung đối với quá trình vận chuyển cơ chất và sự cản trở này rất khó đánh giá về mặt định lượng, enzyme đặc hiệu của tế bào vi sinh vật cố định có thể giảm hoạt độ riêng.[5] 2.3.3. Các yêu cầu đòi tế bào vi sinh vật cố định: Sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp, các tế bào phải có khả năng chiếm thể tích riêng của thiết bị phản ứng nhiều nhất nhằm làm tăng năng suất thể tích. Cơ chất và sản phẩm tạo ra phải có khả năng khắc phục được hàng rào cản trở khuếch tán, chất xúc tác (tế bào gắn vào chất mang ) phải dễ dàng khuấy trộn được và bền về mặt cơ học. Chất xúc tác phải ổn định trong khoảng nhiệt độ họat động của quy trình công nghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình công nghệ, phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào họat động của quá trình trao đổi chất đặc thù với từng cơ thể vi sinh vật. [5] 2.3.4. Giới thiệu về chất mang Cellulose vi khuẩn ( Bacterial Cellulose – BC ) Cellulose là một lọai polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất, không những được xem như thành phần chính của sinh khối thực vật, mà còn là đại diện polymer ngọai bào của vi sinh vật. BC phụ thuộc vào những sản phẩm đặc trưng của quá trình trao đổi chất nguyên thủy và chủ yếu là màng bảo vệ, trong khi cellulose thực vật đóng vai trò cấu trúc tế bào. Cellulose được tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, và Sarcina (Jonas và Farah, 1998). Các sinh vật tổng hợp Cellulose hiệu quả nhất là vi khuẩn sinh acid acetic, Gram (-) Acetobacter xylinum (phân loại như Gluconacetobacter xylinus, Yamada và cộng sự, 1997; Yamada,2000), loại vi khuẩn được sử dụng làm vi sinh vật mẫu dùng trong những nghiên cứu ứng dụng và nghiên cứu cơ bản trên cellulose. Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của BC là độ tinh sạch hóa học. Đây là đặc điểm phân biệt cellulose vi khuẩn với cellulose thực vật, loại cellulose thường liên kết với hemicellulose và lignin. Do những đặc tính duy nhất được tạo ra từ cấu trúc hạt cực mịn, BC có nhiều ứng dụng trong ngành giấy, dệt sợi và công nghệ thực phẩm; được xem như vật liệu sinh học trong nghành mỹ phẩm và y khoa (Ring và cộng sự, 1986). Ứng dụng rộng hơn của loại polysaccharide này phụ thuộc vào quy mô sản xuất và chi phí của nó.Vì vậy,các nghiên cứu cơ bản được tiến hành cùng những nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực cải tiến giống và phát triển quá trình sản xuất. Hình thái đại thể của BC phụ thuộc nghiêm ngặt vào những điều kiện nuôi cấy ( Watanabe và cộng sự,1998,a; Yamanaka và cộng sự,2000). Trong các điều kiện tĩnh, vi khuẩn tích lũy các mãng (BC-S) cellulose trên bề mặt môi trường nước luộc thịch chứa dinh dưỡng ở mặt phân giới ( phân cắt phase) khí-lỏng giàu oxy. Các sợi phụ cellulose nhô ra từ các lỗ sắp theo thứ tự đường thẳng ở bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh thành các vi sợi và ép sâu hơn vào môi trường tăng trưởng.Vì thế, màng mỏng giống như da, nâng đỡ quần thể tế bào A.xylinum bao gồm các dãi cellulose chồng lên nhau và xoắn vào nhau tạo thành các mặt phẳng song song và vô tổ chức (Jonas và Farah,1998). Các sợi BC-S liền kề nhau thường ích phân nhánh và nối liền nhau hơn các sợi của BC được tạo trong môi trường cấy lắc (BC-A), ở dạng những thể hạt không đều nhau, những dãi hình sao và hình sợi, phân tán đều trong nuôi cấy lỏng ( Vandamme và cộng sự, 1998) Tính chất BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao hơn so với các dạng cellulose khác, không chứa lignin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hoàn toàn. Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt. Trong điều kiện ngập nước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose. Khả năng kết sợi tạo tinh thể tốt. Tính bền cơ học tốt, khả năng chịu nhiệt tốt. Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản phẩm mong muốn không cần qua bước trung gian. Chẳng hạn như sản xuất giấy không cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ. Đặc biệt là vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC thu được trong điều kiện là nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng tạo nên chặc chẽ hơn. [5] Vi sinh vật tổng hợp BC BC được tổng hợp bởi một vài giống vi khuẩn, trong đóa chủng Acetobacter phổ biến nhất Các giống vi sinh vật tổng hợp BC được giới thiệu trong bản sau: Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật tạo màng cellulose [5] Chủng vi sinh vật Cấu trúc cellulose Acetobacter Màng mỏng, ngọai bào bao gồm các dải hẹp tạo thành Achromobacter Sợi nhỏ Aerobacter Sợi nhỏ Agrobacterium Sợi nhỏ, ngắn Alcaligenses Sợi nhỏ Pseudomonas Sợi nhỏ đan vào nhau Rhizobium Sợi nhỏ, ngắn Sarcina Cellulose vô định hình Zoogloea Không xác định A. xylinum ( tương tự A. aceti spp. Xylinum, A. xylinus) là chủng tổng hợp BC hiệu quả nhất. Hiện nay, chủng này được tái phân lập và được xếp thuộc giống Gluconacetobacter như G. xylinus ( Yamada và cộng sự, 1998,2000) cùng với các loài khác ( G. Hansensii, G. Europaeus, G. Oboediens và G. Intermedius). Chức năng sinh lý học Trong môi trường sống tự nhiên, phần lớn vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào. Các tế bào vi khuẩn tổng hợp cellulose được bẫy trong mạng lưới polymer, mà mạng này thường xuyên nâng đỡ khuẩn lạc ở mặt phân giới lỏng-khí. Vì thế, các chủng tạo thành BC có thể sống trong nước thải. Chất nền polymer tham gia trong sự dính chặt của tế bào lên trên bất kỳ bề mặt nào có thể được sử dụng và tạo điều kiện cho sự cung cấp dinh dưỡng. Nồng độ của chúng trong lưới polymer được tăng cường đáng kể do các tính chất hấp phụ so với môi trường nước xung quanh. Một số tác giả cho rằng cellulose tổng hợp bởi A. xylinum cũng đóng vai trò dự trữ và có thể được sử dụng bởi các vi sinh vật khi đói. Sự phân hủy của nó sau đó sẽ được xúc tác bởi exo và endoglucanase. Sự có mặt đồng thời của hai chất này được tìm thấy trong nuôi cấy lỏng một số chủng A. xylinum sản sinh cellulose. [5] Do độ nhớt và các đặc tính hút nước của lớp cellulose, khả năng kháng lại các thay đổi bất lợi của các tế bào sản sinh BC (sự giảm hàm lượng nước, biến đổi pH, sự xuất hiện các chất độc, các sinh vật gây bệnh...) trong môi trường sống tăng lên và các tế bào này có thể sinh trưởng sâu hơn và phát triển bên trong màng. Người ta cũng khám phá ra rằng cellulose bảo vệ các tế bào vi khuẩn khỏi sự bức xạ tia tử ngoại. 23% tế bào vi khuẩn sản sinh acid acetic được bao bởi BC sống sót một giờ khi sử lý với sự nhiễu xạ tia tử ngoại. Việc loại bỏ polysaccharide bảo vệ làm giảm mạnh khả năng sống của các tế bào vi khuẩn. 2.3.5. Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 2.3.5.1. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang Phương pháp liên kết cộng hóa trị Đây là phương pháp liên kết tế bào với các polymer đã được họat hóa.Bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào vi sinh vật với chất mang thông qua ”cầu nối” nào đó. Cầu nối này phải có kích thước không lớn lắm và có hai đầu, một đầu nối polymer còn đầu kia nối với tế bào. Phương pháp hấp phụ Đây được coi là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về cố định tế bào vi sinh vật. Trong quá trình cố định vi sinh vật bằng cách hấp phụ có các liên kết sau được hình thành: Liên kết tĩnh điện Van Der Walls: Giữ tế bào và bề mặt chất mang tạo nên một sự chênh lệch điện thế giữa bề mặt chất mang và bề mặt tế bào. Giúp tế bào và chất mang gắn liền nhau. Lực mao quản: Chất mang có các mao quản,khi được ngâm trong các hiền phù vi sinh vật sẽ hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào trong lòng chất mang. Liên kết ion: Bề mặt chất mang và vi sinh vật có mang các ion trái dấu, nhờ vậy tế bào vi sinh vật liên kết với chất mang 2.3.5.2. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang Đối với tế bào vi sinh vật, trong một số trường hợp không nhất thiết phải gắn chặt tế bào vào chất mang polymer và có thể giữ nó bên trong polymer, lúc này polymer tạo thành bao xung quanh tế bào. Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui qua khỏi mạng, nhưng đồng thời đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ dàng. Có một số cách bao gói tế bào như sau: Nhốt trong gel Gel là polymer tổng hợp như polyacrylamide, hydroxyletyl-2-metacrylate. Hay alginate hoặc carrageenan cũng có khả năng tạo gel rất tốt. Phương pháp nhốt trong gel là phương pháp dựa trên cơ sở tạo màng bọc hay polymer. Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm có thể thẩm thấu ra ngoài hay vào trong thông qua màng bọc này và tế bào vẫn ở nguyên trong gel. Nguyên tắc thực hiện đơn giản: Tế bào được trộn vào trong 1 polymer, sau đó tiến hành quá trình trùng hợp với sự có mặt của tác nhân khâu mạch, khi đó tế bào sẽ được bao bọc trong khuôn gel mới. [5] Nhốt trong các sợi nhỏ của sợi tổng hợp Cho dòng chảy tuần hoàn bên trong sợi, do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lắp thường gặp với các màng. Các sợi được dùng thường là các sợi nhân tạo. Các sợi này thường có độ bền acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan. Phương pháp này thường đơn giản trong thao tác hoạt động và không đòi hỏi cải biến hóa học đối với chất mang polymer sợi. Polymer tạo sợi sử dụng trong cố định tế bào thường có giá rẻ và phổ biến ở số lượng đáng kể. [5] 2.3.5.3. Cố định vi khuẩn L.delbrueckii bằng BC Với những tính chất và cấu tạo của BC, ta thấy BC là chất mang thích hợp để cố định vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ, kích cỡ của sợi cellulose phù hợp với việc cố định tế bào vi khuẩn L.delbrueckii lên BC. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng với không khí, làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và giúp tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Nhờ tính dẻo dai và tính hút nước, các lớp cellulose giúp các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, sự xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật cạnh tranh. Sau khi được vắt kiệt nước, BC có khả năng hấp phụ và trương nở tốt khi đưa dịch giống vào. Mặt khác, với phương pháp hấp phụ này ta không cần sử dụng thêm những hóa chất đặc biệt, do đó ít gây ảnh hưởng hoạt tính của vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường và rẻ tiền. Từ những nguyên nhân trên, ta thấy cellulose là 1 loại giá thể phù hợp để cố định vi sinh vật. 2.4. Hệ thống lên men 2.4.1. Các khái niệm chung Một quy trình sàn xuất các sản phẩm công nghệ sinh học có nhiều thiết bị tham gia. Ta có thể chia ra làm bốn nhóm thiết bị như sau: _Thiết bị trước lên men bao gồm các thiết bị chuẩn bị môi trường, tiệt trùng môi trường, nhân giống. _Thiết bị lên men (fermenter). _Thiết bị sau lên men gồm các thiết bị thu hồi sản phẩm, chế biến sảm phẩm lên men thành các dạng thương phẩm. Có thể kể tên các thiết bị như: trích ly, ly tâm, sấy, lọc, kết tinh, hấp phụ, bao gói... _Thiết bị bổ trợ cho nhóm thiết bị trên: các băng tải, thùng chứa... Thiết bị lên men (fermenter) là các thiết bị đóng vai trò chính trong một quy trình sản xuất. Tại đây,các phản ứng sinh hóa diễn ra, chuyển hóa các nguồn cơ chất thành các sản phẩm mong muốn thông qua các vi sinh vật và các enzyme của chúng. Các loại sản phẩm của quá trình lên men thường là: sinh khối của vi sinh vật, sản phẩm trao đổi chất hoặc các loại enzyme sử dụng cho các chuyển hóa sinh hóa khác. 2.4.2. Phân loại fermenter Tùy vào loại sản phẩm, loại vi sinh vật, loại cơ chất, động cơ của quá trình lên men mà cấu tạo, phương thức hoạt động của các fermenter sẽ khác nhau. _Fermenter làm việc liên tục: cơ chất được đưa vào và sản phẩm được tháo ra liên tục. _Fermenter làm việc gián đọan: đây là dạng fermenter có cơ chất được đưa vào một lần từ đầu quá trình lên men. Quá trình lên men diễn ra trong một hệ kín, không có nhập liệu cũng như tháo liệu. Sản phẩm chỉ được lấy ra khi kết thúc thời gian lên men. _Fermenter làm việc bán liên tục: đây là dạng fermenter có cơ chất được nhập liệu theo chu kì, ngoài lượng cơ chất được nhập liệu ban đầu thì sẽ có một lượng cơ chất bổ sung trong khi đang tiến hành lên men. Sản phẩm được tháo ra vào cuối giai đoạn lên men. Thời gian giữa các lần bổ sung cơ chất sẽ được tính toán để thu được hiệu quả cao nhất.[4] 2.4.3. Các kiểu nuôi cấy trong fermenter 2.4.3.1. Nuôi cấy gián đoạn Khi vi sinh vật được nuôi cấy gián đoạn, quá trình sinh trưởng và phát triển sẽ theo các pha: _Pha lag: pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy cho đến khi vi sinh vật đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi sinh vật chưa phân chia mạnh, nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt. _Pha log: trong pha này vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, sinh khối vi sinh vật tăng theo hàm mũ: N= N0.a(t/T) N0:mật độ vi sinh ban đầu T:thời gian thế hệ a:hệ số (1<a<= 2 ) t: thời gian nuôi cấy. _Pha ổn định: Quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học,số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào chết đi, tế bào cũng giữ được sự ổn định về kích thước và khối lượng. Kết quả là sinh khối được giữ ở mức ổn định. _Pha suy vong: Lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa ( hoặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Sản phẩm của quá trình nuôi cấy gián đoạn thường được lấy ra ở cuối pha ổn định nếu quá trình nuôi cấy để thu nhận sản phẩm trao đổi chất, và đầu pha ổn định nếu quá trình nuôi cấy thu nhận sinh khối. Thời gian lên men được lấy bằng thời gian nuôi cấy thích hợp nhất để thu sản phẩm. Thời gian này thường được xác định bằng thực nghiệm hay dựa vào các yếu cầu về công nghệ,về sản phẩm. [5] 2.4.3.2 Nuôi cấy liên tục Giả sử ta có thiết bị lên men làm việc liên tục với thể tích là V (lít) và lưu lượng của dòng môi trường chảy vào bình lên men và dòng tháo sản phẩm là F (lít/giờ). Trong quá trình lên men sẽ có hai quá trình ảnh hưởng tới lượng sinh khối vi sinh vật có trong thiết bị lên men. Đó là quá trình tháo liệu sản phẩm liên tục và quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Ta sẽ xét cân bằng vật chất của thiết bị lên men khi hai trạng thái này độc lập với nhau. Nếu chỉ có quá trình tháo liệu xảy ra ( xem như vi sinh vật không có bất cứ hoạt động sinh lý nào: sinh trưởng, phát triển hay chết đi). Vi sinh vật bị lấy ra khỏi bình nuôi cấy với vận tốc v- v- = dx/dt = F/VX = D.X X là mật độ tế bào (g/L. Hay tế bào/ml) D là tốc độ pha loãng (1/h), là tốc độ cấp môi trường trên thể tích bình nuôi. D = F/V Nếu chỉ xét quá trình phát triển của vi sinh vật, không xét đến quá trình tháo liệu thì vi sinh vật sẽ phát triển và tăng sinh khối theo phương trình Monod: v+ = dX/dt = µ.X v+, v- (g/L.h hay tế bào/ml.h) Với µ (1/h) là tốc độ gia tăng sinh khối, µ xác định bằng phương trình Monod µ = µmax. [S]/Ks + [S] Tuy nhiên cả hai quá trình diễn ra đồng thời nên ta có sự biến thiên sinh khối của vi sinh khối vật là: Vận tốc biến thiên sinh khối: V = dX/dt = (µ - D)e (µ -D)t Nếu µ > D, giá trị v = dX/dt có giá trị dương, nghĩa là nồng độ vi sinh vật trong bình tăng. Ngược lại, nếu µ < D v sẽ có giá trị âm và nồng độ vi sinh vật trong bình giảm. Trong trường hợp µ = D ta có v = 0, nghĩa là nồng độ vi sinh vật không tăng,không giảm theo thời gian, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học. Nếu duy trì sao cho µ luôn luôn bằng D trong thiết bị, ta sẽ thu được quần thể vi sinh vật sinh trưởng và phát triển ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Trong trường hợp như vậy, không những kích thước trung bình của tế bào, trạng thái sinh lý của tế bào vi sinh vật, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất vi sinh vật ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên điều này đồi hỏi phải có hệ thống cảm biến theo dõi và hệ thống điều khiển tự động. Vì vậy, trong nuôi cấy có hai dạng thiết bị là chemostass và turbidostass. Thông số của canh trường thường được cài đặt là: +Mật độ tế bào ( xác định bằng cách đo độ đục của canh trường nuôi cấy). +Nồng độ cơ chất. +Nồng độ sản phẩm. Để theo dõi được các giá trị này thì phải sử dụng các cảm biến (sensor) gắn vào hệ thống lên men, tùy thuộc vào thông số theo dõi mà ta có các cảm biến thích hợp. Chemostass có mức độ ổn định cao hơn turbidostass. Nếu các thông số hoạt động có quan hệ phụ thuộc chặt chẽ với nhau thì cả hệ thống hoạt động độc lập với thời gian. Tóm lại, ở thiết bị lên men liên tục, khi quá trình nuôi cấy đạt tốc độ ổn định thì các thông số như nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ vi sinh vật... là các đại lượng không phụ thuộc vào thời gian ( hoàn toàn hay gần đúng). Vì tiến hành nhập liệu và tháo sản phẩm liên tục nên thời gian lên men trong thiết bị làm việc liên tục là một đại lượng không thể xác định được một cách chính xác. Chúng ta chỉ có thể xác định được thời gian lưu trung bình của một phần tử trong thiết bị. [4] Trong suốt thời gian lưu, một phần tử của canh trường có thể tham gia họat động lên men, hay không tham gia họat động này. Mặt khác thời gian lưu của các phần tử trong thiết bị cũng không như nhau, đặc biệt là các thiết bị có vùng chết hay có dòng chảy tắt. Vì vậy đại lượng thời gian lưu kể trên là giá trị trung bình cho tất cả các phần tử. Thời gian lưu này được xác định bằng thực nghiệm với tiêu chuẩn là độ chuyển hóa mong muốn. Khi đó lưu lượng dòng nhập liệu ( hay tháo sản phẩm) được tính toán để phù hợp với công thức sau: T = V/F Với V: thể tích dung dịch chứa trong thiết bị. F: lưu lượng nhập liệu,tháo sản phẩm T: thời gian lưu CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Rỉ đường Rỉ đường được cung cấp từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ tp.Hồ Chí Minh. 3.1.2. Giống vi sinh vật Vi sinh vật được sử dụng trong đề tài luận văn là Lactobacillus delbrueckii được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa tp.Hồ Chí Minh. 3.1.3. Chế phẩm L.Delbrueckii được cố định trên BC Được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa tp.Hồ Chí Minh. Có mật độ tế bào đạt 2.108 tế bào/cm3. 3.2. Hoá chất, trang thiết bị và dụng cụ 3.2.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường giữ giống và nuôi cấy khuẩn lạc để xác định mật độ tế bào. Môi trường MRS lỏng: Pepton : 10 g Cao thịt : 10 g Cao nấm men : 5 g Glucose : 20 g Tween 80 : 1ml K2HPO4 : 2 g Triamonium hydrogen citrate : 2 g Sodium acetate : 5 g MgSO4 : 0.2 g MnSO4 : 0.2 g Nước cất : 1000ml pH : 6.5 Môi trường MRS agar: Môi trường MRS dịch thể bổ sung 20g agar. Môi trường lên men acid lactic : Môi trường mật rỉ đường 3.2.2. Hóa chất NaOH 1N: 40 (g/l) Thuốc tím kết tinh: A: Tím kết tinh : 2 g Rượu ethylic 90% : 20 ml B: Ammonium axalt : 0.8 g Nước cất : 80ml Trộn đều A và B Thuốc thử lugol: Iode : 1 g KI : 3 g Nước cất : 300 ml Thuốc nhuộm fuchsin: A: Rượu ethylic 960: 10 ml Fuchsin kiềm: 0,3g B: Phenol: 5g Nước cất: 95 ml Trộn A và B lại, pha loãng 5 lần H2SO4 20% KOH 4N Chất chỉ thị màu phenolphthalein Thiết bị và dụng cụ Tủ cấy : 700S - Brlad-france Tủ ấm: Memmert-Germany Nồi hấp khử trùng:Huxky – Đài Loan Tủ lạnh Kính hiển vi :Weatlab seiler - USA Cân phân tích: Kern 770-15 - Orbital Germany Máy ly tâm: Universal 320 Máy đo quang: DR2010 - Hach Máy đo pH: SM 102 - Milwaukee-Romania Máy đo độ Brix Dụng cụ: erlen, becher, đĩa petri, ống nghiệm, pipette, eppendorf, bình thủy tinh SCHOTT DURAN, bình nhựa… 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu Khảo sát Lactobacillus delbrueckii Hàm lượng chất khô biểu kiến Khảo sát một số điều kiện lên men acid lactic trên môi trường rỉ đường pH Thời gian lên men Tiến hành lên men thu nhận acid lactic trong hệ thống lên men liên tục bởi Lb. delbrueckii cố định trong phức chất mang BC Hình 3.1. Sơ đồ bố trí nội dung nghiên cứu 3.2.2. Khảo sát Lactobacillus delbrueckii Giống Lactobacillus delbrueckii được tăng sinh trên môi trường MRS. Giống được cấy vào môi trường đặc và môi trường lỏng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng. Cấy giống vào erlen chứa môi trường MRS lỏng, lắc đều. Tất cả môi trường được cấy giống đem vào tủ ủ ở 37oC trong 24h nhằm tăng sinh khối. 3.2.2.1. Quan sát đại thể: Cấy trãi chủng vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii lên môi trường thạch đĩa, nuôi ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 24h. Quan sát hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc. 3.2.2.2. Quan sát vi thể: Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào, xác định Gram. Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram (1853 – 1938 ) phát minh ra từ năm 1884. Nhờ phương pháp này người ta phân biệt ra 2 nhóm vi khuẩn đó là: vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt được vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có màu tím, cò vi khuẩn Gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít peptidoglycan hơn và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng. Tiến hành: - Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. - Soi kính: dùng vật kính 100x. 3.2.2.3. Khảo sát khả năng tạo thành acid lactic: Nuôi cấy vi khuẩn lactic trong môi trường MRS (nuôi cấy dịch thể), nếu vi khuẩn này sinh ra Acid lactic thì nó sẽ làm cho pH của môi trường giảm xuống. Khoảng chênh lệch thu được về pH chính là khả năng sinh Acid lactic mạnh hay yếu của vi khuẩn đó. 3.2.2.4. Lập đồ thị chuẩn: Mục đích: Xây dựng đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ tế bào (số tế bào/ml) và độ hấp thu (OD). Tiến hành: Định lượng số tế bào vi khuẩn ban đầu trong dịch nuôi cấy tăng sinh sau 24h bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trong môi trường thạch đĩa. Lấy 10ml dịch lên men sau 24h đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ dịch lên men thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý.Hút nước muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml trong ống ly tâm. Tiến hành pha loãng mẫu với các hệ số pha loãng khác nhau và đo OD ứng với các hệ số pha loãng đó. Từ các giá trị OD tương ứng và các giá trị mật độ tế bào pha loãng tiến hành lập đường chuẩn 3.2.2.5. Khảo sát đường cong sinh trưởng trên môi trường MRS và rỉ đường. Mục đích: Xác định các giai đoạn sinh trưởng của giống để lựa chọn thời điểm mà giống đạt chất lượng tốt nhất cho quá trình lên men và thời điểm dừng lên men. Xử lý môi trường MRS: Cân môi trường MRS định mức đến 1000ml Chỉnh pH đến 6.5 Hấp khử trùng 1210 C, 15 phút Cấy giống 3%, ủ 37 0 C . Xử lý môi trường rỉ đường: 100ml rỉ đường + 1ml H2SO4 20% đun sôi cách thủy 20 phút 10 g rỉ đường thủy phân + 0.5 g cao nấm men định mức vừa đủ 100ml Chỉnh pH đến 6.5 bằng KOH 4M Hấp khử trùng 1210 C, 15 phút Cấy giống 3%, ủ 37 0 C . Tiến hành: Nhân giống cấp 1. Cấy trãi giống trên môi trường thạch đĩa để xác định mật độ tế bào trong dịch ban đầu, đồng thời đo OD tại thời điểm này (t=0). Tiến hành nhân giống trong 30h .Sau 2h lấy mẫu đo OD để xác định mật độ tế bào. Phương pháp đo độ đục: Ở phương pháp này mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục (máy quang phổ Hewlett Packard 8453 với chương trình HPUV-Vis Chemstations ở bước sóng 600nm (AG)). Nguyên tắc dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lững trong pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của chúng làm phân tán chùm ánh sáng tới. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào .Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập quan hệ tuyến tính giữa chúng , thông qua máy so màu ở bước sóng 550- 610 nm. Bước 1: Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào Tiến hành pha loãng huyền phù vsv theo bảng 3.1: Bảng 3.1 xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào. Ống TN ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 Mẫu dd (ml) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Nướcmuối sinh lý (ml) 10 9.5 9 8.5 8 7.5 7 6.5 6 OD ( 600nm) cfu /ml *10-7 - Xác định số lượng tế bào ( cfu/ml) tương ứng theo từng mẫu ở bảng trên, Vẽ đường biểu diễn của log(N/ml) (trục tung ) theo OD600nm (trục hoành) . Bước 2: Xác định mật độ tế bào theo trị số OD600nm của các mẫu có tế bào vsv tương ứng cần đo được , kết hợp với đồ thị vừa lập cho phép ta xác định nồng độ tế bào trong huyền phù dịch nuôi . 3.2.3. Khảo sát một số điều kiện lên men acid lactic trên môi trường rỉ đường 3.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô biểu kiến Tiến hành lên men trong bình lên men chứa 50ml môi trường lên men với sự thay đổi nồng độ dịch đường lên men . Cấy giống từ môi trường tăng sinh.Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dịch đường có nồng độ lần lượt như sau: 6%, 8%, 10%, 12%. Ủ ở 37 0 C, trong 22h. Các thông số theo dõi sau thời gian lên men: nồng độ acid lactic (%), mật độ tế bào,pH. 3.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự lên men acid lactic: Tiến hành lên men trong bình lên men chứa 50ml môi trường lên men với nồng độ dịch đường tối ưu đã tìm được ở thí nghiệm trên . Cấy giống từ môi trường tăng sinh.Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dịch đường có pH thay đổi: 5 ; 5.5 ; 6 ; 6.5; 7.0. Ủ ở 37 0 C, 22h. Các thông số theo dõi sau thời gian lên men: nồng độ acid lactic (%), mật độ tế bào,pH. 3.2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men: Tiến hành lên men trong bình lên men chứa 50ml môi trường lên men với nồng độ dịch đường và pH, tối ưu đã tìm được ở thí nghiệm trên . Cấy giống từ môi trường tăng sinh.Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trong thời gian theo dõi là 20h, 22h, 24h, 26h. Các thông số theo dõi sau thời gian lên men: nồng độ acid lactic (%), mật độ tế bào, pH 3.2.4. Tiến hành lên men acid lactic trong hệ thống lên men liên tục bởi L. delbrueckii cố định trong phức chất mang BC 3.2.4.1. Xác định tốc độ pha loãng tối ưu cho quá trình lên men Môi trường được đưa vào với một tốc độ thích hợp nào đó sẽ duy trì trạng thái cân bằng động. Trong chemostat, sự sinh trưởng của vi sinh vật và nồng độ cơ chất thay đổi phụ thuộc vào tốc độ pha loãng. Vì vậy ta cần xác định tốc độ pha loãng thích hợp. Chuẩn bị hệ thống lên men liên tục. Cách tiến hành: 5 bình lên men, là bình thủy tinh SCHOTT DURAN, thể tích: 1L, đường kính: 105mm, chiều cao: 2300 mm. Bình chứa môi trường: bình nhựa, thể tích 10L. Bình chứa sản phẩm: bình nhựa, thể tích 5L. Van truyền dịch: điều chỉnh lưu lượng. Thể tích mỗi bình ở mức chảy tràn (theo thứ tự 5 bình) lần lượt là: 750, 750, 700, 700, 700 ml. Thể tích toàn đường ống dẫn: 140 ml. Thể tích tổng cộng: V = 750 + 750 + 700 + 700 + 700 + 140 = 3740 ml. Hình 3.2 Mô hình hệ thống lên men liên tục tại phòng thí nghiệm Bộ môn sinh học trường ĐH Bách Khoa tp.HCM Chuẩn bị chế phẩm L. delbrueckii cố định trên BC có mật độ tế bào 2.108 tế bào/ml,5 bình lên men đã khử trùng. Thao tác trong điều kiện vô trùng cho chế phẩm cố định vào các bình lên men. Ghi nhận lượng chế phẩm ở mỗi bình lên men. Tiến hành các chu kỳ lên men với tốc độ cấp môi trường là 150, 100 và 75 ml/h. Các thông số theo dõi sự lên men mỗi ngày: nồng độ acid lactic (%), và pH. Từ đó xác định tốc độ pha loãng thích hợp. 3.2.4.2. Kiểm tra tính ổn định của hệ thống Cách tiến hành: Vận hành hệ thống lên men liên tục với tốc độ pha loãng tối ưu đã xác định. Tiến hành lấy mẫu đo các thông số nồng độ acid lactic (%), và pH mỗi ngày. Theo dõi sự thay đổi của các thông số đến khi ổn định. 3.2.5. Các phương pháp phân tích 3.2.5.1. Đo pH: Sử dụng máy đo pH 3.2.5.2.Đo độ Brix: Dùng máy đo độ Brix (khúc xạ kế) có thang đo từ 0 – 32 3.2.5.3. Xác định hàm lượng acid lactic _Nguyên tắc: Lượng acid lactic có trong dịch mẫu có thể được biễu diễn bằng độ Therner.Độ Therner chính là số ml dung dịch NaOH dùng để trung hòa lượng acid lactic có trong 100 ml dung dịch mẫu. Dung dịch phenolphtalein 1% trong môi trường acid không màu, khi lượng acid bị trung hòa bởi NaOH thì phenolptalein chuyển sang mày hồng. Dựa vào sự chuyển màu của phenolphtalein trong mẫu, người ta xác định được lượng NaOH cần dùng. Công thức tính độ Therner: To = n.100/V n: số lượng NaOH để trung hòa 100ml dung dịch mẫu V:thể tích mẫu _Tiến hành: Cho vào becher một lượng mẫu, thêm nước cất vào cho đủ 100ml. Cho vào mẫu 1ml phenolphthalein. Dùng NaOH 0,1N chuẩn độ đến khi trong bechercó màu hồng không phai thì ngừng lại. Lượng acid lactic có trong mẫu: A% = To x 0,009 (g/100ml) 3.2.5.4. Phương pháp đếm khuẩn lạc: (colony count) Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc (colony count) hay đếm đĩa (plate count). Ở phương pháp này tôi thực hiện ở 3 bước kỹ thuật cơ bản: Bước 1 : Mẫu tế bào cần đo tiến hành đem pha loãng mẫu theo dãy thập phân 10-8, 10-9, 10-10, 10-11. Hút 1ml tương ứng ở mỗi độ pha loãng vào mỗi đĩa ( chúng tôi tiến hành lặp lại 3 lần đối với mỗi độ pha loãng) và đổ môi trường dinh dưỡng agar tương ứng vào mỗi đĩa (môi trường đã được khử trùng 1210C, 1at, 20 phút; để nguội ở khoảng 400C). Bước 2: Đem ủ ở 450C, 24h Lưu ý :Chọn đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25- 300 khuẩn lạc /đĩa, đánh dấu đếm, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa ở mỗi độ pha loãng . Bước 3 : Tính kết quả: Mi (cfu/ ml) = Ai x Di / V Ai : số khuẩn lạc trung bình / đĩa. Di : độ pha loãng. V : dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) . Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Một số khảo sát và đặc điểm của Lactobacillus delbrueckii Giống Lactobacillus delbrueckii thuần chủng do phòng thí nghiệm của trường Đại học Bách Khoa TP.HCM cung cấp. 4.1.1. Quan sát đại thể, vi thể Thực hiện phương pháp cấy ria giống Lactobacillus delbrueckii trên môi trường thạch MRS. Những đĩa môi trường này được ủ ở 37oC trong 48h. Sau đó quan sát thấy khuẩn lạc Lactobacillus delbrueckii có hình tròn,kích thước nhỏ vừa, đều, bề mặt lồi, màu trắng đục. Hình 4.1 Hình ảnh đại thể Lactobacillus delbrueckii Hình 4.2 Hình ảnh của một khuẩn lạc Lactobacillus delbrueckii Sau khi giống Lactobacillus delbrueckii được tăng sinh trên môi trường MSR lỏng, tôi tiến hành kiểm tra đặc điểm hình thái của vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm Gram. Kết quả là Lactobacillus delbrueckii bắt màu tím qua phương pháp nhuộm Gram do có lớp peptidoglycan dày, điều đó xác định được Lactobacillus delbrueckii là vi khuẩn Gram (+). Hình 4.3 Hình ảnh vi thể Lactobacillus delbrueckii 4.1.2. Kết quả khảo sát khả năng tạo thành acid lactic Sau khi nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii trong môi trường MRS có pH ban đầu là 6.50 ở nhiệt độ 37 oC. Sau thời gian 24h thì pH của dịch nuôi cấy là 3.53. Vậy Lactobacillus delbruckii có khả năng sinh acid mạnh. Và ở pH < 4 có thể ức chế sự phát triển của Lactobacillus delbrueckii. 4.1.3. Kết quả khảo sát đường cong sinh trường của Lactobacillus delbrueckii trên môi trường MRS và rỉ đường. Cả hai môi trường tỷ lệ cấy giống ban đầu là 3%. Môi trường MRS vốn là môi trường đặc trưng cho vi khuẩn lactic nên Lactobacillus delbrueckii phát triển nhanh. Tại giờ thứ 4 sinh khối của vi khuẩn trong môi trường MRS cao hơn sinh khối của vi khuẩn trong môi trường rỉ đường. Cả hai môi trường pha lag đều trãi qua khoảng 6h. So với môi trường MRS thì môi trường rỉ đường vi khuẩn phát triển chậm hơn, do là môi trường hoàn toàn mới và khác với môi trường nhân giống Lactobacillus delbrueckii. Sau 6h thì vi khuẩn cả 2 trong môi trường đều chuyển sang pha log. Trong môi trường MRS thì vi khuẩn đạt cực đại tại thời điểm 14h, trong môi trường rỉ đường thì vi khuẩn đạt cực đại tại thời điểm 16h. Trong quá trình lên men tùy theo mục đích thu sản phẩm mà người ta chọn thời gian thu hồi sinh khối thích hợp. Chẳng hạn để thu acid lactic, người ta sẽ chọn cuối pha cân bằng vì trong suốt pha cân bằngvi khuẩn vẫn tiếp tục sinh acid lactic. Đồ thị 4.1 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus delbrueckii trên môi trường MRS Đồ thị 4.2 Đường cong sinh trường của Lactobacillus delbrueckii trên môi trường rỉ đường 4.1.4. Kết quả xác định đường chuẩn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào Xây dựng đồ thị chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa mật độ tế bào (số tế bào/ml) và độ hấp thu (OD) Đồ thị 4.3 Biểu diễn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào của vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii trên môi trường rỉ đường. y: mật độ tế bào (tế bào/ml). x: OD R2: hệ số tương quan 4.2.Kết quả khảo sát một số điều kiện lên men acid lactic trong lên men theo mẽ trên môi trường rỉ đường 4.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất khô biểu kiến theo trọng lượng. Khảo sát này nhằm tìm ra một nồng độ chất khô biểu kiến nhất định phù hợp cho quá trình lên men tạo acid lactic. Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô biểu kiến đến mật độ tế bào, pH, Hàm lượng acid lactic (%) Hàm lượng chất khô biểu kiến theo trọng lượng Mật độ tế bào (*1011 tế bào/ml) pH Brix Hàm lượng acid lactic (%) 6% 10.02 3.6 6% 7.2 8% 10.62 3.58 8% 7.92 10% 9.22 3.67 9.6% 6.48 12% 8.67 3.76 12% 6.2 Đồ thị 4.4 Tương quan giữa hàm lượng chất khô biểu kiến theo trọng lượng và acid lactic tạo thành Ứng với nồng độ 6% đến 12%. pH tăng từ 3.58 đến 3.76, độ Brix có sự thay đổi ở nồng độ 10% sau khi lên men thì giảm xuống còn 9.6%. Mật độ tế bào trong khoảng 8.67*1011 đến 10.62*1011 tế bào/ml. Hàm lượng acid lactic từ 6.2 – 7.9%. Ta thấy ở nồng độ 8%, acid sinh ra nhiều hơn nên làm giảm pH của môi trường lên men, đồng thời nồng độ acid lactic sinh ra cũng cao hơn. 4.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men trong quá trình lên men. Chọn nồng độ chất khô biểu kiến là 8%. Tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm mục đích tìm mức pH thích hợp cho quá trình lên men lactic. Bảng 4.2 Ảnh hưởng của pH lên mật độ tế bào, Hàm lượng acid lactic(%) pH ban đầu Mật độ tế bào (*1011 tế bào/ml) pH sau lên men Brix Hàm lượng acid lactic (%) 5.5 5.97 3.64 8% 6.48 6 6.89 3.6 8% 7.38 6.5 7.78 3.6 8% 7.3 7 7.49 3.9 8% 7.3 Đồ thị 4.5 Tương quan giữa pH môi trường lên men và acid lactic tạo thành Ứng với pH thay đổi từ 5.5 đến 7 thì mật độ tế bào vi khuẩn sau lên men cũng thay đổi từ 5.97*1011 đến 7.78*1011. Brix là 8%. pH sau khi lên men thay đổi từ 3.6 đến 3.9, Hàm lượng acid lactic tăng từ 6.48 đến 7.38%. Ta thấy ở pH 6, khả năng lên men sinh acid lactic nhiều hơn so với ở các pH khác. 4.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men trong quá trình lên men. Chọn nồng độ chất khô biểu kiến là 8%. pH là 6. Tôi tiến hành lên men theo dõi thời gian lên men, nhằm mục đích chọn ra thời gian thích hợp để thụ nhận acid lactic. Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên mật độ tế bào,pH, Hàm lượng acid lactic(%). Thời gian Mật độ tế bào *1011 Brix pH Hàm lượng acid lactic (%) 20h 7.20 8% 3.66 6.5 22h 7.29 8% 3.63 7.2 24h 7.46 8% 3.53 7.4 26h 7.83 8% 3.53 7.5 Đồ thị 4.5 Tương quan giữa thời gian lên men và hàm lượng acid lactic tạo thành. Ta thấy cùng một điều kiện lên men, nhưng ở khoảng thời gian khác nhau, từ 20h đến 26h, hàm lượng acid lactic tăng từ 6.2 đến 7.5%. pH thay đổi từ 3.66 đến 3.53, Brix là 8%. Dựa trên kết quả ta thu được, chọn thời gian 26h để thu nhận acid lactic. Tuy nhiên cần phải khảo sát thêm thời gian lên men nhằm khảng định một cách chính xác thời gian tối ưu nhất cho quá lên men acid lactic. Tổng kết phần khảo sát điều kiện lên men acid lactic trên môi trường rỉ đường Nồng độ chất khô biểu kiến là: 8% pH thích hợp là :6 Thời gian lên men thích hợp là : 26h 4.3. Kết quả tiến hành lên men thu nhận acid lactic trong hệ thống lên men liên tục bởi Lb. delbrueckii cố định trong phức chất mang BC Hình 4.4 Mô hình hệ thống lên men liên tục tại phòng thí nghiệm Bộ môn sinh học trường Đại Học Bách Khoa tp.HCM Bảng 4.4 Lượng chế phẩm ở mỗi bình lên men trong hệ thống lên men liên tục Bình Lượng chế phẩm (g) ( Chất lượng giống 2,8.108 tế bào/g chế phẩm) 1 2.15 2 2.10 3 2.00 4 2.20 5 2.12 Trung bình 2.114 4.3.1. Xác định tốc độ pha loãng tối ưu cho quá trình lên men Nhằm mục đích tìm ra tốc độ pha loãng thích hợp cho hệ thống lên men liên tục Bảng 4.5 Biến động pH trong quá trình lên men liên tục Thời gian lưu (giờ) Tốc độ pha loãng (ml/h) Thời gian theo dõi (sau thời gian lưu) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 24 150 2.50 2.51 2.49 2.46 2.45 2.45 2.46 36 100 2.51 2.51 2.48 2.45 2.46 2.45 2.45 48 75 2.50 2.55 2.48 2.45 2.45 2.46 2.46 (Ngaøy) Đồ thị 4.6 Biến động của pH theo thời gian lên men liên tục ở các cấp độ pha loãng 150, 100, 75ml/h Bảng 4.6 Biến động acid lactic (%) trong quá trình lên men liên tục Thời gian lưu (giờ) Tốc độ cấp môi trường (ml/h) Thời gian theo dõi (sau thời gian lưu) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 24 150 6.50 6.75 6.78 6.83 6.85 6.88 6.85 36 100 7.31 7.41 7.50 7.48 7.50 7.55 7.50 48 75 7.30 7.36 7.47 7.42 7.40 7.45 7.45 (Ngaøy) Đồ thị 4.7 Biến động của hàm lượng acid lactic (%), theo thời gian lên men liên tục ở các cấp độ pha loãng 150, 100, 75ml/h Dựa vào bảng 4.5, 4.6 và đồ thị 4.6, 4.7. Ta thấy Sau thời gian lưu, pH ở cả 3 tốc độ pha loãng giao động trong khoảng 2.45 – 2.55. Biến thiên trong khoảng 0.1.Giữa các ngày có biến động lớn từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 4 và ổn định từ ngày thứ 5 trở đi.pH trung bình của tốc độ pha loãng 100ml/h là 2.472 thấp hơn so với cấp độ pha loãng 150ml/h là 2.474, và ở 75ml/h là 2.478. Hàm lượng acid lactic giữa các độ pha loãng có sự chênh lệch. Hàm lượng acid lactic trung bình ở độ pha loãng 150ml/h là 6.777% thấp nhất, độ pha loãng 150ml/ h là 7.407% và 100ml/h là 7.464% là cao nhất. Ở mỗi nồng độ pha loãng, hàm lượng acid lactic biến động theo từng ngày là không đáng kể. Vì vậy ta chọn tốc độ pha loãng là 100ml/h cho hệ thống lên men liên tục. 4.3.2. Kiểm tra tính ổn định của hệ thống Ta cho hệ thống hoạt động với tốc độ pha loãng là 100ml/h, sau 5 ngày ổn định. Bảng 4.7 Bảng theo dõi pH, hàm lượng acid lactic (%) của hệ thống Ngày theo dõi 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 2.50 2.51 2.48 2.45 2.45 2.46 2.45 2.45 Acid lactic (%) 7.31 7.41 7.50 7.48 7.50 7.55 7.50 7.50 % acid lactic pH Thôøi gian theo doõi (Ngaøy) Đồ thị 4.8 Biến động của hàm lượng acid lactic (%),pH theo thời gian trong hệ thống lên men liên tục. Dựa vào bảng 4.7 và đồ thị 4.8 ta nhận thấy pH trong hệ thống lên men giao động trong khoảng 2.45 – 2.51, pH trung bình là 2.468. Độ chênh lệch pH giữa các ngày vào khoảng 0.01 – 0.03. Như vậy pH trong suốt quá trình hoạt động của hệ thống lên men không có biến động lớn. Hàm lượng acid lactic thu được trong suốt quá trình lên men giao động trong khoảng 7.31 – 7.55%, Trung bình là: 7.468%, hàm lượng acid lactic chênh lệch giữa các ngày vào khoảng 0 – 0.1%.Sự chênh lệch này không đáng kể. Như vậy hệ thống lên men liên tục thu nhận acid lactic bởi chế phẩm L.delbrueckii cố định trên phức chất mang BC hoạt động ổn định. CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men acid lactic, và xác định tốc độ pha loãng tối ưu, tính ổn định của hệ thống lên men liên tục bởi L.delbrueckii cố định trên phức chất mang BC. Chúng tôi rút ra những kết quả như sau: _Nồng độ chất khô biểu kiến ban đầu là: 8% _pH ban đầu thích hợp cho quá trình lên men là : 6 _Thời gian lên men tối ưu là : 26h _Tốc độ pha loãng tối ưu trong hệ thống lên men liên tục này là: 100ml/h _Nhận xét về tính ổn định của hệ thống: hệ thống hoạt động ổn định 5.2. Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu ngắn, thiết bị và phương tiện thí nghiệm còn nhiều hạn chế nên nội dung thí nghiệm chưa thể khảo sát hết các yếu tố liên quan đến đề tài. Dựa vào các thông số kết quả đã tìm được tôi kiến nghị tiếp tục bố trí thí nghiệm nghiên cứu thêm: _Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men. _Tỉ lệ giống cấy vào _Tiếp tục khảo sát thời gian lên men _Tiếp tục theo dõi tính ổn định của chế phẩm vi sinh vật cố định qua tỷ lệ tế bào bị rửa trôi và tính ổn định của hệ thống lên men liên tục. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]Kiều Hữu Ánh, “ Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp”, NXB Khoa Học – Kỹ Thuật [2] Nguyễn Thị Hiền, Rỉ đường mía và ứng dụng trong công nghiệp lên men ở nước ta. Lương thực thực phẩm (LTTP) số 4/1979/ trang 23-26. [ 3]. Nguyễn Thị Hiền,Thành phần rỉ đường mía Việt Nam và ứng dụng trong ngành công nghiệp lên men.. Lương thực thực phẩm (LTTP) số 9/1979/ trang 30-34. [4] Nguyễn Thị Hiền,Công Nghệ Sản Xuất Mì Chính Và các Sản Phẩm Lên Men Cổ Truyền, NXB Khoa học Kỹ thuật [5]. Nguyễn Thúy Hương (2006). Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot. Luận án Tiến sỹ Sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. [6] Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (1996), Vi sinh vật công nghiệp – tập 2, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM. [7] Nguyễn Đức Lượng, “ Công nghệ vi sinh” tập 2 “Vi sinh vật công nghiệp”, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM,2002 [8]. Gokhale D và cộng sự ( 2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan. 2008, p. 333–335. [9]. www.bacferm.com.au/silac/micro/m...cro.html [10] [11] [12]. [13]. [14].